Vi beskriver en metod för att generera mänskliga motor enheter i kommersiellt tillgängliga microfluidic enheter genom samodling mänskliga inducerad pluripotenta stamcell-härledda motor nervceller med mänskliga primära mesoangioblast-härledda myotubes som resulterar i bildandet av funktionellt aktiva neuromuskulära korsningar.
Neuromuskulära korsningar (NMJs) är specialiserade synapser mellan axon av den nedre motoriska neuron och muskeln som underlättar engagemanget av muskelkontraktion. I motoriska neuron störningar, såsom amyotrofisk lateral skleros (ALS) och spinal muskelatrofi (SMA), NMJs degenerera, vilket resulterar i muskelatrofi och progressiv förlamning. Den underliggande mekanismen för NMJ-degeneration är okänd, till stor del på grund av bristen på översättningsbara forskningsmodeller. Denna studie syftade till att skapa en mångsidig och reproducerbar in vitro-modell av en mänsklig motorenhet med funktionella NMJs. Därför var humanduced pluripotent stamcell (hiPSC)-härledda motor nervceller och mänskliga primära mesoangioblast (MAB)-härledda myotubes samkulturerade i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter. Användningen av fluidt isolerade mikrofack möjliggör underhåll av cellspecifika mikromiljö samtidigt som cell-till-cell-kontakt tillåts via mikrogrooves. Genom att tillämpa en chemotactic och volumetric gradient stimulerades tillväxten av motor neuron-neuriter genom mikrogrooves främja myotube interaktion och bildandet av NMJs. Dessa NMJs identifierades immunocytochemically genom samlokalisering av motor neuron presynaptic markör synaptophysin (SYP) och postsynaptic acetylkolin receptor (AChR) markör α-bungarotoxin (Btx) på myotubes och karakteriseras morfologiskt med skanning elektronmikroskopi (SEM). Funktionen hos NMJs bekräftades genom att mäta kalcium svar i myotubes vid depolarization av motor nervceller. Den motorenhet som genereras med hjälp av vanliga mikrofluidiska enheter och stamcellsteknik kan bidra till framtida forskning med fokus på NMJs inom hälsa och sjukdom.
NMJs underlättar kommunikationen mellan lägre spinal motor nervceller och skelettmuskulaturfibrer genom frisättning av signalsubstanser1. I motoriska neuron störningar som ALS och SMA, NMJs degenerera, vilket orsakar en störning i kommunikationen med musklerna2,3,4,5,6,7. Detta resulterar i att patienter gradvis förlorar sin muskelfunktion, vilket gör att de är rullstolsbundna och så småningom beroende av andningslivsstöd på grund av progressiv atrofi av vitala muskelgrupper som membranet. De exakta underliggande mekanismerna som ansvarar för denna djupgående förlust av NMJs i dessa störningar är okända. Många studier har gjorts på transgena djurmodeller, vilket har gett oss några insikter om patogenesen vid NMJ degeneration5,6,8,9,10,11. Men för att fullt ut förstå patologin och motverka denervationen är det viktigt att ha ett mänskligt system, vilket möjliggör full tillgänglighet.
Här beskriver protokollet ett relativt enkelt sätt att generera mänskliga NMJs genom samodling av hiPSC-härledda motoriska nervceller och mänskliga primära MAB-härledda myotuber med kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter. Användningen av mikrofluidik för att polarisera och fluidiskt isolera somas och axoner av nervceller har varit känd sedan den första beskrivningen av “Campenot” kamrar12 i slutet av 1970-talet. Sedan dess har mer mikrofluidiska mönster tillverkats, inklusive kommersiella alternativ. De enheter som används i detta protokoll innehåller två fack, och varje fack består av två brunnar anslutna till en kanal13. De två facken är speglade och anslutna till flera mikrogrooves. Dessa mikrogrooves har en storlek som underlättar neurit tillväxt samtidigt upprätthålla fluidisk isolering mellan de två facken genom en kapillär hydrostatiskt tryck13,14. Med hjälp av detta system är det möjligt att odla motoriska nervceller i ett fack och muskelceller i det andra, var och en i deras specifika odlingsmedium, samtidigt som det underlättar en fysisk anslutning genom neuriter som passerar genom mikrogrationerna och engagerar sig med muskelcellerna. Denna modell ger ett fullt tillgängligt och anpassningsbart in vitro-system hos en mänsklig motorenhet, som kan användas för att studera tidig NMJ-patologi vid sjukdomar som ALS och SMA.
Protokollet beskriver en relativt lättanvänd metod, som genererar mänskliga motorenheter med funktionella NMJs i kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter på mindre än 30 dagar. Det beskrivs hur NMJs kan bedömas morfologiskt genom standardtekniker som ICC och SEM och funktionellt genom levande cell kalcium inspelningar.
En stor fördel med detta protokoll är användningen av stamcellsteknik. Detta möjliggör full anpassningsförmåga där NMJs kan utvärderas i både hälsa och sjukdom, oberoende av givarprofilen. Modellen har visat sig redan framgångsrik och fördelaktig i ALS forskning, där vi identifierade nedskrivningar i neurit utväxt, återväxt och NMJ nummer som nya fenotyper på grund av mutationer i FUS gen18. Med denna modell är det möjligt att utöka forskningen till att omfatta sporadiska former av ALS, där etiologin är okänd, genom att använda iPSCs från sporadiska ALS-patienter. Detta ger en fördel jämfört med traditionella djurmodeller, som förlitar sig på transgent överuttryck av muterade gener för att rekapitulera mänsklig sjukdom23,24. Dessutom möjliggör vårt helt mänskliga system potentiell rekapitulering av människospecifik fysiologi och sjukdom. Tidigare studier visade skillnaderna mellan gnagare och human NMJ morfologi25, vilket tyder på att försiktighet måste genomföras när man använder gnagare för att ta itu med mänsklig NMJ patologi. Även om detta system är en relativ enkel in vitro-installation, som saknar komplexiteten hos en in vivo-modell, var det möjligt att visa att NMJ-morfologin som visas i de mikrofluidiska enheterna liknade NMJs av mänskliga amputater25. Dessutom tillåter denna modell NMJ-utvärdering under NMJ-bildande och mognad, vilket potentiellt avslöjar tidiga sjukdom fenotyper, som är frånvarande, oidentifierbara eller förbises i mänskliga obduktion prover.
MABs ger ett giltigt alternativ för att generera myotubes, även om deras begränsade överlevnad på 10 dagar är en nackdel med systemet. Myotube överlevnad förlitar sig på deras fastsättning till ytan, som sannolikt äventyras av spontana sammandragningar av myofibers. Efter mer än 10 dagar kommer de flesta myotubes att ha lossnat, vilket gör NMJ-kulturen oanvändbar. Helst skulle myotubes också genereras från iPSCs. Nuvarande protokoll har dock visat sig vara svåra att reproducera26 på grund av variationer i fusionsindex27,28,29,30.
Genom att använda kommersiellt tillgängliga mikrofluidiska enheter genererade vi ett standardiserat system som är fullt tillgängligt. Andra NMJ-modeller finns31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42. De förlitar sig dock vanligtvis på enskilda fack, som saknar compartmentalization och fluidic isolering mellan celltyper, eller på skräddarsydda odlingskärl, vilket sänker tillgängligheten och potentiellt också reproducerbarheten. De mikrofluidiska anordningar som används för detta protokoll kan köpas med mikrogrooves av olika längder, vilket möjliggör ytterligare analys såsom axonal transport43,44 eller axotomy18,45,46 undersökningar. Den fluidic isolering mellan fack möjliggör ytterligare compartmentalized läkemedelsbehandling av antingen motor neuroner eller myotubes, vilket kan vara gynnsamt i terapi utveckling. Fler företag som specialiserat sig på mikrofluidik har dykt upp, vilket har öppnat upp för ett stort urval av enhetsdesign och funktioner, vilket ytterligare främjar tillgängligheten för in vitro-forskning.
Sammanfattningsvis har vi utvecklat ett protokoll som ger en pålitlig, mångsidig och enkel metod för att odla mänskliga motorenheter med funktionella NMJs.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Nikky Corthout och Sebastian Munck från LiMoNe, Forskargruppen Molecular Neurobiology (VIB-KU Leuven) för deras råd om levande cell kalcium transient fluorescens inspelningar. Denna forskning stöddes av Fulbrightkommissionen i Belgien och Luxemburg, KU Leuven (C1 och “Opening the Future”-fonden), VIB, Byrån för innovation inom vetenskap och teknik (IWT; SBO-iPSCAF), “Fonden för vetenskaplig forskning Flandern” (FWO-Vlaanderen), Target ALS, ALS Liga België (A Cure for ALS), den belgiska regeringen (Interuniversity Attraction Poles Program P7/16 initierat av belgiens federala vetenskapspolitiska kontor), Thierry Latran Foundation och “Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires” (ABMM). T.V. och J.B. stöds av doktorandstipendier som delas ut av FWO-Vlaanderen.
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | B35451 | Antibody (1:1000) |
Acetic Acid | CHEM-Lab NV | CL00.0116.1000 | Coating component. H226, H314. P280 |
Aclar 33C sheet (SEM sheet) | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | Thickness: 7.8 mil |
Agrin (recombinant human protein) | R&D systems | 6624-AG-050 | Media supplement |
Alexa fluor IgG (H+L) 488 donkey-anti rabbit | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 555 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31570 | Antibody (1:1000) |
Alexa fluor IgG (H+L) 647 donkey-anti mouse | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Antibody (1:1000) |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | Media component |
βIII-tubulin (Tubulin) | Abcam | ab7751 | Antibody (1:500) |
β-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | Media component. H317. P280. |
B-27 without vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | Media component |
BDNF (brain-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-02B | Growth factor |
bFGF (recombinant human basic fibroblast growth factor) | Peprotech | 100-18B | Growth factor |
Choline acetyltransferase (ChAT) | Millipore | ab144P | Antibody (1:500) |
Collagen from calfskin | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Coating component |
CNTF (ciliary neurotrophic factor) | Peprotech | 450-13B | Growth factor |
DAPI Nucblue Live Cell Stain ReadyProbes reagent | Thermo Fisher Scientific | R37605 | Immunocytochemistry component |
DAPT | Tocris Bioscience | 2634 | Media supplement |
Desmin | Abcam | Ab15200 | Antibody (1:200) |
DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | Media component |
DMSO | Sigma | D2650-100ML | Cryopreservation component. H315, H319, H335. P280. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | no calcium, no magnesium |
Ethanol | VWR | 20.821.296 | Sterilization. H225. P280 |
Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Media component |
Fluo-4 AM live cell dye | Thermo Fisher Scientific | F14201 | Calcium imaging dye |
Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | Immunocytochemistry component |
GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) | Peprotech | 450-10B | Growth factor |
Glutaraldehyde | Agar Scientific | R1020 | Fixation component. EUH071, H301, H314, H317, H330, H334, H410. P280. |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | Media component |
Human alkaline phosphatase | R&D systems | MAB1448 | Antibody |
ImageJ software | NIH | ICC analysis | |
IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | Media component |
Insulin transferrin selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | Media component |
Islet-1 | Millipore | ab4326 | Antibody (1:400) |
Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | Cryopreservation component |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020-1MG | Coating component and media supplement |
Leica SP8 DMI8 confocal microscope | Leica | ICC confocal microscopy | |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Media component |
Myogenin (MyoG) | Abcam | Ab124800 | Antibody (1:500) |
Myosin heavy chain (MyHC) | In-house, SCIL | Antibody (1:20) | |
N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | Media component |
Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Coating and media component |
Neurofilament heavy chain (NEFH) | Abcam | AB8135 | Antibody (1:1000) |
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | Live-cell calcium imaging microscopy | |
NIS-Elements AR 4.30.02 software | Nikon | Live-cell calcium imaging analysis | |
Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Media component |
Normal donkey serum | Sigma | D9663-10ML | Immunocytochemistry component |
Olig2 | IBL | 18953 | Antibody (1:1000) |
Parafilm M | Sigma | P7793-1EA | Storing equipment |
Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Fixation component. H302, H312, H315, H317, H319, H332, H335, H341, H350. P280. |
Penicillin/Streptomycin (5000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Media component |
Petri dish (3 cm) | nunc | 153066 | Diameter: 3 cm |
Petri dish (10 cm) | Sarstedt | 833.902 | Diameter: 10 cm |
Plate (6-well) | Cellstar Greiner bio-one | 657160 | Culture plate |
Pluronic F-127 | Thermo Fisher Scientific | P3000MP | Fluo-4 dye solvent |
Poly-L-ornithine (PLO) | Sigma | P3655-100MG | Coating component |
Potassium chloride | CHEM-Lab NV | CL00.1133.1000 | Calcium imaging reagent |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Media supplement. H302, H315, H360FD, H410. P280. |
RevitaCell supplement | Thermo Fisher Scientific | A2644501 | ROCK inhibitor solution |
Smoothened agonist | Merch Millipore | 566660 | Media supplement |
Sodium cacodylate buffer | Sigma | C0250 | Fixation component. H301, H331, H350, H410. P280. |
Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | Media component |
Synaptophysin (SYP) | Cell Signaling | 5461S | Antibody (1:1000) |
T75 flask | Sigma | CLS3276 | Culture plate |
Titin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 9D10 | Antibody (1:300) |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ML | Immunocytochemistry component. H302, H315, H318, H319, H410, H411. P280 |
TrypLE express | Thermo Fisher Scientific | 12605010 | MAB dissociation solution |
Tubocyrarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379-100G | Acetylcholine receptor blocker. H301. P280. |
XonaChips pre-assembled microfluidic device | Xona Microfluidics | XC150 | Microgroove length: 150 μm |
Xona Silicone microfluidics device | Xona Microfluidics | SND75 | Microgroove length: 75 μm |