Summary
Ce protocole est dédié à la visualisation des microtubules par transfection de la protéine EB3 afin d’étudier leurs propriétés dynamiques en culture cellulaire primaire. Le protocole a été mis en œuvre sur des fibroblastes cutanés primaires humains obtenus chez des patients atteints de la maladie de Huntington.
Abstract
La transfection avec une protéine marqueur d’intérêt marquée par fluorescence en combinaison avec la microscopie vidéo time-lapse est une méthode classique d’étude des propriétés dynamiques du cytosquelette. Ce protocole offre une technique de transfection des fibroblastes primaires humains, ce qui peut être difficile en raison des spécificités des conditions de culture cellulaire primaire. De plus, le maintien des propriétés dynamiques du cytosquelette nécessite un faible niveau de transfection pour obtenir un bon rapport signal/bruit sans provoquer de stabilisation des microtubules. Il est important de prendre des mesures pour protéger les cellules du stress induit par la lumière et de la décoloration des colorants fluorescents. Au cours de nos travaux, nous avons testé différentes méthodes et protocoles de transfection ainsi que différents vecteurs afin de sélectionner la meilleure combinaison de conditions adaptées aux études de fibroblastes primaires humains. Nous avons analysé les vidéos time-lapse résultantes et calculé la dynamique des microtubules à l’aide d’ImageJ. La dynamique des extrémités plus des microtubules dans les différentes parties cellulaires n’est pas similaire, nous avons donc divisé l’analyse en sous-groupes - la région centrosome, la lamelle et la queue des fibroblastes. Notamment, ce protocole peut être utilisé pour l’analyse in vitro de la dynamique du cytosquelette dans les échantillons de patients, permettant la prochaine étape vers la compréhension de la dynamique des différents développements de la maladie.
Introduction
La maladie de Huntington (MH) est une pathologie neurodégénérative incurable causée par un gène mutationnaire codant pour la protéine de lahuntingtine (HTT). HTT est principalement associé aux vésicules et aux microtubules et est probablement impliqué dans les processus de transport dépendants des microtubules1,2. Pour étudier l’influence de l’HTT mutant sur la dynamique des microtubules, nous avons utilisé la visualisation in vitro de la protéine EB3, qui régule les propriétés dynamiques des microtubules en liant et en stabilisant les extrémités plus en croissance. Pour charger de l’EB3 marqué par fluorescence dans des fibroblastes de peau humaine, une transfection plasmidique a été appliquée. Nous avons utilisé la culture primaire de fibroblastes obtenue à partir de la biopsie cutanée des patients MH pour cette étude.
La mutation du gène de la protéine HTT entraîne l’allongement du tractus de la polyglutamine3. HTT a un rôle dans des processus cellulaires tels que l’endocytose4, le transport cellulaire1,2, la dégradation des protéines5, etc. Une partie substantielle de ces processus implique divers éléments du cytosquelette cellulaire, y compris les microtubules.
Les cellules primaires humaines sont le meilleur modèle pour reproduire le plus fidèlement possible les événements qui se produisent dans les cellules des patients. Pour créer de tels modèles, il faut isoler des cellules à partir de matériel de biopsie humaine (par exemple, à partir d’échantillons chirurgicaux). La lignée cellulaire primaire résultante convient à l’étude de la pathogenèse à l’aide de diverses méthodes génétiques, biochimiques, moléculaires et de biologie cellulaire. En outre, les cultures de cellules primaires humaines servent de précurseur pour la création de diverses cultures transdifférenciées ettransgéniques 6.
Cependant, contrairement aux cultures cellulaires immortalisées, l’inconvénient significatif des cellules primaires est leur capacité de passage limitée. Par conséquent, nous recommandons d’utiliser des cellules au stade des premiers passages (jusqu’à 15). Les cultures plus anciennes dégénèrent très rapidement, perdant leurs propriétés uniques. Ainsi, les cellules primaires nouvellement obtenues doivent être conservées congelées pour un stockage à long terme.
Les cultures cellulaires primaires sont sensibles aux conditions de culture. Par conséquent, ils nécessitent souvent des approches uniques et une optimisation des conditions de croissance. En particulier, les fibroblastes primaires de la peau humaine utilisés dans nos expériences sont exigeants sur le substrat. Par conséquent, nous avons utilisé divers revêtements supplémentaires (par exemple, de la gélatine ou de la fibronectine) en fonction du type d’expérience.
Le cytosquelette cellulaire détermine la forme, la mobilité et la locomotion de la cellule. La dynamique du cytosquelette est cruciale pour de nombreux processus intracellulaires à la fois dans l’interphase et la mitose. En particulier, les cytosquelettes polymérisés à partir de la tubuline sont des structures hautement dynamiques et polaires, permettant un transport intracellulaire dirigé médié par les protéines motrices. Les extrémités des microtubules sont en réarrangement constant, leurs phases d’assemblage alternent avec les phases de démontage, et ce comportement est appelé « instabilité dynamique »7,8,9. Diverses protéines associées modifient l’équilibre de la réaction de polymérisation, conduisant soit à la formation de polymères, soit à la formation de monomères protéiques. L’ajout de sous-unités de tubuline se produit principalement à l’extrémité supérieure des microtubules10. La famille des protéines de liaison terminale (EB) se compose de trois membres : EB1, EB2 et EB3. Ils servent de protéines de suivi des extrémités plus (+TIP) et régulent les propriétés dynamiques des microtubules en se liant et en stabilisant leurs extrémités supérieures en croissance11.
De nombreuses études utilisent la micro-injection ou la transfection de tubuline marquée par molécule fluorescente avec imagerie time-lapse et analyse vidéo pour visualiser les microtubules in vitro. Ces méthodes peuvent être invasives et nocives pour les cellules, en particulier les cellules humaines primaires. L’étape la plus difficile consiste à trouver les conditions de transfection cellulaire. Nous avons essayé d’atteindre le plus haut niveau possible de transfection sans affecter la viabilité et la morphologie cellulaire native. Cette étude applique la méthode classique pour étudier les différences dans la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés de donneurs sains et de patients atteints de la maladie de Huntington.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole suit les directives du Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine de la Federal Medical Biological Agency datées du 8 septembre 2015.
REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu du protocole.
1. Obtention d’une culture primaire de fibroblastes cutanés humains (Figure 2)
- Administrer la biopsie à un laboratoire en quelques heures dans le milieu Modifié Eagle Media (DMEM) de Dulbecco complété par 50 μg/mL de pénicilline et 50 U/mL de streptomycine.
REMARQUE: Une biopsie cutanée doit être effectuée dans des conditions stériles par un médecin après qu’un patient a signé un consentement éclairé. - Placez le tissu de biopsie dans une boîte de Petri de 6 cm avec une petite quantité du milieu.
- À l’aide d’un scalpel stérile, coupez l’échantillon de biopsie en morceaux d’environ 0,5 à 1 mm. Placez 1-2 fragments obtenus dans une boîte de Petri de 3,5 cm et placez un couvercle stérile sur les morceaux de biopsie. Ajouter lentement 1,5 mL d’un milieu de croissance à la composition suivante : DMEM, 50 U/mL de pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
- Cultivez des fibroblastes dans le milieu de croissance à l’intérieur d’un incubateur à CO2 maintenu à5%de CO2, 37 °C, 80% d’humidité.
REMARQUE: Après 4-7 jours, les premiers kératinocytes, puis les fibroblastes, commencent à migrer du tissu vers le fond du plat.
2. Entreposage, congélation et décongélation de la culture primaire
- Retirer les cellules de la boîte de culture (voir points 3.2-3.4).
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 200 x g. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de cellule dans 900 μL de FBS refroidi.
- Transférer dans un tube de cryoconservation goutte à goutte et ajouter 100 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
- Placer la cryosonde dans un congélateur à basse température à -80 °C. Vingt-quatre heures plus tard, transférer le cryovial dans l’azote liquide (−196 °C) pour un stockage à long terme.
- Pour décongeler les cellules cryoconservées, retirer le cryovial du stockage d’azote et, en 1 min, transférer 1 mL du contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL du milieu de transport préchauffé à 37 °C.
- Remettre soigneusement en suspension puis centrifuger le tube pendant 5 min à 200 x g. Jetez le surnageant, remettez en suspension la pastille de cellule dans le volume requis du milieu de croissance et placez-les sur une boîte de Pétri du diamètre requis.
3. Culture cellulaire
- Couvrir le fond du plat avec une solution de gélatine autoclavée à 0,1% préparée dans de l’eau distillée. Incuber pendant 15 min.
REMARQUE: Pour la visualisation de la transfection, des plats à fond de verre (plats confocaux d’une épaisseur de verre de 170 μm) doivent être utilisés. - Préparer un milieu de culture ayant la composition suivante : DMEM complété par 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 50 U/mL pénicilline-streptomycine. Bien mélanger et conserver à 4 °C. Réchauffer le milieu à 37 °C avant de l’ajouter aux cellules.
- Évaluez la culture au microscope. Retirez le milieu et lavez les fibroblastes avec la solution phosphate-sel (DPBS) de Dulbecco.
- Ajouter 1 mL de solution de trypsine préchauffée à 0,25 % aux cellules. Vérifiez les cellules au microscope si elles se détachent complètement du substrat. Désactiver la trypsine avec 1 mL du milieu de culture.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre la pastille de cellule dans 1 mL du milieu de culture.
- Comptez le nombre de cellules. Calculer le nombre requis de cellules pour les ensemencer avec une densité de 8-15 x10 3/cm2 et les remettre en suspension dans 2 mL du milieu de culture.
- Retirer la solution de gélatine de la boîte de culture et ajouter immédiatement 2 mL de la suspension cellulaire. Cultivez des fibroblastes à 37 °C dans un incubateur à CO2.
- Rafraîchissez le milieu tous les 2-4 jours.
REMARQUE: Pour les expériences, utilisez les cellules de 4 à 11 passages.
4. Transfection
- Remplacer le milieu de culture par un milieu de culture frais 24 h avant la transfection.
REMARQUE: La confluence cellulaire doit être de 70 à 80%. - Préparez un complexe ADN-lipide en fonction de la surface et de la densité de l’ensemencement cellulaire. Utilisez un agent de transfection à base de liposomes.
REMARQUE: Utilisez la densité d’ensemencement cellulaire comme 1 x10 4 cellules / cm2. - Ajouter 3 μL de réactif de transfection commercial à 125 μL de milieu essentiel minimal optimal (Opti-MEM) ne contenant aucun antibiotique, sans toucher les parois du tube. Remettez en suspension doucement.
- Diluer l’ADN plasmidique (GFP-EB3) en ajoutant 1 μg d’ADN plasmidique à 125 μL d’Opti-MEM. Remettez en suspension doucement.
REMARQUE: L’encodage vectoriel d’expression GFP-EB311 a été reçu comme un cadeau aimable du Dr I. Kaverina (Université Vanderbilt, Nashville) avec la permission du Dr A. Akhmanova (Université Erasmus, Rotterdam)11. - Ajouter de l’ADN plasmidique dilué à chaque tube de réactif de transfection dilué (1:1). Incuber pendant 30 min.
- Ajouter le complexe ADN-lipide à la boîte de Petri de 6 cm contenant des cellules et mélanger avec une balançoire cruciforme pendant 30 s. Incuber les cellules avec un agent de transfection pendant 24 h, puis passer à un milieu frais. Analyser l’efficacité de la transfection après 24 h et 48 h.
REMARQUE: 24 h après la transfection, l’efficacité était de 10-15%, et après 48 h jusqu’à 40%.
5. Préparation à l’imagerie
- Avant l’imagerie vivante des cellules, changez le milieu de culture en un milieu sans colorant indicateur de pH pour réduire l’autofluorescence.
- Appliquez soigneusement l’huile minérale sur la surface du milieu pour couvrir complètement le milieu, en l’isolant de l’environnement extérieur pour réduire la pénétration de l’O2 et l’évaporation du milieu.
- Utilisez une lampe au mercure et un objectif à immersion dans l’huile 60x ou 100x avec une ouverture numérique élevée pour prendre les images.
REMARQUE: Pour les observations in vivo, le microscope doit être équipé d’un incubateur pour maintenir les conditions nécessaires aux cellules, y compris le chauffage de la table d’objets et de la lentille à +37 ° C, une chambre fermée avec alimentation en CO2 et un support du niveau d’humidité. Utilisez de l’eau distillée double pour créer de l’humidité. Vérifiez le niveau d’eau double distillée avant de filmer. - Placez la boîte confocale avec les cellules dans le support du microscope avant l’imagerie. Assurez-vous que la parabole et l’appareil photo sont solidement fixés au support pour éviter de dériver lors de la prise d’images.
6. Définition des paramètres d’imagerie
- Choisissez les faibles valeurs d’exposition, car la lumière induit des espèces réactives de l’oxygène (ROS) endommageant les cellules.
NOTE: Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes de la peau humaine, une exposition de 300 ms a été sélectionnée. - Concentrez-vous sur l’objet d’intérêt.
REMARQUE: Pour l’imagerie time-lapse à long terme, utilisez le système de stabilisation automatique de la mise au point pour compenser un éventuel décalage le long de l’axe z. - Choisissez les conditions d’imagerie optimales en fonction de la photosensibilité des cellules et du taux de décoloration du fluorochrome.
REMARQUE: Étant donné que les microtubules sont des structures très dynamiques, un intervalle de temps raisonnablement court peut être sélectionné et la fréquence d’images doit être suffisamment élevée. Pour étudier la dynamique des microtubules dans les fibroblastes cutanés, nous avons utilisé à une fréquence de 1 image/ s pendant 3-5 min. - Lorsque vous sélectionnez l’objet suivant pour obtenir l’image, éloignez-vous de la zone déjà imagée. Comme cette zone était sous l’influence de la lumière, il y aura un photo-blanchiment notable.
REMARQUE: Comme une fréquence d’imagerie relativement élevée a été utilisée, l’obturateur ne s’est pas fermé entre les images et la lampe a été allumée pendant toute la période d’imagerie, ce qui explique pourquoi la décoloration a augmenté. - Choisissez la vidéo optimale pour étudier visuellement la dynamique des microtubules, en tenant compte de la qualité de la transfection, de la qualité des images des microtubules (rapport signal/bruit optimal) et de l’absence de dérive dans le cas de la cellule analysée(Figure 3).
- Utilisez les vidéos sélectionnées pour étudier la dynamique des extrémités plus des microtubules en les traçant dans le programme ImageJ ou Fiji (Figure 4).
REMARQUE : Pour obtenir des instructions d’analyse quantitative, voir la figure supplémentaire 2 et le dossier supplémentaire 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les films GFP-EB3 produits à l’aide du protocole(Figure 1)illustrent les propriétés dynamiques des microtubules. Les microtubules sont impliqués dans différents processus cellulaires, et leurs propriétés dynamiques ont un impact sur diverses caractéristiques de vie de la culture cellulaire humaine primaire à partir du matériel de biopsie des patients (Figure 2).
Les paramètres suivants déterminent l’instabilité dynamique des microtubules: les taux de croissance (polymérisation) et de rétrécissement (dépolymérisation); la fréquence des catastrophes (passage de la polymérisation à la dépolymérisation); la fréquence des sauvetages (passage de la dépolymérisation à la polymérisation); ainsi que des pauses - états lorsque le microtubule ne polymérise pas et ne dépolymérise pas 12. Tous les paramètres sont étroitement régulés, et les taux de polymérisation et de dépolymérisation des microtubules individuels peuvent varier considérablement à la fois dans le même et dans différents types de cellules13,14,15,16,17.
Il est nécessaire de considérer pour l’analyse que les microtubules peuvent avoir une dynamique différente en fonction de leur position dans la cellule. Les microtubules situés dans la région du noyau et du centrosome se comportent différemment de ceux de la périphérie cellulaire19. Par conséquent, pour obtenir un résultat fiable, nous avons effectué les mesures dynamiques des microtubules dans trois régions distinctes de la cellule: la partie centrale, le bord d’attaque et la partie arrière (Figure 3). Pour contrôler la distribution correcte de l’étiquette GFP-EB3 dans diverses parties cellulaires, nous avons utilisé des cellules endothéliales de l’artère pulmonaire humaine (HPAEC)(voir la figure supplémentaire 1).
Des programmes spécialisés, tels que ImageJ ou Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), permettent l’analyse des vidéos par les paramètres suivants: (1) le taux de croissance des microtubules; 2° la fréquence des catastrophes; 3° la fréquence des sauvetages; 4° la fréquence des pauses; et (5) la durée des pauses. De plus, des options de programme et des plugins uniques permettent de tracer automatiquement18 ou manuellement19 (Figure 4). La méthode de traçage manuel a mieux fonctionné dans nos expériences, car les mesures automatiques sont sujettes à des erreurs plus importantes et nécessitent plus de répétitions pour un résultat plus précis. Des instructions détaillées sur l’analyse des données sur la dynamique des microtubules se trouvent à la figure supplémentaire 2 et au fichier supplémentaire 1.
Les paramètres d’imagerie peuvent nécessiter des ajustements pendant le processus d’imagerie. Par exemple, la durée de l’imagerie d’une cellule et les valeurs d’exposition peuvent être modifiées. De tels réglages sont utiles en cas d’épuisement rapide du signal ou de rétrécissement de la cellule (Figure 5).
Figure 1: Schéma général du protocole de transfection GFP-EB3 pour la culture de fibroblastes primaires de peau humaine. Le protocole comprend les étapes suivantes: détachement des cellules par la solution de trypsine; inactivation de la trypsine par l’addition de milieu; centrifugation du composé résultant; calcul de la concentration cellulaire; ensemencement cellulaire dans le plat à fond de verre (plat confocal) recouvert de gélatine; transfection de culture cellulaire par ADN plasmidique (avec GFP-EB3) avec le réactif de transfection liposomale; incubation 24-48 h; et l’analyse au microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Schémade préparation de la culture primaire des fibroblastes de la peau humaine. Une biopsie cutanée doit être effectuée dans des conditions stériles par un médecin après qu’un patient a signé un consentement éclairé. Ensuite, un morceau de tissu est transporté dans une petite quantité du milieu sans FBS au laboratoire dans une boîte de Pétri. Un grand fragment de tissu est coupé en morceaux de 0,5 à 1 mm et recouvert d’un verre de couverture avec l’ajout du support avec FBS. Ensuite, la boîte de Petri est placée dans un incubateur à CO2, où après 4-7 jours, les fibroblastes migrent du fragment de tissu vers le fond en verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Marqueur GFP-EB3 (vert) dans différentes zones de fibroblastes humains transfectés, obtenu à partir d’une biopsie cutanée de patients MH : bord d’attaque (panneau supérieur) ; queue (panneau du milieu); partie centrale du fibroblaste (zone autour du centrosome) (panneau inférieur). Barre d’échelle = 10 μm. La fréquence d’imagerie est de 1 image/s. Microscopie fluorescente à grand champ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Suivi manuel GFP-EB3 par le plugin ImageJ MTrackJ. Des traces reflétant la croissance des microtubules ont été obtenues à la suite du marquage manuel image par image des embouts des étiquettes GFP-EB3 aux extrémités plus pendant 20 s d’imagerie. Fibroblastes cultivés transfectés, obtenus à partir de la biopsie cutanée des patients MH. La fréquence d’imagerie est de 1 image/s. Microscopie fluorescente à grand champ. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Dépannage lors de l’imagerie des extrémités plus des microtubules marqués GFP-EB3. (A) Les microtubules marqués par fluorescence sont flous en raison de l’absence de système de focalisation. (B) Les microtubules sont stabilisés et perdent leurs propriétés dynamiques en raison de la surexpression de GFP-EB3 dans la cellule en raison d’une longue incubation avec le mélange transfectant. (C) Rétrécissement de la lame cellulaire à la suite d’une phototoxicité due à la libération de ROS. (D) L’intensité du signal diminue pendant l’imagerie - photoblanchiment rapide. Fibroblastes cultivés transfectés, obtenus à partir de la biopsie cutanée des patients MH. La fréquence d’imagerie est de 1 image par seconde. Microscopie fluorescente à grand champ. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Visualisation sélective des extrémités plus de microtubules en croissance. Marqueur GFP-EB3 (vert) dans différentes zones de cellules endothéliales humaines transfectées (culture de HPAEC: Cellules endothéliales de l’artère pulmonaire humaine) dans le bord d’attaque, la queue et la zone centrale (zone autour du centrosome). Barres d’échelle 10 μm. La fréquence d’imagerie est de 1 image/s Microscopie fluorescente à grand champ. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Analyse de la dynamique des microtubules par étiquette GFP-EB3 après suivi manuel à l’aide du plugin ImageJ MTrackJ. (A,B) Les traces EB3 obtenues par le déplacement des patchs EB3-GFP sur des séries time-lapse de fibroblastes cultivés transfectés, obtenus à partir de la biopsie cutanée des patients MH (sont colorés individuellement). (A) Piste EB3 (violet, No46) obtenue par EB3-GFP patche le déplacement pendant 18 secondes. (B) Piste EB3 (rouge, No37) obtenue par EB3-GFP patche le déplacement pendant 9 secondes. (C) Quantification du déplacement des extrémités plus des microtubules du fibroblaste cutané des patients MH humains présenté dans (A). (D) Quantification du déplacement des microtubules aux extrémités plus indiquées au point (B). Le graphique montre qu’entre 6 et 8 secondes, il y a une pause dans la croissance du microtubule (il n’y a pas de mouvement de l’extrémité plus). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Dossier supplémentaire 1 : Analyse quantitative de la dynamique des extrémités plus des microtubules marqués EB3-GFP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Des résultats de meilleure qualité pour l’analyse de la dynamique des microtubules peuvent être obtenus à partir d’images microscopiques de haute qualité. Il est important d’observer toutes les conditions nécessaires à l’imagerie time-lapse des cellules vivantes et d’ajuster correctement les paramètres d’imagerie. L’utilisation de plats de culture cellulaire spéciaux avec un fond en verre (plats confocaux) est importante, car le verre a un indice de réfraction de la lumière différent de celui du plastique. L’épaisseur du verre et son uniformité sur toute sa surface sont également extrêmement importantes, car ces paramètres sont cruciaux pour la focalisation normale de l’échantillon. La violation de ces paramètres entraîne inévitablement une défaillance du système de mise au point parfait entraînant une mauvaise mise au point, ce qui rend impossible l’utilisation d’une telle vidéo floue pour l’analyse(Figure 5A). Une autre condition importante pour l’imagerie des cellules vivantes est leur protection contre les ROS. Divers réactifs peuvent être utilisés à ces fins20. Dans notre travail, nous utilisons de l’huile minérale, qui isole complètement le milieu de culture de l’atmosphère et empêche les échanges gazeux. De la même manière, l’oxyrase réductrice de ROS peut être utilisée, mais cette enzyme ne convient pas à tous les types de cellules et est plus souvent applicable à l’imagerie avec un temps accru.
Lors du choix du temps d’incubation optimal des cellules après la transfection (24 ou 48 h), il convient de prêter attention au nombre de cellules transfectées. Un nombre inférieur au nombre maximal de cellules exprimant la protéine marquée est déjà suffisant pour l’analyse. La surexpression ne doit pas être autorisée car les microtubules, dans de tels cas, sont stabilisés et leurs propriétés dynamiques ne peuvent pas être analysées (Figure 5B).
Dans certains cas, il peut être nécessaire d’ajuster les paramètres d’imagerie en fonction de la réaction des cellules après le début de l’enregistrement vidéo. Par exemple, il est possible d’observer le rétrécissement de la lame cellulaire en raison d’une sensibilité élevée à la lumière (phototoxicité)(Figure 5C). Lorsqu’elles sont excitées, les molécules fluorescentes réagissent généralement avec l’oxygène moléculaire pour former des radicaux libres qui peuvent endommager les composants cellulaires21. Lors de la conception des expériences, des fluorophores avec la longueur d’onde d’excitation maximale possible doivent être sélectionnés pour minimiser les dommages cellulaires sous éclairage à ondes courtes. En outre, il existe des rapports selon lesquels certains composants des milieux de culture standard, y compris la vitamine riboflavine et l’acide aminé tryptophane, peuvent également contribuer aux effets néfastes de la lumière sur les cellules cultivées22. Entre autres choses, cela peut être causé par une quantité excessive d’étiquettes fluorescentes dans une cellule. Dans ces cas, il devient nécessaire de réduire la durée de l’enregistrement et l’intensité de l’éclairage. Un autre problème possible peut également être le photoblanchiment rapide - diminution de l’intensité du signal pendant l’enregistrement (Figure 5D). Cet effet doit être pris en compte lors de la sélection de l’objet suivant sur le même plat expérimental, car les cellules voisines autour de la zone imagée sont également brûlées.
Il convient de mentionner qu’il existe d’autres méthodes de visualisation des microtubules dans les cellules vivantes, comme la microinjection de la tubuline marquée par fluorescence dans la cellule ou la transduction cellulaire à l’aide de virus. Comme pour toute autre méthode, la méthode de transfection présente des avantages et des inconvénients. Cependant, de notre point de vue, par rapport à la méthode d’injection, la transfection est plus efficace et permet d’obtenir une inclusion massive de vecteurs d’expression dans les cellules, ce qui donne un grand nombre de cellules fluorescentes pour analyse. En outre, la méthode de transfection ne nécessite pas d’équipement et de compétences spéciaux de la part du chercheur. La méthode de transduction virale montre de bons résultats et peut être appliquée. Pourtant, il ne convient pas à toutes les cultures cellulaires (en particulier, il convient moins aux fibroblastes humains, obtenus à partir de la biopsie cutanée des patients MH).
L’étape la plus critique de ce protocole est la transfection effectuée pour assurer une expression protéique suffisante. Un bon rapport signal/bruit, aucun photoblanchiment des microtubules et l’absence de dérive cellulaire pendant l’enregistrement vidéo time-lapse sont absolument essentiels pour une imagerie efficace des microtubules. Dans notreexpérience, la visualisation des microtubules et l’analyse dynamique fournissent des informations vitales sur les propriétés et le comportement des microtubules dans les cellules avec HTT mutant. Notre protocole est applicable pour les études d’autres maladies pour lesquelles la pathologie implique des propriétés dynamiques des microtubules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le ministère de la Science et de l’Enseignement supérieur de la Fédération de Russie, subvention n ° 075-15-2019-1669 (transfection de fibroblastes), par la Fondation russe pour la science, subvention n ° 19-15-00425 (tous les autres travaux sur la culture de fibroblastes in vitro). Il a été partiellement soutenu par le programme de développement de l’Université d’État Lomonosov de Moscou PNR5.13 (imagerie et analyse). Les auteurs reconnaissent le soutien du Centre d’excellence Nikon de l’Institut de biologie physico-chimique A. N. Belozersky. Nous tenons à remercier tout particulièrement Ekaterina Taran pour son aide en doublage. Les auteurs remercient également Pavel Belikov pour son aide au montage vidéo. Les figures du manuscrit ont été créées avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
