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मेटाबारकोडिंग विश्लेषण द्वारा चिली में हानिकारक अल्गल ब्लूम्स की निगरानी के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62967
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 3, 4, 5, 6, 6, 4, 4, 7, 5, 3, 1
1Office of Research and Academia-Government-Community Collaboration, Hiroshima University, 2Graduate School of Human and Environmental Studies, Kyoto University, 3Scientific and Biotechnological Bioresource Nucleus, Universidad de La Frontera, 4Centro de Estudios de Algas Nocivas, Instituto de Fomento Pesquero, 5Ciencias del Mar y Recursos Biologicos, Universidad de Antofagasta, 6Departamento de Ciencias Biológicas y Biodiversidad, Universidad de Los Lagos, 7Japan Fisheries Research and Education Agency, Fisheries Resources Institute

Summary

यह प्रोटोकॉल मेटाबारकोडिंग विश्लेषण के चरणों का परिचय देता है, 16 एस आरआरएनए और 18 एस आरआरएनए जीन को लक्षित करता है, ताकि समुद्री जल के नमूनों में हानिकारक अल्गल खिलने और उनके संबंधित माइक्रोबायोम की निगरानी की जा सके। यह एक शक्तिशाली आणविक-आधारित उपकरण है, लेकिन कई प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है, जिन्हें यहां चरण-दर-चरण नेत्रहीन रूप से समझाया गया है।

Abstract

हानिकारक शैवाल खिलता है (HABs) निगरानी दुनिया भर में लागू किया गया है, और चिली, एक देश, अपने मत्स्य पालन और एक्वाकल्चर के लिए प्रसिद्ध है, इस उद्देश्य के लिए दशकों के लिए सूक्ष्म और विष विश्लेषण का गहन रूप से उपयोग किया है। आणविक जैविक तरीके, जैसे कि उच्च-थ्रूपुट डीएनए अनुक्रमण और जीवाणु संयोजन-आधारित दृष्टिकोण, अभी चिली एचएबी निगरानी में पेश किए जाने लगे हैं, और प्रक्रियाओं को अभी तक मानकीकृत नहीं किया गया है। यहां, चिली एचएबी की निगरानी के लिए 16 एस आरआरएनए और 18 एस आरआरएनए मेटाबारकोडिंग विश्लेषण चरणबद्ध रूप से पेश किए गए हैं। हाल ही की एक परिकल्पना के अनुसार, अल्गल-बैक्टीरियल पारस्परिक संघ खिलने की दीक्षा, रखरखाव और प्रतिगमन के लिए एक महत्वपूर्ण synergetic या विरोधी संबंध लेखांकन निभाता है। इस प्रकार, अल्गल-बैक्टीरियल दृष्टिकोण से एचएबी की निगरानी एचएबी तंत्र की व्यापक समझ और प्रारंभिक चेतावनी के लिए आधार प्रदान कर सकती है। मेटाबारकोडिंग विश्लेषण इस उद्देश्य के लिए सबसे उपयुक्त आणविक-आधारित उपकरणों में से एक है क्योंकि यह एक नमूने में बड़े पैमाने पर अल्गल-बैक्टीरियल टैक्सोनोमिक जानकारी का पता लगा सकता है। मेटाबारकोडिंग विश्लेषण के लिए नमूनाकरण की दृश्य प्रक्रियाएं यहां विशिष्ट निर्देश प्रदान करती हैं, जिसका उद्देश्य त्रुटियों को कम करना और विश्वसनीय डेटा का संग्रह करना है।

Introduction

कई समुद्री फाइटोप्लांकटन प्रजातियां अंतर्जात विषाक्त पदार्थों का उत्पादन करने के लिए जानी जाती हैं, और जब ये प्रजातियां पर्याप्त संख्या में जमा होती हैं, तो वे समुद्री पर्यावरण के लिए हानिकारक होती हैं। इस तरह के हानिकारक अल्गल ब्लूम्स (एचएबी) आजदुनियाके अधिकांश महाद्वीपों के तटों पर देखे जाते हैं। विषाक्त फाइटोप्लांकटन पहले बिवाल्व ऊतकों में जमा होता है, जिससे पाचन पर मनुष्यों सहित जीवों के उच्च ट्रॉफिक स्तरों में बीमारी और मृत्यु हो जाती है। इसके बाद, ये घटनाएं स्थानीय अर्थव्यवस्था, सामाजिक आर्थिक और सार्वजनिक स्वास्थ्यकेलिए गंभीर निहितार्थ लाती हैं। एचएबीके कारण वैश्विक अर्थव्यवस्था को होने वाली क्षति का अनुमान है कि प्रत्येक वर्ष लाखों से अरबों डॉलर का नुकसान होगा। चिली कई देशों में से एक है जो लगातार HABs से पीड़ित है।

चिली लंबी भूमि का एक देश है, जो 4,300 किमी उत्तर और दक्षिण में फैला हुआ है। लम्बी पश्चिमी भूमि प्रशांत महासागर का सामना करती है, जो स्वाभाविक रूप से चिली के एचएबी का अनुभव करने की संभावना को बढ़ाती है। विशेष रूप से दक्षिणी चिली में, कई विश्व प्रसिद्ध सामन एक्वाकल्चर हैं, और हर बार जब इस क्षेत्र में एक एचएबी होता है, तो अल्गल-विषाक्त पदार्थों के परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर खेती वाले सामन बीमार पड़ जाते हैं और मर जाते हैं4,5,6। चिली में, वह वर्ष जब एचएबी ने अर्थव्यवस्था को सबसे अधिक मारा, 2016 था, जिसमें यूएस $ 800 मिलियन7,8के अनुमानित वार्षिक नुकसान के साथ। प्रेरक विषाक्त शैवाल प्रजातियां वर्ष और स्थान के आधार पर भिन्न होती हैं। 2016 के मामले के लिए, अलेक्जेंड्रियम कैटनेला और स्यूडोचैटोनेला वेरुक्लोसा के एक परिसर ने दक्षिणी चिली तट7,8के अधिकांश हिस्सों में एक व्यापक एचएबी का कारण बना। चिली में सबसे हाल ही में एचएबी मार्च 2021 में दक्षिणी चिली में स्थित कैमनचाका में हेटेरोसिग्मा अकाशिवो की प्रेरक अल्गल प्रजातियों के साथ हुआ, जहां इस क्षेत्र में एक बड़ा सामन खेत है।

चिली दो मुख्य तरीकों का उपयोग करके कई वर्षों से तटीय निगरानी कर रहा है; नियमित रूप से विषाक्त शैवाल प्रजातियों की पहचान करने के लिए माइक्रोस्कोप के साथ समुद्री जल का निरीक्षण करना और जैव रासायनिक assays द्वारा शेलफिश में विष के स्तर को मापना9. शेलफिश में विषाक्त शैवाल और विष के स्तर का प्रारंभिक पता लगाना एचएबी को नहीं रोकता है; हालांकि, ये विश्लेषण तत्काल countermeasures ट्रिगर कर सकते हैं और स्थानीय समुदायों को नुकसान को कम कर सकते हैं। इस रणनीति की प्रभावशीलता को और मजबूत करने के लिए, एक आणविक-आधारित विश्लेषणात्मक विधि को हाल ही में समुद्री जल के नमूनों में शैवाल और संबंधित जीवाणु समुदायों का पता लगाने के लिए हमारे पारंपरिक चिली एचएबी निगरानी कार्यक्रम में जोड़ा गया था। विशेष रूप से, मेटाबारकोडिंग का उपयोग करके एक बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण विधि जो 16S rRNA और 18S rRNA जीन को लक्षित करती है, को चुना गया था। यद्यपि इस तकनीक के लिए जटिल प्रक्रियाओं और महंगी मशीनरी और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है, यह एक उन्नत तकनीक है जो एक बार में समुद्री जल के नमूने में मौजूद हजारों शैवाल और बैक्टीरिया जेनेरा / प्रजातियों का पता लगा सकती है।

एचएबी के कारणों को विभिन्न होने का अनुमान लगाया जाता है, जैसे कि तापमान और मौसम, लेकिन उन्हें सामान्यीकृत करना असंभव है। ऐसा इसलिए है क्योंकि एचएबी प्रजातियां और आवृत्तियां क्षेत्र और स्पैटिओटेम्पोरल स्थितियों पर निर्भर करती हैं, जिसमें प्राकृतिक घटनाएं शामिल होती हैं जैसे कि भौगोलिक विशिष्टता, पोषक तत्वों के मिश्रण को ऊपर उठाना, और2,10, 11,12के कारण भूमि से तत्व अपवाह। इसके अतिरिक्त, कृत्रिम कारक जैसे यूट्रोफिकेशन स्थानीय HABs12,13कोप्रभावित करते हैं। जटिल multifactor के कारण, यह एक सटीक HAB भविष्यवाणी करने के लिए आसान नहीं है। हाल के वर्षों में, एक विचार है कि विशिष्ट जीवाणु आबादी कारकों में से एक के रूप में एचएबी के विकास से संबंधित हो सकती है, और इस परिकल्पना का समर्थन करने के लिए अनुसंधान तेजी से स्पष्ट हो गया है14,15,16,17,18। आणविक जीव विज्ञान तकनीकों का उपयोग आमतौर पर जीवाणु संयोजन का अध्ययन करने के लिए किया जाता है; हालांकि, इस तरह की एक मानकीकृत विधि अभी तक चिली एचएबी निगरानी9में स्थापित नहीं की गई है। एचएबी के साथ अल्गल-बैक्टीरियल एसोसिएशन का अध्ययन करने के लिए, वर्तमान चिली के तटीय निगरानी कार्यक्रमों के लिए मेटाबारकोडिंग विश्लेषण करना अनिवार्य है। इस प्रकार, यह प्रोटोकॉल नेत्रहीन रूप से हमारे चिली एचएबी निगरानी कार्यक्रम का परिचय देता है, जो मेटाबारकोडिंग विश्लेषण का उपयोग करके समुद्री जल के नमूनों में शैवाल और बैक्टीरिया प्रजातियों का पता लगाने के विश्लेषण के लिए एक चरणबद्ध प्रक्रिया पर ध्यान केंद्रित करता है।

हमारे चिली HAB निगरानी कार्यक्रम का वर्णन पूर्ण प्रोटोकॉल Yarimizu et al.9में उपलब्ध है। इसमें समुद्री जल के नमूने, माइक्रोस्कोपिक अल्गल प्रजातियों का पता लगाने, अल्गल-बैक्टीरियल जीन का पता लगाने, वर्णक विश्लेषण, मौसम संबंधी डेटा संग्रह, और भौतिक और रासायनिक जल संपत्ति assays की प्रक्रियाएं शामिल हैं। अल्गल और जीवाणु प्रजातियों का पता लगाने के लिए 16S rRNA और 18S rRNA मेटाबारकोडिंग विश्लेषण का चरणबद्ध प्रोटोकॉल प्रीप्रिंट19के रूप में उपलब्ध है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से मेटाबारकोडिंग विश्लेषण चरणों को प्रदर्शित करता है क्योंकि यह सबसे जटिल हिस्सा है और हमारे एचएबी निगरानी कार्यक्रम का मुख्य आकर्षण है। इस प्रोटोकॉल में कार्यक्रम का परिचय और अल्गल प्रजातियों की माइक्रोस्कोपी का पता लगाना भी शामिल है। मेटाबारकोडिंग द्वारा अल्गल प्रजातियों का विश्लेषण करते समय, दो तरीकों से परिणामों को सत्यापित करने के लिए माइक्रोस्कोपी को एक साथ करना महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल में टैक्सोनॉमी असाइनमेंट के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करने का तरीका शामिल नहीं है, लेकिन डेटाबेस अनुशंसा निम्न अनुभाग के अंत में संक्षेप में बताई गई है।

Protocol

1. नमूना संग्रह और pretreatment

  1. लक्ष्य स्थान से लगभग 3 एल पानी के नमूने एकत्र करें।
  2. मुक्त रहने वाले और संलग्न बैक्टीरिया को अलग करने के लिए एक अग्रानुक्रम निस्पंदन (1 μm और 0.2 μm रंध्र आकार की झिल्ली) के माध्यम से 16S rRNA विश्लेषण के लिए पानी के नमूने के 1 एल को फ़िल्टर करें।
  3. 0.2 μm झिल्ली के साथ एक एकल निस्पंदन के माध्यम से 18S-rRNA विश्लेषण (फाइटोप्लांकटन का पता लगाने) के लिए पानी के नमूने का एक और 1 एल फ़िल्टर करें।
    नोट: पानी के नमूने का निस्पंदन नमूनाकरण के 12 घंटे के भीतर पूरा किया जाना चाहिए।
  4. बाँझ सर्जिकल कैंची के साथ आधे में फ़िल्टर की गई झिल्ली को काटें और इसे एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें। 1 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या अगले चरण पर आगे बढ़ें।
  5. चेलेक्स विधि के साथ डीएनए निकालें के रूप मेंवर्णित 9| 1 महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. माइक्रोस्कोप विश्लेषण

  1. एक 1 एमएल ग्रिड-स्लाइड पर एक पिपेट द्वारा पानी के नमूने के 1 एमएल को स्थानांतरित करें।
  2. माइक्रोस्कोप के तहत नमूने का निरीक्षण करें।
  3. फाइटोप्लांकटन प्रजातियों के रिकॉर्ड नाम और मात्रा।

3. 16S rRNA और 18S rRNA मेटाबारकोडिंग विश्लेषण

नोट: इस प्रक्रिया में सात खंड होते हैं: तैयारी, पहली पीसीआर एम्प्लिकॉन पीढ़ी, पहला एम्प्लिकॉन क्लीनअप, दूसरे पीसीआर द्वारा इंडेक्सेशन, दूसरा पीसीआर एम्प्लिकॉन सत्यापन और सफाई, डीएनए एकाग्रता समायोजन, और डीएनए विकृतीकरण और अनुक्रमण। पूरी प्रक्रिया में एक अनुभवी प्रयोगशाला कर्मियों द्वारा कम से कम 5 दिन (40 घंटे) लगते हैं। उत्पाद संख्या और विनिर्माण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. तैयारी
    1. 70% इथेनॉल के साथ साफ पिपेट्स और लैमिनर हुड कैबिनेट 30 मिनट के लिए यूवी एक्सपोजर के बाद अक्सर। उपयोग की जाने वाली सामग्री को निष्फल करना।
    2. कमरे के तापमान पर डीएनए नमूनों को पिघलाएं, 2 मिनट के लिए 100 x g पर सेंट्रीफ्यूज, और प्रत्येक नमूना supernatant के 100 μL को 8-ट्यूब स्ट्रिप्स में स्थानांतरित करें।
  2. पहली पीसीआर amplicon पीढ़ी
    नोट:: एक लैमिनर हुड कैबिनेट में निम्न कार्यविधियाँ निष्पादित करें। प्राइमर संदूषण से बचने के लिए पीसीआर ग्रेड पानी के साथ लक्ष्य एकाग्रता के लिए 1 μM स्टॉक से प्राइमरों को हमेशा पतला करें।
    1. प्रतिक्रियाओं के लिए एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पहला पीसीआर मास्टर मिश्रण तैयार करें(तालिका 1, तालिका 2)।
    2. एक 8-ट्यूब पट्टी में मास्टर मिश्रण के 22.5 μL ऐलीकोट और डीएनए नमूने के 2.5 μL जोड़ें। नकारात्मक नियंत्रण के लिए पीसीआर ग्रेड पानी के 2.5 μL का उपयोग करें।
    3. पहला PCR चक्र चलाएँ(तालिका 3)।
    4. 2% Agarose-TBE जेल के 100 mL तैयार करें जिसमें 1x न्यूक्लिक एसिड जेल दाग के 10 μL होते हैं।
    5. 1x डीएनए लोडिंग डाई के 1.5 μL और agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 4 μL का मिश्रण लोड करें। इसके अलावा, जेल पर 100 बीपी डीएनए सीढ़ी लोड करें।
    6. 30 मिनट के लिए 100 वोल्ट पर वैद्युतकणसंचलन करें।
    7. सुनिश्चित करें कि एक यूवी प्रकाश छवि कैप्चर के तहत 500-600 बीपी रेंज पर एक बैंड है। प्राइमर-डिमर बैंड राउंड 80 बीपी का है।
      नोट: समुद्री पानी के नमूनों में पीसीआर अवरोधक होते हैं। लापता amplicons कभी कभी पीसीआर ग्रेड पानी के साथ 1: 100 या 1: 1000 नमूनों को पतला करके हल किया जा सकता है।
    8. अगले चरण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर पहले पीसीआर उत्पादों को स्टोर करें।
      चेतावनी: भंडारण के एक सप्ताह से अधिक न करें।
  3. पहली पीसीआर amplicon क्लीनअप
    नोट:: इस अनुभाग को एक लैमिनर हुड कैबिनेट के बाहर किया जा सकता है।
    1. प्राइमर-डिमर उत्पादों सहित पीसीआर प्रतिक्रिया अवशेषों को हटाने के लिए चुंबकीय मोती डीएनए क्लीनअप सिस्टम का उपयोग करें।
    2. एक नई 96 अच्छी तरह से प्लेट के लिए प्रत्येक साफ पहले पीसीआर उत्पाद के 20 μL स्थानांतरण. एक माइक्रो सील फिल्म के साथ प्लेट सील. अगले चरण के आगे बढ़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: भंडारण के एक सप्ताह से अधिक न करें।
  4. दूसरी PCR द्वारा अनुक्रमणिका
    नोट: इस अनुभाग में, शुद्ध पहले PCR उत्पादों को विभिन्न इंडेक्स प्राइमर संयोजनों के साथ प्रवर्धित किया जाएगा।
    1. सभी सूचकांक 1 और सूचकांक 2 प्राइमर(तालिका 4)को 1 μM तक पतला करें, जिसमें एक लैमिनर हुड कैबिनेट में रखे गए 8 ट्यूब पीसीआर स्ट्रिप्स में पीसीआर ग्रेड पानी होता है।
      नोट: इस अनुभाग में आगे के चरणों को एक लैमिनर हुड कैबिनेट के बाहर किया जा सकता है, क्योंकि इंडेक्स प्राइमर पहले पीसीआर प्रतिक्रियाओं के लिए विशिष्ट होते हैं ओवरहैंग एडाप्टर।
    2. एक क्षैतिज पंक्ति में स्थिति अनुक्रमणिका 1 प्राइमर एक ऊर्ध्वाधर पंक्ति में अनुक्रमणिका 2 प्राइमर(तालिका 5).
    3. एक नई 96-अच्छी तरह से प्लेट में, प्रत्येक अच्छी तरह से गर्म-स्टार्ट-तैयार सूत्रीकरण के 12.5 μL जोड़ें।
    4. प्रत्येक सूचकांक प्राइमर (1 μM) के 2.5 μL को प्रत्येक के साथ-साथ तालिका 4 में एक multichannel पिपेट का उपयोग करके जोड़ें।
    5. शुद्ध पहले पीसीआर उत्पाद के 7.5 μL जोड़ें।
    6. 10 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण. एक माइक्रो सील फिल्म के साथ प्लेट को कवर करें।
    7. दूसरा PCR चक्र चलाएँ(तालिका 3)।
    8. प्लेट को -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      चेतावनी: भंडारण के एक सप्ताह से अधिक न करें।
  5. दूसरा पीसीआर एम्प्लिकॉन सत्यापन और सफाई
    1. एक टुकड़ा विश्लेषक और संबंधित अभिकर्मक का उपयोग करें। भंवर और उपयोग से पहले अभिकर्मक नीचे स्पिन.
    2. नमूना बफर और डीएनए स्क्रीन टेप को 30 मिनट के लिए कमरे के अस्थायी पर संतुलित करने की अनुमति दें। फिर, डीएनए स्क्रीन टेप को एक टुकड़ा विश्लेषक में रखें।
    3. नए 8 ट्यूब स्ट्रिप्स में नमूना बफर के 2 μL और दूसरे PCR amplicon के 3 μL मिश्रण. टुकड़ा विश्लेषक में 8 ट्यूब स्ट्रिप्स डालें। प्रारंभ करने के लिए चलाएँ दबाएँ.
      सावधानी: हवा के बुलबुले के गठन से बचा जाना चाहिए।
    4. सुनिश्चित करें कि दूसरे पीसीआर amplicons लगभग 613 बीपी (600 - 630 बीपी) दोनों 16S और 18S rRNA जीन के लिए कर रहे हैं।
    5. एक चुंबकीय मोती डीएनए सफाई प्रणाली का उपयोग कर दूसरे पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें।
  6. डीएनए सांद्रता समायोजन
    1. एक न्यूक्लिक एसिड परिमाणीकरण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके शुद्ध दूसरे पीसीआर उत्पादों में डीएनए एकाग्रता को मापें।
    2. एनएम में लक्ष्य जीन एकाग्रता की गणना करें, 16एस और 18 एस आरआरएनए जीन दोनों के लिए 613 बीपी के रूप में औसत अंतिम पुस्तकालय आकार के लिए लेखांकन:
      Equation 1
    3. बाँझ पीसीआर पानी के साथ प्रत्येक शुद्ध दूसरे पीसीआर उत्पाद को एक नए 0.2 एमएल 96 अच्छी तरह से प्लेट में 4 एनएम तक पतला करें।
      नोट: प्लेट को यहां -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। अन्यथा, बाकी प्रक्रियाओं को बिना रुके किया जाना चाहिए।
    4. प्रत्येक 4 nM दूसरे पीसीआर उत्पाद के 3 μL ऐलीकोट और एक पूल किए गए पुस्तकालय के रूप में एक नई बाँझ 1.5 mL ट्यूब में सभी मिश्रण। ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर या हर समय बर्फ के स्नान पर रखें।
    5. न्यूक्लिक एसिड परिमाणीकरण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके पुष्टि के लिए पूल किए गए पुस्तकालय की एकाग्रता को मापें। 4 nM करने के लिए एकाग्रता समायोजित करें यदि यह 4 nM से अधिक है।
      नोट: अधिक केंद्रित डीएनए overestimated पढ़ने की संख्या पैदा करता है, विश्लेषण में बाधा.
  7. डीएनए विकृतीकरण और अनुक्रमण
    नोट:: यह अनुभाग विशिष्ट अभिकर्मकों के साथ Illumina MiSeq सिस्टम का उपयोग करता है। सामग्री की तालिकामें उत्पाद संख्या देखें।
    नोट: समय का कड़ाई से पालन करें। अनुक्रमण के दिन कारतूस को छोड़कर सभी अभिकर्मकों को पिघलाएं।
    1. अनुक्रमण से एक दिन पहले, -20 डिग्री सेल्सियस से एक पूर्व-भरे हुए रेडी-टू-यूज अभिकर्मक कारतूस को हटा दें और पिघलने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. 96 डिग्री सेल्सियस के लिए 1.5 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों के लिए उपयुक्त एक गर्मी ब्लॉक सेट करें।
    3. बर्फ पर संकरण बफर रखें।
    4. पीसीआर ग्रेड पानी के साथ एक नई ट्यूब में 1 एन से 0.2 एन तक आणविक ग्रेड NaOH को पतला करें।
    5. TE बफर (pH 8.0) के साथ एक नई ट्यूब में 10 nM स्टॉक से 4 nM तक एक रेडी-टू-यूज कंट्रोल लाइब्रेरी को पतला करें (यानी, नियंत्रण लाइब्रेरी के 2 μL + TE बफर के 3 μL)।
    6. "1" लेबल वाली एक नई ट्यूब में 4 एनएम नियंत्रण पुस्तकालय के 4 μL के साथ 4 nM पूल किए गए नमूना पुस्तकालय के 16 μL को मिलाएं।
    7. एक नई ट्यूब "2" लेबल में 0.2 N NaOH के 10 μL के साथ ट्यूब "1" में नमूना के 10 μL मिश्रण.
    8. भंवर ट्यूब 2 के लिए 5 s, संक्षेप में नीचे स्पिन, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन.
    9. ट्यूब 2 करने के लिए संकरण बफर के 980 μL जोड़ें.
    10. "3" लेबल वाली एक नई ट्यूब में, संकरण बफर के 390 μL के साथ ट्यूब 2 से नमूना 260 μL मिलाएं। ट्यूब को उलटकर मिलाएं।
    11. ट्यूब 3 को 2 मिनट के लिए 96 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें और तुरंत इसे अधिकतम 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।
    12. कारतूस को 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर से निकालें।
    13. प्रत्येक संबंधित अनुक्रमणिका 1 और अनुक्रमणिका 2 एडाप्टर के साथ अनुक्रमण के लिए नमूना-पत्रक तालिका 6के रूप में सेट करें।
    14. MiSeq v3 किट से flowcell निकालें। धीरे बाँझ आणविक ग्रेड पीसीआर पानी के साथ flowcell साफ.
      नोट: flowcell के केशिका डॉट्स पर पानी मत डालो। धीरे से गैर-रेशेदार कागज के साथ flowcell से पानी पोंछें।
    15. कारतूस में ट्यूब 3 (650 μL) की पूरी मात्रा लोड करें।
    16. इंस्ट्रूमेंट ऑपरेशन सॉफ्टवेयर में, अनुक्रमण का चयन करें और निर्देशों का पालन करें। Flowcell, निगमन बफर, और कारतूस सम्मिलित करें। नमूना-पत्रक लोड करें. प्रतिक्रिया प्रारंभ करने के लिए चलाएँ दबाएँ.
      नोट:: इस अनुक्रम चलाने में 3-5 दिन लगेंगे। डेटा स्वचालित रूप से Basespace प्लेटफ़ॉर्म पर अपलोड किया जाएगा। कच्चे डेटा को कंप्यूटर में दो फ़ोल्डरों में संग्रहीत किया जाएगा: विश्लेषण फ़ोल्डर जिसमें फास्टक्यू फ़ाइलें और आउटपुट जिसमें बीसीएल फाइलें और जेपीईजी चित्र शामिल हैं।

4. अनुक्रमण डेटा के लिए टैक्सोनोमिक असाइनमेंट

  1. FASTQ फ़ाइल संसाधन
    नोट:: DADA2 पैकेज23 का R24 FASTQ फ़ाइलों को संसाधित करने के लिए अनुशंसित डेटाबेस में से एक है। दिशानिर्देश [https://github.com/mickeykawai/exec_dada2] पर उपलब्ध है। इस दिशानिर्देश को DADA2 पाइपलाइन ट्यूटोरियल [https://benjjneb.github.io/dada2/tutorial.html] के हाल के संस्करण को अपनाकर तैयार किया गया था।
    1. प्रक्रिया कच्चे FASTQ युग्मित अंत अनुक्रमों trimming, गुणवत्ता फ़िल्टरिंग, dereplication और अद्वितीय अनुक्रमों की गिनती, नमूना अनुमान, contigs में विलय और chimeric अनुक्रमों को हटाने के लिए.
    2. 16S rRNA और 18S rRNA जीन टुकड़े दोनों के लिए निम्नलिखित DADA2 निर्दिष्ट पैरामीटर का उपयोग करें; trimLefts = 0, 0, truncLens = [अनुक्रम गुणवत्ता की जाँच करें और इसे एक उपयुक्त लंबाई के लिए सेट करें]।
      नोट:: अन्य पैरामीटर के लिए डिफ़ॉल्ट मान maxN = 0, maxEE = 2,2, trancQ = 2 हैं।
  2. वर्गीकरण असाइनमेंट
    नोट:: SILVA RRNA डेटाबेस DADA2 [silva_nr_v132_train_set.fa.gz डिफ़ॉल्ट के रूप में सेट किया गया है] के लिए वर्गीकरण असाइनमेंट के लिए अनुशंसित है।
    1. 16S rRNA जीन टुकड़ा विश्लेषण के लिए क्लोरोप्लास्ट और माइटोकॉन्ड्रियल ओटीयू को हटा दें। 16S rRNA और 18S rRNA विश्लेषण से सिंगलटन निकालें।
    2. सबसे कम अनुक्रमण गहराई वाले नमूने के आधार पर भी अनुक्रमण गहराई के लिए सभी नमूनों को दुर्लभ करें।
    3. पठनों की संख्या, असाइन किए गए ओटीयू और किस स्तर पर, फ़िल्टर किए गए पठन, और बहिष्कृत किए गए सिंगलटन की संख्या रिकॉर्ड करें.
  3. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. phyloseq 25 और vegan26 के R पैकेज का उपयोग करकेमाइक्रोबियलडेटा पर सांख्यिकीय विश्लेषण करें।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल समुद्री जल के नमूनों में अल्गल प्रजातियों की पहचान करने के लिए 18S rRNA जीन मेटाबारकोडिंग विश्लेषण का उपयोग करता है। चित्र 1 में एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाया गया है, जिसमें 19फरवरी, 2019 को मेत्री, प्यूर्टो मोंट, चिली (-41.597; -72.7056) से एकत्र समुद्री जल का विश्लेषण इस प्रोटोकॉल के साथ किया गया था। परिणाम ने समुद्री जल के नमूने में 30 से अधिक अल्गल प्रजातियों के साथ कुल 13,750 पढ़ता दिखाया। इस नमूने में प्रमुख एल्गा नेविकुला एसपीपीथा। 70.77% की सापेक्ष बहुतायत के साथ। इसके अलावा, माइक्रोमोनास (6.40%), Chaetoceros spp. (4.44%), Scripsiella spp. (2.44%), और Prorocentrum spp केलिए पर्याप्त बहुतायत देखी गई थी। (1.28%). स्यूडोचैटोनेला एसपीपी., चिली एचएबी के उच्चतम विषाक्त अल्गल प्रेरकों में से एक, इस समुद्री जल के नमूने से 0.52% के साथ पाया गया था।

डेटा विश्वसनीयता को सत्यापित करने के लिए, 18S rRNA जीन विश्लेषण द्वारा पहचाने गए अल्गल प्रजातियों की तुलना उसी समुद्री जल के नमूने में माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त लोगों से की गई थी(चित्रा 2)। 18S rRNA जीन विश्लेषण के अनुरूप, माइक्रोस्कोपी से पता चला कि प्रमुख प्रजातियां Navicula sppथी। एक मामूली प्रजाति के रूप में 74.1% और प्रोरोसेंट्रम एसपीपी (0.60%) की सापेक्ष बहुतायत के साथ। इसके विपरीत, माइक्रोस्कोपिक अवलोकन से प्रलेखित हेटेरोकैप्सा एसपीपी (9.04%) को इस नमूने में 18S rRNA जीन विश्लेषण द्वारा पहचाना नहीं गया था। माइक्रोस्कोपी द्वारा दर्ज अज्ञात फाइटोप्लांकटन कोशिकाओं के आसपास 12.6% छोटे थे। यह माइक्रोमोनासहो सकता है, 18 एस आरआरएनए परिणामों के अनुसार।

प्रोटोकॉल समुद्री जल के नमूनों में जीवाणु प्रजातियों की पहचान करने के लिए 16S rRNA जीन मेटाबारकोडिंग विश्लेषण का उपयोग करता है। एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3में दिखाया गया है, जिसमें 18S rRNA जीन विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही समुद्री जल का विश्लेषण 16S rRNA जीन विश्लेषण के साथ किया गया था। परिणाम ने समुद्री जल के नमूने में 30 से अधिक जीवाणु प्रजातियों के साथ कुल 31,758 पढ़ता है। यह रेखांकित किया जाना चाहिए कि इस समुद्री जल के नमूने को संलग्न बैक्टीरिया से मुक्त-जीवित बैक्टीरिया को अलग करने के लिए अग्रानुक्रम फिल्टर झिल्ली (1 μm और 0.2 μm रंध्र आकार) के माध्यम से पारित किया गया था। फिर, प्रत्येक फिल्टर झिल्ली द्वारा कैप्चर की गई कोशिकाओं को डीएनए निष्कर्षण के लिए इलाज किया गया था, इसके बाद 16 एस आरआरएनए जीन विश्लेषण किया गया था। चित्रा 3 में प्रतिनिधि परिणाम 0.2 μm रंध्र आकार झिल्ली से पहचाने गए बैक्टीरिया प्रजातियों को दर्शाता है, जिन्हें मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया के रूप में परिभाषित किया गया है। प्रमुख मुक्त रहने वाले बैक्टीरिया 20.02% की सापेक्ष बहुतायत के साथ एमिलिबैक्टर एसपीपी थे, इसके बाद क्लैड आईए (13.53%) और अलीगीफिलस एसपीपीथे। (7.06%). इस समुद्री जल के नमूने से पता लगाए गए बाकी बैक्टीरिया प्रजातियों को अपेक्षाकृत समान रूप से वितरित किया गया था। एक ही विश्लेषण 1 μm रंध्र आकार की झिल्ली द्वारा कब्जा कर ली गई कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है संलग्न-बैक्टीरिया प्रजातियों का पता लगाने के रूप में।

जब इन मेटाबारकोडिंग assays एक निश्चित अध्ययन अवधि में निर्धारित समय बिंदुओं पर प्रदर्शन कर रहे हैं, परिणाम समय श्रृंखला विश्लेषण के रूप में संक्षेप में किया जा सकता है। ऐसा करने का एक तरीका यह है कि एक अद्वितीय विकास पैटर्न खोजने के लिए समय के एक समारोह के रूप में विशेष अल्गल और जीवाणु प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत को प्लॉट किया जाए। चित्रा 4 मेत्री, चिली में अलेक्जेंड्रियम और स्यूडोचैटोनेला के एक प्रतिनिधि समय-श्रृंखला की साजिश को दर्शाता है। एक समय-श्रृंखला मेटाबारकोडिंग विश्लेषण को संक्षेप में प्रस्तुत करने का एक और तरीका यह है कि सभी पहचाने गए अल्गल और बैक्टीरियल को समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किया जाए, जो जीवों के कुछ समूहों की आबादी में परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है। चित्रा 5 और चित्रा 6 क्रमशः सभी जीवाणु जीनस और आदेश की सापेक्ष बहुतायत को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं, जो पांच महीने में मेत्री के समुद्री जल से पाए जाते हैं।

तालिका 1: पहले पीसीआर मास्टर मिश्रण सामग्री: तालिका 16S rRNA और 18S rRNA विश्लेषण के लिए प्रति प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण सामग्री दिखाती है। प्राइमर अनुक्रम तालिका 3 में सूचीबद्ध हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: प्राइमर अनुक्रम: पहले पीसीआर के लिए प्राइमरों को 16एस आरआरएनए और 18 एस आरआरएनए विश्लेषण के लिए सूचीबद्ध किया गया है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: पीसीआर चक्र: पहले पीसीआर और दूसरे पीसीआर के लिए थर्मल चक्र सूचीबद्ध हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 4: अनुक्रमणिका अनुक्रम: दूसरी पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले इंडेक्स 1 (i7) और इंडेक्स 2 (i5) प्राइमर सूचीबद्ध हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5: अनुक्रमणिका 1 और अनुक्रमणिका 2 स्थिति का उदाहरण: त्रुटि को कम करने के लिए, इंडेक्स प्राइमरों को पहले स्थिति में रखा जाना चाहिए, और प्रत्येक के एलीकोट को मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके 96-अच्छी तरह से प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 6: नमूना-पत्रक का उदाहरण: अनुक्रमण से पहले, अनुक्रमणिका 1 और अनुक्रमणिका 2 एडाप्टर के संगत एक नमूना-पत्रक बनाया जाना चाहिए। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 1
चित्रा 1:18S rRNA मेटाबारकोडिंग विश्लेषण का प्रतिनिधि परिणाम: 19 फरवरी, 2019 को मेत्री, लॉस लागोस, चिली से एकत्र किए गए समुद्री जल के नमूने में मौजूद अल्गल प्रजातियों को 18S rRNA मेटाबारकोडिंग परख द्वारा पहचाना गया था। "अज्ञात" असाइन किए गए अनुक्रमों को समाप्त कर दिया गया था, और प्रत्येक पहचानी गई प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत को प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2:माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण का प्रतिनिधि परिणाम: अल्गल प्रजातियों की पहचान माइक्रोस्कोपी द्वारा 19 फरवरी, 2019 को मेत्री, लॉस लागोस, चिली के पानी के नमूने से की गई थी। प्रत्येक प्रजाति की मात्रा को मैन्युअल रूप से गिना गया था और प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3:16S rRNA मेटाबारकोडिंग विश्लेषण का प्रतिनिधि परिणाम: 19 फरवरी, 2019 को मेत्री, लॉस लागोस, चिली से पानी के नमूने में मौजूद जीवाणु प्रजातियों को 16S rRNA मेटाबारकोडिंग परख द्वारा पहचाना गया था। प्रत्येक पहचानकी गई प्रजातियों की सापेक्ष बहुतायत को प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: अलेक्जेंड्रियम एसपीपी और स्यूडोचैटोनेला एसपीपी के प्रतिनिधि समय-श्रृंखला प्लॉट 18एस आरआरएनए मेटाबारकोडिंगिन मेत्री, चिली से प्राप्त: चित्रा यारिमिज़ु एट अल9से पुनर्मुद्रित। दो विषाक्त शैवाल प्रजातियों, अलेक्जेंड्रियम और स्यूडोचैटोनेला को समय के साथ 18 एस आरआरएनए विश्लेषण द्वारा चुनिंदा रूप से निगरानी की गई थी, और सापेक्ष बहुतायत को समय-बिंदु के कार्य के रूप में प्लॉट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5:प्रतिनिधि जीनस समय-श्रृंखला प्लॉट 16S rRNA और 18S rRNA मेटाबारकोडिंग से प्राप्त: मेत्री, चिली के पानी में पहचाने गए सभी जीवाणु और यूकेरियोटिक जीनस, पांच महीने से अधिक की निगरानी की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6:16S rRNA और 18S rRNA मेटाबारकोडिंग से प्राप्त प्रतिनिधि आदेश समय-श्रृंखला प्लॉट: मेत्री, चिली के पानी में पहचाने गए सभी जीवाणु और यूकेरियोटिक आदेश, पांच महीने से अधिक की निगरानी की गई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका S1 और तालिका S2:
तालिका S1: चित्र 5 और चित्रा 6के लिए कच्चा डेटा | तालिका S2: चित्रा 5 और चित्रा 6के कच्चे डेटा पर QC की जाँच का परिणाम। कृपया इन तालिकाओं को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

इस प्रोटोकॉल ने चिली एचएबी की निगरानी के लिए समुद्री जल के नमूनों में अल्गल और बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान करने के लिए 18 एस आरआरएनए और 16 एस आरआरएनए जीन मेटाबारकोडिंग विश्लेषण सफलतापूर्वक किया। इस प्रोटोकॉल द्वारा पता लगाए गए प्रमुख शैवाल और कुछ छोटे शैवाल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किए गए लोगों के अनुरूप थे, जो प्रोटोकॉल की विश्वसनीयता की पुष्टि करते थे। प्रोटोकॉल का मुख्य आकर्षण यह है कि विश्लेषण ने अलेक्जेंड्रियम एसपीपी और स्यूडोचैटोनेला एसपीपी कापता लगाया, जो दक्षिणी चिली में दो सबसे अधिक समस्याग्रस्त एचएबी पैदा करने वाली प्रजातियां हैं, यहां तक कि मेत्री के समुद्री जल से भी कम बहुतायत में। विशेष रूप से, स्यूडोचैटोनेला एसपीपी। माइक्रोस्कोप के तहत पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण प्रजातियां हैं क्योंकि कोशिकाएं छोटी होती हैं और आसानी से प्रकाश के नीचे फट जाती हैं याफिक्सेटिव 27,28का उपयोग करती हैं। मेटाबारकोडिंग अल्गल प्रजातियों की जानकारी प्रदान कर सकती है जो समुद्री जल के नमूनों में शायद ही कभी मौजूद होती है जो माइक्रोस्कोपी की पहचान नहीं कर सकती है। प्रोटोकॉल ने 30 से अधिक जीवाणु प्रजातियों का भी पता लगाया। यद्यपि ये बैक्टीरिया अल्गल विकास से कैसे संबंधित हैं, इस बिंदु पर अज्ञात है, समय-श्रृंखला विश्लेषण में अल्गल-बैक्टीरियल प्रजातियों का बड़े पैमाने पर डेटा संग्रह संभवतः ऐसी महत्वपूर्ण खोजों को प्रदान करेगा। इस प्रकार, पारंपरिक चिली एचएबी निगरानी कार्यक्रमों में मेटाबारकोडिंग विश्लेषण जोड़ना निस्संदेह वर्तमान एचएबी निगरानी दक्षता को मजबूत करेगा। वास्तव में, मेटाबारकोडिंग विश्लेषण के लिए यह दृश्य प्रोटोकॉल न केवल चिली के पानी की अल्गल-बैक्टीरियल निगरानी के लिए फायदेमंद हो सकता है, बल्कि दुनिया भर में अन्य एचएबी-प्रभावित क्षेत्रों में तट निगरानी कार्यक्रमों के लिए भी फायदेमंद हो सकता है।

यद्यपि इस प्रोटोकॉल ने उपर्युक्त लाभ प्रदान किए हैं, विधि की कमियों पर चर्चा की जानी चाहिए। जैसा कि दृश्य प्रोटोकॉल में देखा गया है, मेटाबारकोडिंग विधि समय लेने वाली और जटिल है, जिसमें महंगी मशीनरी और अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। प्रयोगशाला कर्मियों को विशेष रूप से प्रशिक्षित किया जाना चाहिए, या यह सामग्री, श्रम और समय को बर्बाद कर देगा। इसके अलावा, मेटाबारकोडिंग द्वारा अल्गल डिटेक्शन को माइक्रोस्कोपी के साथ जोड़ा जाना चाहिए ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि एक ही प्रमुख प्रजातियों को दो ओर्थोगोनल विधियों से पहचाना जाताहै। माइक्रोस्कोपी एक गैर-इनवेसिव उपकरण है, अधिकांश भाग के लिए, अल्गल प्रजातियों की पहचान करने के लिए, जिसका अर्थ है कि जब अल्गल प्रजातियों में अद्वितीय और स्पष्ट आकार होते हैं तो गलतियां करना कठिन होता है। बेशक, मानव त्रुटि तब हो सकती है जब प्रजातियों में एक दूसरे के समान आकार हों। दूसरी ओर, चूंकि मेटाबारकोडिंग विश्लेषण के लिए कई चरणों की आवश्यकता होती है, इसलिए यह स्वाभाविक रूप से त्रुटियों को बढ़ाता है। यह एक नमूना मिश्रित हो सकता है, गलत अभिकर्मक इसके अलावा, या कुछ प्रक्रियाओं को याद कर रहा है। इसलिए, माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त किए गए लोगों के साथ मेटाबारकोडिंग परिणामों की तुलना करना महत्वपूर्ण है। अंत में, प्रोटोकॉल केवल गुणात्मक रूप से लागू होता है, और परिणामों की गणना सापेक्ष बहुतायत के लिए की जानी चाहिए। जैसा कि लैम्ब एट अल ने 2019 में कहा था, मात्रात्मक प्रदर्शन के रूप में वर्तमान मेटाबारकोडिंग अभी भी सीमित है, और मेटाबारकोडिंग से पहले अतिरिक्त शोध की आवश्यकता होती है, जिसे मात्रात्मक अनुप्रयोगों30के लिए आत्मविश्वास से उपयोग किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल को 140 - 170 नमूनों के लिए अनुकूलित किया गया था, जो कि Illumina Inc द्वारा जारी किए गए 16S मेटाजीनोमिक अनुक्रमण लाइब्रेरी तैयारी मैनुअल से प्रति रन थे। अनुकूलित प्रोटोकॉल का कई बार परीक्षण किया गया था और इस अंतिम संस्करण को जारी करने के लिए आगे संशोधित किया गया था। इसलिए, प्रत्येक चरण का सटीक रूप से पालन करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा यह है कि नमूना संदूषण से बचने के लिए अतिरिक्त देखभाल की आवश्यकता होती है। पिपेट्स और लैमिनर फ्लो हुड को हर समय 70% अल्कोहल और यूवी एक्सपोजर के साथ साफ किया जाना चाहिए, और बाँझ सामग्री को ऑटोक्लेव किया जाना चाहिए। प्राइमरों और अभिकर्मकों को हर नए रन पर स्टॉक से सीधे पतला किया जाना चाहिए, या अभिकर्मकों का पुन: उपयोग और कई कमजोर पड़ने के जोखिम एक नमूना संदूषण कारण हो सकता है। प्रोटोकॉल निर्दिष्ट करता है कि ऑपरेशन को लैमिनर फ्लो हुड के बाहर कब किया जा सकता है। जब तक अन्यथा, नमूनों को एक साफ लैमिनर प्रवाह हुड में इलाज किया जाना चाहिए। एक साथ कई 8-ट्यूब स्ट्रिप्स से निपटने पर, पहले 8-ट्यूब स्ट्रिप पर काम करने और अगले 8-ट्यूब स्ट्रिप पर जाने से पहले इसे कैप करने की सिफारिश की जाती है। ढक्कन को लंबे समय तक खुला छोड़ना नमूना संदूषण का कारण बन सकता है क्योंकि 16 एस और 18 एस आरआरएनए जीन परिवेश में अत्यधिक सर्वव्यापी हैं। कहा गया समय, जैसे कि मिश्रण समय और इनक्यूबेशन समय, का पालन किया जाना चाहिए जैसा कि वास्तव में वर्णित है क्योंकि प्रत्येक चरण के लिए सबसे अच्छी अवधि का चयन एकाधिक परीक्षण रन के आधार पर किया गया था। अतिरिक्त या अपर्याप्त समय, उदाहरण के लिए, नमूना उपज को कम कर सकता है। प्रक्रिया को केवल उस हिस्से पर रोका जाना चाहिए जो प्रोटोकॉल कहता है कि यह बंद हो सकता है। नकारात्मक नियंत्रण रखना महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पुष्टि करता है कि सकारात्मक परिणाम कृत्रिम झूठे सकारात्मक नहीं हैं। अंत में, दिनों की योजना बनाने के लिए अत्यधिक अनुशंसा की जाती है क्योंकि सभी चरणों को संसाधित करने के लिए कम से कम पांच दिनों की आवश्यकता होती है, और कुछ हिस्सों को अगले ठहराव संकेत तक रोका नहीं जा सकता है।

अनुक्रमित डेटा के लिए टैक्सोनोमिक असाइनमेंट की सीमा संक्षेप में यहां नोट की गई है। बैक्टीरियल और अल्गल प्रजातियों के लिए नए खोजे गए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों को डेटाबैंक में दैनिक रूप से अपडेट किया जाता है। जबकि अच्छी तरह से अध्ययन किए गए अल्गल और बैक्टीरियल प्रजातियों को मज़बूती से पंजीकृत किया जाता है, डेटाबैंक में अपडेट की गई अज्ञात प्रजातियों के लिए कई अनुक्रम भी हैं। यह इंगित करता है कि पंजीकृत न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमों का संकल्प हमेशा प्रजातियों की पहचान के लिए पर्याप्त नहीं होता है, लेकिन केवल जीनस पहचान के लिए। इस प्रकार, माइक्रोस्कोपिक प्रजातियों की पहचान को ऑर्थोगोनल रूप से किया जाना चाहिए। इस काम के लिए एक ओपन-एक्सेस पाइपलाइन स्थापित करने से एक बार में अनुक्रमित डेटा के एक बड़े सेट से निपटने और त्रुटि होने पर कुशलतापूर्वक जांच करने में एक महत्वपूर्ण लाभ होता है। इसके अतिरिक्त, DADA2 का आउटपुट एक पाठ या csv फ़ाइल में है, जो इसे आगे सांख्यिकीय विश्लेषण करना आसान बनाता है। दूसरी ओर, टैक्सोनोमिक असाइनमेंट करने के लिए एक बड़े सर्वर की आवश्यकता होती है, खासकर जब एक डेटासेट बड़ा होता है। पाइपलाइन स्थापित करने के लिए, पाइपलाइन स्थापित करने के लिए इंजीनियरों की आवश्यकता होती है, और पेशेवरों को पैरामीटर, ऑपरेशन, लिनक्स और जैव सूचना विज्ञान को समझना चाहिए।

एक HAB निगरानी उपकरण के रूप में दायरे के अलावा, इस प्रोटोकॉल के उपयोग को खोजी अनुसंधान उद्देश्यों के लिए विस्तारित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चिली की सरकार और स्थानीय मछुआरों के बीच पर्यावरण शांति संघों के साथ-साथ स्थानीय HAB31, 32की बढ़ी हुई संख्या के बारे में बहस चल रही है। सरकार का दावा है कि यह ग्लोबल वार्मिंग और एल नीनो जैसी प्राकृतिक घटना के कारण है, जबकि बाद की पार्टियों का दावा है कि सैल्मन एक्वाकल्चर इसका कारण है। सैल्मन चिली की एक स्वदेशी प्रजाति नहीं है और आधी सदी पहले चिली के पानी में नहीं थी। चिली की सरकार का उद्देश्य उस समय अर्थव्यवस्था को विकसित करना और एक सामन व्यवसाय विकसित करके गरीब क्षेत्रों के लिए रोजगार पैदा करनाथा। पूंजीगत लाभ के लिए विदेशों से हस्तक्षेप के साथ, चिली ने पेन-स्टाइल एक्वाकल्चर विकास में बड़ी सफलता हासिल की, और पिछले कई दशकों में सामन की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि हुईहै 31,32,33। इसके बाद, सैल्मन के लिए भोजन की एक बड़ी मात्रा को समुद्र में फेंक दिया गया है, जिससे स्थानीय लोगों को संदेह है कि सैल्मन एक्वाकल्चर लगातार स्थानीयHABs 31,32का कारण है। सच्चाई अब अज्ञात है, लेकिन इसे अंततः समझा जाना चाहिए ताकि एचएबी से स्थानीय समुद्री पर्यावरण, अर्थव्यवस्था और मानव स्वास्थ्य की रक्षा के लिए रणनीतियां तैयार की जा सकें। स्थानीय शैवाल-जीवाणु संबंध पर आणविक-आधारित विश्लेषण इस तरह के विषय के लिए एक कदम आगे स्पष्टीकरण में योगदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, तकनीक शैवाल और जीवाणु प्रजातियों की खोज कर सकती है जो पहले लक्ष्य महासागरीय क्षेत्र में मौजूद नहीं थीं, लेकिन हाल के वर्षों में नाटकीय रूप से बढ़ी हैं, जो जीआईएस और ईडीएनए विश्लेषण34द्वारा यामाटो समन्दर(Hynobius Vandenburghi)की एक अलिखित आबादी की खोज के लिए साकाई एट अल द्वारा किए गए अध्ययन के समान है। इसलिए, HAB निगरानी उपकरण से परे, इस मेटाबारकोडिंग प्रोटोकॉल अन्य संभावनाओं के लिए संभावित उपयोग है।

Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है। अध्ययन के डिजाइन, संग्रह, विश्लेषण, या डेटा की व्याख्या में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी; पांडुलिपि के लेखन में, या परिणामों को प्रकाशित करने के निर्णय में।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चिली में सतत विकास-निगरानी शैवाल (SATREPS-MACH) के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी अनुसंधान साझेदारी पर एक अध्ययन के लिए अनुदान (JPMJSA1705) द्वारा समर्थित किया गया था। हम डॉ सैंड्रा रियोस (Universidad de Los Lagos) को धन्यवाद देते हैं कि उन्होंने हमें एक फिल्म क्लिप का उपयोग करने की अनुमति दी। हम नील एंड्रयू हॉलैंड को पांडुलिपि के अपने परिश्रमी प्रूफरीडिंग के लिए धन्यवाद देते हैं। हम फाइटोप्लांकटन पहचान पर हमें सलाह देने के लिए प्यूर्टो मोंट, चिली में CREAN-IFOP में प्रयोगशाला समूह के सदस्यों के लिए हमारी ईमानदारी से सराहना व्यक्त करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL single tube ThermoFisher Q32856 sterile
1.5 mL tubes ThermoFisher 2150N sterile
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap ThermoFisher AB0451 & 4323032 sterile
96-well 0.2 mL PCR plate ThermoFisher N8010560
AccuRuler 100 bp DNA Ladder MaestroGen 02001-500
Chelex 100 Chelating Resin Bio-Rad 1432832
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump MilliporeSigma WP6122050
D1000 Reagents Agilent Technologies 5067-5583
D1000 sample buffer Agilent Technologies 5067-5602
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) Promega G1881
Ethanol Molecular Biology Grade E7023 Merck KGaA
Filtration device ThermoFisher 09-740-36H, 09-740-23E
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) Thermo Fisher Scientific Q32851
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) ThermoFisher Q33238
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) Agilent Technologies 5067-5582
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) Agilent G2992AA
GelRed Nucleic Acid Gel Stain Biotium 41002
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) Scientific Industries SI-0236
Heat block
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X Roche KK2602
HT1 Hybridization buffer Illumina 20015892
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D Illumina FC-131-2001, -2002, -2003, -2004
Laminar hood cabinet Biobase Co. Biobase PCR-800 PCR Cabinet
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) Agilent Technologies 5067-5598
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) Promega NG2002
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) ThermoFisher AM10027
Micro-seal film for 96-well plate ThermoFisher 4311971 sterile
MiSeq Reagent Kit v3 Illumina MS-102-3003 includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges.
MiSeq system Illumina SY-410-1003 includes pre-installed software
Molecular grade nuclease-free water Integrated DNA Technologies 11-05-01-04
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M Merck KGaA 1091371000
Multichannel pipettes Not specified Not specified
Multi-Purpose Agarose Cleaver Scientific CSL-AG500
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System ThermoFisher D2
Ow EC-105 Compact Power Supply ThermoFisher 105ECA-115
Pellet Pestle— Cordless Motor ThermoFisher K749540-0000
PhiX control Kit v3 Illumina FC-110-300 ready-to-use control library for Illumina sequencing
Pipette tips Not specified Not specified sterile
Pipettes Not specified Not specified 2, 10, 20, 100, 1000 μL
SterivexTM GP 0.22  μm filter unit MilliporeSigma SVGP01050
Tabletop centrifuge Eppendorf 5427R Centrifuge Eppendorf AG
TBE buffer ThermoFisher B52
TE buffer (pH 8.0) ThermoFisher AM9849
Terr PCR Direct FFPE Kit Takara Bio USA 639284 includes 2X Terra PCR Direct Buffer
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL Takara Bio USA 639271 High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) ThermoFisher A37835
TransIlluminator and image capture system Analytik Jena, AG GelDoc-ItTS2 Imager
Whatman 1.0  m pore-sized membrane MilliporeSigma WHA111110

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References

  1. Hallegraeff, G., Enevoldsen, H., Zingone, A. Global harmful algal bloom status reporting. Harmful Algae. 102, 101992 (2021).
  2. Anderson, D. M. Red Tides. Scientific American. 271 (2), 52-58 (1994).
  3. Sanseverino, I., Conduto, A. D. S., Pozzoli, L., Dobricic, S., Lettieri, T. Algal Bloom and its Economic Impact. , Publications Office of the European Union. (2016).
  4. Molinet, C., Niklitschek, E., Seguel, M., Díaz, P. Trends of natural accumulation and detoxification of paralytic shellfish poison in two bivalves from the Norwest Patagonian inland sea. Revista de Biologia Marina Y Oceanografia. 45, 195-204 (2010).
  5. Mardones, J., Clement, A., Rojas, X., Aparicio, C. Alexandrium catenella during 2009 in Chilean waters, and recent expansion to coastal ocean. Harmful Algae News. 41, 8-9 (2010).
  6. Alvarez, G., et al. Paralytic shellfish toxins in surf clams Mesodesma donacium during a large bloom of Alexandrium catenella dinoflagellates associated to an intense shellfish mass mortality. Toxins (Basel). 11 (4), (2019).
  7. Clément, A., et al. Exceptional summer conditions and HABs of Pseudochattonella in Southern Chile create record impacts on salmon farms. Harmful Algae News. 53, 1-3 (2016).
  8. Trainer, V. L., et al. Pelagic harmful algal blooms and climate change: Lessons from nature's experiments with extremes. Harmful Algae. 91, 101591 (2020).
  9. Yarimizu, K., et al. Protocols for monitoring harmful algal blooms for sustainable aquaculture and coastal fisheries in Chile. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (20), (2020).
  10. Roegner, G. C., Hickey, B. M., Newton, J. A., Shanks, A. L., Armstrong, D. A. Wind-induced plume and bloom intrusions into Willapa Bay, Washington. Limnology & Oceanography. 47 (4), 1033-1042 (2002).
  11. Tweddle, J. F., et al. Relationships among upwelling, phytoplankton blooms, and phycotoxins in coastal Oregon shellfish. Marine Ecology Progress Series. 405, 131-145 (2010).
  12. Glibert, P. M., Anderson, D. M., Gentien, P., Graneli, E., Sellner, K. G. The global complex phenomena of harmful algae blooms. Oceanography. 18 (2), 130-141 (2005).
  13. Paredes-Mella, J., Varela, D., Fernández, P., Espinoza-González, O. Growth performance of Alexandrium catenella from the Chilean fjords under different environmental drivers: Plasticity as a response to a highly variable environment. Journal of Plankton Research. 42 (2), 119-134 (2020).
  14. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).
  15. Amin, S. A., et al. Interaction and signaling between a cosmopolitan phytoplankton and associated bacteria. Nature. 522, 98-101 (2015).
  16. Berdalet, E., et al. Marine harmful algal blooms, human health, and wellbeing: Challenges and opportunities in the 21st century. Journal of Marine Biology Association. 2015, U. K. 1-31 (2015).
  17. Ramanan, R., Kim, B. -H., Cho, D. -H., Oh, H. -M., Kim, H. -S. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology, and emerging applications. Biotechnology Advances. 34 (1), 14-29 (2016).
  18. Seymour, J. R., Amin, S. A., Raina, J. B., Stocker, R. Zooming in on the phycosphere: The ecological interface for phytoplankton-bacteria relationships. Nature Reviews Microbiology. 2, 17065 (2017).
  19. Maruyama, F., et al. 16S and 18S Metabarcoding analysis for Chilean coastal waters harmful algal blooms. protocol.io. , (2020).
  20. Tanabe, A. S., et al. Comparative study of the validity of three regions of the 18S-rRNA gene for massively parallel sequencing-based monitoring of the planktonic eukaryote community. Molecular Ecology Resources. 16, 402-414 (2016).
  21. Nishitani, G., et al. Multiple plastids collected by the Dinoflagellate Dinophysis mitra through Kleptoplastidy. Applied and Environmental Microbiology. 78 (3), 813-821 (2012).
  22. Klindworth, A., et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies. Nucleic Acids Research. 41 (1), 1 (2013).
  23. Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  24. R, R Team DCore. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2007).
  25. McMurdie, P. J., Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One. 8 (4), 61217 (2013).
  26. Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. Journal of Vegetation Science. 14 (6), 927-930 (2003).
  27. Dittami, S. M., Riisberg, I., Edvardsen, B. Molecular probes for the detection and identification of ichthyotoxic marine microalgae of the genus Pseudochattonella (Dictyochophyceae, Ochrophyta). Environmental Science and Pollution Research. 20 (10), 6824-6837 (2013).
  28. Mardones, J. I., et al. Salinity-growth response and ichthyotoxic potency of the Chilean Pseudochattonella verruculosa. Frontiers in Marine Science. 6 (24), (2019).
  29. Santi, I., Kasapidis, P., Karakassis, I., Pitta, P. A comparison of DNA metabarcoding and microscopy methodologies for the study of aquatic microbial eukaryotes. Diversity. 13 (5), 180 (2021).
  30. Lamb, P. D., et al. How quantitative is metabarcoding: A meta-analytical approach. Molecular Ecology. 28 (2), 420-430 (2019).
  31. Mascareño, A., et al. Controversies in social-ecological systems: lessons from a major red tide crisis on Chiloe Island, Chile. Ecology and Society. 23, (2018).
  32. Armijo, J., Oerder, V., Auger, P. -A., Bravo, A., Molina, E. The 2016 red tide crisis in southern Chile: Possible influence of the mass oceanic dumping of dead salmons. Marine Pollution Bulletin. 150, 110603 (2020).
  33. Swanson, H. A. Caught in Comparisons: Japanese Salmon in an Uneven World. , University of California, Santa Cruz. Doctor of Phylosophy thesis (2013).
  34. Sakai, Y., et al. Discovery of an unrecorded population of Yamato salamander (Hynobius vandenburghi) by GIS and eDNA analysis. Environmental DNA. 1 (3), 281-289 (2019).

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मेटाबारकोडिंग विश्लेषण द्वारा चिली में हानिकारक अल्गल ब्लूम्स की निगरानी के लिए एक मानकीकृत प्रक्रिया
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