Summary
该协议描述了设计用于ESLP研究的原位左肺同种异体移植的幼猪模型。重点是麻醉和手术技术，以及关键步骤和故障排除。
Abstract
肺移植是终末期肺病的金标准治疗方法，全世界每年进行超过 4,600 例肺移植手术。然而，肺移植受到可用供体器官短缺的限制。因此，候补名单的死亡率很高。在一些中心， 非原位 肺灌注 （ESLP） 使供体肺利用率提高了 15%-20%。ESLP 已被应用为评估和修复边缘供体肺的一种方法，并已证明移植扩展标准供体 （ECD） 肺后可接受的短期和长期结果。需要大型动物（体内）移植模型来验证正在进行的 体外 研究结果。人类和猪之间的解剖学和生理学差异带来了重大的技术和麻醉挑战。易于复制的移植模型将允许对当前的ESLP策略进行体内验证，并对旨在改善供体肺功能的各种干预措施进行临床前评估。该方案描述了原位左肺同种异体移植的猪模型。这包括麻醉和手术技术、定制的手术清单、故障排除、修改以及该方法的优点和局限性。
Introduction
肺移植是终末期肺病的首要长期治疗方法。全世界每年进行超过 4,600 例肺移植手术 1.然而，肺移植目前有很大的局限性。首先，器官的必要性继续使可用的捐赠者黯然失色。尽管自 2012 年以来，由于更多移植候选者被列入名单、供体数量增加以及恢复器官使用得到改善的综合影响，肺移植率每年都在上升，但移植候补名单的死亡率并未显着下降2.器官质量问题是另一个主要限制，据报道器官利用率低至 20%-30%3,4,5。最后，肺移植术后结局的趋势不尽如人意，长期移植和患者结局仍落后于其他实体器官移植2.
一种新兴技术，即非原位肺灌注（ESLP），有可能减轻这些局限性。ESLP 已越来越多地被用作评估和修复边缘供体肺的方法，并且已证明移植扩展标准供体 （ECD） 肺6、7、8、9、10 后可接受的短期和长期结果。因此，ESLP 将一些中心的利用率提高了 15%-20%6、7、8、9、10、11。
适当的ESLP研究需要对体外研究结果进行体内验证;然而，关于 ESLP12、13、14、15 的猪肺移植模型的文献有限。此外，现有文献提供的关于约克郡猪肺移植麻醉管理的细节不足，肺移植的血流动力学可能非常不稳定12,13,14,15。建立一个易于重复的模型将允许对当前的ESLP策略进行体内验证，并对各种干预措施进行临床前评估，以减少肺缺血再灌注损伤。本研究的目的是描述用于 ESLP 的原位左肺同种异体移植的猪模型。该方案包括麻醉剂和手术技术的描述、自定义手术清单以及有关故障排除体验和方案修改的详细信息。本文还讨论了左肺猪移植模型的局限性和益处。本手稿没有概述35-50公斤约克郡猪猪肺的检索过程，也没有涵盖ESLP的建立和终止。该协议专门针对受体移植手术。
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Protocol
所有程序均按照加拿大动物护理委员会的指导方针和实验动物的护理和使用指南进行。这些协议得到了阿尔伯塔大学机构动物护理委员会的批准。该方案已应用于35-50公斤的雌性幼年约克郡猪。猪是无病原体的食品级标本。它们是从加拿大艾伯塔省埃德蒙顿的猪研究和技术中心购买的（https://srtc.ualberta.ca）。所有参与ESLP程序的人都接受了适当的生物安全培训。
1.术前准备和麻醉
注意：猪在手术前禁食过夜，最长持续时间为12小时。
- 肌内注射氯胺酮 （20 mg/kg） 和阿托品 （0.05 mg/kg） 作为手术室受孕猪的术前用药。
- 将猪仰卧在加热的手术台上以保持体温正常，然后进行面罩诱导。
- 根据动物体重和麻醉系统滴定氧气流速。
注意：氧气流量应为 20-40 mL/kg。 - 以4%-5%施用异氟醚，1-2分钟后降至3%。
- 评估麻醉深度，确保猪对有害刺激没有戒断反射。每 5 分钟重复一次。
注意：如果存在疼痛反应，则增加异氟醚给药的百分比，直到达到适当的麻醉深度。有关氯胺酮和氢吗啡酮维持镇痛的更多详细信息，请参阅本节的第 10 步。不使用麻痹剂。这允许评估戒断反射。捏鼻子被用作有害刺激。 - 一旦确认了正确的麻醉深度，就给猪插管。对于40-50公斤的猪，使用定制的10英寸扁平喉镜和9号或10号气管插管。
- 将脉搏血氧仪探头放在舌头（首选）或耳朵上，并将血氧饱和度定在 90% 以上。
注意： 通过鼻探头监测温度。加热垫用于维持正常体温。 - 为了维持麻醉，调整氧气流量（20-40 mL/kg）和吸入气体速率（1%-3%）。
- 将呼吸机设置保持在 12-30 次呼吸/分钟、6-10 mL/kg 的 TV、5 cm H2O 的 PEEP 和 20 cm H2O 的峰值压力。
注意： 标准 ICU 型正压呼吸机用于创建用于麻醉和通气的封闭系统。以 15 分钟的间隔连续监测和记录生命体征。每 15-60 分钟抽取一次 ABG，具体取决于动物的稳定性。虽然 TV 的目标值高达 10 mL/kg，但可以达到 6-8 mL/kg。 图 1 提供了实验室中应用的移植方案的负压通气 （NPV）-ESLP 的示意图。 - 剃须，清洗并使用聚维酮碘无菌制备切口部位。
注意：在氯胺酮/阿托品镇静后，镇痛方案包括每 1 小时静脉注射 3mg/kg 氯胺酮（范围 1-3 mg/kg，取决于患者参数）和氢吗啡酮 0.05 mg/kg 肌内注射 2 小时通过外周插入的静脉输液管在耳静脉中。两次给药之间任何较长的持续时间都会导致突破性疼痛反应，例如心率加快和呼吸模式/腹部肌肉运动异常。
2. 插入中心静脉和动脉管路
- 插入中心静脉输液和肝素给药中心线。
注：总静脉输液计算为 1 mL/kg/h，并给予液体推注 PRN 以维持 MAP >60 mmHg。中心静脉导管也用于使用类固醇、抗生素、血管加压药和正性肌力药物。有关线路定位，请参见 图2A 。- 使用聚维酮碘制备溶液准备皮肤并使其完全干燥。使用电烙术在气管中心做一个 5-8 cm 的中线切口，并从胸骨切迹向颅内延伸。
- 使用烧灼法将皮肤和皮下脂肪分开。
- 分割束带肌之间的中线平面，然后划分结缔组织层，以识别气管外侧的左侧或右侧颈动脉血管内束。
- 使用丝带（2-0 号）作为血管环获得颈静脉的近端和远端控制。
- 系好颅骨环绕系带，并在近端系带上向上缩回以控制血流。
- 使用 Metzenbaum 剪刀在静脉上做一个小切口（参见 材料表），以容纳双端口、7 Fr 中心线（~血管周长的 ~1/3）。
- 同时，释放近端血管环上的张力，插管静脉，然后系紧以将插管固定在静脉中 10 厘米的深度。
- 用肝素冲洗管路，连接到0.9%生理盐水的静脉输液管路，如果猪因脱水而血管内耗尽，则给予液体。
注意：肝素会锁定任何未使用的端口。 - 给予 500 mg 甲泼尼松和 1 g 头孢唑林静脉注射。
- 按照相同的技术，使用 7 Fr 动脉管对颈总动脉进行插管，以实现准确的血压管理。
3.左肺摘取
- 将猪置于右侧卧位。
- 进行左前外侧开胸手术（图2）。
- 使用聚维酮碘制备溶液准备皮肤并使其完全干燥。使用以下标志标记开胸切口（20 cm）：使用触诊识别左肩胛骨的尖端;同样，通过触诊识别胸骨下方的剑突。如图 2B 所示连接两者。
- 将总共 10 mL 的 0.25% 布比卡因注射到切口线和切口上方和下方的两个肋骨空间中。
- 使用电烙术解剖皮肤、皮下层和肌肉层。背阔肌必须分开。识别切口正下方的肋骨，并在肋骨顶部烧灼以暴露肋间肌肉，同时避开肋间神经血管束。
- 使用蚊子止血器刺穿肋骨正上方的肋间肌肉，然后用手指感觉胸部内部是否有粘连。使用Yankauer抽吸或手指（见 材料表）将肺推开，同时沿肋骨的顶部边缘烧灼以延长开胸手术。
- 向前延伸开胸手术，直到距离胸骨 1 英寸。将开胸手术向后延伸至椎旁肌肉。
- 插入Cooley胸骨牵开器（参见 材料表）以打开开胸手术（10cm）（图2C）。缩回肺以暴露左半合子静脉（图2D）。
- 使用Metzenbaum剪刀和精细的Lauer进行周向解剖左半合子静脉。用丝带缠绕容器，然后将其结扎并横断（图2E）。在近端残端系上一条丝绸领带，以增加控制力。
注意：劳尔是用于组织解剖的直角夹或乳糜泻夹。 - 解剖左肺动脉 （PA） 和左肺静脉 （PV）。用丝带环绕静脉进行控制（图2F）。
注意：上 PV 非常小，并且根据个体解剖结构在其分支点或共同躯干处缝合结扎。左主支气管深至PA和LA（左心房），因此有时，在动脉和静脉被夹住并横断之前，它不能轻易解剖（图2G）。 - 在钳制PA前5分钟施用5000单位肝素IV。
注意：肝素5000单位IV也在松开PA前5分钟施用。之后每一小时，施用1000单位静脉注射肝素。 - 分别夹紧 PA（DeBakey 交叉夹）、左下肺静脉（Satinsky 夹）和左支气管（Spoon Potts 夹）（参见 材料表）。左支气管夹紧后，将潮气量降至 5 mL/kg。
- 横切 PA、左下肺静脉和左支气管。留出至少 0.5 厘米的纸巾袖带进行缝制。分割左下肺韧带，切除左肺。
注意：左肺可以丢弃或保留用于控制组织学。
4.终止ESLP，左肺分裂，用电解质溶液冲洗
- 在最大吸气时夹紧通气管，终止灌注和通气，并断开肺与 ESLP 装置的连接。
- 称量肺部以确定水肿形成的量。
注意：水肿是由于过多液体积聚而导致的组织肿胀。 - 对副肺叶进行组织活检，将其分成三等份，然后将一块放入以下各一块中：最佳切割温度 （OCT） 凝胶、福尔马林和在液氮中快速冷冻。
注意：此步骤通常在作者的实验室中执行。然后将样品储存以备将来分析：将OCT和速冻样品保存在-80°C冰箱中，将福尔马林储存的样品置于适当密封的容器中并储存在4°C冰箱中。具体ESLP方案和组织分析详见其他专题16。 - 将左供体肺与右肺分开。留下 1 cm 的供体 PA、1 cm 的供体支气管和足够的供体 LA 袖带（周向 ~0.5 cm）缝合到受体 LA（图 2H）。使左侧下部 PV 和左侧上部 PV 与供体 LA 壁保持连续性，以促进以后的吻合。
- 称量左肺。
- 使用连接到静脉输液管的滴吸器对供体左侧 PA 进行插管，并通过肺脉管系统冲洗 500 mL 细胞外、低钾、葡聚糖基电解质保存溶液。冲洗过程中用丝带将套管固定在 PA 中，并在冲洗完成后松开。
注意：上述步骤与用于此工作的特定 ESLP 设备有关，可能不直接适用于其他设备。
5.左肺移植
- 将供体肺插入受体的胸部，从下叶开始。不要强行将肺固定到位。
注意：可能需要通过扭转胸骨牵开器来向上抬起下胸腔以容纳供体肺。理想情况下，接受者比供体大几公斤，以促进尺寸匹配。 - 首先在TF针上使用4-0 prolene进行支气管吻合术（图2I）。
注意：运行的端到端吻合效果很好。缝纫前修剪两个吻合口端的多余长度，以避免多余组织引起的扭结。 - 使用运行的端到端吻合术，在 BV-1 针头上用 6-0 prolene 进行 LA 吻合术。再次，修剪多余的组织以避免扭结。
注意：LA 易碎，受益于小 BV-1 针头。可能需要对供体进行水平咬合，以购买足够的组织并纠正因将供体 IPV 和 SPV 缝合到受体 IPV/LA 开口而导致的大小不匹配。 - 将供体SPV合并到下PV和LA吻合口中，以允许左上肺叶静脉引流（图2J）。
注意：分支上肺静脉 （SPV） 直径小于 0.5 厘米。常见的 SPV 躯干长度不一，并且不常规存在，因此供体和受体 SPV 之间的直接吻合是一个糟糕的选择。 - 使用运行的端到端吻合术，在 BV-1 针头上用 6-0 prolene 完成 PA 吻合术。再次，修剪多余的组织以避免扭结。
- 取下支气管钳夹并增加 TV，目标值为 10 mL/kg。
- 确认肝素化，给予钾转移（40 mg 呋塞米、10 单位胰岛素、100 mL 25% 葡萄糖溶液）、部分打开 PA 钳夹、脱气并系扎 PA 缝合线。完全松开 PA clamp 10 分钟后。
- 同时，对 LA 进行脱气，系好缝合线，然后取下 LA 夹。
- 从中心静脉输血气，从左中叶再灌注组织活检。
注意：要进行组织活检，请使用 0 号丝带环绕中叶顶点的 1 厘米部分，系扎以诱捕组织，然后用 Metzenbaum 剪刀剪断隔离部分。将活检分成三等份，并如前所述进行管理。 - 进行左肺和右肺支气管镜检查，以评估支气管吻合和抽吸分泌物。使用适配器连接将支气管镜插入气管插管。
- 将示波器连接到吸力。将支气管镜推进到左支气管中。检查支气管吻合口（图2N）。将内窥镜向下推进细支气管并吸出任何液体。在右侧重复。
注意： 不要让血氧饱和度低于 90%。如果饱和度低于此水平，请取下内窥镜并让清管器不间断通风几分钟以恢复。
- 将示波器连接到吸力。将支气管镜推进到左支气管中。检查支气管吻合口（图2N）。将内窥镜向下推进细支气管并吸出任何液体。在右侧重复。
- 插入20 Fr可延展胸管（图2L），将开胸手术分成三层（图2M），并在动脉血气（ABG）稳定后立即使猪俯卧（图2O）。
- 在俯卧位监测猪4小时以上。每 30 分钟进行一次 ABG 分析。再灌注后每小时给予 1000 单位肝素。
- 每小时取 10 mL 血样进行离心和炎症标志物的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 分析16。
注意：离心参数将在后面详细介绍。
- 每小时取 10 mL 血样进行离心和炎症标志物的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 分析16。
6. 孤立性左肺评估
- 将猪仰卧放置，并使用聚维酮碘制备溶液重新制备胸骨。进行中线胸骨切开术以进行最终的离体左肺评估（图2P）。
- 如前所述，使用Metzenbaum剪刀打开左胸膜，并从左下叶进行组织活检（注意步骤5.9）。
- 打开副肺叶胸膜，用 Metzenbaum 剪刀解剖总静脉。
注意：稍后将夹紧。 - 使用 21 G 针头从 LA 吻合口采集血样。将针头引向左肺静脉，远离左心房或副肺叶干。
- 打开右胸膜，为右肺门夹腾出空间（参见 材料表）。解剖右下肺韧带直至肺门。确保可以在肺门上部、下部和前部周围放置一个夹子。
注意：这确保了肺门被闭塞，并且所有氧合都依赖于左肺。此时右肺不会通气，这应该通过呼吸机呼吸缺乏充气/放气来明显。右下叶可以从胸部抬起以完成此操作。 - 使用DeBakey主动脉交叉钳夹（参见 材料表）夹紧副叶静脉，以阻塞任何进入LA的副叶引流（图2Q）。
- 夹紧右肺门，并用指向左肺的21G针从左侧PV吻合口处采集以下连续血样：夹紧后0分钟，1分钟，2分钟，5分钟和10分钟。
注：取五个样品以监测氧分压（PaO2）的任何趋势（图2R）。PaO2 应保持相对稳定，以代表正常的左肺功能。如果任何样品出现凝血问题或动脉血气分析出现问题，五个样品还可以为质量评估提供保险。 - 横切吻合口，切除左肺。横断 IVC，通过放血加速麻醉下的安乐死。
注意：受体猪的总麻醉时间为8小时。 - 称量供体肺以评估水肿的形成，并检查其整体外观。检查 PA、支气管和 LA 袖带，在供体肺和受体纵隔内是否有血栓或其他病变体征。
- 运行最终的气体分析，离心灌注液样品，并如前所述储存组织活检（步骤4.3的注释）。
注意：离心设置为：112 x g，9 次加速，9 次减速，4 °C 和 15 分钟持续时间。
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Representative Results
所有结果均在 NPV-ESLP16 12 小时后再灌注 4 小时的背景下进行。在肺外植体期间，有几种临床结果需要预期（图3）。通常，猪在左肺移植成功后将保持血流动力学稳定，但由于对手术的血管舒张反应，可能需要低剂量输注去氧肾上腺素（剂量范围：2-10 mg/h）。心率目标应约为 100-120 次/分，SpO 2 > 90% 时呼吸频率 （RR） 为 8-30%，平均动脉压 （MAP） > 60 mmHg，常温 （38 °C），潮气量 （TV） 目标为 5 mL/kg，单肺通气时峰值压力为 20-24 cm H2O。在单肺通气期间，通气量减少一半，以保护左肺免受过度充气。增加呼吸频率以达到生理性呼气末二氧化碳水平（图3）。因此，图 3 显示了移植关键点期间的典型血流动力学和通气参数。
在肺植入过程中，以下结果是典型的。在ESLP运行期间，左肺将吸收液体，并且看起来比外植的肺更重和更大。因此，受体应比供体略大（2-4公斤），因此胸部可以容纳有点水肿的肺。肺部需要轻轻按压才能通过开胸手术插入胸部。更容易先插入下瓣，然后插入上瓣。支气管是直接的端到端吻合术，应首先进行。建议在 TF 针头上使用 4-0 prolene。LA 袖口非常易碎，但由于组织的冗余和柔韧性，缝制起来不太难。BV-1 针头上的 6-0 prolene 对 LA 吻合术效果很好。PA 是最后一次进行的吻合术。这种容器很容易撕裂，牵引力很小。如果它撕裂，可以打开心包并将夹子向健康组织近端移动以进行缝合。同样，BV-1 针头上的 6-0 prolene 适用于这种吻合术。
在再灌注时，注意到以下趋势。一旦松开支气管，将电视增加到 10 mL/kg，左肺将开始充气。虽然潮气量的目标是 10 mL/kg，但通常达到 6-8 mL/kg，这是在再灌注的前 2-3 小时内逐渐实现的，具体取决于所使用的 ESLP 方案和植入肺的质量。极少数情况下，可能会有小的漏气，这可以通过在前壁上简单地缝合来补救。后壁更难修复，需要填塞。应努力避免支气管吻合口漏气。支气管镜检查显示右肺正常，左肺通常水肿。检查缝合线，从气道中抽出约 50-100 mL 透明液体。在吸吮过程中，电视会从 300 秒到 20 秒显着下降，因此应快速执行此操作以使猪恢复。如果动脉饱和度降至90%以下，应终止支气管镜检查，并让猪在通气1-2分钟后恢复。第一动脉血气 （ABG） 通常正常，因为右肺功能正常，左肺恢复。
在再灌注时主动给予呋塞米、葡萄糖和胰岛素有助于缓解细胞内转移导致的钾急剧升高。在60-120分钟的再灌注期间，钾会可预见地升高（表1）。 表 1 显示了常温负压通气 （NPV） ESLP 12 小时后移植 4 小时再灌注的 ABG 样本。在4小时再灌注期间大约需要两到四个班次，以保持钾<5 mmol/L。如果趋势是向上的，并且表现为每隔 30 分钟抽取的两种气体之间的快速变化，则目标值为 K+< 4.5 mmol/L。 变化包括 40 mg 呋塞米、100 mL 25% 葡萄糖 （D25） 和 10 单位常规胰岛素，通过中心线 静脉推注 。有时，猪需要输注低剂量多巴酚丁胺（1.5-5 mcg / kg / min）以及去氧肾上腺素（2-10 mg / h）在再灌注30-60分钟后治疗发展中的血管麻痹反应。在这种情况下，最好只使用去氧肾上腺素。然而，多巴酚丁胺可以作为一种有用的补充正性肌力药物，以维持平均动脉压大于 60 mmHg，尤其是在心率过缓的情况下。
在开胸手术闭合并使猪俯卧时，通气和血流动力学得到改善。修改可能是剧烈的，发生在 5-10 分钟内，但偶尔反应需要 1 小时。潮气量随着右肺压力/重量的减轻而增加，左肺继续通气，顺应性和复张性得到改善。在改变体位后，可以进一步进行重复支气管镜检查以清除气道。在接下来的 4 小时内，去氧肾上腺素需求降低，TV 接近目标 10 mL/kg，动脉血气管稳定（表 1）。重申一下，如果目标TV为10 mL/kg，则通常可实现6-8 mL/kg范围内的TV（图3）。
在进行最终离体左肺评估时，观察到一种稳定的行为模式。猪仰卧位胸骨切开术的血流动力学耐受性较差，可能需要额外的血管加压药支持。左肺检查显示缺血性再灌注损伤 （IRI） 引起的不同程度的轻度充血。右肺表现正常。夹紧右肺门后，猪出现窦性心动过速（120-140 bpm），100%的心输出量被转移到左肺。此时目标潮气量不会减少，因为整个过程需要 10 分钟。猪在5分钟内保持稳定，但心脏可能在5-10分钟之间发生心室颤动，并且可能需要手动心脏按摩才能继续灌注左肺。将左肺移植、称重，并检查吻合口是否通畅。猪在放血时迅速死亡，这与先前移植的肺的移植相吻合。
成功的移植在实验后具有可预测的结果（表1 和 图4）。 图 4 显示了移植方案期间典型的 P：F 比变化和水肿形成。通常，左肺的体重会增加约 35% （+/-15%）;然而，循环中残留的血液会导致这种重量。再灌注时PF比值下降约100，因为左肺在氧合时不能立即有效，但这种差异在2-3小时内得到改善。在 4 小时时进行孤立的左肺评估时，PF 比值将保持稳定或略有下降。通常，10 分钟分离的左肺气体与 12 小时 ESLP 后的最终气体分析相似（表 1）。然而，这完全取决于所采用的ESLP协议，以及IRI的发生程度。不成功的移植可能是由 LPA 凝固引起的，这会导致梗死的肺不能充氧。同样，移植手术的持续时间也会影响再灌注肺功能的质量。植入手术应花费 30-60 分钟。较长时间的手术会使供体肺暴露于破坏性的热缺血时间，从而加剧缺血性再灌注损伤，并可能混淆实验性 ESLP 方案的结果。给定实验的特定 ESLP 方案可能会产生一个无功能的肺，尽管进行了未闭吻合，但移植后仍无法氧合。这种分离的左肺气体颜色会很深（脱氧），氧分压低（PaO2）。
图1：猪左肺移植方案示意图。 约克郡猪进行左肺移植后 12 小时 NPV-ESLP 运行的示意图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：猪左肺移植手术方案照片 。 （A） 颈内和颈总动脉线放置。（B）开胸切口。（C） 开胸手术。（D）左半合子静脉。（E） 结扎的左半合子静脉。（F） 肺静脉隔离。（G） 左心耳袖带、左支气管和左肺动脉被夹住。（H） 左供体肺，有肺静脉、支气管和 PA 袖带。（I）肺动脉吻合术。（J）左肺移植和松开。（K） 肺重新定位。（L） 胸管定位。（M） 开胸缝合术。（N） 支气管吻合术。（O） 猪处于俯卧位。（P） 胸骨切开术。（Q） 副肺叶夹紧（右肺夹紧，但未显示）。（R） 从肺静脉吻合术（先前穿刺部位出血）抽取左肺静脉血样。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：猪左肺移植手术的监测和通气参数。 （A） 受者移植前的典型参数。（B） 受体左肺外植体的典型参数。（C） 左肺供体移植后 4 小时的典型参数。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：移植前后的 P：F 比值和体重增加。 （A） 整个移植过程中的 PaO 2：FiO2 比率。（B） NPV-ESLP 12 小时后整个移植过程中左肺的重量增加。请点击这里查看此图的较大版本.
| 动脉血气分析（100% FiO2） | 体内研究 收件人 | T0 再灌注 | T1 再灌注 | T2 再灌注 | T3再灌注 | T4再灌注 | 离体左肺预钳 | 孤立的左肺钳夹后（0 分钟） | 离体左肺钳夹后（1 分钟） | 孤立的左肺钳夹后（5 分钟） | 孤立的左肺钳夹后（10 分钟） |
| 血气值 | |||||||||||
| 酸碱度 | 7.402 | 7.327 | 7.284 | 7.402 | 7.421 | 7.479 | 7.504 | 7.399 | 7.371 | 7.423 | 7.435 |
| pCO2 （毫米汞柱） | 47.7 | 57.3 | 56.4 | 36.9 | 35.3 | 35.6 | 34.2 | 45.6 | 48.1 | 40.6 | 36.6 |
| pO2 （毫米汞柱） | 299 | 184 | 165 | 355 | 358 | 300 | 327 | 287 | 207 | 335 | 249 |
| 血氧饱和度值 | |||||||||||
| 血红蛋白 （g/dL） | 11.2 | 12.5 | 11.3 | 11.6 | 10.3 | - | 17.1 | 11.7 | 13.5 | 16.3 | 13.8 |
| 二氧化硫 （%） | 100.1 | 99.2 | 99 | 99.8 | 99.8 | - | 99.9 | 100.2 | 99.7 | 99.8 | 99.9 |
| 电解质值 | |||||||||||
| K+ （毫摩尔/升） | 4.5 | 6.2 | 4.4 | 4 | 4.1 | 4.6 | 5.2 | 5.4 | 5.3 | 6.9 | 7.4 |
| Na+ （毫摩尔/升） | 141 | 143 | 140 | 245 | 145 | 144 | 140 | 141 | 139 | 137 | 136 |
| 钙2+ （毫摩尔/升） | 0.99 | 0.88 | 0.81 | 0.74 | 0.66 | 0.61 | 0.36 | 0.98 | 0.42 | 0.36 | 0.38 |
| Cl- （毫摩尔/升） | 97 | 97 | 95 | 101 | 100 | 96 | 91 | 102 | 94 | 91 | 94 |
| Osm （毫摩尔/千克） | 287 | 287.9 | 293.7 | 292.4 | 297.5 | 293.5 | 284.7 | 287.1 | 282.9 | 278.2 | 277.1 |
| 代谢物值 | |||||||||||
| 葡萄糖 （mmol/L） | 4,2 | 2.7 | 13.4 | 2.8 | 8.3 | 5 | 5.1 | 4.9 | 4.5 | 4.6 | 4.2 |
| 乳酸 （mmol/L） | 1.2 | 1.3 | 3.8 | 2.5 | 1.3 | 1.2 | 1.4 | 1.8 | 1.4 | 1.9 | 2.7 |
| 酸碱状态 | |||||||||||
| HCO-3 （毫摩尔/升） | 29 | 29.1 | 25.9 | 22.4 | 22.5 | 26.1 | 26.7 | 27.6 | 27.1 | 26.1 | 24.1 |
表 1：ESLP 12 小时后左肺移植后进行的血气分析。 Ca+， 钙离子;Cl-， 氯离子;Hb，血红蛋白;HCO3-，碳酸氢根离子;K+， 钾离子;Na+， 钠离子;Osm， 渗透压;paCO2，动脉二氧化碳分压;PaO2， 动脉血氧分压;sO2， 氧饱和度;孤立的左肺预夹，右肺门打开;夹紧后离体左肺，右肺门夹紧后 1 分钟。
补充文件1：左肺移植手术安全检查表。请点击这里下载此文件。
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Discussion
该协议涉及几个关键的手术步骤，需要进行故障排除以确保移植和肺部评估成功。与成年人的肺相比，幼年猪肺非常脆弱，因此手术外科医生在处理猪肺时必须小心。在进行 12 小时的 ESLP 后尤其如此，因为器官将承担液体量并且容易因过度操作而受伤。任何过大的压力都会导致实验肺不张或创伤，从而影响评估结果。同样，幼猪的血管结构非常脆弱。避免 PA 夹扭转至关重要，因为这会导致组织层撕裂或解剖。PA 撕裂将需要打开心包以进入左侧 PA 的更近端部分，该部分可以吻合到植入肺。DeBakey 血管钳具有低调的外形，非常适合手术领域，但如果外科医生不小心，该仪器可能会对脆弱的 PA 造成伤害。使用卡在窗帘上的丝带将夹子固定到位有助于防止移位或扭转。支气管吻合口松开后移植肺的支气管镜检查也很关键。ESLP 和移植 12 小时后供体肺气道内常有液体。抽吸这种液体对于确保左肺功能的最佳恢复至关重要，从而在再灌注 4 小时后进行评估。在支气管镜检查和第一次动脉血气分析结果显示钾水平令人满意后，插入胸管、闭合切口并俯卧位至关重要。猪的血流动力学和通气在俯卧位时要稳定得多，胸腔重新近似。此阶段钾升高> 5.5 mmol/L，有发生心动过缓骤停的风险，需要紧急重新打开和手动心脏按摩以支持灌注，最好避免灌注。由于再灌注时发生高钾血症和心动过缓停滞的显著风险，因此从再灌注开始连续进行动脉血气分析，每 30 分钟重复一次，直至放血 4 小时至关重要。动脉血气分析可提供氧合、二氧化碳分压 （PCO2）、钾和葡萄糖的基本读数。密切监测这四种成分并适当处理它们对于实验的成功至关重要。连续遥测读数对于监测与高钾血症和预期心动过缓相关的峰值 T 波也至关重要。在实验的最后阶段，在从 LA 吻合口抽取最终血样之前，夹住右肺门和副肺叶至关重要。右肺门向副肺叶供血，副肺叶通常 通过 共同躯干引流至左下肺静脉附近。右肺门和副肺叶需要分开夹紧，以确保右肺功能不会通过血液混合产生样品 LA 气体。建议从 PV 吻合口或仅 PV 吻合口后抽取左肺动脉血气样本。
已对此协议进行了一些修改，并对所描述的方法进行了重要的故障排除。最初，它 试图通过正中 胸骨切开术进行植入;然而，由于猪 PA、支气管和 LA 的方向，暴露量不理想。该方法成功实施，但在随后的手术中尝试开胸手术以改善暴露。从可视化和技术角度来看，这被证明是一种优越的手术方法。另一项重要修改是制定和实施手术安全/方案清单（补充文件 1）。所有参与的团队成员都有一个重要的学习曲线，这些实验是资源密集型的。制定了一份清单来指导通信和文件协议的制定（补充文件1）。该清单允许系统化和简化协议，以加快学习速度。肝素化方案也进行了修改。在前十例移植中，有两例由于左肺腔内有凝块形成而导致左肺缺血。最初，在 PA 钳夹前 5 分钟给予 5000 单位肝素 IV，在 PA 松开前 5 分钟再给予 5000 单位肝素。PA 松开后，给药频率增加到每小时 5000 单位，并且自采用这种方法以来，没有出现任何出血或 PA 凝固问题。开发了一种使用较少肝素的策略来控制费用，在 PA 钳夹前 5 分钟和部分 PA 松开前 5 分钟静脉注射 5000 单位肝素。随后在病例的剩余时间里，每小时推注 1000 个单位静脉注射肝素。无法获得ACT分析，而ACT分析是获得肝素化充分性的最准确手段。
PA 的松开也从突然松开修改为在 10 分钟内逐渐将全血流重新引入移植肺的方法。左下 PV 和 LA 袖带在 PA 松开时保持夹紧，以便顺行脱气。全 PA 血流对脆弱的 LA 缝合线产生了显着的压力，并在肺脉管系统内产生了相当大的压力，这似乎是破坏性的。长时间的 PA 松开允许 LA 的顺行脱气，流量逐渐增加，而不是突然松开和流量突然增加。长时间松开夹紧可保护缝合线和肺内皮免受压力突然增加的影响。即使使用ESLP，对移植肺的缺血性损伤和细胞死亡也会导致缺血再灌注后钾大量释放到猪的循环中。为了主动管理高钾血症，将方案修改为在再灌注时通过静脉注射呋塞米 40 mg、100 mL 25% 葡萄糖 （D25） 和 10 单位常规胰岛素来先发制人地转移钾。这在再灌注的第一个小时内维持了动脉血气组上的目标钾，并且可以在实验早期安全地俯卧猪，这有助于移植功能。从血流动力学的角度来看，该方案被修改为使用去氧肾上腺素作为主要的血管加压药支持。发现加压素的效果较差。偶尔滴注低剂量多巴酚丁胺以增加心输出量，同时输注去氧肾上腺素以维持血压。尽管如此，由于其致心律失常的特性，多巴酚丁胺的使用仍然很少。最后，对离体左肺的评估进行修改。钳夹右肺门后，提起心脏头侧后，首先从LA体内抽出LA气体;然而，从旁叶引流到LA的气体混合产生了错误的高PaO2 读数。现在，在分别夹紧右肺和副肺叶后，将样本抽取到LA吻合线的远端。这些样本是在钳夹右肺门后 0、1、2、5 和 10 分钟采集的，更准确地表示孤立的左肺功能。可能需要在 5-10 分钟之间进行手动心脏按摩。最近的方案改进与上肺静脉 （SPV） 吻合术有关。最初，接收SPV由于口径小且容易凝结而被过度缝合。尽管如此，供体的上叶偶尔会出现充血，因为猪之间的侧支引流是可变的，而且不充分。为了解决这个问题，供体 SPV 和 IPV 被纳入受体的 IPV/LA 吻合术中，消除了静脉引流和肺淤血的任何问题。随着经验的增长，该协议将继续受益于进一步的修改。
这种左肺移植方法存在一些局限性。该模型仅以 4 小时为周期进行评估，仅考虑 ESLP 后 12 小时后急性术后移植的肺功能。该协议的设计考虑到了动物的恢复;但是，它尚未以这种能力进行测试。该技术操作需要相当的手术技能，并且需要训练有素的外科医生或高度独立的外科实习生来执行。发生致命错误的机会很多，会损害整个实验，需要适当的手术技术来避免或纠正此类危险。移植肺的唯一真正评估发生在再灌注的最后。自体右肺能够满足猪的氧气需求并产生令人满意的动脉血气。当右肺完全夹在肺门时，它无法接受新鲜氧气、新鲜脱氧血液供应和含氧血液引流。这是确定移植左肺功能的关键时刻，因为 100% 的心输出量被重定向到移植的肺，移植肺全权负责全身氧合。
与现有/替代方法相比，这种方法有多种好处。在回顾文献12、13、14、15 后，在初级心脏外科实习生或完全合格的外科医生手中对 1 或 2 头猪进行初始学习曲线后，该方法是最详细和可重复的。操作简单明了;然而，猪的血流动力学（包括其对致命性心律失常的易感性）为那些习惯于在成年人身上进行手术的人创造了一个学习机会，从心肺的角度来看，成年人更健壮。孤立的左肺功能评估方法虽然简短，但易于执行且可重复性高。特别是，这种方法提供了比目前文献中更多的麻醉管理细节。
体内移植对于ESLP和肺移植研究至关重要。ESLP 是自引入抗排斥药物以来肺移植领域最关键的发展，一些中心已经受益于该技术提供的器官利用率提高 6,7,8,9,10,11,12。这一研究领域需要进一步发展，以降低候补名单死亡率并扩大ESLP平台的可及性。ESLP的体外分析受益于大型动物模型的体内评估和确认。确认体外研究结果的大型动物模型对于开发实验室的临床试验批准通常是必要的。这种方法为进行ESLP研究的实验室提供了一种可靠且相对直接的移植方法。
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Disclosures
DHF拥有 非原位 器官灌注技术和方法的专利。DHF 和 JN 是 Tevosol， Inc. 的创始人和主要股东。
Acknowledgments
这项研究由大学医院基金会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer | Radiometer | 989-963 | |
| Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small | Covidien | 352/5877 | |
| Allison Lung Retractor | Pilling | 341679 | |
| Arterial Filter | SORIN GROUP | 01706/03 | |
| Backhaus Towel Clamp | Pilling | 454300 | |
| Bovine Serum Albumin | MP biomedicals | 218057791 | |
| Biomedicus Pump | Maquet | BPX-80 | |
| Bronchoscope | |||
| Cable Ties – White 12” | HUASU International | HS4830001 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C69-500G | |
| Cooley Sternal Retractor | Pilling | 341162 | |
| CUSHING Gutschdressing Forceps | Pilling | 466200 | |
| Debakey-Metzenbaum Dissecting | Pilling | 342202 | |
| Scissors | Pilling | 342202 | |
| DeBakey Peripheral Vascular Clamp | Pilling | 353535 | |
| Debakey Straight Vascular Tissue Forceps | Pilling | 351808 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500G | |
| Drop sucker | |||
| Endotracheal Tube 9.0mm CUFD | Mallinckrodt | 9590E | |
| Flow Transducer | BIO-PROBE | TX 40 | |
| Infusion Pump | Baxter | AS50 | |
| Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator | SORIN GROUP | K190690 | |
| Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2" | Medtronic | 6013 | |
| Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8' | Medtronic | 3108 | |
| Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6' | Medtronic | 3506 | |
| Laryngoscope | N/A | N/A | Custom-made with 10-inch blade |
| Metzenbaum Dissecting Scissors | Pilling | 460420 | |
| Medical Carbon Dioxide Tank | Praxair | 5823115 | |
| Medical Oxygen Tank | Praxair | 2014408 | |
| Medical Nitrogen Tank | Praxair | NI M-K | |
| Mosquito Clamp | Pilling | 181816 | |
| Harken Auricle Clamp | |||
| Organ Chamber | Tevosol | ||
| PlasmaLyte A | Baxter | TB2544 | |
| Poole Suction Tube | Pilling | 162212 | |
| Potassium Phosphate | Fischer Scientific | P285-500G | |
| PERFADEX Plus | XVIVO | 19811 | |
| Satinsky Clamp | Pilling | 354002 | |
| Scale | TANITA | KD4063611 | |
| Silicon Support Membrane | Tevosol | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519-1KG | |
| Sodium Chloride 0.9% | Baxter | JB1324 | |
| Sorin XTRA Cell Saver | SORIN GROUP | 75221 | |
| Sternal Saw | Stryker | 6207 | |
| Surgical Electrocautery Device | Kls Martin | ME411 | |
| TruWave Pressure Transducer | Edwards | VSYPX272 | |
| Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr X2 | Arrowg+ard | CS-12702-E | |
| Vorse Tubing Clamp | Pilling | 351377 | |
| Willauer-Deaver Retractor | Pilling | 341720 | |
| Yankauer Suction Tube | Pilling | 162300 | |
| 0 ETHIBOND Green 1X36" Endo Loop 0 | ETHICON | D8573 | |
| 0 PDS II CP-1 2x27” | ETHICON | Z467H | |
| 1 VICRYL MO-4 1x18” | ETHICON | J702D | |
| 2-0 SILK Black 12" x 18" Strands | ETHICON | SA77G | |
| 4-0 PROLENE Blue TF 1x24” | ETHICON | 8204H | |
| 6-0 PROLENE Blue BV 2x30” | ETHICON | M8776 | |
| 21-Gauge Needle |
References
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