Summary
このプロトコルは、EB3タンパク質トランスフェクションによる微小管プラスエンドビジュアライゼーションに専念し、一次細胞培養における動的特性を研究しています。このプロトコルは、ハンチントン病患者から得られたヒト原発性皮膚線維芽細胞に実施された。
Abstract
蛍光標識マーカータンパク質とタイムラプスビデオ顕微鏡との組み合わせでのトランスフェクションは、細胞骨格の動的特性を研究する古典的な方法です。このプロトコルは、ヒトの原発性線維芽細胞トランスフェクションの技術を提供し、一次細胞培養条件の詳細のために困難であり得る。さらに、細胞骨格の動的特性の維持は微小管の安定化を引き起こすことなく良好な信号対雑音比を得るためにトランスフェクションの低レベルを必要とします。光によるストレスや蛍光色素の退色から細胞を保護する対策を講じるのが重要です。私たちの研究の過程で、我々は人間の一次線維芽細胞研究に適した条件の最良の組み合わせを選択するために、異なるトランスフェクション方法とプロトコルだけでなく、異なるベクターをテストしました。得られたタイムラプス動画を解析し、ImageJを用いて微小管ダイナミクスを計算した。異なる細胞部分における微小管のプラスエンドのダイナミクスは似ていないので、我々は分析をサブグループ(中心領域、ラメラ、線維芽細胞の尾)に分けました。特に、このプロトコルは、患者のサンプルにおける細胞骨格動態の インビトロ 分析に使用することができ、様々な疾患の発症のダイナミクスを理解するための次のステップを可能にする。
Introduction
ハンチントン病(HD)は、タンパチンチンタンパク質(HTT)をコードする変異遺伝子によって引き起こされる不治の神経変性病理である。HTT は、主に小胞と微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセス1,2に関与している。微小管ダイナミクスに対する変異HTTの影響を研究するために、成長するプラスエンドを結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質のインビトロビジュアライゼーションを用いた。蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用した。この研究では、HD患者の皮膚生検から得られた原発性線維芽細胞培養を用いた。
HTTタンパク質遺伝子の変異は、ポリグルタミン管3の伸びにつながる。HTTは、エンドサイトーシス4、細胞輸送1、2、タンパク質分解5、等のような細胞プロセスにおいて役割を有する。これらのプロセスの大部分は、微小管を含む細胞細胞骨格の様々な要素を含む。
ヒトの初等細胞は、患者細胞で起こる事象を可能な限り密接に再現するのに最適なモデルです。このようなモデルを作成するには、ヒト生検材料(例えば、外科サンプルから)から細胞を分離する必要があります。得られた一次細胞株は、種々の遺伝的、生化学的、分子的、および細胞生物学の方法を用いて病原論を研究するのに適している。また、ヒト一次細胞培養は、様々なトランスフォー分化およびトランスジェニック培養を作成するための前駆体として機能する6。
しかし、不死化細胞培養とは対照的に、初代細胞の重大な欠点は、その限られた通過能力である。したがって、初期の通路段階(最大15)で細胞を使用することをお勧めします。古い文化は非常に迅速に退化し、そのユニークな特性を失います。したがって、新たに得られた一次細胞は、長期保存のために凍結しておくべきである。
一次細胞培養は、培養条件に影響を受けやすい。したがって、多くの場合、独自のアプローチと増大する条件の最適化が必要です。特に、我々の実験で使用されるヒト皮膚原発性線維芽細胞は、基質に要求されている。そこで、実験の種類に応じて、様々な追加コーティング(例えばゼラチンやフィブロネクチン)を用いた。
細胞骨格は、細胞の形状、移動度、および移動を決定します。細胞骨格の動態は、多くの細胞内プロセスにおいて、相間および有糸分裂の両方において極めて重要である。特に、チューブリンから重合した細胞骨格は、高い動的かつ極性構造であり、運動タンパク質媒介指向細胞内輸送を可能にする。微小管の末端は一定の再配置で、その組立相は分解相と交互に行われ、この動作は「動的不安定性」7、8、9と呼ばれる。様々な関連タンパク質は、重合反応の平衡をシフトし、ポリマー形成またはタンパク質モノマー形成のいずれかに導く。管状サブユニットの添加は、主に微小管10のプラスエンドで起こる。エンド結合(EB)タンパク質ファミリーは、EB1、EB2、EB3の3つのメンバーで構成されています。それらはプラスエンドトラッキングタンパク質(+TIP)として機能し、成長するプラスエンド11を結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節する。
多くの研究では、蛍光分子標識チューブリンマイクロインジェクションまたはトランスフェクションを使用して、タイムラプスイメージングとビデオ分析を行い、 インビトロで微小管を視覚化する。これらの方法は、細胞、特に初等ヒト細胞に侵襲的で有害である可能性があります。最も困難なステップは、細胞トランスフェクションの条件を見つけることです。生存率やネイティブ細胞形態に影響を与えることなく、可能な限り最高レベルのトランスフェクションに到達しようとしました。この研究は、健康なドナーとハンチントン病患者の皮膚線維芽細胞における微小管ダイナミクスの違いを研究するために古典的な方法を適用する。
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Protocol
このプロトコルは、2015年9月8日付の連邦医療生物機関の連邦研究および物理化学医療臨床センターのガイドラインに従っています。
注: 図 1 は、プロトコルの概要を示します。
1. ヒト皮膚線維芽細胞の一次培養を得る(図2)
- 50 μg/mLのペニシリンと50 U/mLのストレプトマイシンを補った、ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)培地で、数時間以内に検査室に生検を届けます。
注:皮膚生検は、患者がインフォームド・コンセントに署名した後、医師によって無菌状態で行われなければなりません。 - 生検組織を少量の培地と共に6cmのペトリ皿に入れます。
- 無菌メスを使用して、生検サンプルを約0.5〜1mmの大きさに切ります。1-2で得られた断片を3.5cmのペトリ皿に入れ、生検片の上に無菌カバースリップを置きます。次の組成物に1.5mLの成長培地をゆっくりと加える:DMEM、50 U/mLペニシリンストレプトマイシン、および10%牛血清(FBS)。
- 培養線維芽細胞は、CO2インキュベーター内部の成長培地中で、5%CO2、37°C、80%湿度で維持した。
注:4-7日後、最初のケラチノサイト、次に線維芽細胞は、組織から皿の底に移行し始めます。
2. 一次文化の貯蔵、凍結、凍結解除
- 培養皿から細胞を取り除きます(ポイント3.2-3.4を参照)。
- 細胞懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移し、遠心分離機を200 x gで5分間移動 します。その後、上清を捨て、冷却されたFBSの900 μLで細胞ペレットを再懸濁します。
- 凍結保存チューブに滴下し、100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えます。
- 低温冷凍庫に-80°Cでクライオプローブを入れる。 24時間後、長期保存のために凍結窒素を液体窒素(−−196°C)に移します。
- 凍結保存された細胞を解凍するには、窒素貯蔵から凍結を取り出し、1分以内に、37°Cに予熱した輸送媒体の9mLを含む15mL円錐状のチューブに1mLの含有量を移す。
- 慎重に再中断し、200 x gで5分間チューブを遠心分離します。上清を捨て、細胞ペレットを必要量の成長培地に再懸濁し、所要径のペトリ皿の上に置く。
3. 細胞培養
- 蒸留水で作られたオートクレーブ0.1%ゼラチン溶液で皿底を覆います。15分間インキュベートします。
注:トランスフェクションビジュアライゼーションには、ガラス底プレート皿(ガラス厚170 μmの共焦点皿)を使用する必要があります。 - 以下の組成物を有する培地を調製する:DMEMは10%FBS、2 mM L-アラニル-L-グルタミン、50 U/mLペニシリン連鎖球菌シンを添加した。十分に混ぜ合わせ、4°Cで保存します。 培地を37°Cに温め、細胞に加えます。
- 顕微鏡下で培養を評価する。培地を取り出し、Dulbeccoのリン酸塩溶液(DPBS)で線維芽細胞を洗います。
- 細胞に1mLのプリ加温0.25%トリプシン溶液を加えます。基板から完全に切り離す場合は、顕微鏡下の細胞を確認してください。1 mLの培養培地でトリプシンを非アクティブ化する。
- 細胞懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移します。チューブを5分間200xgで遠心分離し、上清を取り除き、培養液の1mLで細胞ペレットを再懸濁する。
- セルの数をカウントします。8-15 x 103/cm2 の密度でそれらを播種し、培養培地の2 mLで再中断するために必要な数の細胞を計算します。
- ゼラチン溶液を培養皿から取り出し、すぐに2mLの細胞懸濁液を加える。CO2インキュベーターで37°Cで線維芽細胞を栽培します。
- 2~4日ごとにメディアをリフレッシュします。
メモ:実験では、4-11の通路のセルを使用してください。
4. トランスフェクション
- 培養前に培養液を24時間新鮮な培養培地に交換する。
注: 細胞合流は 70-80% である必要があります。 - 細胞の播種の面積と密度に基づいてDNA-脂質複合体を調製する。リポソーム系トランスフェクション剤を使用する。
注:セルシード密度を1 x 104 セル/cm2として使用してください。 - 3 μLの市販トランスフェクション試薬を、チューブの壁に触れることなく、抗生物質を含まない最適な最小必須培地(Opti-MEM)の125 μLに添加します。穏やかに再中断します。
- プラスミドDNA(GFP-EB3)を1μg添加して、125μLのオプティ-MEMに添加した。穏やかに再中断します。
注:GFP-EB311 をコードする発現ベクターは、A.アフマノワ博士(エラスムス大学、ロッテルダム)11の許可を得て、I.カベリナ博士(ナッシュビルのヴァンダービルト大学)から親切な贈り物として受け取りました。 - 希釈されたトランスフェクション試薬の各チューブに希釈プラスミドDNAを加える(1:1)。30分間インキュベートします。
- 細胞を含む6cmのペトリ皿にDNA-脂質複合体を加え、30sの十字架スイングと混合する。トランスフェクション剤を24時間インキュベートし、次いで新鮮な培地に変える。24時間および48時間後のトランスフェクションの効率を分析する。
注:トランスフェクション後24時間、効率は10〜15%、48時間後に40%までであった。
5. イメージングの準備
- 細胞の生画像化の前に、自己蛍光を低減するためにpH-indicator色素のない培地に培養培地を変更する。
- ミネラルオイルを培地表面に慎重に塗布して培地を完全に覆い、外部環境から単離してO2 の浸透と媒体の蒸発を低減する。
- 水銀ランプと油浸漬60倍または100xの対物レンズを使用して、高い数字の開口を使用して画像を撮影します。
注:生体内観察のために、顕微鏡は、物体テーブルとレンズを+37°C、CO2供給付きの密閉室、湿度レベルの支持に加熱するなど、細胞に必要な条件を維持するためにインキュベーターを装備する必要があります。湿度を作るために二重蒸留水を使用してください。撮影前に二重蒸留水のレベルを確認してください。 - 画像化の前に、顕微鏡ホルダーに細胞と共焦点皿を置きます。画像を撮りながら漂わないように、皿とカメラがホルダーにしっかりと取り付けられていることを確認してください。
6. イメージングパラメータの設定
- 光は細胞損傷性活性酸素種(ROS)を誘導するので、低露出値を選択してください。
注:ヒト皮膚線維芽細胞における微小管の動態を研究するために、300msの曝露が選択されました。 - 関心のある対象に焦点を当てます。
メモ:長期的なタイムラプスイメージングの場合は、自動フォーカス安定化システムを使用して、Z軸に沿ったシフトの可能性を補正します。 - 細胞の光感度と蛍光色素のフェージングの速度に応じて、最適なイメージング条件を選択します。
メモ:微小管は非常に動的な構造であるため、適度に短い時間間隔を選択することができ、フレームレートは十分に高くなければなりません。皮膚線維芽細胞の微小管ダイナミクスを調べるには、1フレーム/sの周波数で3〜5分間使用しました。 - 次のオブジェクトを選択してイメージを取得する場合は、すでにイメージされた領域から離します。このエリアは光の影響を受け、目立つ写真漂白が発生します。
注:比較的高い画像周波数を使用しているため、画像間のシャッターが閉じ、画像撮影の全期間、ランプが点灯し、フェージングが増加しました。 - トランスフェクションの品質、微小管の画像の品質(最適な信号対雑音比)、および分析された細胞の場合のドリフトの欠如を考慮して、微小管のダイナミクスを視覚的に研究するための最適なビデオを選択してください(図3)。
- 選択したビデオを使用して、ImageJ または Fiji プログラムでマイクロチューブのプラスエンドダイナミクスをトレースして、マイクロチューブのプラスエンドダイナミクスを調べることができます (図 4)。
注: 定量的分析命令については 、図 2 および 補足ファイル 1を参照してください。
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Representative Results
生成された GFP-EB3 ムービーは、プロトコルを使用して生成されます (図 1) マイクロチューブの動的特性を示しています。微小管は異なる細胞プロセスに関与しており、その動的特性は患者の生検材料からの原発ヒト細胞培養の様々な生命特性に影響を与える(図2)。
次のパラメータは、微小管の動的不安定性を決定します: 成長の速度 (重合) と縮小 (脱重合);大惨事の頻度(重合から脱重合への移行);救助の頻度(重合解除から重合への移行);一時停止と同様に - 微小管が重合せず、12を非重合しない状態。すべてのパラメータは厳しく調節されており、個々の微小管の重合率および脱重合率は、同じ細胞タイプ13、14、15、16、17の両方で有意に変動する可能性がある。
微小管は、細胞内での位置によって異なるダイナミクスを持つことができることを分析のために考慮する必要があります。核と中心の領域に位置する微小管は、細胞周辺19上のものと比較して異なる振る舞いがする。したがって、信頼性の高い結果を得るために、細胞の3つの別々の領域(中央部、先端エッジ、および尾部)で微小管の動的測定を行いました(図3)。種々の細胞部分におけるGFP-EB3標識の正しい分布を制御するために、我々はヒト肺動脈内皮細胞(HPAEC)を使用した(補足図1参照)。
ImageJ やフィジー (ImageJ 2 v1. 53i) などの特殊なプログラムでは、次のパラメータでビデオを分析できます。(2) 大惨事の頻度(3) 救助の頻度;(4) 一時停止の頻度;および (5) 一時停止の期間。さらに、独自のプログラムオプションとプラグインは、自動的に18 または手動でトレースを 可能にします 19 (図 4)。自動計測はエラーが大きくなる傾向があり、より正確な結果を得るためには繰り返しが必要になるため、手動トレース法は実験でうまく機能しました。微小管ダイナミクスデータ解析の詳細な手順は、 補足図 2 および 補足ファイル 1を参照してください。
イメージングパラメータは、イメージングプロセス中に調整が必要な場合があります。たとえば、1つのセルイメージングの持続時間と露光値を変更できます。このような設定は、高速信号のバーンアウトがある場合、またはセルが縮小する場合に役立ちます (図 5)。
図1:ヒト皮膚原発性線維芽細胞培養のためのGFP-EB3トランスフェクションプロトコルの一般的なスキーム プロトコルには、トリプシン溶液による細胞のデタッチの手順が含まれます。中程度の添加によるトリプシンの不活性化;得られた化合物の遠心分離;細胞濃度の計算;ゼラチンでコーティングされたガラス底皿(共焦点皿)に細胞播種;細胞培養は、リポソームトランスフェクション試薬を用いたプラスミドDNA(GFP-EB3による)によるトランスフェクション;インキュベーション 24-48 時間;顕微鏡下で分析します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ヒト皮膚線維芽細胞一次培養調製スキーム 皮膚生検は、患者がインフォームド・コンセントに署名した後、医師によって無菌状態で行われなければならない。その後、組織の一部は、シャーレの実験室にFBSなしで少量の培地で輸送されます。大きな組織の断片は0.5〜1mmの大きさに切断され、FBSを搭載したカバーガラスで覆われています。その後、ペトリ皿をCO2 インキュベーターに入れ、4〜7日後に線維芽細胞が組織断片からガラス底に移行する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HD患者の皮膚生検から得られる、トランスフェクトされたヒト線維芽細胞の異なる領域のGFP-EB3マーカー(緑色 ):先端(上パネル);テール(中央パネル);線維芽細胞の中央部(セントロソームの周りのゾーン)(下部パネル)。スケールバー= 10 μmイメージングの周波数は 1 フレーム/sです。広視野蛍光顕微鏡。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:イメージJプラグインMTrackJによるGFP-EB3マニュアル追跡 微小管の成長を反映したトラックは、イメージングの20sの間にプラスエンドでのGFP-EB3ラベルチップのフレームごとの手動マーキングの結果として得られた。トランスフェクトされた培養線維芽細胞は、HD患者の皮膚生検から得られる。イメージングの周波数は 1 フレーム/sです。広視野蛍光顕微鏡。スケールバー= 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:微小管プラス末端と標識されたGFP-EB3のイメージング中のトラブルシューティング(A)蛍光標識微小管は、焦点システムがないため焦点が合っていない。(B)微小管は、トランスフェクション混合物との長いインキュベーションのために細胞内のGFP-EB3の過剰発現のために安定し、その動的特性を失う。(C)ROSの放出による光毒性の結果として細胞ラメラの縮小。(D)イメージング中の信号強度低下 - 急速な光の漂白。トランスフェクトされた培養線維芽細胞は、HD患者の皮膚生検から得られる。撮像頻度は1フレーム/秒です。広視野蛍光顕微鏡。スケールバー= 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助図1:成長する微小管プラスエンドの選択的可視化。 GFP-EB3マーカー(緑色)は、ヒト内皮細胞のトランスフェクトされた異なる領域(HPAECの培養:ヒト肺動脈内皮細胞の培養)の先端、尾部および中央領域(中心領域の周囲の領域)である。スケールバー10 μm。画像化周波数は1フレーム/s広視野蛍光顕微鏡です。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:ImageJプラグインMTrackJを使用した手動追跡後のGFP-EB3ラベルによる微小管ダイナミクス分析(A,B)EB3-GFPパッチにより得られたEB3トラックは、HD患者の皮膚生検から得られる、トランスフェクトされた培養線維芽細胞のタイムラプス系列に変位する(個別に着色されている)。(A)EB3 トラック (紫, No46) EB3-GFP パッチ変位で 18 秒の間に.(B)EB3トラック(赤、No37)により得られたEB3-GFPパッチが9秒間変位する。(C) ヒトHD患者の皮膚線維芽細胞の微小管のプラスエンド変位の定量化(A)(D) に示す微小管のプラスエンド変位の定量化 (B)グラフは、6~8秒の間に微小管の成長が一時停止していることを示しています(プラスエンドの動きはありません)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:EB3-GFP標識微小管プラス末端のダイナミクスの定量分析。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
微小管のダイナミクス解析の品質の向上は、高品質の顕微鏡画像から得ることができます。生きている細胞のタイムラプスイメージングに必要なすべての条件を観察し、イメージングパラメータを正しく調整することが重要です。ガラスはプラスチックとは異なる屈折率を有するため、ガラス底部(共焦点皿)を備えた特殊な細胞培養皿を使用することは重要である。ガラスの厚さと領域全体の均一性も非常に重要です。これらのパラメータの違反は必然的に完璧なフォーカスシステムの障害を引き起こし、その結果、フォーカスが悪くなり、そのような焦点外のビデオを分析に使用することが不可能になります(図5A)。生細胞イメージングのもう一つの重要な条件は、ROSからの保護です。このような目的のために種々の試薬を用いることができる20.私たちの仕事では、大気中から培地を完全に分離し、ガス交換を防ぐ鉱物油を使用しています。同様に、ROS還元オキシラーゼも使用できますが、この酵素はすべての細胞タイプに適しておらず、時間の増加によるイメージングに適しています。
トランスフェクション後の細胞の最適なインキュベーション時間(24または48時間)を選択する場合、トランスフェクトされた細胞の数に注意を払う必要があります。標識されたタンパク質を発現する細胞の最大数よりも小さい数は、すでに分析に十分である。このような場合、微小管は安定化され、動的プロパティを解析できないため、過剰発現は許可されません (図 5B)。
場合によっては、ビデオ記録開始後の細胞の反応に応じて撮像パラメータを調整する必要がある場合がある。例えば、光に対する高感度(光毒性)による細胞ラメラ収縮(光毒性)を観察することができる(図5C)。励起されると、蛍光分子は通常、分子酸素と反応して、細胞成分21に損傷を与えるフリーラジカルを形成する。実験を設計する際には、短波照明下での細胞損傷を最小限に抑えるために、可能な最大励起波長の蛍光色素を選択する必要があります。また、リボフラビンビタミンやトリプトファンアミノ酸を含む標準的な培養培地の特定の成分が、培養細胞22に対する光の悪影響にも寄与する可能性があるという報告がある。とりわけ、これは1つの細胞内の過剰な量の蛍光標識によって引き起こされる可能性がある。これらの場合、記録の持続時間および照明の強度を低減する必要が出る。別の考えられる問題は、急速な光の点滅である可能性があります - 記録中の信号強度の減少(図5D)。この効果は、同じ実験皿の次のオブジェクトを選択する際に考慮する必要があります。
蛍光標識チューブリンの細胞への微小注入やウイルスを用いた細胞の細胞トランスダクションのような生細胞における微小管の可視化のための他の方法があることを言及すべきである。他の方法と同様に、トランスフェクション法には利点と欠点があります。しかし、我々の観点からは、注入法と比較して、トランスフェクションがより効果的であり、細胞内に発現ベクターを大量に含めることを可能にし、分析のための多数の蛍光細胞を生じさせる。また、トランスフェクション法は研究者からの特別な機器や技能を必要としません。ウイルスの伝達の方法は、良好な結果を示し、適用することができます.それでも、全ての細胞培養に適しているわけではない(特に、HD患者の皮膚生検から得られるヒト線維芽細胞にはあまり適していない)。
このプロトコルの最も重要なステップは、十分なタンパク質発現を確保するために行われるトランスフェクションです。良好な信号対雑音比、微小管の光化、およびタイムラプスビデオ録画中の細胞漂流の欠如は、効果的な微小管イメージングにとって絶対に重要です。我々の実験では、 微小管の可視化と動的解析は、変異HTTを有する細胞内の微小管の特性および挙動に関する重要な情報を提供する。我々のプロトコルは、病理が微小管の動的特性を含む他の疾患の研究に適用される。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、ロシア連邦の科学と高等教育省によって資金提供されました, 助成金0. 075-15-2019-1669 (線維芽細胞のトランスフェクション), ロシア科学財団によって, 助成金第19-15-00425 (vitroで線維芽細胞の栽培に関するすべての他の作品).これは、ロモノソフモスクワ州立大学開発プログラムPNR5.13(イメージングと分析)によって部分的にサポートされました。著者らは、A.N.ベロゼルスキー物理化学生物学研究所のニコン・センター・オブ・エクセレンスの支援を認めている。エカテリーナ・タランに、声優の支援をしてくれた方に、特別な感謝を申し上げたいと思っています。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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