Summary
Mevcut protokol, sürekli büyüyen bir fare kesici dişinden, fare azı dişinden ve insan dişlerinden tek hücreli RNA-seq analizine uygun tek hücreleri izole etmek için hızlı, verimli ve nazik bir yöntem sunar.
Abstract
Fare ve insan dişleri, tek hücreli transkriptomik veya diğer uygulamalar için hızlı ve verimli hücre izolasyonu için zorlu organları temsil eder. Hücre dışı matris bakımından zengin olan diş hamuru dokusu, tipik olarak tek hücreli transkriptomik için makul sürenin ötesinde uzun ve sıkıcı bir ayrışma işlemi gerektirir. Gen ifadesinde yapay değişikliklerden kaçınmak için, tek hücrelerin analizine kadar bir hayvanı ötenaziden geçen sürenin en aza indirilmesi gerekir. Bu çalışma, fare ve insan dişlerinden scRNA-seq (tek hücreli RNA dizilimi) için uygun mükemmel bir kalitede tek hücreli süspansiyon elde etmeyi sağlayan hızlı bir protokol sunar. Bu protokol hızlandırılmış doku izolasyon adımlarına, enzymatic sindirime ve daha sonra son tek hücreli süspansiyonun hazırlanmasına dayanmaktadır. Bu, dokuların hızlı ve nazik bir şekilde işlenmesini sağlar ve yüksek canlılık ve minimum transkripsiyonik değişikliklerle hücre süspansiyonları elde etmek için daha fazla hayvan veya insan örneği kullanılmasına izin verir. Bu protokolün sadece fare veya insan dişlerinde değil, kıkırdak, yoğun bağ dokusu ve dermis de dahil olmak üzere diğer hücre dışı matris bakımından zengin dokularda da scRNA-seq'i gerçekleştirmek isteyen araştırmacılara rehberlik edebileceği beklenebilir.
Introduction
Tek hücreli RNA dizilimi, in vivo hücre popülasyon yapısını, hiyerarşisini, etkileşimlerini ve homeostazı deşifre etmek için güçlü bir araçtır1,2. Bununla birlikte, sonuçları bu gelişmiş analizin ilk adımına bağlıdır - karmaşık, iyi organize edilmiş dokudan mükemmel kalitede tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması. Bu, hücreleri canlı tutmayı ve hücrelerin gen ekspresyon profillerinde istenmeyen, yapay değişiklikleri önlemeyi kapsar3,4. Bu tür değişiklikler, nüfus yapısının yanlış nitelendirilmesine ve toplanan verilerin yanlış yorumlanmasına neden olabilir.
Çok çeşitli dokulardan izolasyon için özel protokoller geliştirilmiştir5,6,7,8. Genellikle çeşitli proteolitik enzimlerle daha fazla inkübasyon ile birlikte mekanik ayrışmalar alırlar. Bunlar tipik olarak tripsin, kollajenazlar, dispazlar, papain6,7,8,9 veya Accutase, Tryple, vb. Transkriptom kalitesini etkileyen en kritik kısım enzimamatik sindirimdir. 37 °C'de enzimlerle uzun süreli inkübasyonun gen ekspresyonunu etkilediği ve strese bağlı birçok genin 10,11,12,13'lük bir şekilde yukarı doğru akredasyonuna neden olduğu gösterilmiştir. İzolasyon sürecinin diğer kritik parametresi, doku iskemisi14'den sonra hücre transkriptomlarının değiştiği gösterildiği için genel uzunluğudur. Bu protokol, tek hücrelerin fare ve insan dişlerinden yumuşak bir şekilde izole edilmesinin, diğerlerinden daha hızlı, daha önce kullanılan karmaşık dokulardan hücrelerin izolasyonu için protokollerin etkili bir protokolünü sunar5,6,9,11,13,15,16.
Bu protokol, yumuşak dokunun sert dişten hızlı bir şekilde nasıl incelten ve scRNA-seq için uygun tek hücreli bir süspansiyonun nasıl hazırlanacağını sunar. Bu yöntem sadece bir santrifüjleme adımı oluşturur ve doku elleçleme ve sindirim süresini azaltarak ve doku ve hücreleri çoğu zaman 4 °C'de tutarak istenmeyen transkripsiyon değişikliklerinin etkisini en aza indirir. Prosedür, örnek olarak hücrelerin fare kesici dişlerinden, azı dişinden ve insan bilgelik dişlerinden izolasyonu sergiler, ancak esas olarak çeşitli organizmalardaki diğer dişler için çalışmalıdır. Protokolün tamamı Şekil 1'de şematik olarak görselleştirilmiştir. Bu protokol son zamanlarda fare ve insan dişlerinden elde edilen bir diş hücresi tipi atlas oluşturmak için kullanılmıştır1.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Uluslararası ve yerel yönetmeliklere göre yapıldı ve Eğitim, Gençlik ve Spor Bakanlığı, Çek Cumhuriyeti (MSMT-8360/2019-2; MSMT-9231/2020-2; MSMT-272/2020-3). Bu protokol hem erkek hem de dişi wildtype C57BL/6 ve CD-1 fareleri ve genetiği değiştirilmiş Sox10::iCreERT2 mice17 (çeşitli muhabir sistemleri ile birlikte) ile C57BL/6 arka plan üzerinde test edilmiştir. Çek Cumhuriyeti'nin Brno kentindeki Masaryk Üniversitesi Brno & St. Anne's Fakülte Hastanesi Tıp Fakültesi Etik Kurulları'nın onayıyla insan örnekleriyle deneyler yapıldı.
1. Deneysel kurulum ve çözümlerin hazırlanması
- Enstrüman kurulumu
- Santrifüjü 4 °C'ye kadar soğutun.
- Kuluçka odasını 37 °C'ye ısıtın.
- Floresan ile etkinleştirilen hücre sıralama (FACS) makinesini başlatın ve sıralayıcının tüm sıcaklıklarını (toplama tüpü tutucusu dahil) 4 °C'ye ayarlayın. Cihaz kalite kontrolünü gerçekleştirin, düşme gecikmesini ayarlayın.
- Ön gating stratejisini ayarlayın ve test sıralamasını gerçekleştirin.
NOT: FACS kullanırken 100 μm nozül kullanın.
- Çözümleri hazırlayın (adım 1.2.1-1.2.3).
- Yıkama çözeltisi: HBSS'de (Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi) taze %2 FBS (Fetal Sığır Serumu) hazırlayın.
- Sindirim karışımı: HBSS'de tamamen çözünmüş taze kollajenaz P (3 U/mL) hazırlayın.
- İsteğe bağlı: Tek hücreli süspansiyonu -80 °C'de saklamak için -20 °C dondurucuda taze HBSS + BSA (%0,04) ve soğuk analitik dereceli metanol hazırlayın.
NOT: 1. adımın deneme başlamadan önce gerçekleştirilmesi gerekir. Kullanılan çözümlerin bileşimi Tamamlayıcı Tablo 1'de özetlenmiştir.
2. Deney hayvanı/hayvan ve insan dişinin hazırlanması
- Deney hayvanlarını hazırlayın (fare).
- Fareyi yerel yönetmeliklere göre ötenazi yapmak; örneğin anestezik aşırı dozda daha önce açıklandığı gibi1.
DİkKAT: Deney hayvanlarının insancılı ötenazi düzenlemeleri yerel olarak değişir. Her zaman geçerli yerel düzenlemelere uyun. - Hemen doku diseksiyon adımına geçin (adım 3).
NOT: Deney hayvanlarından alınan doku hemen parçalanamazsa (örneğin, hayvan barınma tesisinden transfer nedeniyle), deney hayvanlarını buza yerleştirin ve en kısa sürede doku diseksiyonu gerçekleştirin. Fare azı dişi posalarından daha fazla hücre elde etmek için daha genç (6 hafta ve daha az) hayvanlar kullanın. Yaş arttıkça diş posasının boyutu azalır. Fare kesici dişler çoğunlukla artan yaşla birlikte yapılarını tutar, böylece çeşitli yaşlardaki hayvanlar doku diseksiyonu için kullanılabilir.
- Fareyi yerel yönetmeliklere göre ötenazi yapmak; örneğin anestezik aşırı dozda daha önce açıklandığı gibi1.
- İnsan dişini hazırlayın
NOT: İnsan dişleri klinik olarak ilgili bir nedenle çıkarılmıştır. Her tanı ayrı ayrı tedavi edildi ve deneyimli bir diş cerrahı her zaman diş çekimini gerçekleştirdi.- Yeni çıkarılan dişi hemen buz gibi HBSS'li 50 mL'lik bir tüpe koyun ve tüpü bir sonraki işleme kadar buzda tutun.
NOT: En yüksek hücre verimi için hastalardan 25-30 yaşına kadar tutulan yirmilik dişlerin kullanılması önerilir.
- Yeni çıkarılan dişi hemen buz gibi HBSS'li 50 mL'lik bir tüpe koyun ve tüpü bir sonraki işleme kadar buzda tutun.
3. Doku diseksiyonu
- Deneysel hayvanı başının arkasında tutun, başının ventral yönüne bakın, böylece kuyruk uzağa işaret ediyor.
- Küçük, keskin makas kullanarak, mandibular kemeri, mandibulaların her yarısı arasındaki yumuşak dokuyu ve bitişik yüz kaslarını ortaya çıkarmak için cildi mandibuladan hızla çıkarın.
- Mandibulanın her iki tarafından derin bir kesim yapın; ilk olarak, m. masseter boyunca mandibulanın buccal tarafı boyunca temporomandibular bağlantıya kadar ve daha sonra mandibulanın her yarısının iç kısmı boyunca ağız boşluğunun tabanından geçer (bkz. Ek Şekil 1).
- Mandibula boyunca temporomandibuler ekleme kadar tüm kasları ve bağları ağız boşluğunun hem dışından hem de içinden kesin.
NOT: Kemikleri kesmekten kaçının. Bu kesici dişteki en apikal kısmına zarar verebilir. - Bükülmüş uç cımbız kullanarak mandibulayı kavrayın ve çıkarın. Daha sonra, parçalanmış mandibulayı mandibuler senfonik keserek makasla ikiye bölün (bkz. Ek Şekil 1).
- Mandibulanın her yarısından kalan yumuşak dokuyu chafe etmek için endüstriyel bir düşük tiftik mendili kullanın. Mandibulanın her iki kısmı temizlendikten sonra, buz gibi HBSS ile önceden hazırlanmış bir Petri kabına yerleştirin.
NOT: Bu noktadan sonra buz üzerinde çalışın. Fare kesici dişlerinin ve azı dişlerinin daha fazla diseksiyonu, siyah arka plana sahip bir stereomikroskop altında gerçekleştirilir. - Fare mandibular kesici dişler
- Mandibular kesici dişlerin diseksiyonu için, alveolar sırtı üç azı dişiyle birlikte çıkarın ve mandibular kemeri birinci ve ikinci azı dişi arasındaki konuma karşılık gelen yerde enine şekilde kırın.
NOT: Bu adımı gerçekleştirmek için 11 numaralı keskin bir neşter bıçağı ve cımbız kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu). - Kesici diş soketinin geri kalanından dikkatlice çekin.
NOT: Başarılı olursa, çıkarılan kesici diş, tam servikal döngülere sahip epitel dokusu da dahil olmak üzere bozulmamış apikal parçalar içerecektir. - Gerekirse, kesici cımbız ve neşter ile kesici dişe bağlı kalan kemik parçalarını çıkarın.
- Parçalanmış kesici dişleri taze, buz gibi HBSS'ye yerleştirin ve ilgi çekici dokuyu kesin: servikal döngü, diş hamuru veya dişin diğer kısımları.
- Parçalanmış yumuşak dokuyu 10 cm'lik bir Petri kabının ortasına taze, buz gibi bir HBSS damlasına yerleştirin. Buzda kal.
- Mandibular kesici dişlerin diseksiyonu için, alveolar sırtı üç azı dişiyle birlikte çıkarın ve mandibular kemeri birinci ve ikinci azı dişi arasındaki konuma karşılık gelen yerde enine şekilde kırın.
- Fare mandibular azı dişleri
- Mandibular azı dişlerinin diseksiyonu için, neşter bıçağı kullanarak alveolar sırtı mandibulanın geri kalanından tamamen çıkarın.
- Parçalanmış alveolar kreti bir Petri kabında taze, buz gibi HBSS'ye taşıyın ve köklere bağlı kalan tüm alveolar kemik parçalarını dikkatlice çıkarın.
- Alveolar kemiksiz parçalanmış azı dişlerini taze, buz gibi HBSS'ye yerleştirin. Hamuru açığa çıkarmak için, pulpa boşluğuna ulaşana kadar ince, keskin uçlu cımbız kullanarak dentin parçalarını apikal taraftan çıkarmaya başlayın.
- Pulpa boşluğuna ulaşıldıktan sonra, bir çift keskin uçlu cımbız kullanarak diş hamurunu dikkatlice parçalara alın ve diş hamurunun yumuşak dokusunu buzda tutulan 10 cm'lik petri kabının ortasında taze, buz gibi bir HBSS damlasına yerleştirin.
NOT: Fare azı dişi hamurları son derece küçük olduğundan, stereomikroskop üzerindeki büyütmeyi buna göre uyarlar.
- İnsan dişi
- Kalan kanı çıkarmak için insan dişini buz gibi HBSS'de bir kez daha yıkayın.
- Dişi üç kalın duvarlı steril plastik torbaya yerleştirin ve dişi kırmak için dökme demir tezgah mühendisi mengenesi kullanın. Torbalara nüfuz etmemek için düz yüzeyli mengene çeneleri kullanın.
- Dişin çatladığını duyana kadar mengeneyi yavaşça sıkın; torbalardan çıkarın ve petri kabına taze, buz gibi HBSS'ye yerleştirin.
- İki cımbız kullanarak, diş hamurunu çıkar, sert dokunun tüm kalıntılarından temizleyin ve buz üzerinde tutulan 10 cm Petri kabının ortasında bir damla buz gibi HBSS'ye yerleştirin.
DİkKAT: İnsan dokusu potansiyel olarak bulaşıcı olabilir. İnsan dokusu ile çalışırken, doku ile doğrudan teması önlemek için koruyucu ekipman kullanın.
4. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması
- HBSS'de tamamen çözünmüş Kollajenaz P'den (3 U/mL) oluşan 2,5 mL sindirim karışımına sahip 15 mL'lik bir tüp hazırlayın. Çözeltiyi kullanıma kadar buzda tutun.
NOT: Her zaman yeni hazırlanmış Kollajenaz P kullanın; aliquots dondurmayın. Kollajenaz P etkinliği toplu işlerden toplu işlere değişir. Seyreltmeden önce partinizin etkinliğini kontrol edin. Kollajenaz P, liyofilize tozda miktarı zaten yeterli olan kalsiyum ile aktive edilir. Bu nedenle enzim karışımını kalsiyum ile zenginleştirmek gereksizdir. Kollajenaz P, FBS tarafından inaktive edilmez, ancak şelatlama ajanları (örneğin, Etilenediaminetetraacetic - EDTA) tarafından inaktive edilebilir. Dissosiasyon işleminin durdurulması, Yıkama çözeltisinde Kollajenaz P'nin seyreltilmesiyle sağlanır (HBSS'de% 2 FBS). FBS eklemenin hücre canlılığını ve sıralamadan sonraki son hücre sayısını artırdığı gösterilmiştir18. - 10 numaralı yuvarlak şekilli neşter bıçağı kullanarak, dokuyu her yönde mümkün olan en küçük parçalara bölün. Damlacığın ortasındaki doku parçalarını yeniden ayırın ve yuvarlak şekilli (No. 10) neşter bıçağı kullanarak doku agregalarını tekrar tekrar kesin. Malzeme yeterince kıyılana kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
- Parçalanmış doku parçalarını hazırlanan sindirim karışımına 1 mL pipet ucu kullanarak aktarın.
NOT: Aynı anda daha fazla sayıda hayvanın işlenmesi durumunda, dokuyu Collagenase P ile birkaç tüpe bölün. Tüp başına maksimum miktar, yaklaşık 10 fare kesici dişten elde edilen posalardır. Posaların çok daha küçük olduğu azı dişleri durumunda, işlenmiş posa sayısı yeterince artırılabilir. İnsan dişlerini kullanırken, posa boyutuna bağlı olarak tüp başına maksimum 2-3 posa kullanın. - Tüpü bir çalkalayıcı ile önceden ısıtılmış 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Çalkalayıcının içindeki tüpü 60° açıya eğin ve tüpün içinde sürekli süspansiyon hareketleri sağlamak için hızı 150-200 rpm'ye ayarlayın.
- Tüm kümeleri parçalamak için süspansiyonu her 3-4 dakikada bir 1 mL pipet ucuyla kuvvetlice üçe ayırın.
NOT: Zamanla, kümeler neredeyse yok olana kadar küçülür ve yumuşar. - Toplamda, 15-20 dakika kuluçkaya yatır. Kuluçkanın sonunda, son kez tritüre edin ve ardından 12 mL'lik son hacme yavaşça buz gibi Yıkama çözeltisi ekleyin.
- Süspansiyonu 50 μm hücre süzgeç kullanarak filtre ederek kalan kümeleri veya kireçlenmiş doku parçalarını çıkarın.
- Filtrelenmiş hücre süspansiyonunun 10-20 μL'sini alın ve bir hücre sayma odası (Hemositometre) kullanarak santrifüjleme sırasında hücreleri sayın. 4 °C'de 300 x g'da 5 dakika santrifüj. 10 mL serolojik pipet kullanarak süpernatant çıkarın.
NOT: Seyreltilmiş süspansiyonda sayılamayacak hücre sayısı sınırlıysa, hücre sayımını atlayın ve daha fazla işlem için tüm hücreleri kullanın. - İsteğe bağlı: Sabitleme ve depolama için devam edin21.
- 100 uL HBSS + BSA'da (%0,04) peletleri (107 hücreye kadar) yeniden askıya alın.
- 400 μL soğutulmuş metanol ekleyin ve yavaşça karıştırın.
- Hücre süspansiyonu buz üzerinde 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
- İşlenene kadar (en fazla 1 ay) -80 °C'de saklayın.
- Peletin Yıkama çözeltisinde yeniden kullanın. Yıkama çözeltisinin 700-1200 hücresini/μL'sini hedefleyin.
- Daha fazla işleme kadar tüpü buzda tutun.
NOT: Gerekirse, sabitleme ve depolamayı -80 °C'de gerçekleştirin. Bununla birlikte, scRNA-seq için hücre süspansiyonunun derhal işlenmesi önerilir. Diğer adımlar tek hücreli RNA seq protokolüne bağlı olacaktır. scRNA-seq protokolü bir mikroakışkan sistem kullandığında (bazı sc-RNA-seq şirketleri kullanır), hücreleri doğrudan veya hücre sıralamadan sonra üreticinin yönergelerine göre yükler. - FACS için 5.
5. Floresanla etkinleştirilen hücre sıralama (FACS)
- Sıralamadan önce hücre sıralama aletini hazırlayın.
- Tüm sistemi 4 °C'ye soğutun, cihaz kalite kontrolünü gerçekleştirin, düşme gecikmesini ve sapma plakalarının voltajını ayarlayın. Toplama tüplerini toplama tüpü tutucusuna koyun.
NOT: Kaçınılmaz bir hücre kaybına neden olan ek santrifüj adımlarını önlemek için, hücreleri küçük bir miktar (25-50 μL) Yıkama çözeltisi ile bir mikrotüp (1,5 mL) olarak sıralayın.
- Tüm sistemi 4 °C'ye soğutun, cihaz kalite kontrolünü gerçekleştirin, düşme gecikmesini ve sapma plakalarının voltajını ayarlayın. Toplama tüplerini toplama tüpü tutucusuna koyun.
- İsteğe bağlı: FACS'den önce canlılık boyama gerçekleştirin.
- FACS'den önce hücre süspansiyonuna Propidium iyodür ekleyin 0,5 μg/mL son konsantrasyona ve 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Örneği hücre sıralayıcısına yükleyin. Hücre kalıntılarını, çiftleri ve ölü hücreleri kaldırmak için sıkı bir gating stratejisi ayarlayın. Hücreleri hazırlanmış bir tüp veya çok kuyulu plakalar halinde sıralayın. Şekil 2'de bir gating stratejisi örneği gösterilmiştir.
NOT: Manipülasyon adımlarını en aza indirmek ve protokolü hızlandırmak için, uygulanabilirlik boyama kullanmak yerine sıkı bir gating stratejisi uygulanması önerilir ( Şekil 2'de önerilir). Bağışıklık hücrelerini izole popülasyondan ayırmak için CD45 antikor boyama işlemi yapılabilir. Bunu gerçekleştirmek için hücre süspansiyonunu 100 μL boyama çözeltisinde (PBS + %2 FBS + anti-CD45-APC konjuge antikor 1/100 seyreltme) yeniden kullanın. Işıktan korunan buzda 15 dakika kuluçkaya yatın ve doğrudan FACS gerçekleştirin.
Representative Results
Tek hücrelerin örnek izolasyonu, 6 haftalık bir C57BL/6 fare erkeğinden iki mandibuler kesici dişten gerçekleştirildi. Bu protokolün ardından tek hücreli süspansiyon hazırlandı ve daha sonra tek hücreli sıralama yapıldı. Hazırlanan tek hücreli süspansiyon FACS kullanılarak analiz edilmiş ve sıralanmıştır (Şekil 2). İlk olarak, FSC-A (ileri saçılma, alan) ve SSC-A (yan dağılım, alan) çizimi uygulandı ve hücre enkazımızı ve hücre çiftlerimizi veya agregalarımızı filtrelemek için beklenen boyut ve tanecikli bir popülasyon seçmek için uygun bir gating stratejisi kullanıldı (Şekil 2A). Tüm olayların %38'ini sayan bu seçili popülasyon (P1) daha fazla kullanıldı ve kalan hücre çiftlerini çıkarmak için FSC-A ve FSC-H (ileri dağılım, yükseklik) parametreleri uygulandı (Şekil 2B). P1'in %95'ini sayan hücre çiftleri (P2) olmayan popülasyon daha sonra scRNA-seq için kullanılabilir. Alternatif olarak, ilgi popülasyonu seçmek için ek gating kullanılabilir (örneğin, floresan proteinlerin ekspresy ekspresyoyması veya canlı / ölü boyama). Son süspansiyondaki canlı/ölü hücre sayısını kontrol etmek için PI (propidium iyodür) boyama işlemi yapıldı (Şekil 2C). PI- (yaşayan) hücreleri içeren P3 popülasyonu, ana P2 popülasyonunun %98,4'ü ve toplam olayların %35,5'i idi. Filtrelenmiş, ölü (PI+) hücrelerin toplam sayısı 1887'dir.
RNA-seq (P2) için uygun canlılık lekesi olmadan elde edilen son hücre sayısı, iki fare kesici bağ hamurundan 118.199 hücre saydı. Bu, bir mandibular kesici dişten neredeyse 60.000 canlı hücre sayısı anlamına gelir.
Son tek hücreli süspansiyonda bağışıklık hücrelerinin sayısını netleştirmek için iki yaklaşım kullanılmıştır. İlk olarak CD45 antikor boyama ve sonrasında FACS analizi kullanıldı. Tamamlayıcı bir yöntem olarak scRNA-seq verilerindeki toplam immün hücre sayısı (CD45+) analiz edildi. FACS analizi CD45+ hücrelerinin %14,44'ünü (%13,20 canlı ve %1,24 ölü) göstermiştir (Şekil 3A). scRNA-seq verilerinin analizi CD45 eksprese edici hücrelerin %10,90'ını göstermiştir (Şekil 3B). SCRNA-seq verilerindeki CD45+ hücrelerinin azalması, scRNA-seq analizi sırasında ek eşiklemeden kaynaklanabilir.
Fare kesici diş örneğine ilişkin bu temsili veriler, verilen protokolün katı gating stratejisi ile birlikte, canlılık boyamanın ek kullanımına gerek kalmadan tek bir fare dişinden yüksek sayıda hücre elde etmede etkili olduğunu göstermektedir. İmmün (CD45+) hücrelerin oranı küçüktü (%13.2). Ayrıca, daha önce bağışıklık hücrelerinin diş homeostazını korumada gerekli olduğu gösterilmiştir, bu nedenle FACS sırasında scRNA-seq analizinden çıkarılması bazı uygulamalarda ters etki edecektir.
Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Fare ve insan dişlerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için sıcaklık koşulları ve beklenen süre de dahil olmak üzere farklı adımlar temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Gating stratejisinin örneği. P1 kapısını üretmek için FSC-A ve SSC-A gating kullanıldı, hücre popülasyonu beklenen boyut ve parçalı yapı ile yansıtıldı ve hücre ve hücre dışı matris kalıntılarını ve en büyük olayları (A) filtre etti. Daha sonra, P1 popülasyonu, hücre çiftlerini (B) filtreleyen FSC-H ve FCS-A çiziminde çizildi. Bu P2 popülasyonu daha sonra propidium iyodür (C) ile ölü hücrelerin varlığı için analiz edildi. Kapı başına olay/hücre sayısı (D) içinde temsil edilir. (FSC-A - ileri saçılma, alan; SSC-A - yan dağılım, alan; FSC-H - ileri dağılım, yükseklik; PI - propidium iyodür). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bağışıklık hücrelerinin nicelemesi. İmmün hücrelerin nicelleştirilmesi, anti-CD45 antikoru ile boyanmış hücrelerin FACS analizi ve propidium iyodür boyama (A) kullanılarak Canlı/Ölü analizi ile gerçekleştirildi. ScRNA-seq analizi (B) sırasında immün hücrelerin daha fazla ölçülmesi yapıldı. (CD45-APC - anti-CD45 allolikokyanin konjuge antikor; PI - propidium iyodür; t-SNE - t-dağıtılmış stokastik komşu gömme). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Mandibula diseksiyon işlemine genel bakış. Kesikli çizgiler önerilen kesimleri gösterir. TMJ - temporomandibular eklem, m. masseter - kaslı masseter. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo 1: Çalışmada kullanılan çözeltilerin bileşimleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Discussion
Hücresel veya moleküler düzeyde diş ve kemikleri incelemek genellikle zordur, çünkü bu dokuları oluşturan hücreler farklı sert matrislerle çevrilidir19. Diş dokusu üzerinde tek hücreli RNA-seq gerçekleştirmenin ana hedeflerinden biri, transkriptomlarında herhangi bir yapay değişiklik olmadan ve hızlı bir şekilde ilgi çekici hücreler elde etme ihtiyacıdır. Bunu başarmak için, hücreleri fare ve insan diş pulpalarından izole etmek için uygun, tüm transkriptomik uygulamalar için hızlı tek hücreli süspansiyon üretimine izin veren son derece verimli bir protokol geliştirilmiştir. Bu, hızlı doku izolasyonu, doku ve hücre manipülasyonlarının adımlarını en aza indirme ve mekanik ve enzymatic sindirimi kolaylaştırarak sağlandı.
Bu protokolün en kritik adımları hızlı doku işleme ve yeterli tek hücreli süspansiyon hazırlığı8,9'dur. Diş matkabı veya diğer ısı üreten cihazlar kullanmadan diş pulpaları elde etmek için manuel bir yaklaşım kullanılır. Aşırı ısınma, ısı şok proteinlerinin ve diğer genlerin yapay bir ifadesine neden olabilir ve sonuçta analiz edilen gen ekspresyon kalıplarının orijinal dokuya temsil edilememiş olmasına neden olabilir20. Manuel doku hasadı, önceden biraz eğitime ihtiyaç duyacak zorlu bir adım olabilir. Hamur daha sonra küçük parçalara ayrılır ve 37 ° C'de enzmatik olarak sindirilir. 15-20 dakikalık enzymatic sindirim dışında, tüm protokol 4 ° C'de gerçekleştirilir. Doku işleme ve özellikle enzimamatik sindirim mümkün olan en kısa sürede en aza indirildi, çünkü 37 °C'de daha uzun süreli inkübasyon gen ekspresyon modellerinde değişikliklere neden olabilir10. Enzymatic sindirimden önce dentin mekanik olarak çıkarılması önerilir. Dentin ve posaya bağlı predentin çok miktarda kolajen içerir ve aşırı varlığı sindirim çözeltisinin etkinliğini azaltabilir. Vücuttan çıkarıldıktan (veya organizmaların ölümünden) sonra, hücrelerin gen ifade kalıplarını hızlı bir şekilde değiştirmeye başladıkları gösterilmiştir12. Bu nedenle hücre izolasyonu ve işlenmesi mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır. Mevcut protokol, işlemin dokuyu izole etmekten (ötenazi yapan hayvan) tek hücreli süspansiyon hazırlamaya kadar 35-45 dakikaya kadar azaltılmasını sağlar.
Bu tekniğin alternatif bir modifikasyonu, daha sonra kullanılmak üzere hücre korumasıdır. Bu metanol fiksasyonu ile elde edilir. Metanol sabit hücre süspansiyonu, protokolde açıklandığı gibi -80 °C'de 1 aya kadar saklanabilir21. Bununla birlikte, mümkün olduğunda, doğrudan scRNA-seq gerçekleştirin, çünkü metanol sabit tek hücreli süspansiyonlardan elde edilen tek hücreli verilerin strese bağlı genlerin artan ekspresyonundan ve ortam RNA22 ile kontaminasyondan muzdarip olabileceği gösterilmiştir. Bu adımda üreticinin protokollerine göre ek değişiklikler gerekebilir.
Bu iletişim kuralının ilk uygulamasından önce, tekniği sınamak için birkaç doğrulama adımı gerçekleştirmeniz önerilir. Deneyimlerimize göre, protokolün yukarıda belirtilen kritik adımlarını test etmeyi öneriyoruz. Ek olarak, kollajenaz P çözeltisinin etkinliğini test etmeyi ve doku ayrışma adımının işlenmesini test etmeyi öneriyoruz. Özellikle, kollajenaz P inkübasyonunun başlatılmasından sonraki ilk 5 dakika civarında, doku parçaları bir araya gelmelidir. Bu yaygın bir durumdur. Agregalar 1 mL pipet kullanılarak her 3-4 dakikada bir parçalanır ve artan zamanla zar zor görünene kadar küçülmelidir.
Ayrıca, suboptimal süpernatant çıkarılmasına bağlı olası hücre kayıplarını tespit etmek için santrifüjlemeden önce ve filtrelemeden önce ve sonra hücre sayımının bir hücre sayım odasında yapılması önerilir. Son tek hücreli süspansiyonun saflaştırılması gerekiyorsa, FACS kullanılabilir. Hücre sıralama sadece kalıntıları veya ölü hücreleri kaldırmakla kalmaz, aynı zamanda floresan etiketli hücrelerle son süspansiyonu zenginleştirmeyi sağlar13,19. Hücre sıralayıcısının kesme stresini veya tıkanmasını önlemek için geniş bir nozül (85 μm veya 100 μm) kullanılır. Bu, sıralanmış hücrelerin canlılığını daha da artıracaktır.
Bu teknik hem fare hem de insan dişleri üzerinde tasarlanmış ve test edilmiştir. Ana sınırlayıcı faktör, yaşlı farelerin (azı dişleri) ve insanların dişlerinin azaltılmış diş pulpalarındaki az sayıda hücredir. Daha fazla sayıda hücre elde edilmesi gerektiğini veya yaşlı hastaların dişlerinden hücrelerin elde edileceğini varsayalım. Olası bir çözüm, daha yüksek sayıda dişi işlemek ve daha sonra tek bir örnek olarak işlenen tek bir partide birleştirmektir.
İnsan diş hamurunun canlı hücreleri ilk olarak yirmi yıldan uzun bir süre önce kollajenaz I ve dispase23 enzim karışımı kullanılarak izole edildi. O zamandan beri, diş pulpası hücrelerinin izolasyonları yaygın olarak kullanılmaya devam etti ve çeşitli teknikler kullanıldı5,6,7,8. Burada sunulan yöntemin kritik önemi, scRNA-seq için son hücre süspansiyonunun yüksek kalitesini sağlamak için izolasyonu hızlı ve nazik hale getirmek için tüm izolasyon adımlarının uyarlanmasıdır. Enzimlerle daha uzun süreli inkübasyon ile daha yüksek hücre verimi elde edilebilir. Bu protokol, tek hücreli RNA dizilimi için uygun kalitede fare ve insan dişlerinden hızlı bir şekilde tek hücre elde etmek için etkili bir çözüm sağlar. Bu tekniğin sadece hafif teknik değişikliklerle diğer dokular veya organizmalar için yaygın olarak kullanılması beklenebilir.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
J.K., Masaryk Üniversitesi Hibe Ajansı (MUNI/H/1615/2018) ve Tıp Fakültesi MU'dan genç araştırmacıya fonlar ile desteklendi. J.L., Masaryk Üniversitesi Hibe Ajansı tarafından desteklenmiştir (MUNI/IGA/1532/2020) ve Brno Şehir Belediyesi tarafından finanse edilen Brno Doktora Yetenek Bursu Sahibidir. T.B. Avusturya Bilim Fonu (Lise Meitner hibesi: M2688-B28) tarafından desteklendi. Lydie Izakovicova Holla ve Veronika Kovar Matejova'ya insan dişlerinin eldeine yardım ettikleri için teşekkür ederiz. Son olarak, Radek Fedr ve Karel Soucek'e FACS sıralama konusundaki nazik yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 10735078001 | |
| CellTrics 50 µm, sterile | Sysmex | 04-004-2327 | |
| Collagenase P (COLLP-PRO) | Roche | 11213857001 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 10 | AESCULAP | 16600495 | |
| CUTFIX Scalpel Blades, Fig. 11 | AESCULAP | 16600509 | |
| Fetal Bovine Serum (South America), Ultra low Endotoxin | Biosera | FB-1101/500 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) without Ca2+ and Mg2+ | SIGMA | H6648 | |
| Industrial low lint wipes, MAX60 | Dirteeze | MAX60B176 | |
| Industrial strong tweezers, style 660, bent serrated pointed tips, 150mm | Value-Tec | 50-014366 | |
| Methyl alcohol A.G. | Penta | 21210-11000 | |
| Propidium Iodide Solution | BioLegend | 421301 | |
| Scalpel handle | CM Instrumente | AG-013-10 | |
| Serological pipettes 10mL, individually wrapped, 200 pcs. | CAPP | SP-10-C | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 | |
| Surgical scissors (9cm) | CM Instrumente | AI-430-09Y | |
| Tissue culture dish Ø 100 mm | TPP | 93100 |
References
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Soldatov, R., et al. Spatiotemporal structure of cell fate decisions in murine neural crest. Science. 364 (6444), (2019).
- Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends in Cell Biology. 0 (0), (2021).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, (2018).
- Chiba, Y., et al. Single-cell RNA-sequencing from mouse incisor reveals dental epithelial cell-type specific genes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2020).
- Debnath, S., et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation. Nature. 562 (7725), 133-139 (2018).
- Kanton, S., Treutlein, B., Camp, J. G. Chapter 10 - Single-cell genomic analysis of human cerebral organoids. Methods in Cell Biology. 159, 229-256 (2020).
- Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nature Medicine. 20 (10), 1174-1181 (2014).
- vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
- Miyawaki-Kuwakado, A., et al. Transcriptome analysis of gene expression changes upon enzymatic dissociation in skeletal myoblasts. Genes to Cells. 26 (7), 530-540 (2021).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 7944 (2020).
- Ferreira, P. G., et al. The effects of death and post-mortem cold ischemia on human tissue transcriptomes. Nature Communications. 9 (1), 490 (2018).
- He, W., Ye, J., Xu, H., Lin, Y., Zheng, Y. Differential expression of α6 and β1 integrins reveals epidermal heterogeneity at single-cell resolution. Journal of Cellular Biochemistry. 121 (3), 2664-2676 (2020).
- Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. The Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3412-3424 (2011).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Greenblatt, M. B., Ono, N., Ayturk, U. M., Debnath, S., Lalani, S. The unmixing problem: A guide to applying single-cell RNA sequencing to bone. Journal of Bone and Mineral Research. 34 (7), 1207-1219 (2019).
- Charlebois, D. A., Hauser, K., Marshall, S., Balázsi, G. Multiscale effects of heating and cooling on genes and gene networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (45), 10797-10806 (2018).
- Chen, J., et al. PBMC fixation and processing for Chromium single-cell RNA sequencing. Journal of Translational Medicine. 16 (1), 198 (2018).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
