Summary
このプロトコルはESLPの研究との使用のために設計されている同所性左肺の同種移植の幼体のブタモデルを記述する。麻酔薬と外科的技術、および重要なステップとトラブルシューティングに重点が置かれています。
Abstract
肺移植は末期肺疾患のゴールドスタンダード治療法であり、世界中で年間4,600件以上の肺移植が行われています。しかし、肺移植は利用可能なドナー臓器の不足によって制限されています。そのため、待機リストの死亡率が高い。上皮内肺灌流(ESLP)は、一部のセンターでドナーの肺利用率を15%〜20%増加させました。ESLPは、辺縁ドナー肺を評価および再調整する方法として適用されており、許容できる短期および長期転帰が実証されています 拡張基準ドナー(ECD)肺の移植後。現在進行中のin vitro研究結果を検証するには、大型動物(in vivo)移植モデルが必要です。ヒトとブタの解剖学的および生理学的違いは、技術的および麻酔上の重大な課題を提起します。容易に再現可能な移植モデルにより、現在のESLP戦略のin vivo検証と、ドナーの肺機能を改善するために設計されたさまざまな介入の前臨床評価が可能になります。このプロトコルは同所性同置の左肺のallotransplantationのブタモデルを記述する。これには、麻酔薬と外科的技術、カスタマイズされた外科的チェックリスト、トラブルシューティング、変更、およびアプローチの利点と制限が含まれます。
Introduction
肺移植は、末期肺疾患の優れた長期治療です。世界中で年間4,600件以上の肺移植が行われています1。しかし、現在のところ、肺移植には大きな限界があります。一つには、臓器の必要性が利用可能なドナーを凌駕し続けていることです。2012年以降、肺移植の割合は、移植候補の増加、ドナー数の増加、回復臓器の利用の改善などの複合効果により、毎年増加しているにもかかわらず、移植待機者の死亡率は有意に減少していません2。臓器の質に関する懸念は、20%〜30%と報告されている臓器利用率3,4,5という低い報告があり、もう一つの大きな限界を表しています。最後に、肺移植の術後転帰の傾向は満足のいくものではなく、長期移植片と患者の転帰は依然として他の固形臓器移植に遅れをとっています2。
新しい技術である上皮内肺灌流(ESLP)は、これらの制限を軽減する可能性を秘めています。ESLPは、限界ドナーの肺を評価および再調整する方法としてますます適用されており、 拡張基準ドナー(ECD)肺の移植後の許容可能な短期および長期転帰 6,7,8,9,10。その結果、ESLPは一部のセンターの使用率を15%〜20%向上させました6,7,8,9,10,11。
適切なESLP研究には、in vitro所見のin vivo検証が必要です。ただし、ESLP12、13、14、15のブタ肺移植モデルに関する文献は限られています。さらに、入手可能な文献では、肺移植のためのヨークシャー豚の麻酔薬管理に関する詳細が不十分であり、血行動態が非常に不安定になる可能性があります12,13,14,15。簡単に再現可能なモデルを確立することで、現在のESLP戦略のin vivo検証と、肺虚血再灌流障害を減らすためのさまざまな介入の前臨床評価が可能になります。本研究の目的は、ESLPで使用するための同所性左肺同種移植のブタモデルを説明することです。プロトコルには、麻酔薬と外科的技術の説明、カスタム外科的チェックリスト、およびトラブルシューティングの経験とプロトコルの変更に関する詳細が含まれています。この研究では、左肺ブタ移植モデルの限界と利点についても議論されています。この原稿は、35〜50kgのヨークシャー豚におけるブタの肺の回収プロセスを概説しておらず、ESLPの確立と終了についても説明していません。このプロトコルは、レシピエント移植手術にのみ対応しています。
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Protocol
すべての手順は、カナダ動物管理評議会のガイドラインおよび実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して行われました。プロトコルは、アルバータ大学の施設動物管理委員会によって承認されました。このプロトコルは、35〜50 kgの雌の若いヨークシャー豚に適用されています。豚は病原体を含まない食品グレードの標本です。それらは、カナダのアルバータ州エドモントンにある豚研究技術センター(https://srtc.ualberta.ca)から購入されます。ESLP手順に関与するすべての個人は、適切なバイオセーフティトレーニングを受けていました。
1.術前の準備と麻酔
注:豚は手術前に最大12時間一晩絶食します。
- 手術室でレシピエントブタの前投薬として、ケタミン(20 mg / kg)とアトロピン(0.05 mg / kg)の筋肉内注射を投与します。
- 豚を加熱された手術台に仰臥位に置き、正常温血症を維持し、マスク誘導を進めます。
- 動物の体重と麻酔システムに応じた滴定酸素流量。
注:酸素流量は20〜40 mL / kgである必要があります。 - イソフルランを4%〜5%で投与し、1〜2分後に3%に減らします。.
- 麻酔の深さを評価し、豚が有害な刺激に反応して離脱反射を持っていないことを確認します。5分ごとに繰り返します。
注意: 痛みの反応が存在する場合は、適切な麻酔の深さが達成されるまで、イソフルラン投与の割合を増やします。.ケタミンとヒドロモルフォンによる維持鎮痛の詳細については、このセクションのステップ10を参照してください。.麻痺薬は投与されません。これにより、離脱反射の評価が可能になります。鼻つまみは有害な刺激として使用されます。 - 正しい麻酔深度が確認されたら、豚を挿管します。40〜50kgの豚には、カスタムの10インチのフラットブレード喉頭鏡とサイズ9または10の気管内チューブを使用します。
- パルスオキシメータプローブを舌(推奨)または耳に置き、酸素飽和度が90%を超えるようにします。
注:体温は鼻プローブで監視されます。温熱パッドは、正常熱血症を維持するために使用されます。 - 麻酔を維持するには、酸素流量(20〜40 mL / kg)と吸入ガス量(1%〜3%)を調整します。.
- 人工呼吸器の設定は、呼吸数12〜30呼吸/分、TVを6〜10 mL / kg、PEEP 5 cm H 2 O、ピーク圧力を20 cm H2Oに保ちます。
注:標準的なICUスタイルの陽圧換気装置を使用して、麻酔と換気のための閉鎖システムを作成します。バイタルは継続的に監視され、15分間隔で記録されます。ABGは、動物の安定性に応じて、15〜60分ごとに描画されます。テレビは10 mL / kgまで目標とされていますが、6〜8 mL / kgが達成されます。図1は、ラボで適用された移植プロトコルの陰圧換気(NPV)-ESLPの概略 図 です。 - ポビドンヨードを使用して切開部位を剃り、洗浄し、無菌的に準備します。
注:ケタミン/アトロピンによる鎮静後、鎮痛療法には、3mg / kgケタミンIVq1時間(患者のパラメーターに応じて範囲1〜3 mg / kg)とヒドロモルフォン0.05 mg / kg IM q 2時間を、耳静脈に末梢に挿入されたIVラインを介して投与することが含まれます。.投与間隔が長くなると、心拍数の上昇や異常な呼吸パターン/腹筋の動きなど、画期的な痛みの反応が生じます。.
2.中心静脈および動脈ラインの挿入
- 液体とヘパリン投与のために中心線を挿入します。.
注: 総 IV 輸液投与は 1 mL/kg/h に計算され、体液ボーラスは MAP >60 mmHg を維持するために PRN を投与されます。セントラルラインは、ステロイド、抗生物質、昇圧剤、強心剤の投与にも使用されます。ラインの位置については 、図2A を参照してください。- ポビドンヨード調製液を使用して皮膚を準備し、完全に乾かします。電気焼灼を使用して、気管を中心として5〜8cmの正中線切開を行い、胸骨切痕から頭側に伸ばします。
- 焼灼を使用して皮膚と皮下脂肪を分割します。
- ストラップの筋肉間の正中線面を分割し、結合組織層を分割して、気管の外側にある左または右の頸動脈血管内束を特定します。
- シルクタイ(サイズ2-0)を血管ループとして使用して、頸静脈の近位および遠位の制御を取得します。
- 頭蓋を囲むネクタイを結び、近位ネクタイを上向きに引っ込めて血流をコントロールします。
- メッツェンバウムのハサミ( 材料表を参照)を使用して静脈を小さく切開し、2ポート、7Frの中心線(血管の円周の~1/3)を収容します。
- 同時に、近位血管ループの張力を解放し、静脈をカニューレ挿入し、次にカニューレを10cmの深さで静脈に固定するように結び付けます。
- ラインをヘパリンで洗い流し、0.9%生理食塩水のIVラインに接続し、豚が脱水症状で血管内が枯渇している場合は輸液を投与します。
メモ: ヘパリンは未使用のポートをロックします。 - 500mgのメチルプレドニゾンと1gのセファゾリンIVを投与します。.
- 正確な血圧管理のために、7 Fr動脈ラインを使用して総頸動脈をカニューレ挿入するのと同じ手法に従います。
3.左肺の調達
- 豚を右外側褥瘡の位置に置きます。
- 左前外側開胸術を行います(図2)。
- ポビドンヨード調製液を使用して皮膚を準備し、完全に乾かします。開胸切開部(20 cm)に次のランドマークを使用してマークを付けます:触診を使用して左肩甲骨の先端を特定します。同様に、触診で胸骨より劣る剣状突起を特定します。 図 2B に示すように、この 2 つを接続します。
- 合計10 mLの0.25%ブピバカインを切開線と切開の上下の2つのリブスペースに注入します。
- 電気焼灼を使用して、皮膚、皮下層、筋肉層を解剖します。広背筋は分割する必要があります。切開部のすぐ下の肋骨を特定し、肋骨の上部を焼灼して、肋間神経血管束を避けながら肋間筋を露出させます。
- 蚊の止血剤を使用して肋骨のすぐ上の肋間筋に穴を開け、指を使って胸の内側を感じて癒着します。肋骨の上端に沿って焼灼しながら、ヤンカウアー吸引または指( 材料表を参照)を使用して肺を押しのけ、開胸術を延長します。
- 胸骨から1インチ離れるまで開胸術を前方に伸ばします。開胸術を傍脊髄筋まで後方に伸ばします。
- Cooley胸骨リトラクター( 材料表を参照)を挿入して、開胸術を広く(10 cm)開きます(図2C)。肺を引っ込めて、左半接合静脈を露出させます(図2D)。
- メッツェンバウムのハサミと細かいラウアーを使用して、左半接合静脈を円周方向に解剖します。容器を絹のタイで囲み、結紮してトランセクトします(図2E)。コントロールを強化するために、近位の切り株にシルクのネクタイを締めてください。
注:ラウアーは、組織の解剖に使用される直角クランプまたはセリアッククランプです。 - 左肺動脈(PA)と左肺静脈(PV)を解剖します。コントロールのために絹のネクタイで静脈を囲みます(図2F)。
注:優れたPVは非常に小さく、個々の解剖学的構造に応じて、分岐点または共通の幹で縫合糸結紮されています。左主幹気管支はPAとLA(左心房)の奥深くにあるため、動脈と静脈をクランプして切除するまで簡単に解剖できない場合があります(図2G)。 - PAをクランプする5分前に5000ユニットのヘパリンIVを投与します。
注:ヘパリン5000ユニットIVは、PAをクランプ解除する5分前にも投与されます。その後、1時間ごとに1000単位のヘパリンIVが投与されます。 - PA(DeBakeyクロスクランプ)、左下肺静脈(Satinskyクランプ)、および左気管支(スプーンポッツクランプ)を個別にクランプします( 材料表を参照)。左気管支をクランプしたら、一回換気量を5 mL / kgに減らします。.
- PA、左下肺静脈、および左気管支を切除します。ティッシュカフを少なくとも0.5cm残して縫います。左下肺靭帯を分割し、左肺を切除します。
注:左肺は、対照組織型のために廃棄または保持することができます。
4.ESLPの終了、左肺の分裂、および電解液による洗い流し
- 換気チューブを最大吸気でクランプし、灌流と換気を終了し、肺をESLP装置から切り離します。
- 肺の重さを量って、浮腫形成の量を決定します。
注:浮腫は、過剰な体液の蓄積による組織の腫れです。 - 副葉の組織生検を行い、3等分し、最適切削温度(OCT)ゲル、ホルマリン、液体窒素中での急速凍結のそれぞれに1個ずつ入れます。
注: この手順は、通常、作成者のラボで行われます。OCTおよび急速凍結サンプルは-80°Cの冷凍庫に保管し、ホルマリンで保存したサンプルは適切に密閉された容器に入れ、4°Cの冷蔵庫に保管します。特定のESLPプロトコルと組織分析の詳細は、他の場所で公開されています16。 - 左ドナー肺を右肺から分けます。1cmのドナーPA、1cmのドナー気管支、および適切なドナーLAカフ(円周方向に~0.5cm)を残して、レシピエントLAに縫い付けます(図2H)。左の劣ったPVと残った上質のPVは、後の吻合を容易にするために、ドナーLA壁と連続して残します。
- 左肺の重さを量ります。
- IVラインに接続されたドロップ吸盤を使用してドナーの左PAをカニューレ挿入し、500 mLの細胞外、低カリウム、デキストランベースの電解質保存溶液を肺血管系から順行性に洗い流します。フラッシュ中にシルクタイでPAにカニューレを固定し、フラッシュが完了したら解放します。
メモ:上記の手順は、この作業に使用される特定のESLPデバイスに関連し、他のデバイスに直接適用できない場合があります。
5.左肺移植
- ドナー肺を下葉から始めてレシピエントの胸に挿入します。肺を無理に押し込まないでください。
注:胸骨リトラクターを締めてドナーの肺を収容するために、胸郭下部を上向きに持ち上げる必要がある場合があります。理想的には、レシピエントはドナーよりも数キログラム大きいので、サイズが一致しやすくなります。 - 最初にTF針に4-0プロレンを使用して気管支吻合を行います(図2I)。
注:実行中のエンドツーエンドの吻合はうまく機能します。縫製する前に、2つの吻合部の端から余分な長さを切り取り、余分な組織によって引き起こされるねじれを防ぎます。 - 実行中のエンドツーエンドの吻合を使用して、BV-1 針に 6-0 プロレンを使用して LA 吻合を 2 回目に実行します。繰り返しになりますが、ねじれを防ぐために余分な組織を切り取ります。
注:LAは砕けやすく、小さなBV-1針の恩恵を受けます。ドナーの水平咬傷は、適切な組織を購入し、ドナーのIPVとSPVをレシピエントのIPV / LA開口部に縫い付けることによって引き起こされるサイズの不一致を修正するために必要になる場合があります。 - ドナーSPVを下PVおよびLA吻合に組み込み、左上肺葉静脈ドレナージを可能にします(図2J)。
注:枝上肺静脈(SPV)の直径は0.5cm未満です。一般的なSPVトランクは長さが可変であり、日常的に存在するわけではないため、ドナーとレシピエントのSPV間の直接吻合は不十分な選択肢です。 - 実行中のエンドツーエンドの吻合を使用して、BV-6-0 針の 1-1 プロレンで PA 吻合を完了します。繰り返しになりますが、ねじれを防ぐために余分な組織を切り取ります。
- 気管支クランプを取り外し、TVを目標に10 mL / kgに増やします。
- ヘパリン化を確認し、カリウムシフト(フロセミド40mg、インスリン10単位、25%デキストロース溶液100mL)を投与し、PAクランプを部分的に開き、空気を抜き、PA縫合糸を結びます。10分後にPAクランプを完全に解放します。
- その間、LAの空気を抜き、縫合糸を結び、LAクランプを取り外します。
- 中心線から再灌流血液ガスを採取し、左中葉から再灌流組織生検を行います。
注:組織生検を行うには、サイズ0のシルクタイを使用して中葉頂点の1 cmの部分を囲み、タイダウンして組織を捕らえ、分離した部分をメッツェンバウムのハサミで切断します。生検を3等分し、前述のように管理します。 - 左右の肺気管支鏡検査を実施して、気管支吻合を評価し、分泌物を吸引します。アダプター接続を使用して気管支鏡を気管内チューブに挿入します。
- スコープを吸引に接続します。気管支鏡を左気管支に進めます。気管支吻合部を検査します(図2N)。スコープを細気管支に進め、液体を吸引します。右側で繰り返します。
注意: 酸素飽和度が90%を下回らないようにしてください。飽和度がこのレベルを下回った場合は、スコープを取り外し、ブタが数分間中断のない換気で回復するのを待ちます。
- スコープを吸引に接続します。気管支鏡を左気管支に進めます。気管支吻合部を検査します(図2N)。スコープを細気管支に進め、液体を吸引します。右側で繰り返します。
- 20 Fr の可鍛性胸腔チューブを挿入し (図 2L)、開胸術を 3 層に閉じ (図 2M)、動脈血ガス (ABG) が安定したらすぐに豚をうつ伏せにします (図 2O)。
- うつ伏せの姿勢で4時間にわたって豚を監視します。30分ごとにABG分析を実行します。再灌流後、毎時1000単位のヘパリンを投与する。
- 1時間ごとに10 mLの血液サンプルを採取し、遠心分離および炎症マーカーの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)分析を行います16。
注:遠心分離パラメータについては、後で詳しく説明します。
- 1時間ごとに10 mLの血液サンプルを採取し、遠心分離および炎症マーカーの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)分析を行います16。
6.孤立した左肺の評価
- 豚を仰臥位に置き、ポビドンヨウ素調製液を使用して胸骨を再準備します。最終的な孤立した左肺評価のために正中胸骨切開術を実施します(図2P)。
- メッツェンバウムのハサミを使用して左胸膜を開き、前述のように左下葉から組織生検を行います(ステップ5.9の注)。
- 副葉胸膜を開き、メッツェンバウムのハサミを使用して総静脈を解剖します。
注:これは後でクランプされます。 - 21Gの針を使用してLA吻合から血液サンプルを採取します。針を左肺静脈に向け、一般的な左心房または副葉幹から遠ざけます。.
- 右胸膜を開いて、右門部クランプ用のスペースを作ります( 材料表を参照)。右下肺靭帯を門まで解剖します。クランプを門部の周囲に上、下、前方に配置できることを確認してください。
注:これにより、肺門が閉塞し、すべての酸素化が左肺に依存するようになります。このとき、右肺は換気されませんが、これは人工呼吸器による膨張/収縮の欠如によって明らかになるはずです。右下葉を胸から持ち上げて、これを達成することができます。 - DeBakey大動脈クロスクランプ( 材料表を参照)を使用して副葉静脈をクランプし、LAへの副葉ドレナージを閉塞します(図2Q)。
- 右の鼻冠をクランプし、左肺に向けられた 21 G の針を使用して、左 PV 吻合から次の連続血液サンプルを採取します: クランプ後 0 分、1 分、2 分、5 分、および 10 分後。
注:酸素分圧(PaO2)の傾向を監視するために、5つのサンプルを採取します(図2R)。PaO2 は、適切な左肺機能を表すために比較的安定しているはずです。また、5つのサンプルは、サンプルの凝固に問題がある場合や、ABG分析で問題が発生した場合に、品質評価の保証を提供します。 - 吻合部を切除し、左肺を切除します。IVCをトランセクトして、放血による麻酔下での安楽死を促進します。
注:レシピエントブタの総麻酔時間は8時間です。 - ドナー肺の重量を量って浮腫の形成を評価し、全体的な外観を検査します。PA、気管支、およびLAカフを検査して、ドナーの肺とレシピエント縦隔内の血栓またはその他の病状の兆候がないか調べます。
- 最終ガス分析を実行し、灌流液サンプルを遠心分離し、前述のように組織生検を保存します(ステップ4.3の注記)。
注:遠心分離の設定は、112 x g、加速度9回、減速9回、4°C、持続時間15分です。
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Representative Results
すべての結果は、NPV-ESLP16 の 12 時間後の 4 時間の再灌流のコンテキストにあります。肺外植片では、いくつかの臨床転帰が予想されます(図3)。典型的には、ブタは左肺移植が成功した後も血行動態的に安定しているが、手術に対する血管拡張反応のためにフェニレフリンの低用量注入(用量範囲:2〜10 mg / h)が必要になる場合があります。心拍数は約100〜120 bpm、呼吸数(RR)はSpO 2>8〜30%、平均動脈圧(MAP)>60 mmHg、常温(38°C)、一回換気量(TV)は5 mL / kgを目標とし、ピーク圧力は20〜24 cm H2Oの片肺換気をします。片肺換気では、左肺を過膨張から保護するために換気量を半分に減らしました。呼吸数は、生理学的潮汐終末二酸化炭素レベルを目標とするように増加しました(図3)。したがって、図3は、移植の臨界点における典型的な血行動態および換気パラメータを示しています。
肺移植中、以下の結果が典型的です。左肺はESLPの実行中に液体を吸収し、外植された肺よりも重くて大きく見えます。このため、レシピエントはドナーよりわずかに大きい(2〜4 kg)必要があるため、胸郭はやや浮腫性の肺を収容できます。肺は、開胸術によって胸部に挿入するために穏やかな圧力を必要とします。最初に下葉を挿入し、次に上葉を挿入する方が簡単です。気管支は直接的なエンドツーエンドの吻合であり、最初に行う必要があります。TFニードルに4-0プロレンをお勧めします。LAの袖口は非常に砕けやすいですが、ティッシュの冗長性と柔軟性により、縫製はそれほど難しくありません。BV-1針の6-0プロレンは、LA吻合に適しています。PAは最後に行われる吻合術です。この容器は、ほとんど牽引力がなく、簡単に引き裂くことができます。裂けた場合は、心膜を開き、クランプを近位に動かして健康な組織に向かって縫製することができます。繰り返しになりますが、BV-1針の6-0プロレンは、この吻合に適しています。
再灌流の際、以下の傾向が認められた。気管支のクランプを解除し、テレビを10 mL / kgに戻すと、左肺が膨らみ始めます。一回換気量の目標は10 mL / kgでしたが、一般的に6〜8 mL / kgが達成され、これは、使用されるESLPプロトコルと移植された肺の質に応じて、再灌流の最初の2〜3時間で徐々に達成されます。まれに、小さな空気漏れが発生することがありますが、これは前壁の簡単な縫合で改善できます。後壁は修復が難しく、梱包が必要になります。気管支吻合からの空気漏れを避けるために多大な努力を払わなければなりません。.気管支鏡検査では、右肺は正常に見え、左肺は通常浮腫性です。縫合線を検査し、約50〜100mLの透明な液体を気道から吸引します。吸引中はテレビが300秒から20秒に大幅に低下するため、豚が回復できるように、このアクションをすばやく実行する必要があります。動脈飽和度が90%を下回った場合は、気管支鏡検査を終了し、豚は1〜2分間の換気で回復します。第1動脈血ガス(ABG)は、左肺が回復するにつれて右肺が正常に機能しているため、通常は正常です。
再灌流時のフロセミド、デキストロース、およびインスリンの積極的な投与は、細胞内シフトによるカリウムの劇的な上昇を緩和するのに役立ちます。カリウムは、60〜120分の再灌流中に予想通り上昇します(表1)。表 1 は、12 時間の常温陰圧換気 (NPV) ESLP に続く 4 時間の再灌流による移植上の ABG のサンプルを示しています。カリウムを 5 mmol/L に保つために、4 時間の再灌流中に約 2 < 4 シフトが必要です。傾向が上向きで、30 分間隔で描画された 2 つのガス間の急激な変化として現れる場合、目標は K+< 4.5 mmol/L です。 シフトには、40 mg のフロセミド、100 mL の 25% デキストロース (D25)、および 10 単位の通常のインスリンが含まれます。時折、ブタは低用量のドブタミン注入(1.5-5 mcg / kg / min)とフェニレフリン(2-10 mg / h)を30〜60分の再灌流後に必要とし、血管麻痺反応を治療します。この状況ではフェニレフリンを排他的に使用することが好ましい。ただし、ドブタミンは、特に心拍数が徐脈の場合、平均動脈圧を60 mmHgを超える状態に維持するための有用な補助的強極性剤となり得る。
開胸術を閉じ、ブタをうつ伏せにすると、換気と血行動態の改善が実証されます。変更は劇的であり、5〜10分で発生する可能性がありますが、応答に1時間かかる場合があります。右肺から圧力/重量が取り除かれると一回換気量が増加し、左肺はコンプライアンスとリクルートを改善して換気を続けます。気管支鏡検査を繰り返すことで、位置が変わった後に気道をきれいにすることができます。次の4時間で、フェニレフリン必要量は減少し、TVは目標の10 mL / kgに近づき、ABGは安定します(表1)。繰り返しになりますが、10 mL/kgのテレビをターゲットとした場合、通常、6〜8 mL/kgの範囲のテレビが達成されます(図3)。
最終的な孤立した左肺評価の時点で、安定した行動パターンが観察されています。ブタは、胸骨切開術のために仰臥位での血行動態への耐性が低く、追加の昇圧剤のサポートが必要になる場合があります。左肺の検査では、虚血性再灌流障害(IRI)による軽度の充血の程度がさまざまに見られます。右肺は正常のようです。右門をクランプすると、ブタは洞性頻脈(120〜140 bpm)になり、心拍出量の100%が左肺に転用されます。この時点では、プロセス全体に 10 分かかるため、目標とする一回換気量は減少しません。ブタは5分までは安定していますが、心臓は5〜10分の間に心室細動を発症する可能性があり、左肺の灌流を継続するには手動心臓マッサージが必要になる可能性があります。左肺を摘出し、体重を量り、吻合部の開存性を検査します。ブタは放血時に急速に死亡し、これは以前に移植された肺の摘出と一致します。
移植が成功すると、実験後に予測可能な結果が得られます(表1 および 図4)。 図4 は、移植プロトコル中の典型的なP:F比の変化と浮腫の形成を示しています。通常、左肺は約35%(+/- 15%)の体重増加を経験します。ただし、循環中の残留血液がこの重量に寄与します。左肺は酸素化にすぐには効果がないため、再灌流でPF比は約100低下しますが、この不一致は2〜3時間で改善します。4時間で左肺を分離して評価すると、PF比は安定しているか、わずかに低下します。一般に、10 分間に分離された左肺ガスは、12 時間 ESLP 後の最終ガス分析と同様です (表 1)。ただし、これは採用されているESLPプロトコルと発生するIRIの範囲に完全に依存します。移植の失敗は、LPAの凝固によって引き起こされる可能性があり、その結果、酸素化しない肺梗塞が発生します。同様に、移植手術の期間は、再灌流肺機能の質に影響を与える可能性があります。移植手術には30〜60分かかります。手術が長引くと、ドナーの肺が損傷する温かい虚血性時間にさらされ、虚血性再灌流損傷が悪化し、実験的ESLPプロトコルの結果が混乱する可能性があります。特定の実験の特定のESLPプロトコルは、特許吻合にもかかわらず、移植後に酸素化に失敗する機能しない肺を生成する可能性があります。そのような孤立した左肺ガスは、酸素分圧(PaO2)が低い状態で非常に暗い色(脱酸素化)になります。
図1:ブタ左肺移植プロトコルの概略図。 ヨークシャー豚の左肺移植に続く12時間のNPV-ESLP実行の概略図。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:ブタ左肺移植手術プロトコルの写真 。 (A)内頸静脈および総頸動脈ラインの配置。(B)開胸切開術。(C)開胸術。(D)左半接合静脈。(E)結紮された左半接合静脈。(F)肺静脈の単離。(G)左心房腱板、左気管支、左肺動脈をクランプ。(H)肺静脈、気管支、PAカフを備えた左ドナー肺。(i)肺動脈吻合。(J)左肺を移植し、クランプを外した。(K)肺の位置が再配置されました。(L)胸部チューブの位置。(M)開胸術閉鎖。(N)気管支吻合。(O)うつ伏せの豚。(P)胸骨切開術。(Q)副葉をクランプ(右肺をクランプ、ただし図示せず)。(R)肺静脈吻合(以前の穿刺部位からの出血)から左肺静脈血液サンプルを採取した。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ブタ左肺移植手術のモニタリングと換気のパラメータ。 (A)レシピエント移植前の典型的なパラメータ。(B)レシピエント左肺外植片の典型的なパラメータ。(C)左肺ドナー移植後4時間の典型的なパラメータ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:移植前後のP:F比と体重増加。 (A)移植中のPaO2:FiO2比。(B)NPV-ESLPの12時間後の移植中の左肺の体重増加。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
| 動脈血ガス(100%FiO2) | 生体内 受信者 | T0再灌流 | T1再灌流 | T2再灌流 | T3再灌流 | T4再灌流 | 孤立した左肺プレクランプ | 孤立した左肺ポストクランプ (0 分) | 孤立した左肺ポストクランプ(1分) | 孤立した左肺ポストクランプ(5分) | 孤立した左肺ポストクランプ(10分) |
| 血液ガス値 | |||||||||||
| pHの | 7.402 | 7.327 | 7.284 | 7.402 | 7.421 | 7.479 | 7.504 | 7.399 | 7.371 | 7.423 | 7.435 |
| pCO2(mmHg) | 47.7 | 57.3 | 56.4 | 36.9 | 35.3 | 35.6 | 34.2 | 45.6 | 48.1 | 40.6 | 36.6 |
| pO2(mmHg) | 299 | 184 | 165 | 355 | 358 | 300 | 327 | 287 | 207 | 335 | 249 |
| 酸素濃度測定値 | |||||||||||
| Hb (g/dL) | 11.2 | 12.5 | 11.3 | 11.6 | 10.3 | - | 17.1 | 11.7 | 13.5 | 16.3 | 13.8 |
| sO2 (%) | 100.1 | 99.2 | 99 | 99.8 | 99.8 | - | 99.9 | 100.2 | 99.7 | 99.8 | 99.9 |
| 電解質値 | |||||||||||
| K+ (ミリモル/L) | 4.5 | 6.2 | 4.4 | 4 | 4.1 | 4.6 | 5.2 | 5.4 | 5.3 | 6.9 | 7.4 |
| Na+ (ミリモル/L) | 141 | 143 | 140 | 245 | 145 | 144 | 140 | 141 | 139 | 137 | 136 |
| Ca2+ (ミリモル/L) | 0.99 | 0.88 | 0.81 | 0.74 | 0.66 | 0.61 | 0.36 | 0.98 | 0.42 | 0.36 | 0.38 |
| Cl-( ミリモル/L) | 97 | 97 | 95 | 101 | 100 | 96 | 91 | 102 | 94 | 91 | 94 |
| オスム(mmol/kg) | 287 | 287.9 | 293.7 | 292.4 | 297.5 | 293.5 | 284.7 | 287.1 | 282.9 | 278.2 | 277.1 |
| 代謝物値 | |||||||||||
| グルコース (mmol/L) | 4,2 | 2.7 | 13.4 | 2.8 | 8.3 | 5 | 5.1 | 4.9 | 4.5 | 4.6 | 4.2 |
| 乳酸 (mmol/L) | 1.2 | 1.3 | 3.8 | 2.5 | 1.3 | 1.2 | 1.4 | 1.8 | 1.4 | 1.9 | 2.7 |
| 酸塩基の状態 | |||||||||||
| HCO-3 (ミリモル/L) | 29 | 29.1 | 25.9 | 22.4 | 22.5 | 26.1 | 26.7 | 27.6 | 27.1 | 26.1 | 24.1 |
表1:ESLPの12時間後の左肺移植後に実施された血液ガス分析。 Ca+、カルシウムイオン;Cl-、塩化物イオン;Hb、ヘモグロビン;HCO3-、重炭酸イオン;K +、カリウムイオン;Na+、ナトリウムイオン;オスム、浸透圧;paCO2、二酸化炭素の動脈分圧;PaO2、酸素の動脈分圧;sO2、酸素飽和度;孤立した左肺プレクランプ、右肺門が開いている。分離された左肺ポストクランプ、右門がクランプされてから1分後。
補足ファイル1:左肺移植の外科的安全性チェックリスト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルにはいくつかの重要な外科的ステップが関与しており、移植と肺の評価を確実に成功させるためにトラブルシューティングが必要です。ブタの幼体の肺は、ヒトの成体の肺に比べて非常にデリケートであるため、手術医はブタの肺を扱う際には注意が必要です。これは、ESLPを12時間実行した後、臓器が体液量を帯び、過度の操作による損傷を受けやすくなるため、特に当てはまります。過度の圧力は、実験肺に無気肺または外傷を引き起こし、評価結果に影響を与えます。同様に、若いブタの維管束構造は非常にデリケートです。PAクランプのねじれは、組織層の裂け目や解剖を引き起こす可能性があるため、避けることが重要です。PAの裂傷は、移植肺に吻合できる左PAのより近位部分にアクセスするために心膜を開く必要があります。DeBakey血管クランプは、手術野によくフィットする薄型ですが、外科医が注意しないと、この器具は繊細なPAに損傷を与える可能性があります。外れやねじれを防ぐために、ドレープにスナップされるシルクタイを使用してクランプを所定の位置に固定すると便利です。気管支吻合をアンクランプした後の移植肺の気管支鏡検査も重要です。ESLPと移植の12時間後にドナーの肺気道内に液体があることがよくあります。この液体を吸引することは、左肺機能の最適な回復を確実にし、それによって4時間の再灌流後の評価を確実にするために不可欠です。.気管支鏡検査と最初のABGが満足のいくカリウムレベルで戻った後、胸腔チューブを挿入し、切開部を閉じ、ブタをうつ伏せにすることが重要です。ブタの血行動態と換気は、腹臥位でかなり安定しており、胸郭が再調整されています。この段階でカリウム>が5.5 mmol / L上昇すると、徐脈停止のリスクがあり、灌流をサポートするために緊急の再開封と手動心臓マッサージが必要になりますが、これは避けるのが最善です。.再灌流時の高カリウム血症と徐脈停止の重大なリスクがあるため、再灌流から始まり、4時間の放血まで30分ごとに繰り返す連続ABGを実行することが重要です。.ABGは、酸素化、二酸化炭素分圧(PCO2)、カリウム、およびグルコースの本質的な測定値を提供します。これら4つの成分を綿密に監視し、適切に処理することは、実験を成功させるために不可欠です。継続的なテレメトリーの読み取りは、高カリウム血症と徐脈の予測に関連するピークT波を監視するためにも重要です。.実験の最終段階では、LA吻合部から最終的な血液サンプルを採取する前に、右肺門と副葉をクランプすることが重要です。右肺門は副肺葉に血液を供給し、副肺葉は左下肺静脈に隣接して、しばしば共通の幹 を介して 排出されます。右肺門と副葉は別々にクランプして、右肺機能が血液混合によってサンプルのLAガスに寄与しないようにする必要があります。PV吻合部またはそれのすぐ先から左肺ABGサンプルを採取することをお勧めします。
このプロトコルには、説明されている方法の重要なトラブルシューティングとともに、いくつかの変更が加えられています。当初は、胸骨正中切開 術による 移植が試みられました。しかし、曝露はブタPA、気管支、LAの配向により最適ではありませんでした。このアプローチは成功裏に実施されたが、その後の手術では、曝露を改善するために開胸術が試みられた。これは、視覚化と技術的観点から優れた外科的アプローチであることが証明されました。もう1つの重要な修正は、外科的安全性/プロトコルチェックリスト(補足ファイル1)の開発と実施でした。関係するすべてのチームメンバーにとってかなりの学習曲線があり、これらの実験はリソースを大量に消費します。通信および文書プロトコルの開発をガイドするためのチェックリストが作成されました(補足ファイル1)。チェックリストにより、プロトコルを体系化および簡素化して、より迅速な学習が可能になりました。ヘパリン化プロトコルも変更されました。最初に実施された10件の移植のうち2件は、左PAの血栓形成による左肺虚血に苦しんでいた。最初に、5000単位のヘパリンIVをPAクランプの5分前に投与し、さらに5000単位をPAクランプ解除の5分前に投与した。投与頻度は、PAアンクランプ後、毎時5000単位に増加し、このアプローチを採用して以来、出血やPA凝固の問題はありませんでした。費用を抑えるために、PA クランプの 5 分前と部分的な PA アンクランプの 5 分前に 5000 単位の IV ヘパリンを投与する戦略が開発されました。これに続いて、ケースの残りの部分で1時間ごとに1000ユニットIVヘパリンボーラスが続きます。ヘパリン化の妥当性にアクセスする最も正確な手段であるACT分析へのアクセスはありませんでした。
PAのクランプ解除も、突然のクランプ解除から、移植された肺に10分かけて徐々に完全な流れを再導入するアプローチに変更されました。左下PVとLAカフは、PAのクランプ解除時にクランプされたままになり、順行性の脱気が可能になります。PAがフルになると、繊細なLA縫合線に大きな圧力がかかり、肺血管系内にかなりの圧力がかかり、損傷しているように見えました。長時間のPAアンクランプにより、突然のクランプ解除と流量の急激な増加とは対照的に、流量を徐々に増加させてLAの順行性デエアが可能になります。長時間のアンクランプは、縫合線と肺内皮を急激な圧力上昇から保護します。ESLPでも、移植された肺および細胞死に対する虚血性侮辱は、虚血性再灌流後の豚の循環へのカリウムの有意な放出に寄与する。高カリウム血症を積極的に管理するために、プロトコルは、フロセミド 40 mg IV、100 mL の 25% デキストロース (D25)、および 10 単位の通常のインスリンを投与することにより、再灌流時にカリウムを先制的にシフトするように変更されました。これにより、再灌流後1時間以内にABG上の目標カリウムが維持され、実験の早い段階でブタを安全に繁殖させることができ、移植片の機能に役立ちます。血行動態の観点から、プロトコルはフェニレフリンを主要な昇圧剤サポートとして使用するように変更されます。バソプレシンは効果が低いことがわかった。ドブタミンの低用量点滴は、血圧を維持するためのフェニレフリン注入とともに、心拍出量を増やすために時折実行されました。それでも、ドブタミンは不整脈原性のために控えめに使用されています。最後に、孤立した左肺の評価が変更されました。右肺門を締め付けた後、LAガスは最初に心臓頭蓋骨を持ち上げた後、LAの体から引き出されました。しかし、副ローブの排水からLAへのガス混合により、PaO2 の測定値が誤って高くなりました。現在、サンプルは、右肺と副葉を個別にクランプした後、LA吻合ラインの遠位に引き出されます。これらのサンプルは、右肺門をクランプしてから 0、1、2、5、および 10 分後に採取され、孤立した左肺機能をより正確に表しています。手動心臓マッサージは、5〜10分の間に必要になる場合があります。最新のプロトコルの改善は、上肺静脈(SPV)吻合に関連しています。当初、レシピエントのSPVは、口径が小さく、凝固しやすいため、縫いすぎていました。それでも、ドナーの上葉は、ブタ間で側副排水がばらつきがあり、不十分であったため、時折うっ血に悩まされていました。これを改善するために、ドナーのSPVとIPVがレシピエントのIPV / LA吻合に組み込まれ、静脈ドレナージと肺のうっ血の問題が解消されました。このプロトコルは、経験が積まれるにつれて、さらなる変更の恩恵を受け続けます。
この左肺移植方法にはいくつかの制限があります。このモデルは 4 時間の期間でのみ評価されており、ESLP の 12 時間後の急性術後期間の移植された肺機能のみが考慮されています。このプロトコルは、動物の回復を念頭に置いて設計されました。ただし、その能力ではまだテストされていません。技術的な操作にはかなりの外科的スキルが必要であり、実行するには訓練を受けた外科医または高度に独立した外科研修医が必要です。実験全体を損なう致命的なエラーが発生する機会は多く、そのような危険を回避または修正するには適切な外科的技術が必要です。移植された肺の唯一の真の評価は、再灌流の最後に行われます。生まれつきの右肺は、ブタの酸素要求量を満たし、満足のいくABGを産生することができます。右肺が門部で完全に固定されると、新鮮な酸素、新鮮な脱酸素化された血液供給、および酸素化された血液排出を受けることが妨げられます。これは、心拍出量の100%が移植された肺に向けられ、全身の酸素化のみに関与するようになるため、移植された左肺機能を決定する極めて重要な瞬間です。
この方法には、既存の方法や代替方法に関して複数の利点があります。文献12,13,14,15を確認した後、この方法は、ジュニア心臓外科研修生または完全に資格のある外科医の手にある1匹または2匹の豚の初期学習曲線の後に最も詳細で再現性があります。操作は簡単です。しかし、ブタの血行動態(致死性不整脈に対する感受性を含む)は、心肺の観点からより頑健な成人のヒトでの手術に慣れている人にとって学習の機会を生み出します。孤立した左肺機能評価の方法は、短いですが、実行が簡単で再現性が高いです。特に、この方法論は、現在文献で入手可能なものよりも麻酔薬管理についての詳細を提供します。
生体内移植は、ESLPおよび肺移植の研究に不可欠です。ESLPは、拒絶反応抑制薬の導入以来、肺移植における最も重要な開発であり、一部の施設では、この技術によってもたらされる臓器利用率の向上からすでに恩恵を受けています6,7,8,9,10,11,12。待機リストの死亡率を低下させ、ESLPプラットフォームへのアクセスを拡大するためには、この研究分野のさらなる進歩が必要です。ESLPによるin vitro解析は、in vivo評価と大型動物モデルの確認から恩恵を受けます。in vitro所見を確認する大動物モデルは、多くの場合、開発ラボの臨床試験の承認に必要です。この方法は、ESLP研究を行うラボに信頼性が高く、比較的簡単な移植方法を提供します。
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Disclosures
DHFは、 Ex situ 臓器灌流技術および方法に関する特許を保有しています。DHFとJNは、Tevosol, Inc.の創業者であり、大株主です。
Acknowledgments
この研究は、大学病院財団に代わって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer | Radiometer | 989-963 | |
| Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small | Covidien | 352/5877 | |
| Allison Lung Retractor | Pilling | 341679 | |
| Arterial Filter | SORIN GROUP | 01706/03 | |
| Backhaus Towel Clamp | Pilling | 454300 | |
| Bovine Serum Albumin | MP biomedicals | 218057791 | |
| Biomedicus Pump | Maquet | BPX-80 | |
| Bronchoscope | |||
| Cable Ties – White 12” | HUASU International | HS4830001 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | C69-500G | |
| Cooley Sternal Retractor | Pilling | 341162 | |
| CUSHING Gutschdressing Forceps | Pilling | 466200 | |
| Debakey-Metzenbaum Dissecting | Pilling | 342202 | |
| Scissors | Pilling | 342202 | |
| DeBakey Peripheral Vascular Clamp | Pilling | 353535 | |
| Debakey Straight Vascular Tissue Forceps | Pilling | 351808 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767-500G | |
| Drop sucker | |||
| Endotracheal Tube 9.0mm CUFD | Mallinckrodt | 9590E | |
| Flow Transducer | BIO-PROBE | TX 40 | |
| Infusion Pump | Baxter | AS50 | |
| Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator | SORIN GROUP | K190690 | |
| Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2" | Medtronic | 6013 | |
| Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8' | Medtronic | 3108 | |
| Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6' | Medtronic | 3506 | |
| Laryngoscope | N/A | N/A | Custom-made with 10-inch blade |
| Metzenbaum Dissecting Scissors | Pilling | 460420 | |
| Medical Carbon Dioxide Tank | Praxair | 5823115 | |
| Medical Oxygen Tank | Praxair | 2014408 | |
| Medical Nitrogen Tank | Praxair | NI M-K | |
| Mosquito Clamp | Pilling | 181816 | |
| Harken Auricle Clamp | |||
| Organ Chamber | Tevosol | ||
| PlasmaLyte A | Baxter | TB2544 | |
| Poole Suction Tube | Pilling | 162212 | |
| Potassium Phosphate | Fischer Scientific | P285-500G | |
| PERFADEX Plus | XVIVO | 19811 | |
| Satinsky Clamp | Pilling | 354002 | |
| Scale | TANITA | KD4063611 | |
| Silicon Support Membrane | Tevosol | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 792519-1KG | |
| Sodium Chloride 0.9% | Baxter | JB1324 | |
| Sorin XTRA Cell Saver | SORIN GROUP | 75221 | |
| Sternal Saw | Stryker | 6207 | |
| Surgical Electrocautery Device | Kls Martin | ME411 | |
| TruWave Pressure Transducer | Edwards | VSYPX272 | |
| Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr X2 | Arrowg+ard | CS-12702-E | |
| Vorse Tubing Clamp | Pilling | 351377 | |
| Willauer-Deaver Retractor | Pilling | 341720 | |
| Yankauer Suction Tube | Pilling | 162300 | |
| 0 ETHIBOND Green 1X36" Endo Loop 0 | ETHICON | D8573 | |
| 0 PDS II CP-1 2x27” | ETHICON | Z467H | |
| 1 VICRYL MO-4 1x18” | ETHICON | J702D | |
| 2-0 SILK Black 12" x 18" Strands | ETHICON | SA77G | |
| 4-0 PROLENE Blue TF 1x24” | ETHICON | 8204H | |
| 6-0 PROLENE Blue BV 2x30” | ETHICON | M8776 | |
| 21-Gauge Needle |
References
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