Summary
Este protocolo está dedicado a la visualización de microtúbulos plus-end mediante transfección de proteínas EB3 para estudiar sus propiedades dinámicas en cultivo celular primario. El protocolo se implementó en fibroblastos primarios de piel humana obtenidos de pacientes con enfermedad de Huntington.
Abstract
La transfección con una proteína marcadora de interés marcada fluorescentemente en combinación con videomicscopía de lapso de tiempo es un método clásico para estudiar las propiedades dinámicas del citoesqueleto. Este protocolo ofrece una técnica para la transfección de fibroblastos primarios humanos, que puede ser difícil debido a los detalles de las condiciones de cultivo de células primarias. Además, el mantenimiento de la propiedad dinámica del citoesqueleto requiere un bajo nivel de transfección para obtener una buena relación señal-ruido sin causar estabilización de microtúbulos. Es importante tomar medidas para proteger las células del estrés inducido por la luz y el desvanecimiento del tinte fluorescente. En el curso de nuestro trabajo, probamos diferentes métodos y protocolos de transfección, así como diferentes vectores para seleccionar la mejor combinación de condiciones adecuadas para estudios de fibroblastos primarios humanos. Analizamos los videos de lapso de tiempo resultantes y calculamos la dinámica de los microtúbulos utilizando ImageJ. La dinámica de los extremos positivos de los microtúbulos en las diferentes partes celulares no es similar, por lo que dividimos el análisis en subgrupos: la región del centrosoma, la lámina y la cola de los fibroblastos. En particular, este protocolo se puede utilizar para el análisis in vitro de la dinámica del citoesqueleto en muestras de pacientes, lo que permite el siguiente paso hacia la comprensión de la dinámica de los diversos desarrollos de la enfermedad.
Introduction
La enfermedad de Huntington (EH) es una patología neurodegenerativa incurable causada por un gen mutacionina que codifica la proteína cazadora (HTT). La HTT se asocia principalmente con vesículas y microtúbulos y probablemente esté involucrada en procesos de transporte dependientes de microtúbulos1,2. Para estudiar la influencia de la HTT mutante en la dinámica de los microtúbulos, utilizamos la visualización in vitro de la proteína EB3, que regula las propiedades dinámicas de los microtúbulos uniéndose y estabilizando los extremos superiores en crecimiento. Para cargar EB3 marcado fluorescentemente en fibroblastos de piel humana, se aplicó transfección por plásmido. Para este estudio se utilizó el cultivo primario de fibroblastos obtenido de la biopsia de piel de los pacientes con EH.
La mutación en el gen de la proteína HTT conduce a la elongación del tracto de la poliglutamina3. HTT tiene un papel en procesos celulares tales como endocitosis4,transporte celular1,2,degradación deproteínas 5,etc. Una parte sustancial de estos procesos involucra varios elementos del citoesqueleto celular, incluidos los microtúbulos.
Las células primarias humanas son el mejor modelo para reproducir los eventos que ocurren en las células de los pacientes lo más cerca posible. Para crear tales modelos, uno necesita aislar células de material de biopsia humana (por ejemplo, de muestras quirúrgicas). La línea celular primaria resultante es adecuada para estudiar la patogénesis utilizando varios métodos genéticos, bioquímicos, moleculares y de biología celular. Además, los cultivos celulares primarios humanos sirven como precursores para la creación de diversos cultivos transdiferenciados y transgénicos6.
Sin embargo, a diferencia de los cultivos celulares inmortalizados, la desventaja significativa de las células primarias es su limitada capacidad de paso. Por lo tanto, recomendamos el uso de células en la etapa de pasajes tempranos (hasta 15). Las culturas más antiguas degeneran muy rápidamente, perdiendo sus propiedades únicas. Por lo tanto, las células primarias recién obtenidas deben mantenerse congeladas para su almacenamiento a largo plazo.
Los cultivos celulares primarios son susceptibles a las condiciones de cultivo. Por lo tanto, a menudo requieren enfoques únicos y optimización de las condiciones de crecimiento. En particular, los fibroblastos primarios de la piel humana utilizados en nuestros experimentos son exigentes con el sustrato. Por lo tanto, utilizamos varios recubrimientos adicionales (por ejemplo, gelatina o fibronectina) dependiendo del tipo de experimento.
El citoesqueleto celular determina la forma celular, la movilidad y la locomoción. La dinámica del citoesqueleto es crucial para muchos procesos intracelulares tanto en interfase como en mitosis. En particular, el citoesqueleto polimerizado a partir de tubulina, son estructuras altamente dinámicas y polares, lo que permite el transporte intracelular dirigido mediado por proteínas motoras. Los extremos de los microtúbulos están en constante reordenamiento, sus fases de ensamblaje se alternan con las fases de desmontaje, y este comportamiento se denomina "inestabilidad dinámica"7,8,9. Varias proteínas asociadas cambian el equilibrio de la reacción de polimerización, lo que lleva a la formación de polímeros o a la formación de monómeros de proteínas. La adición de subunidades de tubulina ocurre principalmente en el extremo superior de los microtúbulos10. La familia de proteínas de unión al final (EB) consta de tres miembros: EB1, EB2 y EB3. Sirven como proteínas de seguimiento de extremos más (+TIP) y regulan las propiedades dinámicas de los microtúbulos uniéndose y estabilizando sus extremos superiores en crecimiento11.
Muchos estudios utilizan microinyección o transfección de tubulina marcada con moléculas fluorescentes con imágenes de lapso de tiempo y análisis de video para visualizar microtúbulos in vitro. Estos métodos pueden ser invasivos y dañinos para las células, especialmente las células humanas primarias. El paso más desafiante es encontrar las condiciones para la transfección celular. Intentamos alcanzar el nivel más alto posible de transfección sin afectar la viabilidad y la morfología celular nativa. Este estudio aplica el método clásico para estudiar las diferencias en la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel de donantes sanos y pacientes con enfermedad de Huntington.
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Protocol
Este protocolo sigue las directrices del Centro Federal de Investigación y Clínica de Medicina Físico-Química de la Agencia Federal Médica Biológica de fecha 08 de septiembre de 2015.
NOTA: La Figura 1 ofrece una visión general del protocolo.
1. Obtención de un cultivo primario de fibroblastos de piel humana (Figura2)
- Entregue la biopsia a un laboratorio en unas pocas horas en el medio Modified Eagle Media (DMEM) de Dulbecco suplementado con 50 μg/ml de penicilina y 50 U/ml de estreptomicina.
NOTA: Una biopsia de piel debe ser realizada en condiciones estériles por un médico después de que un paciente firme un consentimiento informado. - Coloque el tejido de la biopsia en una placa de Petri de 6 cm junto con una pequeña cantidad del medio.
- Usando un bisturí estéril, corte la muestra de biopsia en trozos de aproximadamente 0.5-1 mm de tamaño. Coloque 1-2 fragmentos obtenidos en una placa de Petri de 3,5 cm y coloque un cubrehojas estériles sobre las piezas de biopsia. Agregue lentamente 1.5 ml de un medio de crecimiento a la siguiente composición: DMEM, 50 U / ml de penicilina-estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Cultivo de fibroblastos en el medio de crecimiento dentro de una incubadora de CO2 mantenido al 5% de CO2,37 °C, 80% de humedad.
NOTA: Después de 4-7 días, primero los queratinocitos, luego los fibroblastos, comienzan a migrar del tejido al fondo del plato.
2. Almacenamiento, congelación y descongelación del cultivo primario
- Retirar las células de la placa de cultivo (véanse los puntos 3.2 a 3.4).
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga durante 5 min a 200 x g. Luego deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 900 μL de FBS enfriado.
- Transfiera a un tubo de criopreservación gota a gota y agregue 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO).
- Coloque la criosonda en un congelador de baja temperatura a -80 °C. Veinticuatro horas después, transfiera el criovial a nitrógeno líquido (-196 ° C) para su almacenamiento a largo plazo.
- Para descongelar las células criopreservadas, retire el criovial del almacenamiento de nitrógeno y, en 1 min, transfiera 1 mL del contenido a un tubo cónico de 15 mL que contenga 9 mL del medio de transporte precalentado a 37 °C.
- Resuspender cuidadosamente y luego centrifugar el tubo durante 5 min a 200 x g. Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en el volumen requerido del medio de crecimiento y colóquelos en una placa de Petri del diámetro requerido.
3. Cultivo celular
- Cubra el fondo del plato con una solución de gelatina al 0,1% en autoclave preparada en agua destilada. Incubar durante 15 min.
NOTA: Para la visualización de la transfección, se deben utilizar platos con fondo de vidrio (platos confocales con espesor de vidrio de 170 μm). - Preparar un medio de cultivo que tenga la siguiente composición: DMEM suplementado con 10% fbs, 2 mM L-alanil-L-glutamina, 50 U/mL de penicilina-estreptomicina. Mezclar bien y conservar a 4 °C. Calentar el medio a 37 °C antes de añadirlo a las células.
- Evaluar el cultivo bajo el microscopio. Retire el medio y lave los fibroblastos con la solución de sal de fosfato (DPBS) de Dulbecco.
- Agregue 1 ml de solución de tripsina al 0,25% precalentada a las células. Revise las células bajo el microscopio si se desprenden completamente del sustrato. Desactivar la tripsina con 1 ml del medio de cultivo.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular en 1 ml del medio de cultivo.
- Cuente el número de celdas. Calcular el número requerido de células para sembrarlas con una densidad de 8-15 x 103/cm2 y resuspend en 2 mL del medio de cultivo.
- Retire la solución de gelatina de la placa de cultivo e inmediatamente agregue 2 ml de suspensión celular. Cultivar fibroblastos a 37 °C en una incubadora de CO2.
- Refresque el medio cada 2-4 días.
NOTA: Para experimentos, use las celdas de 4-11 pasajes.
4. Transfección
- Reemplace el medio de cultivo por un medio de cultivo fresco 24 h antes de la transfección.
NOTA: La confluencia celular debe ser del 70-80%. - Prepare un complejo ADN-lípido basado en el área y la densidad de la siembra celular. Use un agente de transfección basado en liposomas.
NOTA: Utilice la densidad de siembra celular como 1 x 104 celdas/cm2. - Añadir 3 μL de reactivo de transfección comercial a 125 μL de medio esencial mínimo óptimo (Opti-MEM) que no contenga antibióticos, sin tocar las paredes del tubo. Resuspendir suavemente.
- Diluir el ADN plásmido (GFP-EB3) añadiendo 1 μg del ADN plásmido a 125 μL de Opti-MEM. Resuspendir suavemente.
NOTA: La codificación del vector de expresión GFP-EB311 fue recibida como un amable regalo del Dr. I. Kaverina (Universidad de Vanderbilt, Nashville) con permiso del Dr. A. Akhmanova (Universidad Erasmus, Rotterdam)11. - Agregue ADN plásmido diluido a cada tubo de reactivo de transfección diluido (1:1). Incubar durante 30 min.
- Agregue el complejo ADN-lípido a las células que contienen la placa de Petri de 6 cm y mezcle con un giro cruciforme durante 30 s. Incubar las células con un agente de transfección durante 24 h y luego cambiar a medio fresco. Analizar la eficiencia de la transfección después de 24 h y 48 h.
NOTA: 24 h después de la transfección, la eficiencia fue del 10-15%, y después de 48 h hasta el 40%.
5. Preparación para la obtención de imágenes
- Antes de obtener imágenes en vivo de las células, cambie el medio de cultivo a un medio sin colorante indicador de pH para reducir la autofluorescencia.
- Aplique cuidadosamente aceite mineral a la superficie del medio para cubrir completamente el medio, aislándolo del entorno externo para reducir la penetración de O2 y la evaporación del medio.
- Utilice una lámpara de mercurio y una lente de objetivo de inmersión en aceite de 60x o 100x con una apertura numérica alta para tomar las imágenes.
NOTA: Para observaciones in vivo, el microscopio debe estar equipado con una incubadora para mantener las condiciones necesarias para las células, incluido el calentamiento de la mesa de objetos y la lente a +37 ° C, una cámara cerrada con suministro de CO2 y soporte de nivel de humedad. Use agua destilada doble para crear humedad. Compruebe el nivel de agua destilada doble antes de filmar. - Coloque el plato confocal con las células en el soporte del microscopio antes de obtener imágenes. Asegúrese de que el plato y la cámara estén bien conectados al soporte para evitar la deriva mientras se toman imágenes.
6. Configuración de los parámetros de imagen
- Elija los valores de exposición bajos, ya que la luz induce especies reactivas de oxígeno (ROS) que dañan las células.
NOTA: Para estudiar la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de piel humana, se seleccionó una exposición de 300 ms. - Centrarse en el objeto de interés.
NOTA: Para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, utilice el sistema de estabilización automática del enfoque para compensar un posible cambio a lo largo del eje Z. - Elija las condiciones óptimas de imagen dependiendo de la fotosensibilidad de las células y la velocidad de desvanecimiento del fluorocromo.
NOTA: Dado que los microtúbulos son estructuras altamente dinámicas, se puede seleccionar un intervalo de tiempo razonablemente corto y la velocidad de fotogramas debe ser lo suficientemente alta. Para investigar la dinámica de los microtúbulos en fibroblastos de la piel, se utilizó a una frecuencia de 1 fotograma/s durante 3-5 min. - Al seleccionar el siguiente objeto para obtener la imagen, aléjese del área ya fotografiada. Dado que esta área estaba bajo la influencia de la luz, habrá un fotoblanqueo notable.
NOTA: Dado que se utilizó una frecuencia de imagen relativamente alta, el obturador no se cerró entre las imágenes y la lámpara se encendió durante todo el período de imágenes, por lo que aumentó el desvanecimiento. - Elija el video óptimo para estudiar visualmente la dinámica de los microtúbulos, teniendo en cuenta la calidad de la transfección, la calidad de las imágenes de los microtúbulos (relación óptima señal-ruido) y la ausencia de deriva en el caso de la célula analizada(Figura 3).
- Utilice los videos seleccionados para estudiar la dinámica de los extremos superiores de los microtúbulos rastreándolos en el programa ImageJ o Fiji(Figura 4).
NOTA: Para las instrucciones de análisis cuantitativo, consulte la Figura suplementaria 2 y el Archivo complementario 1.
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Representative Results
Las películas GFP-EB3 resultantes producidas utilizando el protocolo (Figura 1) ilustran las propiedades dinámicas de los microtúbulos. Los microtúbulos están involucrados en diferentes procesos celulares, y sus propiedades dinámicas afectan varias características de vida del cultivo celular humano primario a partir del material de biopsia de los pacientes (Figura 2).
Los siguientes parámetros determinan la inestabilidad dinámica de los microtúbulos: las tasas de crecimiento (polimerización) y contracción (despolimerización); la frecuencia de las catástrofes (transición de la polimerización a la despolimerización); la frecuencia de los rescates (transición de la despolimerización a la polimerización); así como pausas - estados cuando el microtúbulo no polimeriza y no despolimeriza 12. Todos los parámetros están estrechamente regulados, y las tasas de polimerización y despolimerización de microtúbulos individuales pueden variar significativamente tanto en el mismo como en diferentes tipos de células13,14,15,16,17.
Es necesario considerar para el análisis que los microtúbulos pueden tener diferentes dinámicas dependiendo de su posición en la célula. Los microtúbulos localizados en la región del núcleo y el centrosoma se comportan de manera diferente en comparación con los de la periferia celular19. Por lo tanto, para obtener un resultado confiable, realizamos las mediciones dinámicas de los microtúbulos en tres regiones separadas de la célula: la parte central, el borde de ataque y la parte de la cola(Figura 3). Para controlar la correcta distribución de la etiqueta GFP-EB3 en varias partes celulares, utilizamos células endoteliales de la arteria pulmonar humana (HPAEC) (ver Figura suplementaria 1).
Programas especializados, como ImageJ o Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), permiten el análisis de los vídeos por los siguientes parámetros: (1) la tasa de crecimiento de los microtúbulos; (2) la frecuencia de las catástrofes; 3) la frecuencia de los rescates; (4) la frecuencia de las pausas; y (5) duración de las pausas. Además, las opciones de programa únicas y los complementos permiten el seguimiento automático18 o manualmente19 (Figura 4). El método de rastreo manual funcionó mejor en nuestros experimentos, ya que las mediciones automáticas son propensas a errores más grandes y requieren más repeticiones para un resultado más preciso. Las instrucciones detalladas sobre el análisis de datos de la dinámica de los microtúbulos se pueden encontrar en la Figura suplementaria 2 y en el Archivo complementario 1.
Los parámetros de imagen pueden requerir ajustes durante el proceso de obtención de imágenes. Por ejemplo, se puede cambiar la duración de una imagen celular y los valores de exposición. Tales configuraciones son útiles si hay un agotamiento rápido de la señal, o la célula se encoge (Figura 5).
Figura 1: El esquema general del protocolo de transfección GFP-EB3 para el cultivo de fibroblastos primarios de piel humana. El protocolo incluye los siguientes pasos: desprendimiento de células por la solución de tripsina; inactivación de tripsina por la adición del medio; centrifugación del compuesto resultante; cálculo de la concentración celular; siembra celular al plato de fondo de vidrio (plato confocal) recubierto con gelatina; transfección de cultivo celular por ADN plásmido (con GFP-EB3) con el reactivo de transfección liposomal; incubación 24-48 h; y análisis bajo un microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Esquema de preparación de cultivo primario de fibroblastos de piel humana. Una biopsia de piel debe ser realizada en condiciones estériles por un médico después de que un paciente firme un consentimiento informado. Luego, un pedazo de tejido se transporta en una pequeña cantidad del medio sin FBS al laboratorio en una placa de Petri. Un gran fragmento de tejido se corta en trozos de 0.5-1 mm de tamaño, y se cubren con una cubierta de vidrio con la adición del medio con FBS. Luego, la placa de Petri se coloca en una incubadora de CO2, donde después de 4-7 días los fibroblastos migran del fragmento de tejido al fondo de vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Marcador GFP-EB3 (verde) en diferentes áreas de fibroblastos humanos transfectados, obtenido de biopsia de piel de pacientes con EH: borde de ataque (panel superior); cola (panel central); parte central del fibroblasto (zona alrededor del centrosoma) (panel inferior). Barra de escala = 10 μm. La frecuencia de imagen es de 1 fotograma/s. Microscopía fluorescente de campo amplio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Seguimiento manual GFP-EB3 por el plugin ImageJ MTrackJ. Las pistas que reflejan el crecimiento de los microtúbulos se obtuvieron como resultado del marcado manual fotograma a fotograma de las puntas de las etiquetas GFP-EB3 en los extremos superiores durante 20 s de imagen. Fibroblastos cultivados transfectados, obtenidos de biopsia de piel de pacientes con EH. La frecuencia de imagen es de 1 fotograma/s. Microscopía fluorescente de campo amplio. Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Solución de problemas durante la toma de imágenes de los extremos superiores de los microtúbulos marcados con GFP-EB3. (A) Los microtúbulos marcados con fluorescentes están fuera de foco debido a la ausencia de un sistema de enfoque. (B) Los microtúbulos se estabilizan y pierden sus propiedades dinámicas debido a la sobreexpresión de GFP-EB3 en la célula debido a la larga incubación con la mezcla transfectante. (C) Reducción de la lámina celular como resultado de la fototoxicidad debido a la liberación de ROS. (D) La intensidad de la señal disminuye durante la toma de imágenes - fotoblanqueo rápido. Fibroblastos cultivados transfectados, obtenidos de biopsia de piel de pacientes con EH. La frecuencia de imagen es de 1 fotograma por segundo. Microscopía fluorescente de campo amplio. Barras de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Visualización selectiva de los extremos superiores de los microtúbulos en crecimiento. Marcador GFP-EB3 (verde) en diferentes áreas de células endoteliales humanas transfectadas (cultivo de HPAEC: Human Pulmonary Artery Endothelial Cells) en borde de ataque, cola y área central (zona alrededor del centrosoma). Barras de escala 10 μm. La frecuencia de la imagen es de 1 fotograma/s Microscopía fluorescente de campo amplio. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Figura complementaria 2: Análisis de la dinámica de los microtúbulos mediante la etiqueta GFP-EB3 después del seguimiento manual utilizando el complemento ImageJ MTrackJ. (A,B) Las pistas EB3 obtenidas por EB3-GFP parches de desplazamiento en series de lapso de tiempo de fibroblastos cultivados transfectados, obtenidos de la biopsia de piel de pacientes con EH (se colorean individualmente). (A) La pista EB3 (púrpura, No46) obtenida por los parches EB3-GFP se desplaza durante 18 segundos. (B) La pista EB3 (roja, No37) obtenida por EB3-GFP corrige el desplazamiento durante 9 segundos. (C) Cuantificación del desplazamiento de extremos positivos de los microtúbulos del fibroblasto cutáneo de pacientes humanos con EH que se muestra en (A). (D) Cuantificación del desplazamiento de los extremos superiores de los microtúbulos que se muestra en (B). El gráfico muestra que entre 6-8 segundos hay una pausa en el crecimiento del microtúbulo (no hay movimiento del extremo más). Haga clic aquí para descargar este archivo.
Expediente complementario 1: Análisis cuantitativo de la dinámica de los extremos positivos de los microtúbulos marcados con EB3-GFP. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Se pueden obtener resultados de mejor calidad para el análisis dinámico de microtúbulos a partir de imágenes microscópicas de alta calidad. Es importante observar todas las condiciones necesarias para la obtención de imágenes de lapso de tiempo de las células vivas y ajustar correctamente los parámetros de la imagen. El uso de platos especiales de cultivo celular con un fondo de vidrio (platos confocales) es importante, ya que el vidrio tiene un índice de refracción de la luz diferente al plástico. El grosor del vidrio y su uniformidad en toda su área también es extremadamente importante, ya que estos parámetros son cruciales para el enfoque normal de la muestra. La violación de estos parámetros conduce inevitablemente a una falla del sistema de enfoque perfecto, lo que resulta en un mal enfoque, lo que hace imposible usar dicho video desenfocado para el análisis(Figura 5A). Otra condición importante para las imágenes de células vivas es su protección contra las ROS. Se pueden utilizar varios reactivos para tales fines20. En nuestro trabajo, utilizamos aceite mineral, que aísla completamente el medio de cultivo de la atmósfera y evita el intercambio de gases. De la misma manera, se puede usar la oxirasa reductora de ROS, pero esta enzima no es adecuada para todos los tipos de células y es más a menudo aplicable a las imágenes con mayor tiempo.
Al elegir el tiempo óptimo de incubación de las células después de la transfección (24 o 48 h), se debe prestar atención al número de células transfectadas. Un número menor que el número máximo de células que expresan la proteína marcada ya es suficiente para el análisis. No se debe permitir la sobreexpresión porque los microtúbulos, en tales casos, están estabilizados y sus propiedades dinámicas no pueden ser analizadas(Figura 5B).
En algunos casos, puede ser necesario ajustar los parámetros de imagen de acuerdo con la reacción de las células después del inicio de la grabación de video. Por ejemplo, es posible observar la reducción de la lámina celular debido a la alta sensibilidad a la luz (fototoxicidad) (Figura 5C). Cuando se excitan, las moléculas fluorescentes suelen reaccionar con el oxígeno molecular para formar radicales libres que pueden dañar los componentes celulares21. Al diseñar experimentos, se deben seleccionar fluoróforos con la longitud de onda de excitación máxima posible para minimizar el daño celular bajo iluminación de onda corta. Además, hay informes de que ciertos componentes de los medios de cultivo estándar, incluida la vitamina riboflavina y el aminoácido triptófano, también pueden contribuir a los efectos adversos de la luz en las células cultivadas22. Entre otras cosas, esto puede ser causado por una cantidad excesiva de etiquetas fluorescentes en una célula. En estos casos, se hace necesario reducir la duración de la grabación y la intensidad de la iluminación. Otro posible problema también puede ser el fotoblanqueo rápido: disminución de la intensidad de la señal durante la grabación(Figura 5D). Este efecto debe tenerse en cuenta al seleccionar el siguiente objeto en el mismo plato experimental, ya que las células vecinas alrededor del área fotografiada también se queman.
Cabe mencionar que existen otros métodos para la visualización de microtúbulos en células vivas como la microinyección de tubulina marcada con fluorescentes en la célula o la transducción celular utilizando virus. Al igual que con cualquier otro método, hay ventajas y desventajas en el método de transfección. Sin embargo, desde nuestro punto de vista, en comparación con el método de inyección, la transfección es más efectiva y permite lograr la inclusión masiva de vectores de expresión en las células, lo que resulta en una gran cantidad de células fluorescentes para su análisis. Además, el método de transfección no requiere equipos y habilidades especiales del investigador. El método de transducción viral muestra buenos resultados y se puede aplicar. Aún así, no es adecuado para todos los cultivos celulares (en particular, es menos adecuado para fibroblastos humanos, obtenidos de la biopsia de piel de pacientes con EH).
El paso más crítico en este protocolo es la transfección realizada para garantizar una expresión suficiente de proteínas. Una buena relación señal-ruido, sin fotoblanqueo de microtúbulos y la ausencia de deriva celular durante la grabación de video de lapso de tiempo son absolutamente críticos para la obtención efectiva de imágenes de microtúbulos. En nuestroexperimento, la visualización de microtúbulos y el análisis dinámico proporcionan información vital sobre las propiedades y el comportamiento de los microtúbulos en las células con HTT mutante. Nuestro protocolo es aplicable para estudios de otras enfermedades para las que la patología implica propiedades dinámicas de los microtúbulos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación Rusa, subvención No. 075-15-2019-1669 (transfección de fibroblastos), por la Fundación Rusa de Ciencias, subvención No. 19-15-00425 (todos los demás trabajos sobre el cultivo de fibroblastos in vitro). Fue parcialmente apoyado por el programa de desarrollo de la Universidad Estatal de Moscú Lomonosov PNR5.13 (imágenes y análisis). Los autores reconocen el apoyo del Centro de Excelencia Nikon en el Instituto A. N. Belozersky de Biología Físico-Química. Queremos ofrecer nuestro agradecimiento especial a Ekaterina Taran por su ayuda con la actuación de voz. Los autores también agradecen a Pavel Belikov por su ayuda con la edición de video. Las figuras en el manuscrito fueron creadas con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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