Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

الحقن الفيروسي المجسم، وزرع عدسة مؤشر التدرج لتصوير الكالسيوم العميق للدماغ في الجسم الحي

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63049
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

ERRATUM NOTICE

Summary

Miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة ديناميكيات الخلايا العصبية والدوائر الدقيقة في الفئران التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول إجراء جراحات الدماغ لتحقيق تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي باستخدام منظار مصغر.

Abstract

المجهر الفلوري المصغر (miniscope) هو أداة قوية لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الحيوانات التي تتصرف بحرية. يوفر العديد من المزايا على أنظمة تصوير الكالسيوم التقليدية متعددة الفوتونات: (1) مدمجة. (2) خفيفة الوزن؛ (3) بأسعار معقولة؛ و (4) يسمح بالتسجيل من الحيوانات التي تتصرف بحرية. يصف هذا البروتوكول جراحات الدماغ لتصوير الكالسيوم العميق في الدماغ في الجسم الحي باستخدام نظام تسجيل مصغر تم تطويره خصيصا. يتكون إجراء التحضير من ثلاث خطوات ، بما في ذلك (1) حقن الفيروس بشكل نمطي في منطقة الدماغ المطلوبة من دماغ الفأر لتسمية مجموعة فرعية محددة من الخلايا العصبية باستخدام مستشعر الكالسيوم المشفر وراثيا. (2) زرع عدسة مؤشر التدرج (GRIN) التي يمكنها نقل صورة الكالسيوم من منطقة الدماغ العميقة إلى نظام المنظار المصغر ؛ و (3) تثبيت حامل المنظار المصغر على جمجمة الماوس حيث يمكن إرفاق المنظار المصغر لاحقا. لإجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يتم تثبيت المنظار المصغر على الحامل ، ويتم جمع صور الكالسيوم العصبية جنبا إلى جنب مع تسجيلات السلوك المتزامنة. بروتوكول الجراحة الحالي متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا أحادية الفوتون وثنائية الفوتون لتصوير الكالسيوم العميق في الدماغ في الجسم الحي .

Introduction

تعد إشارات Ca2+ داخل الخلايا منظما أساسيا لنمو الخلايا وانتشارها وتمايزها والهجرة ونسخ الجينات وإفرازها وموت الخلايا المبرمج1. في الخلايا العصبية ، يتم التحكم بدقة في إشارات Ca2+ لأن نمطها المكاني الزماني يرتبط بوظائف حاسمة مثل استثارة الغشاء ، وإطلاق الناقل العصبي ، واللدونة المشبكية2.

يعد تصوير الكالسيوم في الجسم الحي تقنية قوية يمكن استخدامها لفك تشفير تمثيل الدائرة العصبية كعنصر أساسي في السلوكيات الحيوانية الطبيعية ، وتحديد الأنشطة العصبية الشاذة في النماذج الحيوانية لاضطرابات الدماغ ، وكشف الأهداف العلاجية المحتملة التي قد تطبيع هذه الدوائر المتغيرة. الاثنان الشائعان في أنظمة تصوير الكالسيوم في الجسم الحي هما المجهر الفلوري للمسح بالليزر ثنائي الفوتون3،4،5،6 والتنظير المجهري المصغر المثبت على الرأس (miniscope) 7،8،9،10،11،12،13 . يوفر المجهر التقليدي ثنائي الفوتون مزايا قيادية مثل دقة أفضل وضوضاء أقل وتبييض ضوئي أقل. ومع ذلك ، يطلب من التجارب أن تكون ثابتة الرأس ، مما يحد من دراسات السلوك التي يمكن إجراؤها3،4،5،6. على النقيض من ذلك ، فإن نظام المنظار المصغر المثبت على الرأس صغير ومحمول ، مما يجعل من الممكن دراسة مجموعة واسعة من اختبارات السلوك باستخدام تتصرف بحرية7،8،9،10،11،12،13.

هناك مؤشران رائدان ل Ca2+ ، وهما المؤشرات الكيميائية5,14 ومؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) 15,16. تم تسهيل تصوير Ca2+ باستخدام GECIs عالية الحساسية التي يتم تسليمها مع ناقلات فيروسية تسمح بوضع علامات محددة على الخلايا العصبية في الدائرة المستهدفة. إن الجهد المستمر لتعزيز الحساسية وطول العمر والقدرة على تسمية حتى المقصورات تحت الخلوية ، يجعل GECIs مثالية لمختلف دراسات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي 17،18،19.

إن تشتت الضوء في أنسجة المخ أثناء التصوير يحد من الاختراق البصري في العمق ، حتى مع المجهر ثنائي الفوتون. ومع ذلك ، فإن عدسة مؤشر التدرج (GRIN) تتغلب على هذه المشكلة حيث يمكن تضمين عدسة GRIN مباشرة في الأنسجة البيولوجية ونقل الصور من منطقة الدماغ العميقة إلى هدف المجهر. على عكس العدسة التقليدية المصنوعة من مواد متجانسة بصريا وتتطلب سطحا معقدا الشكل للتركيز وإنشاء الصور ، يعتمد أداء عدسة GRIN على تغيير معامل الانكسار التدريجي داخل مادة العدسة التي تحقق التركيز البؤري مع سطح المستوى20. يمكن تصنيع عدسة GRIN حتى قطر 0.2 مم. لذلك ، يمكن زرع عدسة GRIN مصغرة في الدماغ العميق دون التسبب في الكثير من الضرر.

في هذه المقالة ، يتم تقديم بروتوكول جراحة كامل للدماغ العميق في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي. لغرض العرض التوضيحي ، نصف جراحات الدماغ التي تستهدف على وجه التحديد قشرة الفص الجبهي الإنسي (mPFC) لدماغ الفأر وتسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر نظام منظار مصغر مصمم خصيصا طورته مجموعة الدكتور لين في المعهد الوطني لتعاطي المخدرات (NIDA / IRP) 7,12. يتضمن الإجراء التجريبي عمليتين جراحيتين رئيسيتين في الدماغ. الجراحة الأولى هي حقن ناقل فيروسي بشكل نمطي يعبر عن GCaMP6f (GECI) في mPFC. الجراحة الثانية هي زرع عدسة GRIN في نفس منطقة الدماغ. بعد التعافي من جراحات الدماغ هذه ، فإن الإجراء اللاحق هو تثبيت حامل المنظار المصغر (القاعدة) على جمجمة الفأر باستخدام أسمنت الأسنان. في الجسم الحي يمكن إجراء تصوير Ca2+ في أي وقت بعد تركيب المنظار المصغر على قاعدته. بروتوكول الجراحة للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا أحادية الفوتون وثنائية الفوتون للدماغ العميق في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي.

Protocol

يتبع البروتوكول التجريبي إرشادات رعاية الحيوانات بجامعة وايومنغ. الفأر المستخدم في هذه الدراسة يبلغ من العمر 6 أشهر من الذكور C57BL/6J. يمكن استخدام الإجراء لاستهداف أي مناطق عميقة في الدماغ لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي . هنا ، للتوضيح ، منطقة الدماغ المستهدفة هي mPFC الفأر (الأمامي والخلفي (A / P): 1.94 ملم ، الإنسي والجانبي (M / L): 0.5 ملم ، الظهري والبطني (D / V): 1.8 ملم). يتم تعديل هذا البروتوكول استنادا إلى البروتوكول21 المنشور مسبقا.

1. الحقن المجسمة للفيروس في mPFC (الشكل 1)

  1. التحضير للجراحة
    1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف ووضعها على سطح معقم.
    2. تحضير حقنة 10 ميكرولتر عن طريق فتيلة مع المالحة وملء مسبقا مع 5 ميكرولتر من المياه المالحة. قم بتوصيل المحقنة بمضخة دقيقة (انظر جدول المواد).
    3. قم بتشغيل وسادة التدفئة والحفاظ على درجة الحرارة عند 35 درجة مئوية.
  2. ضع الماوس في غرفة الحث (5 بوصة × 10 بوصات × 4 بوصات، الطول × العرض × الارتفاع) مع 5٪ من الأيسوفلوران و1 لتر/دقيقة من معدل تدفق الأكسجين. راقب بعناية واحسب معدل التنفس للماوس. أخرج الفأر بمجرد انخفاض معدل التنفس إلى 1 نفس / ثانية.
    ملاحظة: يمكن مراقبة معدل تنفس الماوس بسهولة من خلال مراقبة حركة عضلات الظهر لأسفل وأعلى أثناء كل استنشاق.
  3. اسمح للفأر بالاستقرار على منطقة على الطاولة منفصلة عن المنطقة الجراحية. باستخدام ماكينة قص الحلاقة، احلق الشعر من رأس الفأر حتى الفقرات العنقية الأولى.
  4. قم بتثبيت الماوس على المسرح المجسمة (انظر جدول المواد) وقم بتأمين موقعه باستخدام قضبان الأذن ومشبك الأنف. الحفاظ على تدفق الايزوفلوران إلى المرحلة المجسمة عند 1.5٪ ايزوفلوران و 0.5 لتر / دقيقة من معدل تدفق الأكسجين.
  5. ضع مرهم العين المزلق على كلتا العينين باستخدام قطعة قطن نظيفة لمنع جفاف العينين أثناء الجراحة. تقييم ردود فعل الدواسة على الماوس للتأكد من أن الماوس مخدر بالكامل قبل بدء الجراحة.
  6. قم بتطهير المنطقة الخالية من الشعر بمحلول بوفيدون اليود بنسبة 7.5٪ (انظر جدول المواد) و 70٪ إيثانول ثلاث مرات لكل منهما باستخدام مسحات قطنية معقمة.
  7. حقن حجم صغير (50 ميكرولتر) من 2 ٪ يدوكائين تحت جلد المنطقة الخالية من الشعر.
  8. قم بعمل شق 2 سم عبر الجلد على طول خط الوسط باستخدام مشرط لفضح لامدا وبريجما الجمجمة.
  9. قم بإزالة اللفافة من الجمجمة بمساعدة مسحات القطن الجافة والملقط المدبب.
  10. بعد أن تصبح البريجما واللامدا مرئيتين، استخدم طرف نتوء مثقاب الأسنان (قطره 0.5 مم) لقياس إحداثيات Z للبريجما ولامدا (انظر جدول المواد). اضبط ارتفاع حامل الأنف حتى تستلقي البريجما واللامدا في نفس وضع Z.
  11. حدد موقع نتوء مثقاب الأسنان 0.5 مم إلى موضع A/P: 1.94 مم، M/L: 0.5 مم من البريجما. حفر من خلال الجمجمة.
    ملاحظة: هنا ، للتوضيح ، منطقة الدماغ المستهدفة هي mPFC الماوس. يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستهداف أي منطقة دماغية عميقة أخرى. على سبيل المثال ، إذا كانت منطقة الدماغ المستهدفة هي Nucleus Accumbens (NAc) ، فيجب أن يكون الموضع المقابل هو A / P: 0.9 mm ، M / L: 1.2 mm.
  12. قم بإزالة الجافية باستخدام طرف إبرة 30 جم ونظف جميع قطع حطام العظام باستخدام ملقط حاد بزاوية 45 درجة.
    ملاحظة: النزيف شائع لأن الأوعية الدموية الصغيرة قد تتمزق أثناء خطوة التنظيف. استخدم مسحات قطنية معقمة لوقف النزيف وتطبيق محلول ملحي لغسل المنطقة. ضع محلول ملحي على منطقة الجمجمة المكشوفة للحفاظ على رطوبةها.
  13. قم بتحميل الفيروس في حقنة الميكرولتر باستخدام لوحة التحكم في المضخة الدقيقة. سحب 500 نانولتر من فقاعة الهواء متبوعا ب 800 نانولتر من الفيروس بمعدل تدفق 50 نانولتر / ثانية.
    ملاحظة: لغرض العرض التوضيحي، هنا، يتم حقن النمط المصلي 1 (AAV1) المرتبط بالفيروس الغدي الذي يعبر عن GCaMP6f (a GECI)، AAV1-CamKII-GCamp6f، في mPFC (انظر جدول المواد). عيار الفيروس هو 2.8 × 1013 GC / mL. هو 1: 2 مخفف في محلول ملحي قبل الحقن.
  14. ضع طرف الإبرة في الجزء العلوي من البريجما لمجرد لمس البريجما ولاحظ الإحداثيات Z الخاصة ب bregma. حرك الإبرة فوق الحفرة المحفورة وحقن 100 نانولتر من الفيروس لضمان عدم انسداد الإبرة.
  15. حرك الإبرة ببطء إلى أسفل في أنسجة المخ إلى إحداثيات Z المستهدفة من D/V: 1.75 مم ثم حركها قليلا إلى إحداثيات Z من D/V: 1.65 مم.
    ملاحظة: هذا هو إنشاء جيب صغير ليتم غرس المحلول الفيروسي. إذا كانت منطقة الدماغ المستهدفة هي NAc ، فيجب أن يكون إحداثي Z المستهدف المقابل ل D / V 4.2 مم ، ثم يتحرك قليلا حتى 4.1 مم.
  16. استخدم لوحة التحكم لضبط المضخة الدقيقة على حقن 500 نانولتر من الفيروس بمعدل تدفق 50 نانولتر / دقيقة. اضغط على زر RUN على لوحة التحكم لحقن الفيروس.
    ملاحظة: سيستغرق الحقن حوالي 10 دقائق. بعد انتهاء الحقن ، انتظر لمدة 5-10 دقائق إضافية قبل إخراج الإبرة من الدماغ. ضع المحلول الملحي بشكل متكرر للحفاظ على رطوبة منطقة الجمجمة المكشوفة خلال فترة الحقن.
  17. حرك الإبرة لأعلى وخارج الدماغ. حقن حجم 500 نانولتر مرتين بمعدل تدفق 50 نانولتر / ثانية.
    ملاحظة: تؤكد هذه الخطوة أنه تم إعطاء حجم مناسب من الفيروس في الدماغ. خلال أول 500 حقن نانولتر ، يتم إطلاق الفيروس ، تليها فقاعات الهواء. خلال حقن 500 nL الثاني ، تظهر فقاعات الهواء أولا ، تليها المياه المالحة. المحقنة جاهزة الآن لتحميل الفيروس للماوس التالي. بمجرد الانتهاء من الجراحة ، يتم تنظيف حقنة الميكرولتر والإبرة جيدا باستخدام الأسيتون متبوعا بمحلول ملحي.
  18. اصطف حواف الجلد وأغلق الشق بعناية باستخدام خياطة (مقاس 4.0). ضع مرهم مضاد حيوي على المنطقة المخيطة لمنع العدوى.
  19. قم بإزالة الماوس من المرحلة المجسمة وأعده إلى قفصه المنزلي. ضع القفص المنزلي في حاضنة 33 درجة مئوية حتى يصبح الماوس متنقلا.
    ملاحظة: عادة ما يستغرق الأمر من 10 إلى 15 دقيقة حتى يستيقظ الفأر من تخدير الأيزوفلوران قبل أن يبدأ في الحركة.
  20. بعد أن يبدأ الفأر في التحرك ، قم بإعطاء الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية لمدة 3 أيام بعد الجراحة (انظر جدول المواد). دع الفأر يتعافى من الجراحة لمدة 14 يوما قبل متابعة زرع عدسة GRIN.

2. زرع عدسة GRIN في mPFC (الشكل 1)

  1. التحضير للجراحة
    1. تحضير السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF) الذي يحتوي على 124 ملليمتر من كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملم من KCl ، 1.25 مللي متر من NaH 2PO 4 ، 1.2 ملليمتر من MgCl 2 ، 25 ملليمتر من الجلوكوز ، 26 ملم من NaHCO3 و2.4 ملليمتر من CaCl2.
    2. تعقيم جميع الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف ووضعها على سطح معقم.
    3. قم بتشغيل وسادة التدفئة والحفاظ على درجة الحرارة عند 35 درجة مئوية.
    4. يذوب 1٪ من الأغاروز ويحفظ في حمام مائي عند 42 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالأغاروز المذاب في الحمام المائي لبضع ساعات.
    5. قم بتطهير عدسة GRIN (قطرها 1 مم ، طولها 4.38 مم ، الشكل 2A) في الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة ، وانقلها إلى أنبوب مملوء بالمحلول الملحي لشطفها بشكل صحيح قبل الزرع.
      ملاحظة: يتم إنتاج عدسات GRIN (انظر جدول المواد) عن طريق تبادل الفضة والليثيوم أيون في نظارات خاصة ، مما يجعلها غير سامة وصديقة للخلايا العصبية 6,7. ومع ذلك ، فإن العديد من عدسات GRIN المتاحة تجاريا قد تتسرب بقايا سامة ، مما يسبب التنكس العصبي ، مما يجعلها غير مناسبة للزرع في الدماغ الحي لدراسات التصوير على المدى الطويل في الجسم الحي. قد تتطلب عدسات GRIN هذه طلاء بعوامل متوافقة بيولوجيا مثل الباريلين-C لمنع الآثار الجانبية السامة على الخلايا العصبية المجاورة22.
  2. وزن الفأر وتخديره عن طريق الحقن داخل الصفاق من خليط الكيتامين / زيلازين (انظر جدول المواد) (الكيتامين: 100 مغ / كغ; زيلازين: 15 مغ/كغ).
    ملاحظة: يتطلب الفأر الذي يزن 30 جم 300 ميكرولتر من خليط الكيتامين / الزيلازين (الكيتامين 100 مجم / مل والزيلازين 1.5 مجم / مل) للجرعة الأولية و 150 ميكرولتر من الكيتامين (10 مجم / مل) لجرعات إضافية أثناء الجراحة. للحفاظ على بقاء الفأر مخدرا خلال العملية الجراحية بأكملها ، يجب إعطاء جرعات إضافية من الكيتامين (50 مجم / كجم) مرة واحدة على الأقل في الساعة. يجب مراقبة مرحلة تخدير الفأر بشكل متكرر من خلال تقييم ردود فعل الدواسة.
  3. احلق الشعر عن المنطقة الجراحية باستخدام ماكينة حلاقة ونظف الشعر باستخدام منشفة ورقية مبللة.
  4. ضع الماوس في المرحلة المجسمة وقم بتأمين موضعه عن طريق تشديد مشبك الأنف وقضبان الأذن. ضع مرهم العين التشحيم على كلتا العينين باستخدام قطعة قطن معقمة. تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق تقييم ردود فعل الدواسة.
  5. قم بتطهير المنطقة الخالية من الشعر بمحلول بوفيدون اليود بنسبة 7.5٪ و 70٪ من الإيثانول ثلاث مرات لكل منهما باستخدام مسحات قطنية معقمة. إدارة 2 مغ / كغ من ديكساميثازون في العضل في الفخذ لتقليل خطر التورم والالتهابات المرتبطة بالجراحة.
  6. حقن 50 ميكرولتر من 2٪ ليدوكائين تحت جلد منطقة الجراحة.
  7. استخدم مقص ناعم لاستئصال منطقة الجلد المثلثة التي يبلغ طولها 1.5 سم (ارتفاع) × 1.0 سم (قاعدة)، من الجانب الأمامي بين العينين إلى الجانب الخلفي خلف لامدا.
  8. قم بإزالة أنسجة السمحاق من الجمجمة باستخدام ملقط ناعم وشفرة صغيرة ومسحات قطنية.
    ملاحظة: يجب تنظيف الجمجمة وتجفيفها جيدا قبل متابعة الخطوة التالية.
  9. تطبيق سيانوكريليت (انظر جدول المواد) على حواف الجلد وإرفاق الجلد بالجمجمة. انتظر لمدة 5 دقائق حتى يجف سيانو أكريلات.
  10. بمساعدة طرف حفر الحفر مقاس 0.5 مم ، قم بمحاذاة البريجما ولامدا في نفس المستوى الأفقي عن طريق ضبط ارتفاع مشبك الأنف.
  11. حدد موقع نتوء مثقاب الأسنان (قطره 1.2 مم) إلى موضع A/P: 1.94 مم، M/L: 0.8 مم من الدريجما. حفر من خلال الجمجمة. قم بإزالة الجافية باستخدام طرف إبرة 30 جم ونظف جميع قطع حطام العظام باستخدام ملقط حاد بزاوية 45 درجة.
    ملاحظة: يمكن أن يمنع حطام العظام هذا خطوة الطموح اللاحقة إذا لم تتم إزالته بالكامل.
  12. قم بتوصيل إبرة حادة مصقولة يدويا بزاوية 27 جم (الشكل 2B) بحامل الإبرة المقترن بذراع روبوتية مائلة بزاوية 10 درجات (الشكل 2C). قم بتوصيل الطرف الآخر من حامل الإبرة بنظام فراغ المنزل.
    ملاحظة: تم تطوير الذراع الروبوتية (انظر جدول المواد) من قبل مجموعة الدكتور لين في NIDA / IRP ويتم التحكم فيها بواسطة برنامج تم تطويره خصيصا ومفتوح الوصول حاليا ، AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. حدد موقع طرف الإبرة لمجرد لمس الدريجما. اضبط إحداثيات Z للبريجما على 0 بالنقر فوق زر Bregma على AutoStereota.
  14. اضبط قيمة Input X على 0.8 ، وقيمة Input Y على 1.94 ، وقيمة Input Z على 1.0 ، ثم انقر فوق الزر Find لتحريك الإبرة إلى الجزء العلوي من الحفرة المحفورة في الجمجمة.
  15. اضبط موضع الإبرة على مركز منطقة أنسجة المخ المكشوفة عبر AutoStereota.
    ملاحظة: لتحريك الإبرة في الاتجاهات الجانبية أو الإنسية، أدخل قيمة الخطوة وانقر فوق الزرين الجانبي أو الإنسي على AutoStereota. وبالمثل ، لتحريك الإبرة في الاتجاهات الأمامية أو الخلفية والظهرية أو البطنية ، انقر فوق الأزرار Rostral أو Caudal والظهرية أو البطنية ، على التوالي.
  16. قم بتشغيل الفراغ وابدأ في شطف منطقة الدماغ المكشوفة باستخدام ACSF من خلال نظام أنابيب يتم التحكم فيه بالجاذبية (انظر جدول المواد) متصل بإبرة 30 G بطرف منحني. يتم فقاعات ACSF باستمرار بخليط غاز من 95٪ O 2 و 5٪ CO 2 ويتم تصفيته من خلال مرشح0.2 ميكرومتر.
    ملاحظة: معدل تدفق ACSF هو ~ 1.5 مل / دقيقة. يتم الاحتفاظ بضغط الإخراج لخليط الغاز عند ~ 3 رطل لكل بوصة مربعة.
  17. شفط أنسجة المخ طبقة تلو الأخرى بمساعدة برنامج AutoStereota (الشكل 3).
    ملاحظة: يتم الانتهاء من شفط أنسجة المخ في 4 جولات بحيث يتم إنشاء جيب عمود (عمق 1.8 مم وقطر 1 مم).
    1. في جلسة "zStep" ، انقر فوق الصفين الأول والثاني وتحقق منهما. قم بتعيين قيم الصف الأول إلى 0.2 و 1. اضبط قيم الصف الثاني على 0.15 و4 (الشكل 3A).
    2. في جلسة "الوضع" ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 1.2 ، واضبط Dims 0.9. تستخدم جميع القيم الأخرى القيم الافتراضية (الشكل 3A).
    3. انقر بالتتابع على أزرار "ضبط" و"الاحتفاظ بالصفر" و"ابدأ" لبدء الطموح.
      ملاحظة: هذههي الجولة 1 من الطموح. تشير قيم الإدخال إلى أن عمق الشفط هو 0.2 مم (من إحداثي Z من 0) خلال الخطوة الأولى مع طبقة واحدة ؛ خلال الخطوة الثانية ، يبلغ عمق الشفط 0.15 مم ، ويتكرر باستمرار لمدة 4 طبقات. دقة الشفط هي 1.2 ، والقطر 0.9 ملم. أثناء الطموح ، يمكن مراقبة الموقع الفوري لطرف الإبرة من خلال لوحة الرسم البياني للمسار. بعد الانتهاء من جولة الشفط هذه ، يتم إنشاء جيب عمود بعمق 0.8 مم وقطر 1 مم. سيعود طرف الإبرة إلى المركز باستخدام إحداثيات Z من 0.
    4. في جلسة "zStep" ، انقر فوق الصفين الأول والثاني وتحقق منهما. قم بتعيين قيم الصف الأول إلى 1 و 1. اضبط قيم الصف الثاني على 0.15 و4 (الشكل 3B).
    5. في جلسة "الوضع"، احتفظ بجميع القيم كما هي في الجولة السابقة (الشكل 3B).
    6. انقر بالتتابع على أزرار "ضبط" و"الاحتفاظ بالصفر" و"ابدأ" لبدء الطموح.
      ملاحظة: هذههي الجولة الثانية من الطموح. تشير قيم الإدخال إلى أن عمق الشفط هو 1 مم (من إحداثي Z من 0) خلال الخطوة الأولى مع طبقة واحدة ؛ خلال الخطوة الثانية ، يبلغ عمق الشفط 0.15 مم ، ويتكرر باستمرار لمدة 4 طبقات. بعد الانتهاء من جولة الشفط هذه ، يتم إنشاء جيب العمود بعمق 1.6 مم وقطر 1 مم.
    7. في جلسة "zStep" ، انقر فوق الصف الأول وتحقق منه فقط. اضبط قيم الصف الأول على 1.8 و1 (الشكل 3C).
    8. في جلسة "الوضع" ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 2.2. وتظل جميع القيم الأخرى كما هي في الجولة السابقة (الشكل 3 جيم).
    9. انقر بالتتابع على أزرار "ضبط" و"الاحتفاظ بالصفر" و"ابدأ" لبدء الطموح.
      ملاحظة: هذه هي الجولة 3من الطموح. تشير قيم الإدخال إلى عمق الشفط هو 1.8 مم (من إحداثي Z من 0) مع طبقة واحدة. قرار الطموح هو 2.2. بعد الانتهاء من جولة الشفط هذه ، يتم إنشاء جيب العمود بعمق 1.8 مم وقطر 1 مم.
    10. في جلسة "zStep" ، انقر فوق الصف الأول وتحقق منه فقط. اضبط قيم الصف الأول على 1.6 و1 (الشكل 3D).
    11. في جلسة "الوضع" ، اضبط حجم الإبرة 27 مقياسا و 2.2 ، واضبط Dims 0.6 (الشكل 3D).
    12. انقر بالتتابع على أزرار "تعيين" و"الاحتفاظ بالصفر" و"ابدأ" لبدء الطموح.
      ملاحظة: هذههي الجولة 4 من الطموح. الغرض من هذه الخطوة هو تنظيف الدم المتراكم في الجيب. النزيف شائع حيث تتمزق الأوعية الدموية الصغيرة أثناء عملية الشفط. لتنظيف الدم تماما ، أوقف ري ACSF لمدة 5 دقائق ثم قم بتشغيل الري مرة أخرى. كررالجولة 4 من الطموح عدة مرات حتى يصبح الجيب خاليا من الدماء. يمكن استخدام هذا البروتوكول لاستهداف أي مناطق دماغية عميقة أخرى. على سبيل المثال ، إذا كانت منطقة الدماغ المستهدفة هي NAc ، فيجب أن يكون إحداثي Z النهائي المقابل ل D / V 4.4 مم.
  18. وقف فراغ والري من ACSF. أحضر الإبرة إلى +2 مم Z-coordinate و 0.5mm الأمامي إلى المركز. ضع عدسة GRIN المعقمة مقاس 1 مم في الجيب.
  19. حافظ على طرف الإبرة على اتصال بعدسة GRIN المكشوفة لضمان استقرار عدسة GRIN بزاوية 10 درجات. اضغط برفق على السطح العلوي لعدسة GRIN باستخدام ورق مناديل ناعمة معقم للتأكد من أن السطح السفلي لعدسة GRIN على اتصال بأنسجة المخ.
  20. ضع Agarose المذاب في الفجوة بين عدسة GRIN وأنسجة المخ بمساعدة ملعقة. بعد أن يشكل Agarose هلام ، قم بإزالة Agarose الزائد باستخدام شفرة صغيرة.
  21. نظف الجمجمة جيدا باستخدام مسحات ملحية وقطنية. اترك الجمجمة لتجف قبل تطبيق أسمنت الأسنان اللاحق (انظر جدول المواد).
  22. أخرج الخلط جيدا من الفريزر -20 درجة مئوية. امزج مسحوق أسمنت الأسنان والسائل الحفاز وطبق طبقة من أسمنت الراتنج اللاصق ذاتي المعالجة على الجمجمة ؛ أولا ، أحط عدسة GRIN ثم قم بتغطية الجمجمة المكشوفة بالكامل.
  23. انتظر لمدة 5 دقائق واتركه يتصلب تماما. قم بإزالة إبرة الشفط بعناية.
  24. في بئر بلاستيكية نظيفة ، امزج مسحوق أسمنت الأسنان والفحم الأسود مع السائل ، وطبق طبقة رقيقة من الخليط فوق الطبقة 1 من أسمنت الأسنان. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح لها بالتصلب.
  25. قم بحماية عدسة GRIN المكشوفة عن طريق تغطيتها بغطاء مخصص مصنوع من أنبوب PCR (الشكل 2D). ضع سيانوكريليت لإرفاق الغطاء بأسمنت الأسنان.
  26. حقن 1 مل من المياه المالحة المسخنة مسبقا تحت الجلد في الفأر تليها 0.1 ملغ / كغ من البوبرينورفين. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي. ضع القفص المنزلي في حاضنة 33 درجة مئوية وراقب الماوس حتى يصبح متنقلا. عادة ما يستغرق الأمر من 20 إلى 40 دقيقة حتى يستيقظ الفأر من التخدير قبل أن يبدأ في الحركة.
  27. إدارة الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية ومراقبة الماوس لمدة 3 أيام على الأقل بعد الجراحة. دع الفأر يتعافى من الجراحة لمدة 30 يوما.

3. لصق حامل منظار صغير (قاعدة) على جمجمة الماوس (الشكل 1)

  1. تخدير الماوس في غرفة الحث مع 5 ٪ من الأيزوفلوران و 1 لتر / دقيقة معدل تدفق الأكسجين حتى ينخفض معدل التنفس إلى 1 التنفس / ثانية.
  2. ضع الماوس في المرحلة المجسمة وقم بتأمين موضعه باستخدام قضبان الأذن ومشابك الأنف. الحفاظ على تدفق مستمر من الايزوفلوران (1.5 ٪) والأكسجين (0.5 لتر / دقيقة).
  3. ضع مرهم العيون على عينيه لإبقائهما رطبتين. قم بتشغيل وسادة التدفئة والحفاظ على درجة الحرارة عند 35 درجة مئوية. تأكد من تخدير الماوس بالكامل عن طريق تقييم ردود فعل الدواسة.
  4. قم بإزالة الغطاء الذي يغطي عدسة GRIN بلطف باستخدام ملقط مدبب. قم بحفر بقايا سيانواكريليت المجففة من أسمنت الأسنان بالكامل باستخدام microdrill (انظر جدول المواد).
  5. قص الشعر حول منطقة أسمنت الأسنان بمقص صغير. نظف الحطام بمساعدة منفضة الهواء المضغوط. استخدم قطعة قطن مغموسة بالأسيتون لتنظيف السطح العلوي لعدسة GRIN.
  6. قم بإعداد المنظار المصغر مع حامله (القاعدة).
    1. ضع صمولة سداسية السداسي #00-90 (انظر جدول المواد) في الفتحة الموجودة في القاعدة وقم بتطبيق سيانواكريليت لتأمينها هناك (الشكل 2E).
    2. ضع شريطا متعدد الفلورو إيثيلين (PTFE) بإحكام حول خيط المنظار الصغير وقم بقص الشريط الإضافي (الشكل 2F).
    3. اربط المنظار المصغر بالقاعدة واستخدم برغي القفل لتأمين المنظار المصغر بالقاعدة (الشكل 2G).
    4. قم بتوصيل المنظار المصغر بكبله وقم بتشغيل برنامج NeuView المطور خصيصا والمفتوح الوصول حاليا (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: تم تطوير برنامج NeuView خصيصا لتصوير الكالسيوم المصغر في الجسم الحي من مجموعة الدكتور لين في NIDA / IRP 7,12. إنه وصول مفتوح (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. في NeuView، انقر فوق الأجهزة، وتحقق من LED1، وانقر فوق الزر بث لعرض الصور الحية (الشكل 4A). لإيقاف البث المباشر، انقر على الزر إيقاف .
    6. قم بتسوية المنظار المصغر في ذراع تثبيت منظار صغير مصمم خصيصا (الشكل 2H) يمكن التعامل مع موضع XYZ باستخدام وحدات تحكم آلية (الشكل 2I).
  7. حدد موقع المنظار الصغير فوق عدسة GRIN المكشوفة مباشرة واجعله موازيا لسطح العدسة. قم بإسقاط المنظار الصغير ببطء نحو عدسة GRIN واضبط موضع Z حتى يتم العثور على أفضل مستوى للتركيز البؤري.
    ملاحظة: يتم تحديد أفضل مستوى بؤري من خلال مقارنة العديد من مواضع Z المحتملة واختيار المستوى البؤري مع تصور واضح لمعظم أجسام الخلايا.
  8. ضع الطبقة الأولى من أسمنت الأسنان حول قاعدة المنظار الصغير بعناية دون تغيير موضع المنظار الصغير. بعد تصلب الأسمنت ، قم بإزالة ذراع الإمساك برفق بحيث يمكن للمنظار الصغير الوقوف بمفرده على رأس الماوس.
    ملاحظة: يميل أسمنت الأسنان إلى الانكماش بعد التصلب ، وسوف يسحب المنظار المصغر بعيدا عن مستوى التركيز الأصلي. عادة ما يتم رفع موضع المنظار المصغر Z قليلا فوق المستوى البؤري الأصلي قبل تطبيق أسمنت الأسنان للتعويض عن التغيير المحتمل.
  9. ضع طبقة ثانية من أسمنت الأسنان حول القاعدة لملء جميع الفجوات والتأكد من عدم وجود تسرب لضوء LED من الفجوات. دع أسمنت الأسنان يصلب.
  10. قم بإزالة الماوس من المرحلة المجسمة. قم بفك برغي القفل وافصل المنظار المصغر عن القاعدة. ضع غطاء واقيا مطبوعا ثلاثي الأبعاد في القاعدة لحماية عدسة GRIN المكشوفة وشد برغي القفل في القاعدة (الشكل 2J).
  11. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي.
    ملاحظة: عادة ما يستغرق الأمر من 10 إلى 15 دقيقة حتى يستيقظ الفأر من تخدير الأيزوفلوران قبل أن يبدأ في الحركة.

4. تركيب المنظار المصغر والتصوير في الجسم الحي Ca2+ (الشكل 1)

  1. قم بتركيب المنظار المصغر على قاعدته
    1. تخدير الماوس لفترة وجيزة في غرفة الحث (5 ٪ isoflurane و 1 لتر / دقيقة معدل تدفق الأكسجين). ضع الماوس على سطح مقعد نظيف.
    2. قم بفك برغي القفل باستخدام مفك براغي صغير ، وقم بإزالة الغطاء الواقي وتنظيف سطح عدسة GRIN باستخدام قطعة قطن منقوعة بالأسيتون.
    3. لف شريط PTFE بإحكام حول خيط المنظار المصغر واربط المنظار المصغر بقاعدته على رأس الماوس.
    4. قم بتوصيل المنظار المصغر بالكابل (الشكل 2K) ، وقم بتشغيل برنامج NeuView.
    5. في NeuView، انقر فوق الأجهزة، وتحقق من LED1، وانقر فوق الزر بث لعرض الصور الحية (الشكل 4A).
    6. حدد أفضل مستوى بؤري عن طريق ضبط موضع المنظار المصغر بالنسبة للقاعدة ، إما بإحكام أو تخفيف طفيف بمساعدة ملقط حاد.
      ملاحظة: يتم تحديد أفضل مستوى بؤري من خلال مقارنة عدة مواقع محتملة واختيار الموقع الذي يحتوي على تصور واضح لمعظم أجسام الخلايا.
    7. شد برغي القفل وضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي.
    8. في NeuView ، اضبط طاقة ضوء LED إلى المستوى الأمثل. انقر فوق التقاط ثم أزرار التشغيل لبدء التسجيل واضغط على إيقاف بعد 150 إطارا.
      ملاحظة: تحدد أقل طاقة ممكنة المستوى الأمثل لطاقة LED للحصول على صورة ساطعة بما فيه الكفاية. الغرض من تسجيل فيديو قصير هو تسهيل تحديد نفس المستوى البؤري في المستقبل للتصوير المتكرر.
    9. افصل الكبل عن المنظار الصغير. دع الماوس يتعافى لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل بدء التجربة.
      ملاحظة: لحماية المنظار الصغير، عادة ما تتم إزالة زجاجة المياه ووحدة تغذية الطعام السلكية خلال هذه الفترة القصيرة من الزمن. إذا كان الفأر بحاجة إلى البقاء في قفصه المنزلي لفترة أطول ، فمن المستحسن توفير هلام النظام الغذائي المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في القفص المنزلي.
  2. الحصول على البيانات لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي
    ملاحظة: يمكن إجراء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في وقت واحد جنبا إلى جنب مع أي اختبارات سلوكية يرغب فيها الباحث. لغرض العرض التوضيحي ، المثال هنا هو التصوير في الجسم الحي Ca2 + أثناء اختبار المجال المفتوح. لتحقيق هذا الهدف ، يلزم وجود جهازي كمبيوتر. تم تجهيز أحد أجهزة الكمبيوتر ببرنامج تجاري (انظر جدول المواد) للتحكم في الكاميرا لتسجيل سلوك الماوس تلقائيا. تم تجهيز الكمبيوتر الآخر ب NeuView للتحكم في المنظار المصغر وتسجيل صور Ca2 +.
    1. قم بتشغيل برنامج كاميرا السلوك (راجع جدول المواد) لعرض ساحة سلوك الماوس من خلال وظيفة البث المباشر. اضبط تركيز الكاميرا العلوية يدويا (الشكل 2L).
    2. حدد الزناد / ستروب وتحقق من "تمكين / تعطيل الزناد" (الشكل 4B). انقر فوق الزر تسجيل ، واستخدم استعراض لتحديد الموقع الذي سيتم فيه حفظ تسجيلات السلوك ، وحدد تنسيق الصورة المطلوب.
      ملاحظة: يتم تمكين وظيفة "التحكم في الزناد" للسماح بتشغيل تسجيل السلوك بواسطة برنامج NeuView بحيث يتم إقران إطارات السلوك وإطارات تصوير الكالسيوم المقابلة مؤقتا معا. يمكن حفظ تسجيل السلوك بأي تنسيق مطلوب. يتم حفظ تسجيل السلوك بشكل عام بتنسيق JPEG في المجلد المعين.
    3. اجعل الماوس قريبا من الساحة وقم بتوصيل المنظار المصغر بالكابل المرتبط بنظام الحصول على البيانات (الشكل 2L) (انظر جدول المواد). ثم يتم وضع الماوس في وسط الساحة.
    4. باستخدام وظيفة البث المباشر لبرنامج NeuView ، اضبط طاقة LED لتحسين سطوع صورة الكالسيوم.
      ملاحظة: بالنسبة لتصوير الكالسيوم، يكون معدل إطارات التسجيل 10 إطارات/ثانية بشكل افتراضي.
    5. في NeuView ، قم بإلغاء تحديد LED1 ، وانقر فوق التقاط ثم أزرار التشغيل لبدء التسجيل ، واضغط على إيقاف بعد 100 إطار.
      ملاحظة: هذا لتسجيل صور الخلفية لحوالي 100 إطار مع إيقاف تشغيل ضوء LED.
    6. في برنامج كاميرا السلوك، انقر فوق بدء التسجيل (الشكل 4C). في NeuView ، تحقق من LED1 ، وانقر فوق التقاط ، ثم أزرار التشغيل لبدء التسجيل. اضغط على إيقاف بعد 3000 إطار.
      ملاحظة: هذا هو تسجيل تصوير الكالسيوم والسلوك في وقت واحد. يبلغ طول الاختبار الميداني المفتوح 15 دقيقة ، وعادة ما يتم تقسيمه إلى ثلاث جلسات تسجيل مدة كل منها 5 دقائق. هذا لمنع المصغر من ارتفاع درجة الحرارة بسبب الاستخدام المستمر.
    7. احفظ كل من تصوير الكالسيوم وتسجيلات السلوك في المجلدات المعينة. كرر التسجيل لجلستين أخريين أثناء تسجيل الخلفية قبل كل جلسة واحفظ جميع التسجيلات في المجلد المعين.
  3. فصل المنظار المصغر عن قاعدته.
    1. بعد اكتمال التسجيل ، افصل الكبل عن المنظار الصغير.
    2. تخدير الماوس لفترة وجيزة في غرفة الحث (5 ٪ isoflurane و 1L / min من معدل تدفق الأكسجين). ضع الماوس على سطح نظيف ودافئ.
  4. قم بفك برغي القفل في القاعدة وافصل المنظار المصغر عن القاعدة. أعد الغطاء الواقي فوق القاعدة وشد برغي القفل. ضع الماوس مرة أخرى في قفصه المنزلي.

Representative Results

يوضح الشكل 1 الإجراء التجريبي التخطيطي ، بما في ذلك الحقن الفيروسي ، وزرع عدسة GRIN ، وتثبيت قاعدة المنظار المصغر على جمجمة الفأر ، وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي عبر منظار مصغر. الإجراء بأكمله يستغرق ~ 2 أشهر. ويبين الشكل 2 المكونات الرئيسية الموصوفة في بروتوكول تصوير الكالسيوم بالمنظار المصغر في الجسم الحي. يعرض الشكل 3 واجهات برنامج AutoStereota أثناء زرع عدسة GRIN. يعرض الشكل 4 واجهات NeuView وبرنامج تسجيل السلوك أثناء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي.

تعتمد نتائج تصوير الكالسيوم في الجسم الحي على نجاح كل من الحقن الفيروسي وجراحات زرع عدسة GRIN. يوضح الشكل 5 مجموعة من النتائج (أي غير الناجحة ودون المستوى الأمثل والجيدة) من تسجيلات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي . في الحالات غير الناجحة ، يمكن أن تظهر صورة الكالسيوم إما مظلمة أو مشرقة ولكنها عادة لا تكشف عن أي خلايا عصبية نشطة أو قليلة جدا. نحن عادة لا نتابع تجارب تسجيل الكالسيوم في الجسم الحي إذا كان هناك أقل من خمس خلايا عصبية نشطة. عادة ما يكشف تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي عن عدة مئات من الخلايا العصبية النشطة. إذا كان التسجيل يحتوي على أقل من مائة خلية عصبية نشطة ، فإننا نعتبره تسجيلا دون المستوى الأمثل.

في كل من التسجيلات دون المستوى الأمثل والجيدة في الجسم الحي ، تمت متابعة تجارب تصوير الكالسيوم ، وتم إجراء تحليل البيانات اللاحق. يظهر الفيلم 1 ممثلا في الجسم الحي يسجل تصوير الكالسيوم من الماوس mPFC. عادة ما تتم معالجة مقاطع فيديو السلوك وبيانات تصوير الكالسيوم بشكل منفصل. يمكن تسجيل مقاطع فيديو سلوك الماوس يدويا. تتم معالجة ملفات تصوير الكالسيوم باستخدام صندوق أدوات معالجة صور الكالسيوم CaIman24. يوضح الشكل 6 خريطة خلية تمثيلية والعديد من آثار الكالسيوم من تسجيل جيد لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي .

بعد الانتهاء من تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، فإن الخطوة الأخيرة هي التأكد مما إذا كان الحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN قد حدث في منطقة الدماغ المطلوبة. لهذا الغرض ، تم اختراق الماوس بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يليه 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). تم حصاد دماغ الفأر ، وتثبيته في 4٪ PFA لمدة 12 ساعة ، وتخزينه في PBS عند 4 درجات مئوية. ثم تم تقسيم دماغ الفأر إلى شرائح بسماكة 50 ميكرومتر مع اهتزاز. كانت شرائح الدماغ ملطخة ب DAPI ولوحظت تحت المجهر (غير موصوفة في البروتوكول)12. الشكل 7 عبارة عن شريحة دماغ فأر ~ 1.94 مم أمامية إلى bregma من فأر تجريبي ، توضح المسار الذي زرعت فيه عدسة GRIN. تشير منطقة التألق الأخضر أسفل مسار عدسة GRIN وحوله إلى التعبير عن GCaMP6f في منطقة mPFC.

Figure 1
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على الإجراء التجريبي . (أ) الحقن المجسمة للفيروس في mPFC. (ب) زرع عدسة GRIN في mPFC. (ج) لصق قاعدة منظار مصغرة على جمجمة الماوس. (د) تركيب المنظار المصغر وتصوير الكالسيوم في الجسم الحي . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: المكونات الرئيسية اللازمة لتصوير الكالسيوم في الجسم الحي . (أ) عدسة GRIN بقطر 1 مم وطول 4.38 مم. (ب) إبرة حادة مصقولة يدويا بوزن 27 جم تستخدم لشفط أنسجة المخ. (ج) الذراع الروبوتية المقترنة بحامل الإبرة. (د) غطاء مصنوع خصيصا من أنبوب PCR لحماية عدسة GRIN المكشوفة حتى تثبيت قاعدة miniscope على جمجمة الماوس. (ه) حامل المنظار المصغر (القاعدة) مع صمولة سداسية عشرية. (و) منظار صغير يتم لف جزء الخيط الخاص به بشريط PTFE. (ز) منظار صغير مثبت على قاعدته ببرغي قفل. (ح) ذراع عقد المنظار الصغير. (I) وحدة تحكم بمحرك 3D مصممة خصيصا تستخدم لتسهيل حركة المنظار المصغر في مواقع XYZ. (J) غطاء واقي مثبت على القاعدة لحماية عدسة GRIN المكشوفة بينما لا يعمل الماوس في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي . (K) المنظار المصغر المتصل بالكابل. (ل) نظام الحصول على البيانات للتصوير في الجسم الحي Ca2+ . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: واجهات برنامج AutoStereota أثناء شفط أنسجة المخ طبقة تلو الأخرى. (أ) الواجهة المقابلة للخطوات من 2.17.1 إلى 2.17.3. (ب) الواجهة المقابلة للخطوات 2-17-4 إلى 2-17-6. (جيم) الواجهة المقابلة للخطوات 2-17-7 إلى 2-17-9. (د) الواجهة المقابلة للخطوات 2-17-10 إلى 2-17-12. تسلط المربعات الحمراء الضوء على قيم الإدخال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: واجهات برنامج NeuView وبرنامج تسجيل السلوك أثناء تصوير الكالسيوم في الجسم الحي . (أ) واجهة NeuView. (ب، ج) واجهات برنامج تسجيل السلوك. تسلط المربعات الحمراء الضوء على الأزرار التي تحتاج إلى النقر فوقها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الحد الأقصى لخرائط خلايا التألق الإسقاطية لإظهار نطاق النتائج المحتملة . (أ ، ب) غير ناجح في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي غير المقبول لتحليل البيانات اللاحقة. (أ) مظلم ويحتوي على أقل من 5 خلايا عصبية نشطة. (B) مشرق ولكن ليس لديه خلايا عصبية نشطة. (ج) خريطة الخلية من تصوير الكالسيوم دون المستوى الأمثل في الجسم الحي الذي يحتوي على بعض الخلايا العصبية النشطة. (د) خريطة الخلية من تصوير الكالسيوم الجيد في الجسم الحي الذي يتضمن عدة مئات من الخلايا العصبية النشطة. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: خريطة الخلية التمثيلية وانتقالات الكالسيوم من تصوير الكالسيوم الناجح في الجسم الحي . اللوحة اليسرى هي الحد الأقصى لخريطة خلية التألق الإسقاط من تسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في mPFC أثناء اختبار ميداني مفتوح. يستمر التسجيل لمدة 5 دقائق. تعرض اللوحة اليمنى انتقالات الكالسيوم من 15 منطقة اهتمام (مطابقة للألوان). شريط المقياس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: تقييم ما بعد الوفاة لفأر تجريبي. تقييم ما بعد الوفاة لتعبير GCaMP6f وزرع عدسة GRIN في mPFC لفأر تجريبي. تشير المساحة المستطيلة إلى مسار زرع عدسة GRIN. تؤكد المنطقة الخضراء تحت المنطقة المزروعة بعدسة GRIN أنه تم التعبير عن GCaMP6f ، وتم زرع عدسة GRIN بدقة في منطقة الدماغ المطلوبة. Cg ، القشرة الحزامية. PrL ، القشرة المخية قبل الحوض. IL ، القشرة تحت الحليمية. شريط المقياس: 400 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مقارنات بين نظام المنظار المصغر المصمم خصيصا في الوكالة الوطنية للتنمية الدولية وأنظمة المنظار المصغر الأخرى 7،8،9،10،11،13،25،26. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الفيلم 1: تسجيل تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس mPFC أثناء اختبار ميداني مفتوح. لأغراض العرض التوضيحي ، يعرض هذا الفيديو تسجيل 1 دقيقة فقط. معدل إطارات التسجيل الأصلي هو 10 إطارات / ثانية. الفيديو أسرع 6 مرات من التسجيل الأصلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الفيلم.

Discussion

السؤال المركزي في علم الأعصاب هو فهم كيفية تشفير الديناميكيات والدوائر العصبية للمعلومات وتخزينها ، وكيف يتم تغييرها في أمراض الدماغ. باستخدام منظار مصغر في الجسم الحي Ca2+ نظام التصوير ، يمكن مراقبة النشاط العصبي الفردي من عدة مئات من الخلايا العصبية داخل الدائرة الدقيقة المحلية في وقت واحد من يتصرف بحرية. هنا ، يتم وصف بروتوكول جراحي مفصل للحقن الفيروسي وزرع عدسة GRIN لإعداد القوارض لتصوير دماغ عميق في الجسم الحي Ca2+ عبر نظام تسجيل مصغر تم تطويره خصيصا. يوضح الجدول 1 مقارنات نظام miniscope الخاص بنا مع أنظمة miniscope الأخرى المتاحة تجاريا والمصممة خصيصا 7,8,9,10,11,13,25,26. تجدر الإشارة إلى أن زرع عدسة GRIN باستخدام البروتوكول الجراحي الحالي متوافق مع أي أنظمة تصوير تجارية أو مصممة خصيصا بفوتون واحد وفوتون اثنين لدماغ عميق في الجسم الحي تصوير الكالسيوم.

من الحقن الفيروسي إلى الحصول على البيانات من miniscope في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، يستغرق الإجراء التجريبي بأكمله ما لا يقل عن 2 أشهر لإكماله. إنها عملية معقدة وكثيفة العمالة. يعتمد النجاح النهائي للتجربة على عوامل متعددة ، بما في ذلك الاختيار السليم ل GECIs ، وحقن الفيروس بدقة في منطقة الدماغ المستهدفة ، والتعبير الفيروسي الكافي في السكان العصبيين المطلوبين ، وزرع عدسة GRIN بدقة في الموقع المطلوب ، والشفاء الكافي من العمليات الجراحية ، وكذلك ، ما إذا كان الالتهاب الحاد يحدث بعد الجراحة ، وما إذا كان سلوك الحيوان يتأثر بشدة بالعمليات الجراحية ، وهلم جرا.

وتشمل خطوتان حاسمتان الحقن المجسمة للفيروس وزرع عدسة GRIN. لغرض العرض التوضيحي ، تم إجراء الحقن المجهري المجسمة في الماوس mPFC ، مع تشفير الفيروس المرتبط بالغدي (AAV1) GCaMP6f تحت سيطرة مروج CaMKII الذي يقوم بتسمية الخلايا العصبية الهرمية بشكل انتقائي في mPFC. تم اختيار GCaMP6f لأنه واحد من أسرع مؤشرات الكالسيوم وأكثرها حساسية مع وقت نصف اضمحلال يبلغ 71 مللي ثانية15. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعبير الفيروسي AAV ل GCaMP6f طويل الأمد (أي عدة أشهر) ، مما يجعله مثاليا لأداء التصوير المتكرر في الجسم الحي Ca2 + على مدى فترة طويلة للدراسات الطولية في نماذج الفئران للأمراض العصبية التنكسية27. يمكن تكييف بروتوكول الجراحة الحالي لاستهداف مجموعات الخلايا المختلفة في أي منطقة دماغية أخرى. تسمح العديد من الأدوات الفيروسية المتاحة بوضع علامات انتقائية على مجموعات عصبية محددة في منطقة الدماغ المطلوبة في العمر المطلوب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين الاستفادة من نظام إعادة تركيب Cre-LoxP والعديد من نماذج الفئران المعدلة وراثيا المتاحة لإجراء تعديلات وراثية ودراسة نتائج الدوائر السلوكية والعصبية28,29.

إحدى السمات الفريدة للبروتوكول المقدم هي أن الشفط الآلي لأنسجة المخ طبقة تلو الأخرى تم إجراؤه قبل زرع عدسة GRIN (قطرها 1 مم). ويتحقق ذلك من خلال إبرة 27 G متصلة بنظام فراغ ، يتم التحكم فيها بواسطة ذراع روبوتية مصممة خصيصا وبرنامج23. استنادا إلى تجربتنا ، تولد هذه الطريقة سطحا موحدا لعدسة GRIN للاتصال بها وتسبب ضررا أقل للأنسجة المجاورة من شفط الأنسجة اليدوي23. لهذا السبب ، يجلب هذا الإجراء ميزة واضحة لعدسات GRIN ذات القطر الأوسع نسبيا (على سبيل المثال ، 1 مم). ومع ذلك، قد لا يكون شفط الأنسجة ضروريا لزرع عدسة GRIN بقطر أصغر (0.5 مم أو 0.25 مم). بدلا من ذلك ، يمكن زراعته مباشرة على طول المسار الرائد المصنوع بإبرة 30 G21.

إلى جانب الخطوتين الحاسمتين اللتين تمت مناقشتهما أعلاه ، يجب النظر بعناية في العديد من العوامل الأخرى من أجل نجاح العملية. (1) يجب تعقيم جميع الأدوات التي تتصل بالدماغ لمنع العدوى. (2) يجب إجراء جميع خطوات الجراحة لتقليل الضرر الذي يلحق بالدماغ لمنع المزيد من الالتهاب وتكوين الأنسجة الندبية المفرطة. (3) يجب النظر بعناية في جرعات التخدير التي تعطى في البداية ويتم الحفاظ عليها أثناء الجراحة ، وخاصة تلك التي تدار داخل الصفاق. يمكن تعديل جرعات التخدير وفقا لسلالات الفئران المختلفة ، حيث قد يكون بعضها أكثر عرضة للإصابة. (4) يجب مراقبة حالة الفأر باستمرار أثناء الجراحة. أخيرا ، (5) تحتاج الفئران إلى المراقبة بانتظام بعد الجراحة ، حيث قد تحدث العديد من المضاعفات بعد الجراحة.

على الرغم من إزالة جزء من أنسجة المخ من جانب واحد خلال خطوة زرع عدسة GRIN ، إلا أننا لم نلاحظ أي عجز سلوكي واضح 7,12. يبلغ وزن المنظار الصغير حوالي 2 جرام ، وقد تم تصميم الكابل خصيصا لجعله خفيفا ولضمان قدرة الماوس على حمله بسهولة. يتم توصيل المنظار الصغير والكابل فقط بالحيوان قبل التصوير في الجسم الحي وفصلهما بعد التصوير. عادة ما لا تستغرق عملية التصوير بأكملها أكثر من 30 دقيقة. لذلك ، لا تمنع هذه الأجهزة الماوس من التصرف بحرية. تحتاج خطوات التثبيت وإزالة المنظار المصغر إلى تخدير قصير (أقل من 2 دقيقة) مع الأيزوفلوران لغرض تقييد الحيوان. عادة ما نسمح للفأر بالتعافي من التعرض القصير للأيسوفلوران لمدة 30 دقيقة قبل إجراء التصوير في الجسم الحي. لقد أجرينا تصوير الكالسيوم المصغر في الجسم الحي مرة واحدة في الأسبوع لبضعة أسابيع دون ملاحظة أي تأثير على صحة الفئران والسلوك الاجتماعي للفأر12.

أحد القيود الرئيسية لنظام تسجيل المنظار المصغر الحالي هو الحاجة إلى توصيل المجهر بكبل للحصول على البيانات. يؤدي وجود الكابل في بعض الأحيان إلى تقييد أداء مهمة الماوس ويحد من تسجيل واحد في كل مرة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير منظار لاسلكي مصغر25,26. سيؤدي ذلك إلى توسيع أداء المهمة والسماح بالتصوير المتزامن في الجسم الحي من متعددة في مجموعة. علاوة على ذلك ، فإن تطوير GECIs أكثر حساسية مع أطوال موجية قابلة للفصل الطيفي جنبا إلى جنب مع منظار مصغر مزدوج اللون سيوفر إمكانيات أكثر إثارة لأبحاث علم الأعصاب.

Disclosures

لا يفيد المؤلفون بأي مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من المعهد الوطني للصحة (NIH) 5P20GM121310 و R61NS115161 و UG3NS115608.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs KF technology 8000037800 For craniotomy
27-G and 30-G needle BD PrecisionGlide Needle REF 305109 and REF305106 For both surgeries
45 angled forceps Fine Science tools 11251-35 For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) Purdue Products L.P. NDC 67618-151-17 Surface disinfectant
Acetone Sigma-Aldrich 179124-1L GRIN lens cleaner
Agarose Sigma-Aldrich A9539-25G For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment HeliDerm Technology 81073087 For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) Johnson & Johnson Consumer Inc 30043308 Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota NIDA/IRP github.com/liang-bo/autostereota For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) Point Grey Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C For recording behavior
Brass hex nut McMASTER-CARR 92736A112 For GRIN lens implantation
Buprenorphine Par Pharmaceuticals NDC 4202317905 For GRIN lens implantation
Calcium chloride Sigma 10043-52-4 For preparing aCSF
Commutator NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank Rocky Mountain Air Solutions BI-OX-CD5C-K For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank Rocky Mountain Air Solutions OX-M-K For virus injection
Cordless Microdrill KF technology 8000037800 For craniotomy
Cyanoacrylate Henkel Coorporation # 1811182 For GRIN lens implantation
Data acquisition controller NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Data transmission cable NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Dental cement set C&B Metabond and Catalyst A00253revA306 and A00168revB306 For GRIN lens implantation
Dental cement set Duralay 2249D For GRIN lens implantation
Dexamethasone VETone NDC 1398503702 For GRIN lens implantation
Dextrose Sigma 50-99-7 For preparing aCSF
Diet gel Clear H20 72-06-5022 Diet Supplement for mouse
GRIN lens GRINTECH NEM-100-25-10-860-S For GRIN lens implantation
Heating Pad Physitemp Instruments LLC. #10023 To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane VETone V1 502017 Anesthesia
Ketamine VETone V1 501072 For GRIN lens implantation
Lidocaine WEST-WARD NDC 0143-9575-01 Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 7791-18-6 For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton) Hamilton 7653-01 For virus injection
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instrument #178647 For virus injection
Miniscope NIDA/IRP Custom-designed For imaging
Miniscope base Protolabs Custom-designed For mounting the base
Miniscope holding arm NIDA/IRP Custom-designed For mounting the base
Miniscope protection cap Protolabs Custom-designed For protecting the miniscope
Motorized controller Thorlabs KMTS50E For mounting the base
NeuView NIDA/IRP https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 For in vivo imaging
Ophthalmic ointment Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Ophthalmic
PCR tube Thermo Scientific AB-0622 For GRIN lens implantation
Pinch Clamp World Precision Instrument 14040 For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape TegaSeal PTFE Tape A-A-58092 For fastening miniScope to the base
Potassium chloride Sigma 7447-40-7 For preparing aCSF
Robotic arm NIDA/IRP Custom-designed For GRIN lens implantation
Saline Hospira RL 7302 For both surgeries
Set screw DECORAH LLC. 3BT-P9005-00-0025 For screwing the brass hex nut in miniscope base
 Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD McMaster 2124T3 For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate Sigma 144-55-8 For preparing aCSF
Sodium chloride Sigma 7647-14-5 For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic Sigma 7558-80-7 For preparing aCSF
Stereotaxic stage KOPF Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic For both surgeries
Sterile cotton swab Puritan REF 806-WC For both surgeries
Surgical tools Fine Science tools 11251-35 For surgeries
Suture Sofsilk REF SS683 For virus injection
 Syringe filter (0.22 µm) Millex SLGVR33RS For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) Addgene 100834-AAV1 For virus injection
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine VETone V1 510650 For GRIN lens implantation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  5. Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
  6. Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
  7. Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
  8. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  9. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  10. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  11. Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  12. Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
  13. Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  17. Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
  18. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  19. Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
  20. Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
  21. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  22. Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
  23. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  25. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
  26. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  27. Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).
  28. Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
  29. McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 176 ، Miniscope ، تصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، mPFC ، الفأر ، جراحة الدماغ

Erratum

Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

الحقن الفيروسي المجسم، وزرع عدسة مؤشر التدرج لتصوير الكالسيوم العميق للدماغ <em>في الجسم الحي</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li,… More

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (176), e63049, doi:10.3791/63049 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter