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Bioengineering

मानव प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट के आधार पर हंटिंगटन के रोग मॉडल में माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड डायनेमिक्स विज़ुअलाइज़ेशन

Published: January 8, 2022 doi: 10.3791/62963
Automatic Translation
*1,2, *2,3, 1,2, 3,4, 3,4, 1,3
1A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, 4Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल प्राथमिक सेल संस्कृति में उनके गतिशील गुणों का अध्ययन करने के लिए ईबी 3 प्रोटीन ट्रांसफैक्शन द्वारा माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड विज़ुअलाइज़ेशन को समर्पित है। यह प्रोटोकॉल हंटिंगटन के रोग रोगियों से प्राप्त मानव प्राथमिक त्वचा फाइब्रोब्लास्ट पर लागू किया गया था ।

Abstract

समय-चूक वीडियो माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में रुचि के फ्लोरोसेंटली लेबल मार्कर प्रोटीन के साथ ट्रांसफैक्शन साइटोस्केलेटन के गतिशील गुणों का अध्ययन करने की एक क्लासिक विधि है। यह प्रोटोकॉल मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट ट्रांसफैक्शन के लिए एक तकनीक प्रदान करता है, जो प्राथमिक कोशिका खेती की स्थिति की बारीकियों के कारण मुश्किल हो सकता है। इसके अतिरिक्त, साइटोस्केलेटन गतिशील संपत्ति रखरखाव को माइक्रोट्यूबुल स्थिरीकरण के कारण बिना एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्राप्त करने के लिए ट्रांसफैक्शन के निम्न स्तर की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं को प्रकाश-प्रेरित तनाव और फ्लोरोसेंट डाई लुप्त होती से बचाने के उपाय करना महत्वपूर्ण है। हमारे काम के दौरान, हमने मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट अध्ययन के लिए उपयुक्त स्थितियों के सर्वोत्तम संयोजन का चयन करने के लिए विभिन्न ट्रांसफैक्शन विधियों और प्रोटोकॉल के साथ-साथ विभिन्न वैक्टर का परीक्षण किया। हमने इमेजजे का उपयोग करके परिणामी समय-चूक वीडियो का विश्लेषण किया और माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता की गणना की। विभिन्न सेल भागों में माइक्रोट्यूबुल्स के प्लस-सिरों की गतिशीलता समान नहीं है, इसलिए हमने विश्लेषण को उपसमूहों में विभाजित किया - सेंट्रोसोम क्षेत्र, लामेला, और फाइब्रोब्लास्ट की पूंछ। विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रोगी नमूनों में साइटोस्केलेटन गतिशीलता के इन विट्रो विश्लेषण के लिए किया जा सकता है, जिससे विभिन्न रोग विकास की गतिशीलता को समझने की दिशा में अगला कदम उठाया जा सकता है।

Introduction

हंटिंगटन रोग (एचडी) जीन एन्कोडिंगहंटिंगटिन प्रोटीन (एचटीटी) में म्यूटेशन के कारण एक लाइलाज न्यूरोडीजेनेरेटिव विकृति है। एचटीटी मुख्य रूप से वेसिकल्स और माइक्रोट्यूबुल्स से जुड़ा हुआ है और शायद माइक्रोट्यूबुल पर निर्भर परिवहन प्रक्रियाओं1,2में शामिल है। माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता पर उत्परिवर्ती एचटीटी के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, हमने ईबी 3 प्रोटीन के विट्रो विज़ुअलाइज़ेशन का उपयोग किया, जो बढ़ते प्लस-एंड्स को बाध्यकारी और स्थिर करके माइक्रोट्यूबल के गतिशील गुणों को नियंत्रित करता है। फ्लोरोसेंटी लेबल EB3 को मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में लोड करने के लिए, प्लाज्मिड ट्रांसफैक्शन लागू किया गया था। हमने इस अध्ययन के लिए एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति का उपयोग किया।

एचटीटी प्रोटीन जीन में उत्परिवर्तन से पॉलीग्लूटामाइन ट्रैक्ट 3 का विस्तारहोताहै । एचटीटी की ऐसी सेलुलर प्रक्रियाओं में भूमिका है जैसे एंडोसाइटोसिस4,सेल ट्रांसपोर्ट1,2,प्रोटीन क्षुण्णता5,आदि। इन प्रक्रियाओं के पर्याप्त हिस्से में माइक्रोट्यूबल सहित सेल साइटोस्केलेटन के विभिन्न तत्व शामिल हैं।

मानव प्राथमिक कोशिकाओं के रूप में बारीकी से संभव के रूप में रोगी कोशिकाओं में होने वाली घटनाओं को पुन: पेश करने के लिए सबसे अच्छा मॉडल हैं । इस तरह के मॉडल बनाने के लिए, किसी को मानव बायोप्सी सामग्री (उदाहरण के लिए, सर्जिकल नमूनों से) से कोशिकाओं को अलग करने की आवश्यकता है। परिणामस्वरूप प्राथमिक कोशिका रेखा विभिन्न आनुवंशिक, जैव रासायनिक, आणविक, और सेल जीव विज्ञान विधियों का उपयोग कर रोगजनन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, मानव प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां विभिन्न ट्रांसफरेंट और ट्रांसजेनिक संस्कृतियों को बनाने के लिए एक अग्रदूत के रूप में काम करती हैं6।

हालांकि, अमर कोशिका संस्कृतियों के विपरीत, प्राथमिक कोशिकाओं का महत्वपूर्ण नुकसान उनकी सीमित मार्ग क्षमता है। इसलिए, हम प्रारंभिक मार्ग चरण (15 तक) में कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं। पुरानी संस्कृतियां बहुत जल्दी पतित होती हैं, जिससे उनके अद्वितीय गुण ों का नुकसान होता है। इस प्रकार, नई प्राप्त प्राथमिक कोशिकाओं को दीर्घकालिक भंडारण के लिए जमे हुए रखा जाना चाहिए।

प्राथमिक कोशिका संस्कृतियां खेती की स्थिति के लिए अतिसंवेदनशील होती हैं। इसलिए, उन्हें अक्सर बढ़ती स्थितियों के अद्वितीय दृष्टिकोण और अनुकूलन की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, हमारे प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले मानव त्वचा प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट सब्सट्रेट पर मांग कर रहे हैं। इसलिए, हमने प्रयोग प्रकार के आधार पर विभिन्न अतिरिक्त कोटिंग्स (जैसे, जिलेटिन या फाइब्रोनेक्टिन) का उपयोग किया।

सेल साइटोस्केलेटन सेल आकार, गतिशीलता और लोकोमोशन निर्धारित करता है। साइटोस्केलेटन की गतिशीलता इंटरफेज और माइटोसिस दोनों में कई इंट्रासेलुलर प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से, ट्यूबुलिन से पॉलीमराइज्ड साइटोस्केलेटन अत्यधिक गतिशील और ध्रुवीय संरचनाएं हैं, जो मोटर प्रोटीन-मध्यस्थता निर्देशित इंट्रासेलुलर परिवहन को सक्षम करती हैं। माइक्रोट्यूबुल्स के सिरों को निरंतर पुनर्व्यवस्था में रखा जाता है, उनके विधानसभा चरण अलग-अलग चरणों के साथ वैकल्पिक होते हैं, और इस व्यवहार को "गतिशील अस्थिरता"7,8, 9कहाजाताहै। विभिन्न संबद्ध प्रोटीन बहुलीकरण प्रतिक्रिया के संतुलन को स्थानांतरित करते हैं, जिससे या तो बहुलक गठन या प्रोटीन मोनोमर गठन होता है। ट्यूबलिन सबयूनिट का जोड़ मुख्य रूप से माइक्रोट्यूबुल्स10के प्लस-एंड पर होता है। अंत बाध्यकारी (ईबी) प्रोटीन परिवार में तीन सदस्य होते हैं: EB1, EB2, और EB3। वे प्लस-एंड-ट्रैकिंग प्रोटीन (+ टीआईपी) के रूप में काम करते हैं और माइक्रोट्यूबल्स के गतिशील गुणों को बाध्यकारी और उनके बढ़ते प्लस-एंड्स11को स्थिर करके विनियमित करते हैं।

कई अध्ययनों में फ्लोरोसेंट अणु-लेबल ट्यूबुलिन माइक्रोइंजेक्शन या टाइम-लैप्स इमेजिंग और वीडियो विश्लेषण के साथ ट्रांसफैक्शन का उपयोग किया जाता है ताकि विट्रो मेंमाइक्रोट्यूबुल्स की कल्पना की जा सके। ये विधियां आक्रामक और कोशिकाओं, विशेष रूप से प्राथमिक मानव कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकती हैं। सबसे चुनौतीपूर्ण कदम सेल ट्रांसफैक्शन के लिए शर्तों को ढूंढना है। हमने व्यवहार्यता और देशी सेल आकृति विज्ञान को प्रभावित किए बिना ट्रांसफैक्शन के उच्चतम संभव स्तर तक पहुंचने की कोशिश की। यह अध्ययन स्वस्थ दाताओं और हंटिंगटन रोग के रोगियों की त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में माइक्रोट्यूबुल गतिशीलता में अंतर का अध्ययन करने के लिए शास्त्रीय विधि लागू करता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल संघीय चिकित्सा जैविक एजेंसी के संघीय अनुसंधान और नैदानिक केंद्र ऑफ फिजिकल-केमिकल मेडिसिन के दिशा-निर्देशों का पालन करता है जो 08 सितंबर, 2015 को है।

नोट: चित्रा 1 प्रोटोकॉल का अवलोकन देता है।

1. मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट की एक प्राथमिक संस्कृति प्राप्त करना(चित्रा 2)

  1. दुल्बेको के संशोधित ईगल मीडिया (डीएमईएम) माध्यम में कुछ घंटों के भीतर बायोप्सी को पेनिसिलिन के ५० μg/mL और स्ट्रेप्टोमाइसिन के ५० यू/एमएल के साथ पूरक में कुछ घंटों के भीतर एक प्रयोगशाला में वितरित करें ।
    नोट: एक त्वचा बायोप्सी एक चिकित्सक द्वारा बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए के बाद एक मरीज को एक सूचित सहमति संकेत ।
  2. बायोप्सी टिश्यू को 6 सेमी पेट्री डिश में थोड़ी मात्रा में मीडियम के साथ रखें।
  3. बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, बायोप्सी नमूने को आकार में लगभग 0.5-1 मिमी के टुकड़ों में काट लें। 1-2 प्राप्त टुकड़ों को 3.5 सेमी पेट्री डिश में रखें और बायोप्सी टुकड़ों पर एक बाँझ कवरलिप रखें। धीरे-धीरे निम्नलिखित संरचना में एक विकास माध्यम के 1.5 एमएल जोड़ें: डीएमईएम, 50 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस)।
  4. एक सीओ2 इनक्यूबेटर के अंदर विकास माध्यम में संस्कृति फाइब्रोब्लास्ट 5% सीओ2, 37डिग्री सेल्सियस, 80% आर्द्रता पर बनाए रखा।
    नोट: 4-7 दिनों के बाद, पहले केराटिनोसाइट्स, फिर फाइब्रोब्लास्ट, ऊतक से पकवान के नीचे तक स्थानांतरित होना शुरू कर दें।

2. प्राथमिक संस्कृति का भंडारण, ठंड और अनफ्रीजिंग

  1. संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को हटा दें (अंक 3.2-3.4 देखें)।
  2. सेल सस्पेंशन को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें और 200 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेंट्रलाइज करें। फिर सुपरनेट को त्यागें और कूल्ड एफबीएस के 900 माइक्रोन में सेल पेलेट को फिर से रीसस्ट करें।
  3. ड्रॉप करके क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब ड्रॉप में स्थानांतरित करें और डिमेथिल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  4. क्रायोप्रोब को कम तापमान वाले फ्रीजर में -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। चौबीस घंटे बाद, क्रायोवियल को दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन (−196 डिग्री सेल्सियस) में स्थानांतरित करें।
  5. क्रायोप्रेवरीडेड कोशिकाओं को डिफ्रॉस्ट करने के लिए, नाइट्रोजन भंडारण से क्रायोवियल को हटा दें और, 1 मिनट के भीतर, सामग्री के 1 एमएल को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें परिवहन माध्यम के 9 एमएल 37 डिग्री सेल्सियस से पहले से गरम होते हैं।
  6. ध्यान से रीसुस्पेंड और फिर 200 x gपर 5 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र। सुपरनैंट को त्यागें, विकास माध्यम की आवश्यक मात्रा में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें और उन्हें आवश्यक व्यास के पेट्री डिश पर रखें।

3. सेल की खेती

  1. डिश बॉटम को आसुत पानी में तैयार ऑटोक्लेवेड 0.1% जिलेटिन समाधान के साथ कवर करें। 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
    नोट: ट्रांसफेक्शन विज़ुअलाइज़ेशन के लिए, ग्लास-बॉटम प्लेट व्यंजन (ग्लास मोटाई 170 माइक्रोन के साथ कॉन्फोकल व्यंजन) का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. निम्नलिखित संरचना वाले एक संस्कृति माध्यम तैयार करें: डीएमईएम 10% एफबीएस, 2 एम एल-एल-एल-एल-ग्लूटामाइन, 50 यू/एमएल पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है। अच्छी तरह मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कोशिकाओं को जोड़ने से पहले मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  3. माइक्रोस्कोप के नीचे संस्कृति का आकलन करें। मीडियम निकालें और दुलबेको के फॉस्फेट-सॉल्ट सॉल्यूशन (डीपीबीएस) से फाइब्रोब्लास्ट धोएं।
  4. कोशिकाओं के लिए पूर्व-गर्म 0.25% ट्राइप्सिन समाधान का 1 मिलियन जोड़ें। माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें यदि वे सब्सट्रेट से पूरी तरह से अलग हो जाते हैं। संस्कृति माध्यम के 1 एमसीएल के साथ ट्राइपसिन को निष्क्रिय करें।
  5. सेल निलंबन को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें, सुपरनैंट को हटा दें, और संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
  6. कोशिकाओं की संख्या गिनें। कोशिकाओं की आवश्यक संख्या की गणना करने के लिए उन्हें 8-15 x 103/सेमी2 के घनत्व के साथ बीज और संस्कृति माध्यम के 2 एमएल में resuspend ।
  7. कल्चर डिश से जिलेटिन का घोल निकालें और तुरंत सेल सस्पेंशन के 2 एमएल डालें। सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर फाइब्रोब्लास्ट की खेती करें।
  8. हर 2-4 दिन में मीडियम को रिफ्रेश करें।
    नोट: प्रयोगों के लिए, 4-11 अंशों की कोशिकाओं का उपयोग करें ।

4. ट्रांसफैक्शन

  1. ट्रांसफेक्शन से पहले कल्चर मीडियम को फ्रेश कल्चर मीडियम 24 घंटे से बदलें।
    नोट: सेल संगम 70-80% होना चाहिए।
  2. कोशिका सीडिंग के क्षेत्र और घनत्व के आधार पर डीएनए-लिपिड परिसर तैयार करें। लिपोसोम बेस्ड ट्रांसफैक्शन एजेंट का इस्तेमाल करें।
    नोट: 1 x 104 कोशिकाओं/
  3. ट्यूब की दीवारों को छुए बिना, किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं से युक्त नहीं, इष्टतम न्यूनतम आवश्यक माध्यम (ऑप्टी-एमईएम) के 125 माइक्रोन में वाणिज्यिक ट्रांसफैक्शन रीएजेंट के 3 माइक्रोन जोड़ें। धीरे-धीरे रीसस्लपेंड करें।
  4. ऑप्टी-एमईएम के 125 माइक्रोन में प्लाज्मिड डीएनए के 1 माइक्रोग्राम जोड़कर पतला प्लास्मिड डीएनए (जीएफपी-ईबी 3)। धीरे-धीरे रीसस्लपेंड करें।
    नोट: अभिव्यक्ति वेक्टर encoding GFP-EB3 11 डॉ ए Akhmanova (इरासमस विश्वविद्यालय, रॉटरडैम)11 से अनुमति के साथ डॉ I Kaverina (Vanderbilt विश्वविद्यालय, नैशविले) से एकतरहका उपहार के रूप में प्राप्त किया गया था ।
  5. पतला ट्रांसफैक्शन रिएजेंट (1:1) की प्रत्येक ट्यूब में पतला प्लाज्मिड डीएनए जोड़ें। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट ।
  6. कोशिकाओं युक्त 6 सेमी पेट्री डिश में डीएनए-लिपिड कॉम्प्लेक्स जोड़ें और 30 एस के लिए क्रूसिफॉर्म स्विंग के साथ मिलाएं। 24 घंटे के लिए एक ट्रांसफैक्शन एजेंट के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं और फिर ताजा माध्यम में बदल जाते हैं । 24 घंटे और 48 घंटे के बाद ट्रांसफैक्शन की दक्षता का विश्लेषण करें।
    नोट: ट्रांसफैक्शन के बाद 24 घंटे, दक्षता 10-15% थी, और 48 घंटे के बाद 40% तक।

5. इमेजिंग के लिए तैयारी

  1. कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग से पहले, ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करने के लिए पीएच-इंडिकेटर डाई के बिना संस्कृति माध्यम को एक माध्यम में बदलें।
  2. मध्यम को पूरी तरह से कवर करने के लिए खनिज तेल को मध्यम सतह पर सावधानीपूर्वक लागू करें, इसे बाहरी वातावरण से अलग करें ताकि ओ2 प्रवेश और मध्यम वाष्पीकरण को कम किया जा सके।
  3. छवियों को लेने के लिए एक उच्च अंक एपर्चर के साथ एक पारा दीपक और तेल विसर्जन 60x या 100x उद्देश्य लेंस का प्रयोग करें।
    नोट: वीवो टिप्पणियों में, माइक्रोस्कोप को कोशिकाओं के लिए आवश्यक शर्तों को बनाए रखने के लिए एक इनक्यूबेटर से सुसज्जित किया जाना चाहिए, जिसमें ऑब्जेक्ट टेबल और लेंस को +37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना, सीओ2 आपूर्ति के साथ एक बंद कक्ष और आर्द्रता स्तर का समर्थन शामिल है। आर्द्रता पैदा करने के लिए डबल डिस्टिल्ड पानी का उपयोग करें। फिल्मांकन से पहले डबल डिस्टिल्ड पानी के स्तर की जांच करें।
  4. इमेजिंग से पहले माइक्रोस्कोप होल्डर में कोशिकाओं के साथ कॉन्फोकल डिश रखें। सुनिश्चित करें कि पकवान और कैमरा सुरक्षित रूप से धारक से जुड़े हुए हैं ताकि छवियां लेते समय बहती से बचा जा सके।

6. इमेजिंग पैरामीटर सेट करना

  1. कम एक्सपोजर मान चुनें क्योंकि प्रकाश सेल-हानिकारक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को प्रेरित करता है।
    नोट: मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में माइक्रोट्यूबुल्स की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, एक 300 एमएस एक्सपोजर का चयन किया गया था।
  2. ब्याज के उद्देश्य पर ध्यान दें।
    नोट: दीर्घकालिक समय-चूक इमेजिंग के लिए, जेड-एक्सिस के साथ संभावित बदलाव की भरपाई के लिए स्वचालित फोकस स्थिरीकरण प्रणाली का उपयोग करें।
  3. कोशिकाओं की फोटोसेंसिटिविटी और फ्लोरोक्रोम लुप्त होती की दर के आधार पर इष्टतम इमेजिंग स्थितियों का चयन करें।
    नोट: चूंकि माइक्रोट्यूबुल अत्यधिक गतिशील संरचनाएं हैं, इसलिए काफी कम समय अंतराल का चयन किया जा सकता है, और फ्रेम दर पर्याप्त रूप से अधिक होनी चाहिए। त्वचा फाइब्रोब्लास्ट में माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता की जांच करने के लिए, हम 3-5 मिनट के लिए 1 फ्रेम/एस की आवृत्ति पर इस्तेमाल किया ।
  4. छवि प्राप्त करने के लिए अगले ऑब्जेक्ट का चयन करते समय, पहले से ही चित्रित क्षेत्र से दूर चले जाएं। चूंकि यह क्षेत्र प्रकाश के प्रभाव में था, इसलिए ध्यान देने योग्य फोटो-ब्लीचिंग होगी।
    नोट: चूंकि अपेक्षाकृत उच्च इमेजिंग आवृत्ति का उपयोग किया गया था, इसलिए शटर छवियों के बीच बंद नहीं हुआ, और लैंप इमेजिंग की पूरी अवधि के लिए जलाया गया था, यही कारण है कि लुप्त होती बढ़ गई।
  5. माइक्रोट्यूबुल्स की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इष्टतम वीडियो चुनें, ट्रांसफेक्शन की गुणवत्ता, माइक्रोट्यूबुल्स की छवियों की गुणवत्ता (इष्टतम सिग्नल-टू-शोर अनुपात) को ध्यान में रखते हुए, और विश्लेषण सेल(चित्रा 3)के मामले में बहती अनुपस्थिति।
  6. इमेजजे या फिजी कार्यक्रम(चित्र 4)में उन्हें ट्रेस करके माइक्रोट्यूबुल्स के प्लस-एंड्स गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए चयनित वीडियो का उपयोग करें।
    नोट: मात्रात्मक विश्लेषण निर्देशों के लिए अनुपूरक चित्रा 2 और अनुपूरक फाइल 1देखें ।

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Representative Results

परिणामस्वरूप GFP-EB3 फिल्में प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का उपयोग करके उत्पादित माइक्रोट्यूबल्स के गतिशील गुणों को दर्शाती हैं। माइक्रोट्यूबुल विभिन्न कोशिका प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं, और उनके गतिशील गुण रोगियों की बायोप्सी सामग्री(चित्रा 2)से प्राथमिक मानव कोशिका संस्कृति की विभिन्न जीवन विशेषताओं को प्रभावित करते हैं।

निम्नलिखित पैरामीटर माइक्रोट्यूबुल्स की गतिशील अस्थिरता का निर्धारण करते हैं: विकास की दरें (बहुलीकरण) और सिकुड़ती (अप्लीमीकरण); आपदाओं की आवृत्ति (बहुलीकरण से अपोर्मीकरण तक संक्रमण); बचाव की आवृत्ति (अपोलिमरीकरण से बहुलीकरण तक संक्रमण); के रूप में अच्छी तरह से ठहराव - राज्यों जब माइक्रोट्यूबुल पॉलीमराइज नहीं करता है और 12depolymerize नहीं करता है . सभी मापदंडों को कसकर विनियमित किया जाता है, और अलग - अलग-अलग माइक्रोट्यूबुल्स के पॉलीमराइजेशन और डीपॉलिमराइजेशन की दरें समान और विभिन्न सेल दोनों प्रकार13,14, 15,16,17दोनों में काफी भिन्न हो सकती हैं।

विश्लेषण के लिए विचार करना आवश्यक है कि माइक्रोट्यूबुल्स में कोशिका में उनकी स्थिति के आधार पर अलग-अलग गतिशीलता हो सकती है। नाभिक और सेंट्रोसोम के क्षेत्र में स्थित माइक्रोट्यूबुल्स कोशिका परिधि19की तुलना में अलग व्यवहार करते हैं । इसलिए, एक विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमने कोशिका के तीन अलग-अलग क्षेत्रों में माइक्रोट्यूबुल्स के गतिशील माप बनाए: केंद्रीय भाग, अग्रणी किनारा, और पूंछ काहिस्सा (चित्र 3)। विभिन्न कोशिका भागों में जीएफपी-ईबी 3 लेबल के सही वितरण को नियंत्रित करने के लिए, हमने मानव फेफड़े की धमनी एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचपीएईसी)(अनुपूरक चित्रा 1 देखें) काउपयोग किया।

इमेजजे या फिजी (इमेजजे 2 वी 1. 53i) जैसे विशेष कार्यक्रम, निम्नलिखित मापदंडों द्वारा वीडियो के विश्लेषण की अनुमति देते हैं: (1) माइक्रोट्यूबल्स के विकास की दर; (2) आपदाओं की आवृत्ति; (3) बचाव की आवृत्ति; (4) ठहराव की आवृत्ति; और (5) ठहराव की अवधि। इसके अलावा, अद्वितीय कार्यक्रम विकल्प और प्लगइन्स स्वचालित रूप से18 या मैन्युअल रूप से19 (चित्र 4)ट्रेसिंग की अनुमति देते हैं। मैनुअल ट्रेसिंग विधि ने हमारे प्रयोगों में बेहतर काम किया क्योंकि स्वचालित माप बड़ी त्रुटियों से ग्रस्त हैं और अधिक सटीक परिणाम के लिए अधिक पुनरावृत्ति की आवश्यकता होती है। माइक्रोट्यूबुल्स डायनामिक्स डेटा विश्लेषण पर विस्तृत निर्देश अनुपूरक चित्रा 2 और अनुपूरक फाइल 1में पाया जा सकता है ।

इमेजिंग पैरामीटर इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान समायोजन की आवश्यकता हो सकती है। उदाहरण के लिए, एक सेल इमेजिंग की अवधि और एक्सपोजर मानों को बदला जा सकता है। यदि तेजी से सिग्नल बर्नआउट होता है, या सेल सिकुड़ता है(चित्र 5)।

Figure 1
चित्रा 1:मानव त्वचा प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति के लिए जीएफपी-EB3 ट्रांसफैक्शन प्रोटोकॉल की सामान्य योजना। प्रोटोकॉल में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: ट्राइप्सिन समाधान द्वारा कोशिकाओं की टुकड़ी; मध्यम जोड़ द्वारा ट्राइप्सिन निष्क्रियता; परिणामस्वरूप यौगिक का अपकेंद्रित्र; कोशिका एकाग्रता की गणना; जिलेटिन के साथ लेपित ग्लास बॉटम डिश (कॉन्फोकल डिश) के लिए सेल सीडिंग; सेल कल्चर ट्रांसफेक्शन द्वारा प्लाज्मिड डीएनए (जीएफपी-ईबी 3 के साथ) लिपोसोमल ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के साथ; इनक्यूबेशन 24-48 घंटे; और एक माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:मानव त्वचा फाइब्रोब्लास्ट प्राथमिक संस्कृति तैयारी योजना। एक रोगी द्वारा सूचित सहमति पर हस्ताक्षर करने के बाद एक चिकित्सक द्वारा बाँझ परिस्थितियों में एक त्वचा बायोप्सी किया जाना चाहिए। फिर ऊतक का एक टुकड़ा एक पेट्री डिश में प्रयोगशाला के लिए FBS के बिना माध्यम की एक छोटी राशि में ले जाया जाता है । ऊतक का एक बड़ा टुकड़ा आकार में 0.5-1 मिमी के टुकड़ों में काट दिया जाता है, और वे एफबीएस के साथ माध्यम के अलावा के साथ एक कवर ग्लास के साथ कवर कर रहे हैं । फिर पेट्री डिश को सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखाजाता है, जहां 4-7 दिनों के बाद फाइब्रोब्लास्ट टिश्यू के टुकड़े से ग्लास बॉटम में माइग्रेट हो जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त संक्रमित मानव फाइब्रोब्लास्ट के विभिन्न क्षेत्रों में जीएफपी-ईबी3 मार्कर (हरा): अग्रणी बढ़त (शीर्ष पैनल); पूंछ (मध्य पैनल); फाइब्रोब्लास्ट का केंद्रीय भाग (सेंट्रोसोम के चारों ओर क्षेत्र) (नीचे पैनल)। स्केल बार = 10 माइक्रोन। इमेजिंग फ्रीक्वेंसी 1 फ्रेम/एस है । वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:ImageJ प्लगइन एमट्रैकजे द्वारा जीएफपी-ईबी3 मैनुअल ट्रैकिंग। माइक्रोट्यूबुल्स के विकास को दर्शाती पटरियों को इमेजिंग के 20 एस के दौरान प्लस-एंड्स पर जीएफपी-ईबी3 लेबल टिप्स के फ्रेम-बाय-फ्रेम मैनुअल मार्किंग के परिणामस्वरूप प्राप्त किया गया था। एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त ट्रांस संक्रमित सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट। इमेजिंग फ्रीक्वेंसी 1 फ्रेम/एस है । वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5:जीएफपी-ईबी3 लेबल माइक्रोट्यूबुल्स प्लस-एंड्स की इमेजिंग के दौरान समस्या निवारण। (ए)फ्लोरोसेंट-लेबल वाले माइक्रोट्यूबल्स फोकसिंग सिस्टम की अनुपस्थिति के कारण फोकस से बाहर हैं । (ख)माइक्रोट्यूबुल्स को स्थिर किया जाता है और ट्रांसफेक्टिंग मिश्रण के साथ लंबे इनक्यूबेशन के कारण कोशिका में जीएफपी-ईबी3 के अतिव्यक्तता के कारण उनके गतिशील गुणों को खो दिया जाता है। (ग)आरओएस की रिहाई के कारण फोटोटॉक्सीसिटी के परिणामस्वरूप सेल लैमेला का सिकुड़ना । (घ)इमेजिंग के दौरान सिग्नल की तीव्रता गिर जाती है - रैपिड फोटोब्लैचिंग। एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त ट्रांस संक्रमित सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट। इमेजिंग फ्रीक्वेंसी 1 फ्रेम प्रति सेकंड है। वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा 1: बढ़ते माइक्रोट्यूबुल प्लस-एंड्स का चयनात्मक दृश्य। प्रमुख किनारे, पूंछ और मध्य क्षेत्र (सेंट्रोसोम के आसपास का क्षेत्र) में संक्रमित मानव एंडोथेलियल सेल (एचपीएईसी की संस्कृति: मानव फेफड़े की धमनी एंडोथेलियल सेल) के विभिन्न क्षेत्रों में जीएफपी-ईबी3 मार्कर (हरा) । स्केल सलाखों 10 μm। इमेजिंग फ्रीक्वेंसी 1 फ्रेम/एस वाइड-फील्ड फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी है । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा 2: इमेजजे प्लगइन एमट्रैकजे का उपयोग करके मैनुअल ट्रैकिंग के बाद जीएफपी-ईबी 3 लेबल द्वारा माइक्रोट्यूबुले गतिशीलता विश्लेषण। (A,B) एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी (व्यक्तिगत रूप से रंगीन) से प्राप्त संक्रमित सुसंस्कृत फाइब्रोब्लास्ट की समय-चूक श्रृंखला पर EB3-GFP पैच विस्थापन द्वारा प्राप्त EB3 पटरियों। (A)EB3 ट्रैक (बैंगनी, No46) EB3-GFP पैच विस्थापन द्वारा प्राप्त 18 सेकंड के दौरान । (ख)EB3 ट्रैक (लाल, No37) EB3-GFP पैच विस्थापन द्वारा 9 सेकंड के दौरान प्राप्त की । (ग)मानव एचडी रोगियों की त्वचा फाइब्रोब्लास्ट(ए)के माइक्रोट्यूब्यूल के प्लस-एंड्स विस्थापन का परिमाणीकरण । (घ)में दिखाए गए माइक्रोट्यूबल्स के प्लस-एंड्स विस्थापन का परिमाणीकरण(बी)। ग्राफ से पता चलता है कि 6-8 सेकंड के बीच माइक्रोट्यूबुल (प्लस-एंड का कोई मूवमेंट नहीं है) के विकास में ठहराव होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1: ईबी 3-जीएफपी लेबल माइक्रोट्यूबल्स के प्लस-एंड्स की गतिशीलता का मात्रात्मक विश्लेषण। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

माइक्रोट्यूबुल्स की गतिशीलता विश्लेषण के लिए बेहतर गुणवत्ता परिणाम उच्च गुणवत्ता वाले सूक्ष्म छवियों से प्राप्त किए जा सकते हैं। जीवित कोशिकाओं के समय-चूक इमेजिंग के लिए सभी आवश्यक शर्तों का पालन करना और इमेजिंग मापदंडों को सही ढंग से समायोजित करना महत्वपूर्ण है। ग्लास बॉटम (कॉन्फोकल व्यंजन) के साथ विशेष सेल संस्कृति व्यंजनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि ग्लास में प्लास्टिक की तुलना में प्रकाश का एक अलग अपवर्तक सूचकांक है। कांच की मोटाई और इसके पूरे क्षेत्र में इसकी एकरूपता भी अत्यंत महत्वपूर्ण है, क्योंकि ये पैरामीटर सामान्य नमूना ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन मापदंडों का उल्लंघन अनिवार्य रूप से सही फोकस सिस्टम की विफलता की ओर जाता है जिसके परिणामस्वरूप ध्यान केंद्रित करना खराब हो जाता है जिससे विश्लेषण के लिए इस तरह के आउट-ऑफ-फोकस वीडियो(चित्रा 5A)का उपयोग करना असंभव हो जाता है। लाइव सेल इमेजिंग के लिए एक और महत्वपूर्ण शर्त ROS से उनकी सुरक्षा है । विभिन्न अभिकर् ता का उपयोग ऐसेउद्देश्योंके लिए किया जा सकता है . अपने काम में हम मिनरल ऑयल का इस्तेमाल करते हैं, जो कल्चर मीडियम को वातावरण से पूरी तरह अलग करता है और गैस एक्सचेंज को रोकता है । इसी तरह, आरओएस को कम करने वाले ऑक्सीरेस का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह एंजाइम सभी प्रकार के सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त नहीं है और अधिक बार बढ़े हुए समय के साथ इमेजिंग पर लागू होता है।

ट्रांसफैक्शन (24 या 48 एच) के बाद कोशिकाओं के इष्टतम इनक्यूबेशन समय का चयन करते समय, संक्रमित कोशिकाओं की संख्या पर ध्यान दिया जाना चाहिए। लेबल प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की अधिकतम संख्या से छोटी संख्या पहले से ही विश्लेषण के लिए पर्याप्त है । अतिउपकरण की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए क्योंकि ऐसे मामलों में माइक्रोट्यूबुल्स स्थिर हो जाते हैं और उनके गतिशील गुणों का विश्लेषण नहीं किया जा सकता है(चित्रा 5B)।

कुछ मामलों में, वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू होने के बाद कोशिकाओं की प्रतिक्रिया के अनुसार इमेजिंग मापदंडों को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। उदाहरण के लिए, प्रकाश (फोटोटॉक्सीसिटी)(चित्रा 5C)के प्रति उच्च संवेदनशीलता के कारण सेल लैमेला सिकुड़ने का निरीक्षण करना संभव है। उत्साहित होने पर, फ्लोरोसेंट अणु आमतौर पर आणविक ऑक्सीजन के साथ मुक्त कण बनाने के लिए प्रतिक्रिया करते हैं जो कोशिका घटकों को नुकसान पहुंचा सकते हैं21। प्रयोगों को डिजाइन करते समय, शॉर्ट-वेव रोशनी के तहत सेल क्षति को कम करने के लिए अधिकतम संभव उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के साथ फ्लोरोफोरस का चयन किया जाना चाहिए। इसके अलावा, ऐसी रिपोर्टें हैं कि राइबोफ्लेविन विटामिन और ट्राइप्टोफहान अमीनो एसिड सहित मानक संस्कृति मीडिया के कुछ घटक भी सुसंस्कृत कोशिकाओं पर प्रकाश के प्रतिकूल प्रभावों में योगदान दे सकते हैं22। अन्य बातों के अलावा, यह एक सेल में फ्लोरोसेंट लेबल की अत्यधिक मात्रा के कारण हो सकता है। इन मामलों में, रिकॉर्डिंग की अवधि और रोशनी की तीव्रता को कम करना आवश्यक हो जाता है। एक और संभावित समस्या भी तेजी से फोटोब्लैचिंग हो सकती है - रिकॉर्डिंग(चित्रा 5डी)के दौरान सिग्नल की तीव्रता कम हो सकती है। एक ही प्रयोगात्मक पकवान पर अगली वस्तु का चयन करते समय इस प्रभाव को ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि इमेज्ड क्षेत्र के आसपास पड़ोसी कोशिकाओं को भी जला दिया जाता है।

यह उल्लेख किया जाना चाहिए कि जीवित कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबुले विज़ुअलाइज़ेशन के अन्य तरीके हैं जैसे फ्लोरोसेंट-लेबल वाले ट्यूबुलिन को वायरस का उपयोग करके कोशिका या कोशिका ट्रांसडक्शन में माइक्रोइंजेक्शन। किसी भी अन्य विधि के साथ, ट्रांसफैक्शन विधि के फायदे और नुकसान हैं। हालांकि, हमारे दृष्टिकोण से, इंजेक्शन विधि की तुलना में, ट्रांसफैक्शन अधिक प्रभावी है और कोशिकाओं में अभिव्यक्ति वैक्टर के बड़े पैमाने पर समावेश को प्राप्त करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में फ्लोरोसेंट कोशिकाएं होती हैं। इसके अलावा, ट्रांसफेक्शन विधि शोधकर्ता से विशेष उपकरण और कौशल की आवश्यकता नहीं है। वायरल ट्रांसडक्शन की विधि अच्छे परिणाम दिखाती है और इसे लागू किया जा सकता है। फिर भी, यह सभी सेल संस्कृतियों के लिए उपयुक्त नहीं है (विशेष रूप से, यह मानव फाइब्रोब्लास्ट के लिए कम उपयुक्त है, एचडी रोगियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त किया जाता है)।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम पर्याप्त प्रोटीन अभिव्यक्ति सुनिश्चित करने के लिए किया गया ट्रांसफैक्शन है। एक अच्छा सिग्नल-टू-शोर अनुपात, माइक्रोट्यूबल्स का कोई फोटोब्लेचिंग नहीं, और समय-चूक वीडियो रिकॉर्डिंग के दौरान सेल बहती की अनुपस्थिति प्रभावी माइक्रोट्यूबल इमेजिंग के लिए बिल्कुल महत्वपूर्ण है। हमारे प्रयोगमें, माइक्रोट्यूबुल्स का दृश्य और गतिशील विश्लेषण उत्परिवर्ती एचटीटी के साथ कोशिकाओं में माइक्रोट्यूबुल गुणों और व्यवहार के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं। हमारा प्रोटोकॉल अन्य बीमारियों के अध्ययन के लिए लागू होता है जिसके लिए विकृति माइक्रोट्यूबल के गतिशील गुणों को फंसाती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को रूसी संघ के विज्ञान और उच्च शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था, अनुदान संख्या 075-15-2019-1669 (फाइब्रोब्लास्ट का ट्रांसफेक्शन), रूसी विज्ञान फाउंडेशन द्वारा, अनुदान संख्या 19-15-00425 (विट्रो मेंफाइब्रोब्लास्ट की खेती पर अन्य सभी कार्य) द्वारा। यह आंशिक रूप से Lomonosov मास्को राज्य विश्वविद्यालय विकास कार्यक्रम PNR5.13 (इमेजिंग और विश्लेषण) द्वारा समर्थित था । लेखक ों ने ए एन बेलोजरस्की इंस्टीट्यूट ऑफ फिजियो-केमिकल बायोलॉजी में निकॉन सेंटर ऑफ एक्सीलेंस के समर्थन को स्वीकार किया । हम आवाज अभिनय के साथ उसकी मदद सहायता के लिए एकातेरिना तरण के लिए हमारे विशेष धन्यवाद की पेशकश करना चाहते हैं । लेखक भी वीडियो संपादन के साथ उनकी मदद के लिए पावेल बेलिकोव का शुक्रिया अदा करते हैं । पांडुलिपि में आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte Logos Biosystems L40002
Microscope incubator for lifetime filming Okolab Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) Open source image processing software
NIS Elements Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil) MP 151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish SPL Lifesciences 20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm) SPL Lifesciences 211350 Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube SPL Lifesciences 50015
Cryogenic Vials Corning-Costar 430659
Microcentrifuge Tube Nest 615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001
Dimethyl sulfoxide PanEko Equation 1135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) PanEko C420Equation 2
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) PanEko P060Equation 2
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin) PanEko Equation 1070
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax Gibco 519850026
Penicillin-streptomycin PanEko A063Equation 2
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova
[Erasmus University, Rotterdam]		 Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003

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References

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Taran, A., Belikova (Shuvalova), L., Lavrushkina, S., Bogomazova, A., Lagarkova, M., Alieva, I. Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (179), e62963, doi:10.3791/62963 (2022).

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