Summary

Microtubule Plus-End Dynamics Visualisering i Huntingtons Sygdom Model baseret på Human Primary Skin Fibroblasts

Published: January 08, 2022
doi:

Summary

Denne protokol er dedikeret til microtubule plus-end visualisering af EB3 protein transfection at studere deres dynamiske egenskaber i primær cellekultur. Protokollen blev implementeret på humane primære hudfibroblaster fra patienter med Huntingtons Sygdom.

Abstract

Transfection med et fluorescerende mærket markørprotein af interesse i kombination med time-lapse videomikroskopi er en klassisk metode til at studere cytoskeletons dynamiske egenskaber. Denne protokol tilbyder en teknik til human primær fibroblast transfection, som kan være vanskeligt på grund af detaljerne i primære celle dyrkning betingelser. Derudover kræver cytoskeleton dynamisk ejendomsvedligeholdelse et lavt niveau af transfection for at opnå et godt signal-til-støj-forhold uden at forårsage mikrotubulestabilisering. Det er vigtigt at træffe foranstaltninger til at beskytte cellerne mod lys-induceret stress og fluorescerende farvestof fading. I løbet af vores arbejde testede vi forskellige transfection metoder og protokoller samt forskellige vektorer for at vælge den bedste kombination af betingelser egnet til humane primære fibroblast undersøgelser. Vi analyserede de resulterende time-lapse videoer og beregnet microtubule dynamik ved hjælp af ImageJ. Dynamikken i mikrotubules plus-enderne i de forskellige celledele er ikke ens, så vi opdelte analysen i undergrupper – centrosome-regionen, lamellaen og halen af fibroblaster. Især kan denne protokol bruges til in vitro-analyse af cytoskeleton dynamik i patientprøver, hvilket gør det muligt for det næste skridt i retning af at forstå dynamikken i de forskellige sygdomsudvikling.

Introduction

Huntingtons Sygdom (HS) er en uhelbredelig neurodegenerativ patologi forårsaget af et mutationsgenkodningsjægerprotein (HTT). HTT er primært forbundet med vesikler og mikrotubuler og er sandsynligvis involveret i mikrotubuleafhængige transportprocesser1,2. For at studere indflydelsen af mutant HTT på mikrotubuledynamikken brugte vi in vitro-visualiseringen af EB3-proteinet, der regulerer mikrotubulernes dynamiske egenskaber ved at binde og stabilisere de voksende plus-ends. For at indlæse fluorescerende mærket EB3 i human hud fibroblaster, plasmid transfection blev anvendt. Vi brugte den primære fibroblastkultur, der blev opnået fra HS-patienternes hudbiopsi, til denne undersøgelse.

Mutationen i HTT-proteingenet fører til forlængelse af polyglutaminkanalen3. HTT har en rolle i sådanne cellulære processer som endokytose4, celletransport1,2, proteinforringelse5osv. Væsentlig del af disse processer involverer forskellige elementer i cellen cytoskeleton, herunder mikrotubuler.

Menneskelige primære celler er den bedste model til at reproducere hændelser, der forekommer i patientceller så tæt som muligt. For at skabe sådanne modeller skal man isolere celler fra humant biopsimateriale (f.eks. fra kirurgiske prøver). Den resulterende primære cellelinje er egnet til at studere patogenese ved hjælp af forskellige genetiske, biokemiske, molekylære og cellebiologiske metoder. Også menneskelige primære cellekulturer tjener som en forløber for at skabe forskellige transdifferentierede og transgene kulturer6.

Men i modsætning til udødeliggjorte cellekulturer er den betydelige ulempe ved primære celler deres begrænsede passagekapacitet. Derfor anbefaler vi at bruge celler i de tidlige passager fase (op til 15). Ældre kulturer degenererer meget hurtigt og mister deres unikke egenskaber. Således bør de nyerhvervede primære celler holdes frosne til langtidsopbevaring.

Primære cellekulturer er modtagelige for dyrkningsforhold. Derfor kræver de ofte unikke tilgange og optimering af vækstbetingelser. Især er den menneskelige hud primære fibroblaster, der anvendes i vores eksperimenter krævende på substratet. Derfor brugte vi forskellige ekstra belægninger (f.eks. gelatine eller fibronectin) afhængigt af eksperimenttypen.

Cellen cytoskeleton bestemmer celleform, mobilitet og bevægelse. Dynamikken i cytoskeleton er afgørende for mange intracellulære processer både i interfase og mitose. Især cytoskeleton polymeriseret fra tubulin, er meget dynamiske og polære strukturer, der muliggør motor protein-medieret rettet intracellulær transport. Mikrotubulernes ender er i konstant omlejring, deres samlingsfaser veksler med demonteringsfaserne, og denne funktionsmåde kaldes “dynamisk ustabilitet”7,8,9. Forskellige tilknyttede proteiner flytter ligevægten i polymeriseringsreaktionen, hvilket fører enten til polymerdannelsen eller proteinmonomerdannelsen. Tilsætning af tubulinunderenheder forekommer hovedsageligt i plus-enden af mikrotubuler10. Den endelige-bindende (EB) proteiner familie består af tre medlemmer: EB1, EB2, og EB3. De tjener som plus-end-tracking proteiner (+TIPs) og regulerer mikrotubulernes dynamiske egenskaber ved at binde og stabilisere deres voksende plus-ends11.

Mange undersøgelser bruger fluorescerende molekyle-mærket tubulin mikroinjection eller transfection med time-lapse imaging og video analyse til at visualisere mikrotubules in vitro. Disse metoder kan være invasive og skadelige for celler, især primære menneskelige celler. Det mest udfordrende skridt er at finde betingelser for celletransfekt. Vi forsøgte at nå det højest mulige niveau af transfection uden at påvirke levedygtigheden og native cellemorfologi. Denne undersøgelse anvender den klassiske metode til at studere forskellene i mikrotubuledynamikken i hudfibroblaster hos raske donorer og patienter med Huntingtons Sygdom.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne fra Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency dateret september 08, 2015. BEMÆRK: Figur 1 giver et overblik over protokollen. 1. Opnåelse af en primær kultur af human hud fibroblaster (Figur 2) Levere biopsien til et laboratorium inden for få timer i Dulbecco’…

Representative Results

De resulterende GFP-EB3-film, der er produceret ved hjælp af protokollen (Figur 1), illustrerer mikrotubulernes dynamiske egenskaber. Mikrotubuler er involveret i forskellige celleprocesser, og deres dynamiske egenskaber påvirker forskellige livskarakteristika i den primære menneskelige cellekultur fra patienternes biopsimateriale (Figur 2). Følgende parametre bestemmer mikrotubulernes dynamiske ustabilitet: vækstraterne (polymer…

Discussion

Bedre kvalitetsresultater til mikrotubules dynamikanalyse kan fås fra mikroskopiske billeder af høj kvalitet. Det er vigtigt at overholde alle de nødvendige betingelser for time-lapse imaging af levende celler og at justere billeddannelsesparametrene korrekt. Brug af specielle cellekulturretter med en glasbund (konfokale retter) er vigtigt, da glas har et andet brydningsindeks for lys end plast. Tykkelsen af glasset og dets ensartethed over hele dets område er også ekstremt vigtigt, da disse parametre er afgørende …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskning blev finansieret af Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse i Den Russiske Føderation, tilskud nr. 075-15-2019-1669 (transfection af fibroblaster), af Den Russiske Videnskabsfond, tilskud nr. 19-15-00425 (alle andre værker om dyrkning af fibroblaster in vitro). Det blev delvist støttet af Lomonosov Moskva State University Development program PNR5.13 (billedbehandling og analyse). Forfatterne anerkender støtte fra Nikon Center of Excellence på A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vi ønsker at tilbyde vores særlige tak til Ekaterina Taran for hendes hjælp med stemmeskuespil. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjælp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet blev skabt med BioRender.com.

Materials

Instrumentation
Camera iXon DU897 EMCCD Andor Technology
Eppendorf Centrifuge 5804 R Eppendorf Corporate
Fluorescence filter set HYQ FITC Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Automated Cell Counte Logos Biosystems L40002
Microscope incubator for lifetime filming Okolab Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS
Gas controller CO2-O2-UNIT-BL
Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) Open source image processing software
NIS Elements Nikon Alternative: Leica, Olympus, Zeiss
Additional reagents
Mineral oil (Light white oil) MP 151694
Cell culture dish
Cell Culture Dish SPL Lifesciences 20035
Confocal Dish (glass thickness 170 µm) SPL Lifesciences 211350 Alternative: MatTek
Conical Centrifuge tube SPL Lifesciences 50015
Cryogenic Vials Corning-Costar 430659
Microcentrifuge Tube Nest 615001
Cultivation
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific L3000001
Dimethyl sulfoxide PanEko Equation 1135
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) PanEko C420Equation 2
DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) PanEko P060Equation 2
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone K053/SH30071.03
Gelatin (bovine skin) PanEko Equation 1070
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050038
Opti-MEM (1x) + Glutamax Gibco 519850026
Penicillin-streptomycin PanEko A063Equation 2
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200072
Transfection
Plasmid DNA with EB3-GFP Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova
[Erasmus University, Rotterdam]
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003

References

  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
  3. MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington’s disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
  4. Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
  5. Steffan, J. S., et al. The Huntington’s disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
  6. Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  9. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
  10. Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
  11. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  12. Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
  13. O’Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
  14. Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
  15. Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
  16. Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
  17. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  19. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
  20. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
  21. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
  22. Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).

Play Video

Cite This Article
Taran, A., Belikova (Shuvalova), L., Lavrushkina, S., Bogomazova, A., Lagarkova, M., Alieva, I. Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington’s Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts. J. Vis. Exp. (179), e62963, doi:10.3791/62963 (2022).

View Video