Summary
Detta protokoll introducerar steg för metabarkodningsanalys, med inriktning på 16S rRNA- och 18S rRNA-gener, för övervakning av skadliga algblomningar och deras tillhörande mikrobiom i havsvattenprover. Det är ett kraftfullt molekylärt baserat verktyg men kräver flera procedurer, som förklaras visuellt här steg för steg.
Abstract
Övervakning av skadliga algblomningar (HAB) har genomförts över hela världen, och Chile, ett land som är känt för sitt fiske och vattenbruk, har intensivt använt mikroskopiska analyser och toxinanalyser i årtionden för detta ändamål. Molekylärbiologiska metoder, såsom DNA-sekvensering med hög genomströmning och bakteriella monteringsbaserade metoder, har precis börjat införas i chilensk HAB-övervakning, och förfarandena har ännu inte standardiserats. Här introduceras 16S rRNA och 18S rRNA metabarcoding analyser för övervakning chilenska HABs stegvis. Enligt en ny hypotes spelar alg-bakteriell mutualistic association ett kritiskt synergetiskt eller antagonistiskt förhållande som står för blomma initiering, underhåll och regression. Övervakning av HAB ur alg-bakteriella perspektiv kan således ge en bredare förståelse för HAB-mekanismer och grunden för tidig varning. Metabarkodningsanalys är ett av de bäst lämpade molekylärbaserade verktygen för detta ändamål eftersom det kan upptäcka massiv alg-bakteriell taxonomisk information i ett prov. De visuella förfarandena för provtagning till metabarkodningsanalys häri ger specifika instruktioner som syftar till att minska fel och insamling av tillförlitliga data.
Introduction
Många marina fytoplanktonarter är kända för att producera endogena toxiner, och när dessa arter ackumuleras i tillräckligt antal är de skadliga för den marina miljön. Sådana skadliga algblomningar (HABs) observeras idag vid kusterna på de flesta kontinenter i världen1. Giftiga fytoplankton ackumuleras först i tvåskaliga vävnader, vilket leder till sjukdom och död i högre trofiska nivåer av organismer, inklusive människor, vid matsmältningen. Därefter får dessa händelser allvarliga konsekvenser för den lokala ekonomin, den socioekonomiska ekonomin och folkhälsan2. De skador på den globala ekonomin som orsakas av HAB uppskattas till miljoner till miljarder dollar varje år3. Chile är ett av många länder som lider av frekventa HAB.
Chile är ett land med lång mark som sträcker sig över 4 300 km norr och söder. Det långsträckta västra landet vetter mot Stilla havet, vilket naturligtvis ökar chanserna för Chile att uppleva HABs. Särskilt i södra Chile finns det många världsberömda lax vattenbruk, och varje gång en HAB förekommer i regionen resulterar algtoxinerna i massiv odlad lax som blir sjuk och dör4,5,6. I Chile var året då HAB drabbade ekonomin hårdast 2016, med en beräknad årlig förlust på 800 miljoner US-dollar7,8. De orsakande giftiga algarterna varierar beroende på år och plats. För 2016-fallet orsakade ett komplex av Alexandrium catanella och Pseudochattonella verruclosa en utbredd HAB i större delen av södra Chiles kust7,8. Den senaste HAB i Chile inträffade med den orsakande algarten Heterosigma Akashiwo i mars 2021 i Camanchaca, som ligger i södra Chile, där området har en stor laxodling.
Chile har genomfört kustövervakning i många år med två huvudmetoder. observera havsvatten med mikroskop för att regelbundet identifiera giftiga algarter och mäta toxinnivåer i skaldjur genom biokemiska analyser9. Tidig upptäckt av giftiga alger och toxinnivåer i skaldjur hindrar inte HABs; Dessa analyser kan dock utlösa omedelbara motåtgärder och minska skadorna på lokalsamhällena. För att ytterligare stärka effektiviteten i denna strategi lades nyligen en molekylärbaserad analysmetod till i vårt konventionella chilenska HAB-övervakningsprogram för att upptäcka alger och relaterade bakteriesamhällen i havsvattenprover. Specifikt valdes en massiv parallell sekvenseringsmetod med metabarkodning som riktar sig mot 16S rRNA- och 18S-rRNA-gener. Även om denna teknik kräver komplicerade procedurer och dyra maskiner och reagenser, är det en avancerad teknik som kan upptäcka tusentals alger och bakteriesläkten / arter som finns i ett havsvattenprov på en gång.
Orsakerna till HAB spekuleras vara olika, såsom temperatur och säsong, men det är omöjligt att generalisera dem. Detta beror på att HAB-arter och frekvenser beror på regionen och spatiotemporala förhållanden, som involverar naturfenomen som geografisk unikhet, uppvällning av näringsämnen och elementavrinning från land på grund av errosion2,10,11,12. Dessutom påverkar artificiella faktorer som övergödning lokala HABs12,13. På grund av den komplexa multifaktorn är det inte lätt att göra en korrekt HAB-förutsägelse. Under de senaste åren finns det en uppfattning att specifika bakteriepopulationer kan vara relaterade till utvecklingen av HABs som en av faktorerna, och forskning för att stödja denna hypotes har blivit alltmer uppenbar14,15,16,17,18. Molekylärbiologiska tekniker används vanligtvis för att studera bakteriell sammansättning; En sådan standardiserad metod har dock ännu inte fastställts i chilensk HAB-övervakning9. För att studera alg-bakteriell associering med HABs, är det absolut nödvändigt att samtidigt utföra metabarkodningsanalys för de nuvarande chilenska kustövervakningsprogram. Således introducerar detta protokoll visuellt vårt chilenska HAB-övervakningsprogram, med fokus på ett stegvis förfarande för att analysera upptäckt av alger och bakterier i havsvattenprover med hjälp av metabarkodningsanalys.
Det fullständiga protokollet som beskriver vårt chilenska HAB-övervakningsprogram finns i Yarimizu et al.9. Det omfattar förfaranden för provtagning av havsvatten, mikroskopisk upptäckt av algarter, algal-bakteriell gendetektering, pigmentanalys, meteorologisk datainsamling och fysiska och kemiska vattenegenskapsanalyser. Det stegvisa protokollet för 16S rRNA och 18S rRNA metabarcoding analys för alg och bakteriell art upptäckt finns som en preprint19. Detta protokoll visar särskilt metabarkodningsanalyssteg eftersom det är den mest komplicerade delen och höjdpunkten i vårt HAB-övervakningsprogram. Detta protokoll innehåller också en introduktion av programmet och mikroskopidetektering av algarter. Vid analys av algarter genom metabarkodning är det viktigt att samtidigt utföra mikroskopi för att verifiera resultaten från de två metoderna. Det här protokollet innehåller inte hur du använder programvara för taxonomitilldelning, men databasrekommendation anges kort i slutet av följande avsnitt.
Protocol
1. Provtagning och förbehandling
- Samla in cirka 3 L vattenprov från målpunkten.
- Filtrera 1 L vattenprov för 16S rRNA-analys genom en tandemfiltrering (1 μm och 0,2 μm porstorleksmembran) för att separera frilevande och bifogade bakterier.
- Filtrera ytterligare 1 L vattenprov för 18S-rRNA-analys (fytoplanktondetektering) genom en enda filtrering med ett 0,2 μm membran.
OBS: Filtreringen av vattenprovet måste slutföras inom 12 timmar från provtagningen. - Skär filtrerat membran i hälften med steril kirurgisk sax och linda det med aluminiumfolie. Förvara vid -20 °C i upp till 1 månad eller gå vidare till nästa steg.
- Extrahera DNA med Chelex-metoden enligt beskrivningen9. Förvara vid -20 °C i upp till 1 månad.
2. Mikroskopanalys
- Överför 1 ml vattenprovet med en pipett till en 1 mL rutnätsrutschbana.
- Observera provet under ett mikroskop.
- Registrera namn och mängd fytoplanktonarter.
3. 16S rRNA och 18S rRNA metabarkodningsanalys
OBS: Denna process består av sju sektioner: förberedelse, första PCR amplicon generation, första amplicon rensning, indexering efter andra PCR, andra PCR amplicon verifiering och rensning, DNA koncentration justering och DNA denaturation och sekvensering. Hela processen tar minst 5 dagar (40 h) av en erfaren labbpersonal. Se tabellen över material för produktnummer och tillverkning.
- Förberedelse
- Rengör pipetter och laminärt huvskåp med 70% etanol följt av UV-exponering i 30 min ofta. Sterilisera material som ska användas.
- Tina DNA-prover vid rumstemperatur, centrifugera vid 100 x g i 2 minuter och överför 100 μL av varje provs supernatant till 8-rörsremsor.
- Första PCR amplicon-generationen
OBS: Utför följande procedurer i ett laminärt huvskåp. Späd alltid ut primers från 1 μM-buljong till målkoncentrationen med PCR-vatten för att undvika primerförorening.- Förbered den första PCR-huvudblandningen i ett sterilt 1,5 ml-rör för reaktioner(tabell 1, tabell 2).
- Alikvot 22,5 μL av huvudblandningen i en 8-rörsremsa och tillsätt 2,5 μL DNA-prov. Använd 2,5 μL PCR-vatten för negativ kontroll.
- Kör den första PCR-cykeln(tabell 3).
- Förbered 100 ml 2% Agarose-TBE-gel som innehåller 10 μL 1x nukleinsyragelfläck.
- Ladda en blandning av 1,5 μL 1x DNA-belastningsfärg och 4 μL PCR-produkt på agarosgelen. Ladda också 100 bp DNA-stege på gelén.
- Utför elektrofores vid 100 V i 30 min.
- Se till att det finns ett band på 500-600 bp-räckvidd under en UV-ljusbildinspelning. Primer-dimer band är runt 80 bp.
OBS: Marina vattenprover innehåller PCR-hämmare. Saknade ampliconer kan ibland lösas genom att späda ut prover 1:100 eller 1:1000 med PCR-vatten. - Förvara de första PCR-produkterna vid -20 °C till nästa steg.
VARNING: Överskrid inte en veckas lagring.
- Första PCR amplicon rensning
OBS: Denna sektion kan utföras utanför ett laminärt huvskåp.- Använd magnetiska pärlor DNA-rensningssystem för att ta bort PCR-reaktionsrester, inklusive primer-dimer produkter.
- Överför 20 μL av varje rengjord första PCR-produkt till en ny 96-brunnsplatta. Försegla plattan med en mikrotätningsfilm. Förvara vid -20 °C tills nästa steg fortsätter.
VARNING: Överskrid inte mer än en veckas lagring.
- Indexering efter andra PCR
OBS: I det här avsnittet kommer renade första PCR-produkter att förstärkas med olika indexprimerkombinationer.- Späd alla index 1- och index 2primrar(tabell 4) till 1 μM med PCR-vatten i 8 rörs PCR-remsor placerade i ett laminärt huvskåp.
OBS: Stegen hädanefter i det här avsnittet kan utföras utanför ett laminärt huvskåp, eftersom indexprimrar är specifika för den första PCR-reaktionsöverhängsadaptern. - Placera index 1 primer i en vågrät rad Index 2 primers i en lodrät rad(tabell 5).
- Tillsätt 12,5 μL varmstartsklar formulering till varje brunn i en ny 96-brunnsplatta.
- Tillsätt 2,5 μL av varje indexprimer (1 μM) till varje samt i tabell 4 med hjälp av en flerkanalspipett.
- Tillsätt 7,5 μL renad första PCR-produkt.
- Blanda försiktigt genom pipettering upp och ner 10 gånger. Täck plattan med en mikrotätningsfilm.
- Kör den andra PCR-cykeln(tabell 3).
- Håll plattan vid -20 °C.
VARNING: Överskrid inte en veckas lagring.
- Späd alla index 1- och index 2primrar(tabell 4) till 1 μM med PCR-vatten i 8 rörs PCR-remsor placerade i ett laminärt huvskåp.
- Andra PCR amplicon verifiering och rensning
- Använd en fragmentanalysator och tillhörande reagens. Virvel och spinna ner reagens före användning.
- Låt provbufferten och DNA-skärmtejpen balansera vid rumstemperatur i 30 minuter. Placera sedan DNA-skärmbandet i en fragmentanalysator.
- Blanda 2 μL provbuffert och 3 μL andra PCR-amplicon i nya 8 rörremsor. Sätt in de 8 rörremsorna i fragmentanalysatorn. Tryck på Kör för att starta.
VARNING: Bildandet av luftbubblor måste undvikas. - Se till att andra PCR-ampliconer är cirka 613 bp (600 - 630 bp) för både 16S och 18S rRNA gener.
- Rena andra PCR-produkter med hjälp av ett DNA-rensningssystem för magnetiska pärlor.
- Justering av DNA-koncentration
- Mät DNA-koncentrationen i de renade andra PCR-produkterna med hjälp av en nukleinsyrakvantifieringsspektrofotometer.
- Beräkna målgenkoncentrationen i nM, med hänsyn till den genomsnittliga slutliga biblioteksstorleken som 613 bp för både 16S- och 18S-rRNA-gener:
- Späd varje renad andra PCR-produkt med sterilt PCR-vatten till 4 nM i en ny 0,2 mL 96 brunnsplatta.
OBS: Plattan kan förvaras vid -20 °C här. Annars måste resten av förfarandena utföras utan att stoppas. - Aliquot 3 μL av varje 4 nM andra PCR-produkt och blanda allt i ett nytt sterilt 1,5 ml-rör som ett poolat bibliotek. Håll röret vid 4 °C eller på isbad hela tiden.
- Mät koncentrationen av det poolade biblioteket för bekräftelse med hjälp av en nukleinsyrakvantifieringsspektrofotometer. Justera koncentrationen till 4 nM om den är högre än 4 nM.
OBS: Överkoncentrerat DNA producerar överskattade läsnummer, vilket hämmar analysen.
- DNA-denaturering och sekvensering
OBS: I det här avsnittet används Illumina MiSeq-system med specifika reagenser. Se produktnummer i Tabellen över material.
OBS: Följ strikt tiden. Tina upp alla reagenser utom patroner på dagen för sekvensering.- En dag före sekvensering, ta bort en förfylld reagenspatron som är klar att använda från -20 °C och förvara vid 4 °C för upptining.
- Ställ in ett värmeblock som lämpar sig för 1,5 ml centrifugrör till 96 °C.
- Placera hybridiseringsbufferten på is.
- Späd NaOH av molekylär kvalitet från 1 N till 0,2 N i ett nytt rör med PCR-vatten.
- Späd ut ett färdigt kontrollbibliotek med TE-buffert (pH 8.0) från 10 nM-lager till 4 nM i ett nytt rör (dvs. 2 μL kontrollbibliotek + 3 μL TE-buffert).
- Blanda 16 μL av 4 nM poolat provbibliotek med 4 μL 4 nM kontrollbibliotek i ett nytt rör märkt "1".
- Blanda 10 μL prov i rör "1" med 10 μL 0,2 N NaOH i ett nytt rör märkt "2".
- Virvla röret 2 för 5 s, snurra ner kort och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Tillsätt 980 μL hybridiseringsbuffert till rör 2.
- Blanda 260 μL från rör 2 med 390 μL i ett nytt rör märkt "3". Blanda genom att vända röret.
- Inkubera rör 3 vid 96 °C i 2 minuter och placera det omedelbart på is i högst 2 min.
- Ta bort patronen från 4 °C kylskåp.
- Ställ in exempelbladet för sekvensering med varje motsvarande index 1 och index 2-kort som i tabell 6.
- Ta bort flödescellen från MiSeq v3-satsen. Rengör försiktigt flödescellen med sterilt PCR-vatten av molekylär kvalitet.
OBS: Häll inte vatten på kapillärpnarna i flödescellen. Torka försiktigt bort vatten från flödescellen med icke-fibrösa papper. - Ladda hela volymen rör 3 (650 μL) i patronen.
- I instrumentdriftsprogram väljer du sekvensering och följer instruktionerna. Sätt in flödescell, inkorporeringsbuffert och patron. Läs in provblad. Tryck på Kör för att starta reaktionen.
OBS: Den här sekvenskörningen tar 3-5 dagar. Data laddas automatiskt upp till Basespace-plattformen. Rådata lagras i två mappar i datorn: Analysmapp som innehåller fastq-filer och utdata som innehåller bcl-filer och jpeg-bilder.
4.Taxonomisk uppgift att sekvensera data
- FASTQ filbehandling
OBS: DADA2-paket23 av R24 är en av rekommenderade databaser för att bearbeta FASTQ-filer. Riktlinjen finns på [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2]. Denna riktlinje utarbetades genom att anta den senaste versionen av DADA2 pipeline tutorial [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html].- Bearbeta råa FASTQ-parade slutsekvenser för trimning, kvalitetsfiltrering, dereplikation och räkning av unika sekvenser, provinferens, sammanslagning till contigs och borttagning av chimeriska sekvenser.
- Använd följande DADA2 specificerade parametrar för både 16S rRNA och 18S rRNA genfragment; trimLefts=0, 0, truncLens=[Kontrollera sekvenskvaliteten och ställ in den på en lämplig längd].
STANDARDvärden för de andra parametrarna är maxN=0, maxEE=2,2, trancQ=2.
- Taxonomi-uppdrag
OBS: SILVA rRNA-databasen rekommenderas för taxonomitilldelning för DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz anges som standard].- Ta bort kloroplast och mitokondriella OTUs för 16S rRNA genfragment analys. Ta bort singletons från 16S rRNA och 18S rRNA-analys.
- Rarifiera alla prover till jämnt sekvenseringsdjup baserat på att provet har det lägsta sekvenseringsdjupet.
- Registrera antalet läsningar, OTU:er som tilldelats och på vilken nivå, filtrerade läsningar och antalet singletons som uteslutits.
- Statistisk analys
- Utför statistisk analys på mikrobiella data med R-förpackningar med phyloseq25 och vegan26.
Representative Results
Detta protokoll använder 18S rRNA genmetabarkodningsanalys för att identifiera algarter i havsvattenprover. Ett representativt resultat visas i figur 1, där havsvattnet som samlats in från Metri, Puerto Montt, Chile (−41.597; −72.7056) den 19 februari 2019, analyserades med detta protokoll. Resultatet visade totalt 13 750 avläsningar med över 30 algarter i havsvattenprovet. Den dominerande algen i detta prov var Navicula spp. med ett relativt överflöd på 70,77%. Dessutom observerades tillräckligt med överflöd för Micromonas (6,40%), Chaetoceros spp. (4,44%), Scripsiella spp. (2,44%), och Prorocentrum spp. (1.28%). Pseudochattonella spp., en av de högsta giftiga alg orsakssamband av chilenska HAB, upptäcktes med 0,52% från detta havsvattenprov.
För att kontrollera uppgifternas tillförlitlighet jämfördes algarten som identifierades genom 18S rRNA-genanalys med dem som erhållits genom mikroskopi i samma havsvattenprov(figur 2). I överensstämmelse med 18S rRNA genanalys visade mikroskopien att den dominerande arten var Navicula spp. med ett relativt överflöd på 74,1% och Prorocentrum spp. (0,60%) som en mindre art. Omvänt identifierades heterocapsa spp. (9,04%) dokumenteras från mikroskopisk observation inte av 18S rRNA gen analys i detta prov. det fanns 12,6% av små runt oidentifierbara fytoplankton celler registreras av mikroskopi. Detta kan vara Micromonas, enligt 18S rRNA-resultaten.
Protokollet använder 16S rRNA genmetabarkodningsanalys för att identifiera bakteriearter i havsvattenprover. Ett representativt resultat visas i figur 3, där samma havsvatten som användes för 18S rRNA-genanalys analyserades med 16S rRNA-genanalys. Resultatet visade totalt 31 758 avläsningar med över 30 bakteriearter i havsvattenprovet. Det bör beskrivas att detta havsvattenprov passerades genom tandemfiltermembran (1 μm och 0,2 μm porstorlekar) för att separera frilevande bakterier från bifogade bakterier. Sedan behandlades celler som fångats av varje filtermembran för DNA-extraktion, följt av 16S rRNA-genanalysen. Det representativa resultatet i figur 3 visar bakteriearter som identifierats från 0,2 μm porstorleksmembran, som definieras som frilevande bakterier. De dominerande frilevande bakterierna var Amylibacter spp. med ett relativt överflöd på 20,02%, följt av Clade Ia (13,53%) och Aligiphilus spp. (7.06%). Resten av de bakteriearter som upptäcktes från detta havsvattenprov var relativt jämnt fördelade. Samma analys kan göras för celler som fångas upp av 1 μm porstor membran som upptäckt av attach-bakterier.
När dessa metabarkodningsanalyser utförs vid schemalagda tidpunkter under en viss studieperiod kan resultaten sammanfattas som tidsserieanalys. Ett sätt att göra det är att plotta det relativa överflöd av vissa alg- och bakteriearter som en funktion av tiden för att hitta ett unikt tillväxtmönster. Figur 4 visar en representativ tidsserie av Alexandrium och Pseudochattonella i Metri, Chile. Ett annat sätt att sammanfatta en tidsserie metabarkodningsanalys är att plotta alla identifierade alg och bakteriella som en funktion av tiden, som representerar befolkningsförändringen hos vissa grupper av organismer. Figur 5 och figur 6 sammanfattar det relativa överflödet av allt bakteriesläkte respektive ordning, som detekteras från havsvattnet i Metri under fem månader.
Tabell 1: Första PCR-huvudblandningsinnehållet: Tabellen visar master mix innehåll per reaktion för 16S rRNA och 18S rRNA analyser. Primersekvenserna visas i tabell 3. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 2: Primer-sekvenser: Primersna för första PCR listas för 16S rRNA och 18S rRNA analyser. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 3: PCR-cykler: Termiska cykler för första PCR och andra PCR listas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 4: Indexsekvenser: Primers för index 1 (i7) och index 2 (i5) som ska användas för andra PCR listas. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 5: Exempel på positionering av index 1 och index 2: För att minska felet måste indexprimrar placeras i positionen först, och alikvot av var och en överförs till en 96-brunnsplatta med hjälp av flerkanalspipett. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tabell 6: Exempel på exempelblad: Före sekvensering måste ett provblad skapas som motsvarar index 1- och index 2-kort. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Figur 1: Representativt resultat av 18S rRNA-metabarkodningsanalys: Algarter som finns i ett havsvattenprov som samlats in från Metri, Los Lagos, Chile den 19 februari 2019, identifierades av 18S rRNA-metabarkodningsanalys. De sekvenser som tilldelades "okänd" eliminerades från, och det relativa överflöd av varje identifierad art plottades. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativt resultat av mikroskopisk analys: Algarten identifierades från ett vattenprov från Metri, Los Lagos, Chile den 19 februari 2019 genom mikroskopi. Mängden av varje art räknades manuellt och ritades. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativt resultat av 16S rRNA-metabarkodningsanalys: Bakteriearter som finns i ett vattenprov från Metri, Los Lagos, Chile den 19 februari 2019, identifierades av 16S rRNA-metabarkodningsanalys. Det relativa överflödet av varje identifierad art plottades. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Representativ tidsserie av Alexandrium spp. och Pseudochattonella spp. erhållen från 18S rRNA metabarcodingin Metri, Chile: Figur omtryckt från Yarimizu et al9. De två giftiga algarterna, Alexandrium och Pseudochattonella övervakades selektivt av 18S rRNA-analys över tiden, och det relativa överflöd plottades som en funktion av tidspunkten. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Representativ släktes tidsserietomt från 16S rRNA och 18S rRNA-metabarkodning: Allt bakteriellt och eukaryota släkte som identifierats i vattnet i Metri, Chile, övervakas under fem månader. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Representativ ordertidsserie som erhållits från 16S rRNA och 18S rRNA-metabarkodning: Alla bakteriella och eukaryota order som identifierats i vattnet i Metri, Chile, övervakas under fem månader. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Tabell S1 och tabell S2:
Tabell S1: Rådata för figur 5 och figur 6. Tabell S2: Resultat av QC-kontroll av rådata i figur 5 och figur 6. Klicka här för att ladda ner dessa tabeller.
Discussion
Detta protokoll utförde framgångsrikt 18S rRNA och 16S rRNA gen metabarcoding analys för att identifiera alg och bakteriella arter i havsvatten prover för övervakning chilenska HABs. De dominerande algerna och några mindre alger som upptäcktes av detta protokoll överensstämde med dem som erhållits genom mikroskopi, vilket bekräftar protokollets tillförlitlighet. Höjdpunkten i protokollet är att analysen upptäckte Alexandrium spp. och Pseudochattonella spp., de två mest problematiska HAB som orsakar arter i södra Chile, från havsvattnet i Metri även vid ett lågt överflöd. Speciellt Pseudochattonella spp. är utmanande arter att identifiera under ett mikroskop eftersom cellerna är små och lätt brustna under ljus eller användning av fixativ27,28. Metabarkodning kan ge algartsinformation som knappast finns i havsvattenprover som mikroskopi inte kan identifiera. Protokollet upptäckte också över 30 bakteriearter. Även om hur dessa bakterier är relaterade till algtillväxt är okänt vid denna tidpunkt, kommer massiv datainsamling av alg-bakteriearter i tidsserieanalysen eventuellt att ge så viktiga upptäckter. Att lägga till metabarkodningsanalys till de konventionella chilenska HAB-övervakningsprogrammen kommer utan tvekan att stärka den nuvarande HAB-övervakningseffektiviteten. Faktum är att detta visuella protokoll för metabarkodningsanalys kan vara fördelaktigt inte bara för chilensk vatten alg-bakteriell övervakning utan också för kustövervakningsprogram i andra HAB-drabbade områden över hela världen.
Även om detta protokoll gav de ovan angivna fördelarna, bör nackdelarna med metoden diskuteras. Som framgår av det visuella protokollet är metabarkodningsmetoden tidskrävande och komplex, vilket kräver dyra maskiner och reagenser. Laboratoriepersonalen måste vara specialutbildad, annars slösar material, arbetskraft och tid. Dessutom måste algdetektering genom metabarkodning paras ihop med mikroskopi för att kontrollera att samma dominerande art identifieras från de två ortogonala metoderna29. Mikroskopi är ett icke-invasivt verktyg för att för det mesta identifiera algarter, vilket innebär att det är svårare att göra misstag när algarten har unika och uppenbara former. Naturligtvis kan mänskliga fel uppstå om arten har mycket liknande former som varandra. Å andra sidan, eftersom metabarkodningsanalys kräver flera steg, ökar det naturligtvis fel. Det kan vara ett prov blandat, fel reagenstillskott eller att missa vissa procedurer. Därför är det viktigt att jämföra metabarkodningsresultaten med de som erhålls genom mikroskopi. Slutligen är protokollet endast kvalitativt tillämpligt, och resultaten måste beräknas för relativt överflöd. Som Lamb et al. uppgav 2019 är den nuvarande metabarkodningen som kvantitativ prestanda fortfarande begränsad, och ytterligare forskning krävs innan metabarkodning kan användas säkert för kvantitativa applikationer30.
Detta protokoll optimerades för 140 - 170 prover per körning från 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation manual utfärdat av Illumina Inc. Det optimerade protokollet testades många gånger och ändrades ytterligare för att utfärda den här slutliga versionen. Därför rekommenderas det starkt att följa varje steg exakt. Den mest kritiska delen av protokollet är att extra försiktighet krävs för att undvika provkontaminering. Pipetter och laminärflödeshuv måste rengöras med 70% alkohol- och UV-exponering hela tiden, och steriliserbara material ska autoklaveras. Primers och reagenser bör spädas direkt från beståndet vid varje ny körning, eller återanvändning av reagenser och exponering för flera utspädningar kan vara en provföroreningsorsak. Protokollet anger när operationen kan utföras utanför den laminära flödeshuven. Om inte annat ska proverna behandlas i en rengjord laminär flödeshuv. När du hanterar flera 8-rörsremsor samtidigt rekommenderas att arbeta på den första 8-rörsremsan och täcka den innan du flyttar till nästa 8-rörsremsa. Att lämna locket öppet under lång tid kan orsaka provkontaminering eftersom 16S- och 18S-rRNA-gener är mycket allestädes närvarande i omgivningen. Den angivna tiden, såsom blandningstid och inkubationstid, bör följas enligt exakt beskrivet eftersom den bästa varaktigheten för varje steg valdes baserat på de flera testkörningarna. Överdriven eller otillräcklig tid kan till exempel minska provutbytet. Processen bör stoppas endast vid den del som protokollet säger att den kan stoppa. Det är viktigt att ha en negativ kontroll eftersom det bekräftar att de positiva resultaten inte är artificiella falska positiva resultat. Slutligen rekommenderas det starkt att planera dagarna eftersom det tar minst fem dagar att bearbeta alla steg, och vissa delar kan inte stoppas förrän nästa stoppskylt.
Begränsningen av taxonomisk tilldelning för sekvenserade data noteras kort här. Nyupptäckta nukleotidsekvenser för bakterie- och algarter uppdateras dagligen i databanken. Medan välstuderade alg- och bakteriearter registreras på ett tillförlitligt sätt, finns det också många sekvenser för okända arter som uppdateras i databanken. Det tyder på att upplösningen av registrerade nukleotidsekvenser inte alltid är tillräcklig för artidentifiering utan endast för släktidentifiering. Således måste mikroskopisk artidentifiering utföras ortogoniskt. Att upprätta en pipeline med öppen åtkomst för det här arbetet har en betydande fördel när det gäller att hantera en stor uppsättning sekvenserade data på en gång och effektivt undersöka när ett fel uppstår. Dessutom finns utgången av DADA2 i en text- eller csv-fil, vilket gör det enkelt att ytterligare statistisk analys. Å andra sidan krävs en stor server för att utföra taxonomiska tilldelningar, särskilt när en data uppsättning är stor. För att konfigurera pipelinen behövs tekniker för att konfigurera pipelinen, och proffsen måste förstå parametrar, drift, Linux och bioinformatik.
Bortsett från omfattningen som ett HAB-övervakningsverktyg kan användningen av detta protokoll utökas för undersökande forskningsändamål. Det pågår till exempel pågående debatter mellan den chilenska regeringen och lokala fiskare tillsammans med fredsorganisationer för miljön om det ökade antalet lokala HAB31,32. Regeringen hävdar att det beror på ett naturfenomen som den globala uppvärmningen och El Niño, medan de senare parterna hävdar att laxodling är orsaken. Lax är inte en inhemsk art i Chile och var inte i chilenskt vatten för ett halvt sekel sedan. Den chilenska regeringen hade då som mål att få ekonomin att växa och skapa arbetstillfällen för fattiga områden genom att utveckla en laxverksamhet33. Med ingripandet från utlandet för kapitalvinst gjorde Chile stor framgång i pennliknande vattenbruksutveckling, och antalet laxar har ökat anmärkningsvärt under de senaste decennierna31,32,33. Därefter har en stor mängd mat till lax kastats i havet, vilket får lokalbefolkningen att misstänka att laxodling är orsaken till de frekventa lokala HAB31,32. Sanningen är okänd nu, men den måste förstås så småningom så att strategier för att skydda den lokala marina miljön, ekonomin och människors hälsa från HAB kan utformas. Den molekylärbaserade analysen av det lokala alg-bakteriella förhållandet kan bidra till ett steg framåt klargörande för ett sådant ämne. Till exempel kan tekniken söka bland alg- och bakteriearter som inte fanns i målhavsområdet tidigare men har ökat dramatiskt under de senaste åren, vilket är något liknande den studie som Sakai et al. har gjort för upptäckten av en oregistrerad population av Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) av GIS och eDNA-analys34. Därför, utöver HAB-övervakningsverktyget, har detta metabarkodningsprotokoll den potentiella användningen för andra prospekt.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien, i insamlingen, analyserna eller tolkningen av data; i skrivandet av manuskriptet, eller i beslutet att publicera resultaten.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidraget (JPMJSA1705) för en studie om science and technology research partnership for Sustainable Development-Monitoring Algae in Chile (SATREPS-MACH). Vi tackar Dr. Sandra Rios (Universidad de Los Lagos) för att vi fick använda ett filmklipp. Vi tackar Neal Andrew Holland för hans flitiga korrekturläsning av manuskriptet. Vi uttrycker vår uppriktiga uppskattning till laboratoriegruppens medlemmar på CREAN-IFOP i Puerto Montt, Chile, för att de ger oss råd om identifiering av växtplankton.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
| 1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
| 8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
| 96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
| AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
| Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
| Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
| D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
| D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
| DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
| Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
| Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
| Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
| Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
| Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
| Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
| Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Heat block | |||
| High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
| HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
| Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
| Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
| Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
| Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
| Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
| Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
| MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
| MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
| Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
| Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
| Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
| Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
| Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
| Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
| Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
| PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
| Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
| Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
| SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
| Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
| TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
| TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
| Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
| ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
| TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
| Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |
References
- Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
- Anderson, D. M.
- Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
- Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
- Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
- Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
- Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
- Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
- Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
- Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
- Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
- Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
- Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
- Azam, F., Malfatti, F.
- Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
- Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
- Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
- Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
- Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
- Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
- Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
- Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
- R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
- McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
- Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
- Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
- Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
- Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
- Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
- Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
- Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
- Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
- Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).
