Summary
Plaqueing, bir popülasyondaki canlı virüsleri ölçmek için kullanılan rutin bir yöntemdir. Plaqueing, bakteri ve bakteriyofajlarla çeşitli mikrobiyoloji müfredatlarında sıklıkla öğretilmesine rağmen, memeli virüslerinin veba edilmesi daha karmaşık ve zaman alıcıdır. Bu protokol, herpes simpleks virüsleri ile düzenli çalışma için güvenilir bir şekilde çalışan prosedürleri açıklar.
Abstract
Metodoloji için birincil literatürdeki referanslar da dahil olmak üzere, virüsleri rahatsız etmek için çok sayıda yayınlanmış protokol vardır. Bununla birlikte, virüsleri rahatsız etmek zor olabilir, bu da spesifikasyonlarına ve iyileştirilmesine odaklanmayı gerektirir. Yeni öğrencilerin ustalaşması için inanılmaz derecede zor bir yöntemdir, çünkü esas olarak en küçük ayrıntılara titizlikle dikkat edilmesini gerektirir. Herpes simpleks virüslerini rahatsız etmenin bu gösterimi, yıllar boyunca yöntemi, özellikle nüanslarını görselleştirmekle mücadele edenlere yardımcı olmalıdır. Bu makale, standart plaquing metodolojisinin aynı ilkelerine dayanmakla birlikte, (1) işlem sırasında bozulmayı önlemek için konakçı hücrelerin en iyi nasıl ele alınacağı, (2) viryonların difüzyonunu sınırlamak için agarozdan daha kullanışlı bir viskoz ortam ve (3) güvenilir bir şekilde tekrarlanabilir sonuçlar üreten basit bir fiksasyon ve boyama prosedürünün ayrıntılı bir tanımını içermesi bakımından farklıdır. Ayrıca, eşlik eden video, başkalarına plak tahlilleri yapma talimatı verirken sıklıkla gözden kaçırılan süreçteki daha ince ayrımları göstermeye yardımcı olur.
Introduction
Virüs plak tahlillerinin başlangıcı, 1890'larda virüslerin ilk keşiflerine kadar uzanır1. Tütün mozaik virüsü ilk önce izole edildi ve tütün yapraklarına geçti, burada bireysel enfeksiyon lekeleri, daha sonra virion2 olarak tanımlanan tek, canlı bir virüs varlığından2 kaynaklandığı ve ölçülebildi. Daha sonra bakteri ve bakteriyofajlarla yapılan seminal çalışmalar, büyümenin orta log fazındaki bakteriler, bakteriyofaj örneklerinin seri seyreltilmesi ve bakteri çimindeki gerçek deliklerin (adlandırılmış plaklar) daha sonra görselleştirilmesiyle üst agar da dahil olmak üzere bu virüsleri plak altına almak için kullanılan teknikleri mükemmelleştirmiştir3.
Hayvan virüslerinin yutulması, bakteriyofajlarla yapılan heyecan verici araştırmaların gerisinde kaldı, çünkü esas olarak kültürde memeli hücrelerinin yetiştirilmesi için gerekli yöntemler 1940'lara kadar geliştirilmedi4. Bununla birlikte, tüm konakçı organizmanın yokluğunda büyüyen murin hücrelerinin ortaya çıkışı4, virüsleri kültürleme ve sayma yeteneğinde yeni bir çağ yarattı. Bu tür çalışmalar, tavuk hücrelerinde Batı Atı Ensefalomiyelit virüsünün ve insan hücrelerinde poliovirüsün yayılması ve kantitasyonu için genişletilmiştir5,6. Kültürlenebilir memeli hücreleri alanı genişledikçe, çeşitli viral enfeksiyonlar için farklı konakçı hücrelerin kıskançlığı, dünyaya her türlü virüsü incelemek için bir dizi olanak sağladı7. Bu, insan herpes virüslerinin, özellikle de mukokutanöz lezyonlara neden olan herpes simpleks virüsü-1 (HSV-1) ve -2'nin (HSV-2) yayılmasını ve miktarını içeriyordu8. Önemli olarak, tüm plak tahlilleri, konakçı hücrelere bir numunede reseptör aracılı bir şekilde girebilen canlı viryonların varlığına bağlıdır9. Plaket tahlillerinin yürütülmesiyle ilgili yayınların yaygınlığı ve çokluğundan bağımsız olarak5,10,11,12,13,14,15,16, HSV-1/-2 için bu yöntemler hem sanatın hem de bilimin bir karışımıdır; Protokoldeki her ayrıntıya dikkat edilmeden tahlil yapılamayacağı gibi, süreçteki incelik için kritikal bir göz olmadan da başarılı bir tahlil yapılamaz. Bu el yazması, HSV-1/-2 plak tahlilleri için en tutarlı tekrarlanabilir yöntemlerden birini, nadiren tartışılan tahlil sanatına yönelik kesin ayrıntılarla tasvir etmektedir.
Bu mevcut protokol, HSV-1 ve -2 için canlı plak oluşturan birimler (PFU) sayımlarını güvenilir bir şekilde elde eder. En iyi sonuçlar, düşük pasajda (pasaj numarası 155'in altında) Vero hücreleri (dönüştürülmüş Afrika yeşil maymun böbrek epitel hücreleri) kullanılarak elde edilir ve% 10 fetal buzağı serumu (FCS), L-alanil-L-glutamin ve bir antibiyotik / antimikotik karışım ile desteklenmiş alfa-MEM17'de rutin olarak yetiştirilir18. Vero hücreleri, bu ortamda haftada iki ila üç kez, her seferinde 1/5 seyreltmede standart olarak çoğaltılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vero hücreleri ve canlı herpes virüsleri ile ilgili tüm prosedürler Towson Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu prosedürlerin genelleştirilmiş bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Vero hücrelerinin tohumlanması
- Plak tahlilini başlatmadan bir gün önce, Vero hücrelerini tripsinize edin ve bunları normal Dulbecco'nun Modifiye Kartallar Ortamında (DMEM) yeniden askıya alın ve standart hücre kültürü metodolojisine göre takviye edin19. Tripsinize olmuş hücreleri, akan Vero hücrelerinin (~ 107 hücre) T-75 şişesi başına 10 mL DMEM'de yeniden askıya alın.
NOT: DMEM, alfa-MEM yerine plak tahlilleri için kullanılır, çünkü hücre büyüme hızını biraz yavaşlatır ve daha iyi plak testi sonuçlarını destekler. - Hücreleri tercih edilen yöntemle sayın (örneğin, Trypan Blue dışlamalı standart bir hemositometre)19.
- Hücreleri 4 x 106 hücre / plakada tohumlayın; HSV-2 için, kuyu başına 2,5 mL DMEM (takviyeli) içeren 6 kuyucuklu plakalar kullanın; ve HSV-1 için, kuyu başına 1.25 mL DMEM (takviyeli) içeren 12 delikli plakalar kullanın.
NOT: Kullanılan plakadan bağımsız olarak hücre sayısı sabit olmalıdır, ancak kuyucukların büyüklüğü plak tahlilindeki doğrulukla ilgilidir. Hücrelerin eşit olarak dağıtılması esastır, bu da plakayı dairesel bir şekilde değil, ileri geri hareket ettirerek en etkili şekilde gerçekleştirilebilir. - Hücrelerin nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca 37 °C / % 5 CO2'de büyümesine izin verin.
NOT: Nem, inkübatörün dibinde bir algisit içeren bir damıtılmış su tavası ile korunur.
2. Numune seyreltme
- Numune seyreltmesini ve hücrelere virüs eklenmesini tek bir laboratuvar oturumunda tamamlayın.
DİKKAT: HSV-1 ve -2 insanlar için bulaşıcıdır ve uygun biyogüvenlik koruması (BSL-2) altında ele alınmalıdır. Virüsle temas eden tüm malzemeleri ayrı tutun ve biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce 1/256 seyreltmede ( Malzeme Tablosuna bakınız), iyodofor, ağartıcı veya güçlü iyonik deterjan (örneğin, SDS) ile kuaterner bir ajanla dezenfekte edin. - Vero hücrelerinin tohumlanmasından sonraki gün, 1x PBS'de plaklanacak her virüs örneğini seri olarak seyreltin; en hassas izleme için genellikle 10 kat seyreltmeler kullanın.
- Bu seyreltmeleri 10-4 (düşük virüs konsantrasyonları için) veya 10-9 (daha yüksek titreli numunelerin beklentileri için) ile plak testinin kendisi için kalan her numuneden en az 1 mL ile yapın.
- Bu seyreltilmiş virüs örneklerini hücrelere eklemeye hazır olana kadar tüm viral seyreltmeleri buz üzerinde (1 saatten fazla değil) tutun.
3. Hücrelere virüs eklenmesi
- Hücre kültürü ortamını pipetle bir veya iki kuyucuktan çıkarın.
NOT: Aspiratör kullanmayın, çünkü tek katmanlı hücreden çok fazla sıvı alır ve hücreleri kurutur. Önemli bir husus, hücre tek katmanının deneyin tüm seyri boyunca sulu kalmasını sağlamaktır. Hücreler kurursa, son adımda plakayı yıkar ve kullanılamaz veriler üretirler. Bu nedenle, bu olasılığı azaltmak için bir seferde yalnızca bir veya iki kuyu işleyin. - Seyreltilmiş virüs örneğini (sırasıyla 6 kuyucuklu ve 12 delikli plakalar için sırasıyla 100-400 μL ve 50-200 μL virüs örneği kullanılır) her bir tek katmana damla damla ekleyin ve damlaları her bir kuyucuğun kenarına ekleyin. Tüm plaka plaklanan virüs örnekleriyle dolana kadar işlemi her bir veya iki kuyucuk için tekrarlayın.
NOT: Damlaları kuyunun merkezine eklemek, yanlışlıkla hücreleri substrattan çıkarabilir. - Virüsü içeren PBS'nin her bir kuyucuktaki tüm tek katmanlı hücreleri kapsadığından emin olmak için tüm plakayı elle hafifçe sallayın, ardından virüsün adsorbe girmesine izin vermek için plakayı 37 ° C'de bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.
- Her 10 dakikada bir, 1 saat içinde, plakayı inkübatörden çıkarın, virüsü her bir kuyucuğa daha eşit bir şekilde yaymak için yavaşça tekrar sallayın ve ardından inkübatöre geri yerleştirin.
NOT: Her deney, replika sayısını ve hangi seyreltmelerin kullanılacağını belirleyecektir; okuyucunun tercihi bu kararı belirler. - Emilmemiş inokulumu yanlışlıkla sayma olasılığını azaltmak için, virüs örneğini 1000 μL pipet uçlarıyla kuyucuklardan çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin.
NOT: Yine, bu prosedür, hücre monokatmanının hidrasyonunu korumak için bir seferde sadece bir veya iki kuyucukla gerçekleştirilir. - 2,5 mL'lik bir metilselüloz bindirmesi yerleştirin (100 mL PBS'de %5 metilselüloz w / w çözün, 121 ° C'de 15 dakika otoklav ve bir sıvı döngüsünde 15 psi, ardından 375 mL DMEM artı 25 mL FBS ekleyin).
- Tüm plaka bindirme içerdiğinde, iki gün boyunca büyümeye izin vermek için plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
NOT: Virüs ve hücrelerin DMEM artı takviyelerinde bile üç gün boyunca büyümesine izin verilirse, tek katmanda önemli miktarda hücre kaybına neden olabilir ve böylece nihai veriler tehlikeye girebilir. - Atık kabı, biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce, tipik olarak ağartıcı, iyodofor veya benzeri bir virüsit ilavesiyle dezenfekte edin.
4. Plaklar için boyama
- İki günlük inkübasyondan sonra, metilselüloz kaplamasını bir pipetle, yine bir seferde bir veya iki kuyucukla çıkarın ve bir atık kabına yerleştirin.
- Plakları lekelemek için her bir kuyucuğa% 50 etanol içinde ~2 mL% 1 kristal menekşe ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
NOT: Bindirmenin her damlasını kaldırmak gerekli değildir. - Plakayı, 37 ° C'de 30 dakika boyunca leke ile doldurulmuş tüm kuyucuklarla inkübe edin. Bu noktada, atık kabı adım 3.8'de yukarıdaki gibi dezenfekte edin.
- Akış temizlenene kadar plakaları musluk suyuyla kuvvetlice yıkayın.
NOT: Yumuşak bir su akışı yeterince kuvvetli değildir; Bir laboratuvar lavabo armatüründen tam basınç gereklidir. - Bu noktada, her seyreltme serisindeki plak sayısında yaklaşık 10 kat fark olduğundan emin olun.
- Plakaların gece boyunca baş aşağı kurumasına izin verin, bundan sonra bireysel plaklar sayılabilir.
5. Plakların sayılması ve virüs titresinin belirlenmesi
- Yaklaşımdan bağımsız olarak (aşağıdaki NOTA bakınız), plak sayısını seyreltme faktörü ile çarpın (örneğin; plaklar 10-4 kuyucuğunda sayılsaydı, plak sayısı 104 ile çarpılırdı).
NOT: 10-100 plak aralığında saymak yararlı olsa da5, 30-300 plaklı kuyuların sayılması biraz daha güvenilirdir ve tam log seyreltmeleri yerine yaklaşık 1/2 log seyreltmelerini dikkate alır. - Bu sayıyı inokulum hacmine bölün (yukarıdaki adım 3.2'de olduğu gibi) ve orijinal numunede HSV'nin en doğru titresini elde etmek için belirtilen aralıkta plakları olan tüm kuyucukların ortalamasını alın.
- Tablo 1'deki sahte verilerin kullanımını göz önünde bulundurarak 5.3.1 ile 5.3.5 arasındaki adımlardaki hesaplamaları gerçekleştirin.
- Sadece 30-300 plakalı kuyuları düşünün (adım 5.1). Bu nedenle, Tablo 1'de, 1, 2 ve 3 numaralı çoğaltmalar için yalnızca 10-5 sütununu kullanın.
- Verilen seyreltmedeki plak sayısını alın ve seyreltme faktörünün karşılığı ile çarpın. Bu nedenle, örnek 1'in 10-5 sütunu, 10-5 seyreltmede 81 plaktan 81 plakaya 105 kez gider.
- Daha sonra bu sayıyı, o kuyucuktaki hücrelere eklenen virüs seyreltmesinin hacmine (mL cinsinden) bölün. Tablo 1'deki HSV-1 ile ilgili verilerin 12 kuyucuklu bir plakadan geldiğini varsayarsak, 0,2 mL en uygun ölçüm olacaktır. Bu nedenle, adım 5.3.2'den itibaren hesaplama, 0,2 mL'ye bölünen 81 x 105 veya HSV-1'in 4,0 x 107 PFU / mL'si olur.
- Tüm yararlı veriler ve ortalamalar için bu işlemi tekrarlayın. Bu nedenle, hesaplamayı 10-5 sütunundaki tüm numuneler üzerinde 5.3.2-5.3.3'te yapın, aynı virüs örneğinden kaynaklandıklarını ve biyolojik replikasyonların en doğru titre ölçümünü elde etmek için yapıldığını varsayarsak. Tablo 1 durumunda, bu örnek için ortalama 4,0 x 107, 2,1 x 107 ve 2,6 x 107 PFU/mL nihai ortalama titre elde etmek için 2,9 x 107 ± 0,98 x 107 PFU/mL'dir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tablo 1'de en iyi sonuçları veren bir deneme gösterilmektedir. Tüm 10 kat seyreltmeler, plak sayılarında yaklaşık 10 kat azalmayı takip eder. Bu tür veriler, her üç kopya için de sayılabilir plak sayısının 10-4 aralığında düştüğü gerçek bir plak testi olan Şekil 2'de de görülebilir. Aynı şey, sayılabilir plak sayısının 10-3 seyreltmede olduğu en üst sıra olan Şekil 3'te de görülebilir.
Bununla birlikte, alt sıradaki Şekil 3, bir plak testi iyi yapılmadığında tamamen farklı bir sonuç göstermektedir. İlk olarak, herhangi bir seyreltmeden görülebilen çok az plak vardır; bu nedenle, veriler kullanılamaz. İkincisi, Vero hücrelerinin substrattan tamamen kalktığı tepenin etrafında görünür alanlar vardır, bu da hücrelerin süreçte kurumasına izin verdiğinin veya kuyunun o bölgesinde çok kuvvetli bir şekilde pipetlendiğinin kanıtıdır.
Tablo 2 ayrıca plak sayımlarında bir dizi potansiyel olarak anormal sonuç göstermektedir ve yol boyunca dikkatli olunması gerekmektedir. Not olarak, ne üst sıra ne de alt replika sırası, biri bir seyreltmeden diğerine geçerken plak sayımlarında düzenli olarak 10 kat fark yaratmaz; bu veriler, virüs seyreltme işlemi sırasında kullanıcı hatasını gösterir. Ayrıca, bir kullanıcının 15.000'den fazla plağı doğru bir şekilde sayması muhtemel değildir, bu nedenle bu verileri sorgulamak gerekir. Son olarak, replika 1, 10-6 seyreltmede, 30-300 aralığında bir plak sayısı olduğu not edilebilir; Bununla birlikte, bu kopyadaki verilerin geri kalanının zayıf doğası göz önüne alındığında, 42 plak sayısının doğru bir sayı olması muhtemel değildir. Bu nedenle, Tablo 2'deki tek inandırıcı veriler çoğaltma 2'dedir .
Şekil 4 , plak testi sırasında hücrelerin kuruması veya yanlış kullanılması ile ilgili aynı sorunları göstermektedir. Bununla birlikte, Şekil 4 kritik olarak zayıf Vero hücresi tohumlamasını göstermektedir; her kuyu daha koyu mor lekeler gösterir, bu da kuyu boyunca iyi yayılmamış hücrelerin göstergesidir ve kümeler halinde üst üste yığılmıştır.
Şekil 1: Genel plak tahlil şeması. BioRender.com tarafından Biorender şablonu "Viral Plak Tahlil Protokolü" nden uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: On iki kuyucuklu plakalarda HSV-1 için plak tahlili. Biyolojik replikasyonlar, HSV-1'in bir örneğinde Şekil 1'de belirtildiği gibi gerçekleştirildi. Bir HSV-1 örneğinin seri 10 kat seyreltmeleri (10-2 seyreltmeden başlayarak) Vero hücrelerine eklendi, inkübe edildi, daha sonra kristal menekşe ile boyandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: HSV-2 için altı kuyucuklu plakalarda plak testi. Biyolojik replikasyonlar, HSV-2'nin bir örneğinde Şekil 1'de belirtildiği gibi gerçekleştirilmiştir. Bir HSV-2 örneğinin seri 10 kat seyreltmeleri (10-2 seyreltmeden başlayarak) Vero hücrelerine eklendi, inkübe edildi, daha sonra kristal menekşe ile boyandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: On iki kuyucuklu plakalarda HSV-1 için plak tahlili. Biyolojik replikasyonlar, HSV-1'in bir örneğinde Şekil 1'de belirtildiği gibi gerçekleştirildi. Bir HSV-1 örneğinin seri 10 kat seyreltmeleri (10-2 seyreltmeden başlayarak) Vero hücrelerine eklendi, inkübe edildi, daha sonra kristal menekşe ile boyandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Seyreltme faktörü | ||||
| Çoğaltmak | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 5721 | 635 | 81 | 5 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5,519 | 521 | 53 | 1 |
Tablo 1: Başarılı bir tahlilden temsili plaket sayılır. Her biyolojik replikasyondan seri seyreltmeler yapıldı; Her seyreltme için temsili plak sayıları (10-3 seyreltmeden başlayarak) gösterilir.
| Seyreltme faktörü | ||||
| Çoğaltmak | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| 1 | 15225 | 635 | 450 | 42 |
| 2 | 4592 | 365 | 42 | 0 |
| 3 | 5519 | 5400 | 53 | 1 |
Tablo 2: Temsili plaket başarısız bir tahlilden sayılır. Her biyolojik replikasyondan seri seyreltmeler yapıldı; Her seyreltme için temsili plak sayıları (10-3 seyreltmeden başlayarak) gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plak tahlilleri neredeyse memeli hücre kültürünün kendisi kadar eski olsa da, her laboratuvarın bu temel tahlili yürütmek için kendi protokol setine sahip olduğu görülmektedir5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 . Bir plak testinin yayınlanmış her versiyonundaki talimatlar çok az farklılık gösterse de, bu el yazmalarının çok azı tutarlı sonuçlar elde etmede yer alan kritik nüansları aydınlatmaktadır.
Bu nedenle, bu protokolün bilimden daha fazla sanat olan bazı kısımları vardır. Vero hücreleri tahlil için kuyucuklara tohumlandığında, kuyu boyunca eşit olarak yayılmalıdır (Şekil 4). Sıvı transferini içeren tüm adımlar (örneğin, adım 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 4.1 ve 4.2), Vero hücresi tek katmanını sulu tutmak için dikkatlice yapılmalıdır (Şekil 3 ve Şekil 4). Ayrıca, kuyunun dibine herhangi bir pipetle dokunmamak da çok önemlidir, aksi takdirde hücreler kazınabilir ve nihai verileri daha da tehlikeye atabilir (Şekil 4).
Metilselüloz, viryonların tüm kuyu boyunca yayılmasını önlemek için bir kaplama malzemesi olarak avantajlı olsa da, alternatifler kullanılabilir. Örneğin, mikrokristalin selüloz21,22 veya karboksimetil selüloz21 kullanılabilir. Ne olursa olsun, metilselüloz, kullanımı en kolay ve en ucuz sıvı kaplama ortamlarından biridir. Protokolün boyama kısmı için farklı bir boya21 veya sabitleme çözeltisi (örneğin, paraformaldehit)21 de kullanılabilir (adım 4), ancak% 50 etanoldeki kristal menekşe, seçenekler arasında en kolay ve en ucuz olanıdır.
Bu tahlilleri yapmak açıkça basit olsa da, eğitim ve uygulama gerektirirler. Bu yöntemi öğrenmek için yeri doldurulamaz olmayan örnekleri kullanmaya değer, böylece en önemli zamanda tekniğe hakim olunur.
Plak tahlillerinin kendileri sadece iyi niyetli canlı viryonları saymak gerektiğinde kullanılmalıdır. Plaqueing, virüs parçacıklarını5,10 ölçmek için floresan mikroskobu23, ELISA24, enzimatik aktivite25,26 veya qPCR27 gibi daha yeni nicel yöntemlere kıyasla çok daha eski bir metodolojidir. Bununla birlikte, bu son yöntemler, tüm viryonların varlığını gösteren vekil veriler üretir, ancak canlı parçacıklarda büyük bir abartıya yol açabilir, çünkü kullanıcı gerçek viryonları değil, enfeksiyonun bir göstergesini ölçecektir. Floresan mikroskobu, bulaşıcı viryonları kaç hücrenin virüs tarafından eksprese edilen bir proteinin varlığını sergilediğine göre ölçer, ancak mutlaka eksiksiz, replikasyon yetkin viryonları tespit etmez. ELISA benzer şekilde, tamamen bulaşıcı bir virion olmadan var olabilecek virüs proteinlerinin varlığını tespit eder. Enzimatik aktivitenin tahlil edilmesi, bozulmamış bir viryonu düşündürürken, yalnızca tek bir aktif enzimin mevcut olduğunu ve bütün bir viryonun gerçek bulaşıcı doğasını yansıtmadığını gösterir. Ve qPCR, bir virüsün genomunun, bu genomun kusurlu olup olmadığına bakılmaksızın sadece kopyalarını ölçer. Canlı virüsleri ölçmek için bir plak testi ile karşılaştırılabilir tek yöntem, virion konsantrasyonunu belirlemek için hala Reed-Muench veya Spearman-Kärber yöntemleri29,30,31 aracılığıyla istatistiksel bir tahmin gerektiren bir son nokta seyreltme testidir28.
Plak tahlilleri viroloji boyunca kullanılan rutin bir yöntem olsa da, tercih edilen nicel tahlil olmadıkları özel durumlar vardır. Örneğin, plak tahlilleri konakçı hücrelerin bir substrata bağlanmasını gerektirir; enfeksiyon için en iyi konakçı hücre yapışık değilse, plaklar asla oluşmaz32. Bazı virüsler, konakçılarının tipik hücre döngüsünden daha yavaş büyür ve bu nedenle filizlenen plaklar, konakçı hücrelerin kendileri tarafından büyütür21. Plaklar bazen sitopatik etkinin doğası gereği iyi oluşmayabilir, bu da iyi niyetli plakların belirlenmesini bir sınırlama haline getirir21.
Burada sunulan herpes virüslerini rahatsız etme yaklaşımı mutlaka benzersiz değildir. Bununla birlikte, başarılı bir HSV plak testi ile ilişkili küçük uyarıların bu derinlemesine açıklaması, birçok kullanıcının, özellikle de acemilerin yaşadığı zorlukları azaltabilir. Ne olursa olsun, açıklanan metodoloji, picornavirüsler33, ortomiksovirüsler34, flavirüsler35, koronavirüsler36 ve ölçülebilir miktarda bulaşıcı hayvan virüsünün gerekli olduğu diğer birçok sistem dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere diğer birçok virüsle yapılan plak tahlilleri için de geniş ölçüde uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Laboratuvarlarımızdaki (PJD ve BJM) bu yöntemleri geliştiren yıllar boyunca bizimle birlikte çalışan sayısız öğrenciye teşekkür ederiz. Vesayeti altında bu metodolojinin ilk geliştirildiği Stan Person'a özel bir teşekkür. Bu çalışma kısmen Towson Üniversitesi Fisher Bilim ve Matematik Lisans Araştırma Destek Fonu ve NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264 tarafından desteklenmiştir. Bu içerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J. Fields Virology. Knipe, D. M., et al. 1, Wolters Kluwer-Lippincott Williams & Wilkins. 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of 'Right and Wrong Cases' (Constant Stimuli) without Gauss's formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -S. Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , Academic Press. (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 15 Unit 15H 11 (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
