Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stereotaxisk viral injektion och gradientindexlinsimplantation för djup hjärna in vivo kalciumavbildning

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63049
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

ERRATUM NOTICE

Summary

Miniscope in vivo kalciumavbildning är en kraftfull teknik för att studera neuronal dynamik och mikrokretsar i fritt uppträdande möss. Detta protokoll beskriver att utföra hjärnoperationer för att uppnå god kalciumavbildning in vivo med hjälp av ett miniskop.

Abstract

Ett miniatyrfluorescensmikroskop (miniskop) är ett potent verktyg för in vivo kalciumavbildning från fritt uppträdande djur. Det erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella kalciumavbildningssystem med flera fotoner: (1) kompakt; (2) lätt vikt, (3) överkomligt; och (4) tillåter inspelning från fritt uppträdande djur. Detta protokoll beskriver hjärnoperationer för djup hjärna in vivo kalciumavbildning med hjälp av ett specialutvecklat miniskopinspelningssystem. Beredningsförfarandet består av tre steg, inklusive (1) stereotaxiskt injicera viruset vid den önskade hjärnregionen i en mushjärna för att märka en specifik undergrupp av neuroner med genetiskt kodad kalciumsensor; (2) implantation av gradientindex (GRIN) lins som kan vidarebefordra kalciumbild från djup hjärnregion till miniskopsystemet; och (3) fästa miniskophållaren över musskallen där miniskop kan fästas senare. För att utföra in vivo kalciumavbildning fästs miniskopet på hållaren och neuronala kalciumbilder samlas in tillsammans med samtidiga beteendeinspelningar. Det nuvarande kirurgiska protokollet är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och tvåfotonavbildningssystem för djup hjärna in vivo kalciumavbildning.

Introduction

Intracellulär Ca2+ signalering är en viktig regulator för celltillväxt, proliferation, differentiering, migration, gentranskription, utsöndring och apoptos1. I neuroner styrs Ca2+ signalering exakt eftersom dess spatio-temporala mönster är relaterat till avgörande funktioner som membran excitabilitet, neurotransmittorfrisättning och synaptisk plasticitet2.

In vivo kalciumavbildning är en kraftfull teknik som kan användas för att avkoda neural kretsrepresentation elementär till normalt djurbeteende, identifiera avvikande neuronala aktiviteter i djurmodeller av hjärnsjukdomar och riva upp potentiella terapeutiska mål som kan normalisera dessa förändrade kretsar. De två vanliga in vivo kalciumavbildningssystemen är tvåfotonlaserskanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 och huvudmonterad miniatyriserad mikroendoskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Den konventionella tvåfotonmikroskopin erbjuder befallande fördelar som bättre upplösning, lägre brus och lägre fotoblekning; Försöksdjuren måste dock vara huvudfastade, vilket begränsar de beteendestudier som kan utföras 3,4,5,6. Däremot är det huvudmonterade miniskopsystemet litet och bärbart, vilket gör det möjligt att studera en mängd olika beteendetester med fritt uppträdande djur 7,8,9,10,11,12,13.

Det finns två ledande Ca2+ indikatorer, kemiska indikatorer 5,14 och genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI)15,16. Ca2+ avbildning har underlättats genom att använda mycket känsliga GECI levererade med virala vektorer som möjliggör specifik märkning av neuroner i den riktade kretsen. Den kontinuerliga ansträngningen att förbättra känsligheten, livslängden och förmågan att märka även de subcellulära facken gör GECI idealiska för olika in vivo kalciumavbildningsstudier 17,18,19.

Spridningen av ljus i hjärnvävnad under avbildning begränsar den optiska penetrationen på djupet, även med tvåfotonmikroskopi. Gradient Index (GRIN) -linsen övervinner dock detta problem eftersom GRIN-linsen kan bäddas in direkt i de biologiska vävnaderna och vidarebefordra bilder från den djupa hjärnregionen till mikroskopmålet. Till skillnad från konventionell lins tillverkad av optiskt homogent material och kräver en komplicerad formad yta för att fokusera och skapa bilder, är GRIN-linsens prestanda baserad på en gradvis brytningsindexförändring i linsmaterialet som uppnår fokus med en plan yta20. GRIN-linsen kan tillverkas ner till 0,2 mm i diameter. Därför kan en miniatyriserad GRIN-lins implanteras i den djupa hjärnan utan att orsaka för mycket skada.

I denna artikel presenteras ett komplett kirurgiskt protokoll för den djupa hjärnan in vivo kalciumavbildning. För demonstrationsändamålet beskriver vi hjärnoperationer som specifikt riktar sig mot mushjärnans mediala prefrontala cortex (mPFC) och in vivo kalciumavbildningsinspelning via ett specialbyggt miniskopsystem som utvecklats av Dr. Lins grupp vid National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Det experimentella förfarandet involverar två stora hjärnoperationer. Den första operationen injicerar stereotaxiskt en viral vektor som uttrycker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den andra operationen är att implantera GRIN-linsen i samma hjärnregion. Efter återhämtning från dessa hjärnoperationer är det efterföljande förfarandet att fästa miniskophållaren (basen) på musskallen med tandcement. In vivo Ca2+ avbildning kan utföras när som helst efter montering av miniskopet på basen. Operationsprotokollet för viral injektion och GRIN-linsimplantation är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och tvåfotonavbildningssystem för den djupa hjärnan in vivo kalciumavbildning.

Protocol

Det experimentella protokollet följer riktlinjerna för djurvård från University of Wyoming. Musen som används i denna studie är 6 månader gammal manlig C57BL / 6J. Förfarandet kan användas för att rikta in sig på alla djupa hjärnregioner för kalciumavbildning in vivo . Här, för demonstration, är det riktade hjärnområdet musen mPFC (främre och bakre (A / P): 1,94 mm, medial och lateral (M / L): 0,5 mm, dorsal och ventral (D / V): 1,8 mm). Detta protokoll är modifierat baserat på det tidigare publicerade protokollet21.

1. Stereotaxisk injektion av virus i mPFC (Figur 1)

  1. Förberedelse för operationen
    1. Sterilisera alla kirurgiska instrument med hjälp av en autoklav och placera dem över en steril yta.
    2. Förbered en 10 μL spruta genom att grunda den med saltlösning och förfylla den med 5 μL saltlösning. Fäst sprutan på en mikropump (se Materialtabell).
    3. Slå på värmedynan och håll temperaturen vid 35 °C.
  2. Placera musen i induktionskammaren (5"x 10" x 4", längd x bredd x höjd) med 5% isofluran och 1 L/min syreflöde. Titta noga på och räkna musens andningsfrekvens. Ta ut musen när andningsfrekvensen minskar till 1 andetag / s.
    OBS: Musens andningsfrekvens kan lätt övervakas genom att titta på nedåt och uppåt av ryggmuskelrörelsen under varje inandning.
  3. Låt musen sätta sig på ett bänkområde separerat från det kirurgiska området. Med en rakklippare, raka håret av från mushuvudet till de första livmoderhalsen.
  4. Sätt musen på stereotaxiska scenen (se Materialtabell) och säkra dess position med öronstänger och näsklämma. Behåll isofluranflödet till stereotaxiskt stadium vid 1,5 % isofluran och 0,5 l/min syreflöde.
  5. Applicera den smörjande oftalmiska ögonsalvan på båda ögonen med en ren bomullspinne för att förhindra torrhet i ögonen under operationen. Bedöm pedalreflexer på musen för att bekräfta att musen är helt sövd innan operationen påbörjas.
  6. Desinficera det hårlösa området med 7,5% povidon-jodlösning (se materialtabell) och 70% etanol tre gånger vardera med sterila bomullspinnar.
  7. Injicera en liten volym (50 μL) av 2% lidokain under huden på det hårlösa området.
  8. Gör ett snitt på 2 cm genom huden längs mittlinjen med en skalpell för att exponera skallens lambda och bregma.
  9. Ta bort fascian från skallen med hjälp av torra bomullspinne och spetsiga pincett.
  10. När bregma och lambda är synliga, använd spetsen på en tandborrburre (0,5 mm i diameter) för att mäta Z-koordinaterna för bregma och lambda (se Materialtabell). Justera näshållarens höjd tills bregma och lambda ligger i samma Z-läge.
  11. Leta reda på 0,5 mm tandborrborr till ett läge av A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm från bregma. Borra genom skallen.
    OBS: Här, för demonstration, är den riktade hjärnregionen musen mPFC. Detta protokoll kan användas för att rikta in sig på någon annan djup hjärnregion. Till exempel, om det riktade hjärnområdet är Nucleus Accumbens (NAc), bör motsvarande position vara A / P: 0,9 mm, M / L: 1,2 mm.
  12. Ta bort dura med en 30 G nålspets och rengör alla bitar av benskräp med 45 ° vinklade vassa pincett.
    OBS: Blödning är vanligt eftersom små blodkärl kan bli spruckna under rengöringssteget. Använd sterila bomullspinne för att stoppa blödningen och applicera saltlösning för att tvätta området. Applicera saltlösning på det exponerade skallområdet för att hålla det fuktigt.
  13. Ladda viruset i mikrolitersprutan med hjälp av mikropumpens kontrollpanel. Dra ut 500 nL luftbubbla följt av 800 nL av viruset vid en flödeshastighet på 50 nL / s.
    OBS: För demonstrationsändamål injiceras här ett adenoassocierat virus serotyp 1 (AAV1) som uttrycker GCaMP6f (en GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, i mPFC (se Materialtabell). Virusets titer är 2,8 x 1013 GC / ml. Det är 1: 2 utspätt i saltlösning före injektion.
  14. Placera nålens spets på toppen av bregma för att bara röra vid bregma och anteckna Z-koordinaten för bregma. Flytta nålen ovanför det borrade hålet och injicera 100 nL av viruset för att säkerställa att nålen inte är igensatt.
  15. Flytta långsamt ner nålen i hjärnvävnaden till den riktade Z-koordinaten för D / V: 1,75 mm och flytta den sedan något upp till Z-koordinaten för D / V: 1,65 mm.
    OBS: Detta för att skapa en liten ficka för den virala lösningen som ska infunderas. Om den riktade hjärnregionen är NAc, bör motsvarande riktade Z-koordinat för D / V vara 4,2 mm och sedan röra sig något upp till 4,1 mm.
  16. Använd kontrollpanelen för att ställa in mikropumpen på att injicera 500 nL av viruset med en flödeshastighet på 50 nL/min. Tryck på RUN-knappen på kontrollpanelen för att injicera viruset.
    OBS: Injektionen tar cirka 10 minuter. När injektionen är över, vänta ytterligare 5-10 minuter innan du tar ut nålen från hjärnan. Applicera ofta saltlösning för att hålla det exponerade skallområdet fuktigt under injektionsperioden.
  17. Flytta nålen upp och ut ur hjärnan. Injicera 500 nL volym två gånger vid flödeshastigheten 50 nL / s.
    OBS: Detta steg bekräftar att en korrekt volym av viruset har administrerats i hjärnan. Under de första 500 nL-injektionerna frigörs viruset, följt av luftbubblor. Under den andra 500 nL-injektionen uppträder luftbubblor först, följt av saltlösning. Sprutan är nu redo att ladda viruset för nästa mus. När operationen är klar rengörs mikrolitersprutan och nålen noggrant med aceton följt av saltlösning.
  18. Rikta upp hudkanterna och stäng försiktigt snittet med en sutur (storlek 4.0). Applicera antibiotikasalva på det sydda området för att förhindra infektion.
  19. Ta bort musen från stereotaxiska scenen och sätt tillbaka den till sin hembur. Placera hemburet i en 33 ° C inkubator tills musen är ambulerande.
    OBS: Det tar vanligtvis 10-15 minuter för en mus att vakna från isoflurananestesi innan den börjar röra sig.
  20. När musen börjar röra sig, administrera icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel i 3 postkirurgiska dagar (se Materialtabell). Låt musen återhämta sig från operationen i 14 dagar innan du fortsätter GRIN-linsimplantationen.

2. GRIN-linsimplantation i mPFC (Figur 1)

  1. Förberedelse för operationen
    1. Förbered den konstgjorda cerebrospinalvätskan (ACSF) innehållande 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mMNaH2PO4, 1,2 mM MgCl 2, 25 mM glukos, 26 mM NaHCO3 och 2,4 mM CaCl2.
    2. Sterilisera alla kirurgiska instrument med hjälp av en autoklav och placera dem över en steril yta.
    3. Slå på värmedynan och håll temperaturen vid 35 °C.
    4. Smält 1% Agarose och förvara den i ett vattenbad vid 42 ° C tills den används.
      OBS: Den smälta agarosen kan förvaras i vattenbadet i ett par timmar.
    5. Desinficera en GRIN-lins (1 mm i diameter, 4,38 mm lång, figur 2A) i 70% etanol i 15 minuter, överför den till ett rör fyllt med saltlösning för att skölja den ordentligt innan du implanterar.
      OBS: GRIN-linser (se Materialtabell) tillverkas via silver- och litiumjonbyte i speciella glasögon, vilket gör dem giftfria och neuronvänliga 6,7. Många kommersiellt tillgängliga GRIN-linser kan dock läcka ut giftiga rester, vilket orsakar neurodegeneration, vilket gör dem olämpliga för implantation i den levande hjärnan för långsiktiga in vivo-avbildningsstudier. Dessa GRIN-linser kan kräva beläggning med biokompatibla medel som parylen-C för att förhindra toxiska biverkningar på närliggande neuroner22.
  2. Väg musen och bedöva den genom en intraperitoneal injektion av ketamin/xylazinblandningen (se materialförteckningen) (ketamin:100 mg/kg; Xylazin: 15 mg/kg).
    OBS: En mus som väger 30 g kräver 300 μL ketamin / xylazinblandning (ketamin 100 mg / ml och xylazin 1,5 mg / ml) för den initiala dosen och 150 μL ketamin (10 mg / ml) för ytterligare doser under operationen. För att hålla musen sövd under hela den kirurgiska processen måste ytterligare doser ketamin (50 mg / kg) administreras minst en gång per timme. Musens anestesistadium måste övervakas ofta genom att bedöma pedalreflexer.
  3. Raka håret från operationsområdet med en rakapparat och rengör håret med en våt pappershandduk.
  4. Placera musen i stereotaxiska scenen och säkra dess position genom att dra åt näsklämman och öronstängerna. Applicera smörjande oftalmisk ögonsalva på båda ögonen med en steril bomullspinne. Bekräfta att musen är helt sövd genom att bedöma pedalreflexer.
  5. Desinficera det hårlösa området med 7,5% povidon-jodlösning och 70% etanol tre gånger vardera med sterila bomullspinne. Administrera 2 mg/kg dexametason intramuskulärt i låret för att minska risken för operationsrelaterad svullnad och inflammation.
  6. Injicera 50 μL 2% lidokain under huden på operationsområdet.
  7. Använd en fin sax för att punktbeskatta ett 1,5 cm (höjd) x 1,0 cm (bas) triangulärt hudområde, från den främre sidan mellan ögonen till den bakre sidan bakom lambdan.
  8. Ta bort periosteumvävnaden från skallen med fina pincett, mikroblad och bomullspinne.
    OBS: Skallen ska rengöras noggrant och torkas innan du fortsätter nästa steg.
  9. Applicera cyanoakrylat (se Materialtabell) på hudens kanter och fäst huden på skallen. Vänta i 5 min tills cyanoakrylaten torkar.
  10. Med hjälp av en 0,5 mm borrspets justerar du bregma och lambda i samma horisontella plan genom att justera näsklämmans höjd.
  11. Placera en tandborrburre (1,2 mm i diameter) till ett läge av A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm från bregma. Borra genom skallen. Ta bort dura med en 30 G nålspets och rengör alla bitar av benskräp med 45 ° vinklade vassa pincett.
    OBS: Detta benskräp kan blockera det efterföljande aspirationssteget om det inte tas bort helt.
  12. Fäst en 27 G manuellt polerad trubbig ändnål (figur 2B) på nålhållaren kopplad till en robotarm lutad med en vinkel på 10° (figur 2C). Anslut den andra änden av nålhållaren till husvakuumsystemet.
    OBS: Robotarmen (se Materialtabell) är utvecklad av Dr. Lins grupp vid NIDA/IRP och styrs av en specialutvecklad, för närvarande öppen åtkomstprogramvara, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Leta reda på nålens spets för att bara röra vid bregma. Ställ in Z-koordinaten för bregma på 0 genom att klicka på Bregma-knappen på AutoStereota.
  14. Ställ in Input X-värde till 0,8, Input Y-värde till 1,94, Input Z-värde till 1,0 och klicka sedan på Find-knappen för att flytta nålen till toppen av det borrade hålet på skallen.
  15. Justera nålens position till mitten av det exponerade hjärnvävnadsområdet via AutoStereota.
    OBS: För att flytta nålen i laterala eller mediala riktningar, ange stegvärdet och klicka på laterala eller mediala knappar på AutoStereota. På samma sätt, för att flytta nålen i främre eller bakre och dorsala eller ventrala riktningar, klicka på Rostral eller Caudal respektive Dorsal eller Ventral knappar.
  16. Slå på vakuumet och börja skölja det exponerade hjärnområdet med ACSF genom ett gravitationsstyrt slangsystem (se Materialtabell) anslutet till en 30 G nål med en böjd spets. ACSF bubblas kontinuerligt med en gasblandning av 95%O2 och 5% CO2 och filtreras genom ett 0,2 μm filter.
    OBS: ACSF-flödeshastigheten är ~ 1,5 ml / min. Gasblandningens utgångstryck hålls vid ~ 3 psi.
  17. Aspirera hjärnvävnad lager för lager med hjälp av AutoStereota-programvaran (Figur 3).
    OBS: Aspiration av hjärnvävnad slutförs i 4 omgångar så att en kolonnficka (1,8 mm djup och 1 mm i diameter) genereras.
    1. I "zStep" -sessionen klickar du på och kontrollerar den första och andra raden. Ange värdena för den första raden till 0,2 och 1. Ange värdena för den andra raden till 0,15 och 4 (figur 3A).
    2. I "Mode" -sessionen ställer du in nålstorlek 27 Gauge och 1.2, ställ in Dims 0.9. Alla andra värden använder standardvärden (figur 3A).
    3. Klicka sekventiellt på knapparna Set, Keep Zero och Start för att starta ambitionen.
      OBS: Detta är denförsta omgången av ambition. Ingångsvärden indikerar att aspirationsdjupet är 0,2 mm (från Z-koordinaten 0) under det första steget med 1 lager; under det andra steget är aspirationsdjupet 0,15 mm, kontinuerligt upprepat i 4 lager. Aspirationsupplösningen är 1,2 och diametern är 0,9 mm. Under aspiration kan den omedelbara placeringen av nålspetsen övervakas genom spårgrafpanelen. Efter att ha slutfört denna aspirationsrunda genereras en kolonnficka med 0,8 mm djup och 1 mm i diameter. Nålspetsen kommer tillbaka till mitten med Z-koordinaten 0.
    4. I "zStep" -sessionen klickar du på och kontrollerar den första och andra raden. Ange värdena för den första raden till 1 och 1. Ange värdena för den andra raden till 0,15 och 4 (figur 3B).
    5. I "Mode" -sessionen, håll alla värden desamma som föregående omgång (Figur 3B).
    6. Klicka sekventiellt på knapparna Set, Keep Zero och Start för att starta ambitionen.
      OBS: Detta är denandra omgången av ambition. Ingångsvärden indikerar att aspirationsdjupet är 1 mm (från Z-koordinaten 0) under det första steget med 1 lager; under det andra steget är aspirationsdjupet 0,15 mm, kontinuerligt upprepat i 4 lager. Efter att ha slutfört denna aspirationsrunda genereras kolonnfickan med 1,6 mm djup och 1 mm i diameter.
    7. I "zStep" -sessionen klickar du bara på och kontrollerar den första raden. Ange värdena för den första raden till 1,8 och 1 (figur 3C).
    8. I "Mode" -sessionen ställer du in nålstorlek 27 Gauge och 2.2. Alla andra värden förblir desamma som för föregående omgång (figur 3C).
    9. Klicka sekventiellt på knapparna Set, Keep Zero och Start för att starta ambitionen.
      OBS: Detta är dentredje omgången av ambition. Ingångsvärden indikerar att aspirationsdjupet är 1,8 mm (från Z-koordinaten 0) med 1 lager. Aspirationsupplösningen är 2.2. Efter att ha slutfört denna aspirationsrunda genereras kolonnfickan med 1,8 mm djup och 1 mm i diameter.
    10. I "zStep" -sessionen klickar du bara på och kontrollerar den första raden. Ställ in värdena för den första raden på 1,6 och 1 (Figur 3D).
    11. I "Mode" -sessionen ställer du in nålstorlek 27 Gauge och 2.2, ställer in Dims 0.6 (Figur 3D).
    12. Klicka sekventiellt på knapparna Set, Keep Zero och Start för att starta ambitionen.
      OBS: Detta är denfjärde omgången av ambition. Syftet med detta steg är att rensa ut blod som ackumuleras i fickan. Blödning är vanligt eftersom små blodkärl spricker under aspirationsprocessen. För att noggrant rengöra blod, stoppa bevattningen av ACSF i 5 minuter och sätt sedan på bevattning igen. Upprepa den 4: e aspirationsrundan flera gånger tills fickan är blodfri. Detta protokoll kan användas för att rikta in sig på andra djupa hjärnregioner. Till exempel, om det riktade hjärnområdet är NAc, bör den slutliga motsvarande Z-koordinaten för D / V vara 4,4 mm.
  18. Stoppa vakuum och bevattning av ACSF. För nålen till +2 mm Z-koordinat och 0,5 mm främre till mitten. Placera det sterila 1 mm GRIN-objektivet i fickan.
  19. Håll nålens spets i kontakt med den exponerade GRIN-linsen för att säkerställa att GRIN-linsen sätts i 10 ° vinkel. Tryck försiktigt på grin-linsens övre yta med sterilt mjukpapper för att säkerställa att GRIN-linsens nedre yta är i kontakt med hjärnvävnaden.
  20. Applicera den smälta Agarose i klyftan mellan GRIN-linsen och hjärnvävnaden med hjälp av en spatel. Efter att Agarose bildar en gel, ta bort överskott av Agaros med ett mikroblad.
  21. Rengör skallen noggrant med saltlösning och bomullspinne. Låt skallen torka före applicering av tandcement (se materialtabell).
  22. Ta ut blandningsbrunnen från -20 °C frys. Blanda tandcementpulver och katalysatorvätska och applicera ett lager av självhärdande självhärdande självhäftande hartscement på skallen; Omge först GRIN-linsen och täck sedan hela den exponerade skallen.
  23. Vänta i 5 min och låt det härda helt. Ta försiktigt bort aspirationsnålen.
  24. Blanda tandcementpulver, svart kol med vätska i en ren plastbrunn och applicera ett tunt lager av blandningen ovanpå det första lagret av tandcement. Vänta i 5 min för att låta det härda.
  25. Skydda den exponerade GRIN-linsen genom att täcka den med ett skräddarsytt lock tillverkat av ett PCR-rör (figur 2D). Applicera cyanoakrylat för att fästa locket på tandcementet.
  26. Injicera 1 ml förvärmd saltlösning subkutant i musen följt av 0,1 mg/kg buprenorfin. Placera musen tillbaka i sin hembur. Placera hemburet i en 33 ° C inkubator och övervaka musen tills den är ambulerande. Det tar vanligtvis 20-40 min för en mus att vakna upp från anestesi innan den börjar röra sig.
  27. Administrera icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel och övervaka musen i minst 3 postkirurgiska dagar. Låt musen återhämta sig från operationen i 30 dagar.

3. Anbringande av miniskophållare (bas) på musskallen (figur 1)

  1. Bedöva musen i en induktionskammare med 5% isofluran och 1 L / min syreflöde tills dess andningsfrekvens minskar till 1 andetag / s.
  2. Placera musen i stereotaxiska scenen och säkra dess position med öronstänger och näsklämmor. Upprätthålla ett kontinuerligt flöde av isofluran (1,5 %) och syre (0,5 l/min).
  3. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att hålla dem fuktiga. Slå på värmedynan och håll temperaturen vid 35 °C. Bekräfta att musen är helt sövd genom att bedöma pedalreflexer.
  4. Ta försiktigt bort locket som täcker GRIN-linsen med spetsiga pincett. Borra bort de torkade cyanoakrylatresterna från dentalcementet helt med hjälp av en mikroborr (se Materialtabell).
  5. Klipp håret runt tandcementområdet med en liten sax. Rengör skräpet med hjälp av en tryckluftsdammsdammare. Använd en acetondoppad bomullspinne för att rengöra grin-linsens övre yta.
  6. Förbered miniskopet med dess hållare (bas).
    1. Placera en #00-90 hexmutter (se Materialtabell) i spåret som finns i basen och applicera cyanoakrylat för att säkra den där (Figur 2E).
    2. Applicera en polytetrafluoretylen (PTFE) tejp tätt runt miniskopets gänga och klipp av den extra tejpen (figur 2F).
    3. Fäst miniskopet på basen och använd låsskruven för att fästa miniskopet på basen (figur 2G).
    4. Anslut miniskopet till kabeln och slå på den specialutvecklade, för närvarande öppna åtkomstprogramvaran, NeuView (se Materialtabell).
      OBS: NeuView-programvaran är specialutvecklad för miniskop in vivo kalciumavbildning från Dr. Lins grupp vid NIDA / IRP 7,12. Det är öppen åtkomst (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. I NeuView klickar du på Maskinvara, kontrollerar LED1 och klickar på Stream-knappen för att visa livebilderna (Bild 4A). För att stoppa livestreaming, klicka på Stopp-knappen .
    6. Sätt miniskopet i en specialbyggd miniskophållarm (figur 2H) vars XYZ-position kan manipuleras med hjälp av motoriserade styrenheter (figur 2I).
  7. Leta reda på miniskopet precis ovanför det exponerade GRIN-objektivet och gör det parallellt med linsens yta. Ta långsamt ner miniskopet mot GRIN-objektivet och justera dess Z-position tills det bästa fokusplanet hittas.
    OBS: Det bästa fokalplanet bestäms genom att jämföra flera möjliga Z-positioner och välja fokalplanet med en tydlig visualisering av de flesta cellkroppar.
  8. Applicera det första lagret tandcement runt miniskopbasen försiktigt utan att ändra miniskopets position. När cementet är härdat, ta försiktigt bort hållarmen så att miniskopet kan stå på egen hand på mushuvudet.
    OBS: Tandcementet tenderar att krympa efter härdning, och det kommer att dra ner miniskopet bort från det ursprungliga fokusplanet. Vanligtvis lyfts miniskop Z-positionen något över det ursprungliga fokalplanet innan tandcement appliceras för att kompensera för den potentiella förändringen.
  9. Applicera ett andra lager tandcement runt basen för att fylla alla luckor och se till att det inte finns något LED-ljusläckage från luckorna. Låt tandcementet härda.
  10. Ta bort musen från stereotaxiska scenen. Lossa låsskruven och lossa miniskopet från basen. Sätt ett 3D-printat skyddslock i basen för att skydda det exponerade GRIN-objektivet och dra åt låsskruven i basen (figur 2J).
  11. Placera musen tillbaka i sin hembur.
    OBS: Det tar vanligtvis 10-15 minuter för en mus att vakna från isoflurananestesi innan den börjar röra sig.

4. Miniskopmontering och in vivo Ca2+ avbildning (Figur 1)

  1. Montera miniskopet på basen
    1. Bedöva musen kort i induktionskammaren (5% isofluran och 1 L / min syreflödeshastighet). Placera musen på en ren bänkyta.
    2. Lossa låsskruven med en liten skruvmejsel, ta bort skyddslocket och rengör ytan på GRIN-linsen med en acetonindränkt bomullspinne.
    3. Vik en PTFE-tejp tätt runt miniskopgängan och fäst miniskopet på basen på mushuvudet.
    4. Anslut miniskopet till kabeln (figur 2K), slå på NeuView-programvaran.
    5. I NeuView klickar du på Maskinvara, kontrollerar LED1 och klickar på Stream-knappen för att visa livebilderna (Bild 4A).
    6. Identifiera det bästa fokalplanet genom att justera miniskopets position i förhållande till basen, antingen något åtdragning eller lossning med hjälp av trubbiga pincett.
      OBS: Det bästa fokalplanet bestäms genom att jämföra flera möjliga platser och välja den med en tydlig visualisering av de flesta cellkroppar.
    7. Dra åt låsskruven och placera musen tillbaka i sin hembur.
    8. I NeuView justerar du LED-lampans effekt till optimal nivå. Klicka på Capture och sedan Trigger-knapparna för att starta inspelningen och slå Stopp efter 150 bilder.
      OBS: Den lägsta möjliga effekten bestämmer den optimala nivån på LED-effekten för att uppnå en tillräckligt ljus bild. Syftet med att spela in en kort video är att underlätta identifieringen av samma fokalplan i framtiden för repetitiv bildbehandling.
    9. Koppla bort kabeln från miniskopet. Låt musen återhämta sig i minst 30 minuter innan du startar experimentet.
      OBS: För att skydda miniskopet tas vanligtvis vattenflaskan och trådmatmataren bort under denna korta tidsperiod. Om musen behöver stanna i sin hembur längre, rekommenderas att leverera kommersiellt tillgänglig dietgel (se Materialtabell) i hemburet.
  2. Datainsamling för kalciumavbildning in vivo
    OBS: In vivo kalciumAvbildning kan samtidigt utföras tillsammans med alla beteendetester som forskaren önskar. För demonstrationsändamålet är exemplet här in vivo Ca2+ avbildning under ett öppet fälttest. För att uppnå detta mål krävs två datorer. En dator är utrustad med kommersiell programvara (se Materialtabell) för att styra en kamera för att spela in musbeteende automatiskt. Den andra datorn är utrustad med NeuView för att styra miniskopet och för att spela in Ca2+ bilderna.
    1. Slå på beteendekamerans programvara (se Materialtabell) för att visa musbeteendearenan via en Livestream-funktion. Justera fokus för den övre kameran manuellt (Figur 2L).
    2. Välj Trigger/Strobe och markera "Enable/disable trigger" (Bild 4B). Klick Spela in knapp, använd Bläddra för att välja den plats där beteendeinspelningar ska sparas, välj önskat bildformat.
      OBS: "Trigger Control" -funktionen är aktiverad så att beteenderegistreringen kan utlösas av NeuView-programvaran så att beteenderamarna och motsvarande kalciumavbildningsramar är temporärt kopplade ihop. Beteendeinspelningen kan sparas i önskat format. Beteendeinspelning sparas vanligtvis i JPEG-format i den angivna mappen.
    3. För musen nära arenan och anslut miniskopet till kabeln som är kopplad till datainsamlingssystemet (figur 2L) (se Materialtabell). Musen placeras sedan i mitten av arenan.
    4. Med Livestream-funktionen i NeuView-programvaran justerar du LED-effekten för att optimera ljusstyrkan på kalciumbilden.
      OBS: För kalciumavbildning är inspelningsbildhastigheten 10 bilder / s som standard.
    5. I NeuView avmarkerar du LED1, klickar på Capture och sedan Trigger-knapparna för att starta inspelningen och trycker på Stop efter 100 bilder.
      OBS: Detta för att spela in bakgrundsbilder för cirka 100 bilder med LED-ljus avstänt.
    6. Klicka på Starta inspelning (bild 4C) i beteendekamerans programvara. I NeuView kontrollerar du LED1, klickar på Capture och sedan triggerknappar för att starta inspelningen. Tryck på Stopp efter 3000 bilder.
      OBS: Detta är att registrera kalciumavbildning och beteende samtidigt. Det öppna fälttestet är 15 minuter långt, vanligtvis uppdelat i tre inspelningssessioner vardera på 5 minuter. Detta för att förhindra att miniskopet överhettas på grund av kontinuerlig användning.
    7. Spara både kalciumavbildning och beteendeinspelningar i de angivna mapparna. Upprepa inspelningen i ytterligare två sessioner medan du spelar in bakgrunden före varje session och spara alla inspelningar i den angivna mappen.
  3. Lossa miniskopet från basen.
    1. När inspelningen är klar kopplar du bort kabeln från miniskopet.
    2. Bedöva musen kort i induktionskammaren (5% isofluran och 1L /min syreflödeshastighet). Placera musen på en ren, varm yta.
  4. Skruva loss låsskruven i basen och lossa miniskopet från basen. Sätt tillbaka skyddslocket över basen och dra åt låsskruven. Sätt tillbaka musen i sin hembur.

Representative Results

Figur 1 visar det schematiska experimentella förfarandet, inklusive viral injektion, GRIN-linsimplantation, anbringande av miniskopbasen på musskallen och in vivo kalciumavbildning via ett miniskop. Hela proceduren tar ~ 2 månader. Figur 2 visar de viktigaste komponenterna som beskrivs i protokollet för miniskop in vivo kalciumavbildning. Figur 3 visar gränssnitten för AutoStereota-programvaran under GRIN-linsimplantation. Figur 4 visar gränssnitten för NeuView och programvara för beteenderegistrering under in vivo-kalciumavbildning .

Resultatet av kalciumavbildning in vivo är beroende av framgången för både virusinjektion och GRIN-linsimplantationsoperationer. Figur 5 visar en rad resultat (dvs. misslyckade, suboptimala och bra) från in vivo kalciumavbildningsinspelningar. I misslyckade fall kan kalciumbilden verka antingen mörk eller ljus men avslöjar vanligtvis inga eller mycket få aktiva neuroner. Vi bedriver vanligtvis inte in vivo kalciuminspelningsexperiment om det finns färre än fem aktiva neuroner. En bra in vivo kalciumavbildning avslöjar vanligtvis flera hundra aktiva neuroner. Om en inspelning innehåller mindre än hundra aktiva neuroner anser vi att det är en suboptimal inspelning.

I både suboptimala och bra inspelningar in vivo genomfördes kalciumavbildningsexperiment, och den efterföljande dataanalysen utfördes. Film 1 visar en representativ in vivo kalciumavbildningsinspelning från musen mPFC. Beteendevideor och kalciumavbildningsdata bearbetas vanligtvis separat. Videor med musbeteende kan poängsättas manuellt. Kalciumavbildningsfiler bearbetas med hjälp av CaImAn kalciumbildbehandlingsverktygslåda24. Figur 6 visar en representativ cellkarta och flera kalciumspår från en bra in vivo-kalciumavbildningsinspelning .

Efter avslutad in vivo kalciumavbildning är det sista steget att bekräfta om virusinjektionen och GRIN-linsimplantationen har inträffat i önskad hjärnregion. För detta ändamål perfusionerades musen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% paraformaldehyd (PFA). Mushjärnan skördades, postfixerades i 4% PFA i 12 timmar och lagrades i PBS vid 4 ° C. Mushjärnan sektionerades sedan i 50 μm tjocka skivor med en vibratom. Hjärnskivorna färgades med DAPI och observerades under mikroskopet (beskrivs inte i protokollet)12. Figur 7 är en mushjärnskiva ~ 1,94 mm främre till bregma från en experimentell mus, som visar spåret där GRIN-linsen implanterades. Det gröna fluorescensområdet under och runt GRIN-linsspåret indikerar uttrycket av GCaMP6f i mPFC-regionen.

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över det experimentella förfarandet. (A) Stereotaxisk injektion av virus i mPFC. (B) GRIN-linsimplantation i mPFC. (C) Anbringande av miniskopbas på musskallen. (D) Miniskopmontering och kalciumavbildning in vivo . Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Huvudkomponenter som behövs för kalciumavbildning in vivo . (A) Ett GRIN-objektiv med en diameter på 1 mm och en längd på 4,38 mm. (B) En 27 G manuellt polerad trubbig nål som används för hjärnvävnadsaspiration. (C) Robotarmen kopplad till nålhållaren. (D) Ett skräddarsytt lock från ett PCR-rör för att skydda den exponerade GRIN-linsen tills miniskopbasen fästs på musskallen. (E) Miniskophållaren (basen) med en insexmutter. F) Ett miniskop vars gängdel är lindad med PTFE-tejpen. (G) Ett miniskop fäst vid basen med en låsskruv. (H) Miniskopets hållarm. (I) En specialbyggd 3D-motoriserad styrenhet som används för att underlätta miniskopets rörelse i XYZ-positioner. (J) Ett skyddslock fäst på basen för att skydda den exponerade GRIN-linsen medan musen inte utför kalciumavbildning in vivo . (K) Miniskopet som är anslutet till kabeln. (L) Datainsamlingssystemet för in vivo Ca2+ avbildning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Gränssnitt för AutoStereota-programvara under aspiration av hjärnvävnad lager för lager. (A) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.1 till 2.17.3. (B) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.4–2.17.6. (C) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.7–2.17.9. (D) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.10–2.17.12. Röda rutor markerar ingångsvärdena. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Gränssnitt för NeuView-programvaran och beteendeinspelningsprogramvaran under in vivo-kalciumavbildning . (A) Gränssnittet för NeuView. (B,C) Gränssnitten för beteendeinspelningsprogramvaran. Röda rutor markerar knappar som måste klickas. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Maximal projektionsfluorescens cellkartor för att visa intervallet av möjliga resultat. (A,B) Misslyckad in vivo kalciumavbildning som inte är acceptabel för efterföljande dataanalys. (A) är mörk och innehåller mindre än 5 aktiva nervceller. (B) är ljus men har inga aktiva nervceller. (C) Cellkartan från en suboptimal in vivo kalciumavbildning som innehåller några aktiva neuroner. (D) Cellkartan från en bra in vivo kalciumavbildning som innehåller flera hundra aktiva neuroner. Skalstång: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Representativ cellkarta och kalciumtransienter från en framgångsrik in vivo-kalciumavbildning. Den vänstra panelen är den maximala projektionsfluorescenscellkartan från en in vivo-kalciumavbildningsinspelning i mPFC under ett öppet fälttest. Inspelningen varar i 5 minuter. Den högra panelen visar kalciumtransienter från 15 intressanta regioner (färgmatchade). Skalstång: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Postmortembedömning av en experimentell mus. Postmortembedömningen för GCaMP6f-uttryck och GRIN-linsimplantation i mPFC hos en experimentell mus. Det rektangulära området anger vägen för GRIN-linsimplantation. Det gröna området under GRIN-linsen implanterade regionen bekräftar att GCaMP6f uttrycktes och GRIN-linsen implanterades exakt i önskad hjärnregion. Cg, cingulära cortex; PrL, prelimbisk cortex; IL, infralimbisk cortex. Skalstång: 400 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Jämförelser av det specialbyggda miniskopsystemet vid NIDA med andra miniskopsystem 7,8,9,10,11,13,25,26. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Film 1: En in vivo kalciumavbildningsinspelning från musen mPFC under ett öppet fälttest. För demonstrationsändamål visar den här videon endast 1 min inspelning. Den ursprungliga inspelningsbildhastigheten är 10 bilder / s. Videon är 6 gånger snabbare än originalinspelningen. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Discussion

En central fråga inom neurovetenskapen är att förstå hur neural dynamik och kretsar kodar och lagrar information, och hur de förändras vid hjärnsjukdomar. Med hjälp av ett miniskop in vivo Ca2+ bildsystem kan individuell neural aktivitet från flera hundra neuroner inom en lokal mikrokrets övervakas samtidigt från ett fritt uppträdande djur. Här beskrivs ett detaljerat kirurgiskt protokoll för viral injektion och GRIN-linsimplantation för att förbereda gnagare för en djup hjärna in vivo Ca2+ -avbildning via ett specialutvecklat miniskopinspelningssystem. Tabell 1 visar jämförelserna av vårt miniskopsystem med andra kommersiellt tillgängliga och specialbyggda miniskopsystem 7,8,9,10,11,13,25,26. Det är värt att notera att GRIN-linsimplantation med det nuvarande kirurgiska protokollet är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och tvåfotonavbildningssystem för en djup hjärna in vivo kalciumavbildning.

Från viral injektion till datainsamling av miniskop in vivo kalciumavbildning, hela experimentella proceduren tar minst 2 månader att slutföra. Det är en komplicerad och arbetsintensiv process. Experimentets slutliga framgång beror på flera faktorer, inklusive korrekt val av GECI, injektion av virus exakt i det riktade hjärnområdet, tillräckligt viralt uttryck i den önskade neurala befolkningen, implantation av GRIN-lins exakt på önskad plats, adekvat återhämtning från operationer, samt om allvarlig inflammation uppstår efter operationen och om djurets beteende påverkas allvarligt av operationer, och så vidare.

Två kritiska steg inkluderar stereotaxisk injektion av virus och GRIN-linsimplantation. För demonstrationsändamålet utfördes stereotaxisk mikroinjektion i musen mPFC, med adenoassocierat virus (AAV1) som kodar för GCaMP6f under kontroll av CaMKII-promotorn som selektivt märker pyramidala neuroner i mPFC. GCaMP6f valdes eftersom det är en av de snabbaste och mest känsliga kalciumindikatorerna med en halv sönderfallstid på 71 ms15. Dessutom är AAV-viralt uttryck av GCaMP6f långvarigt (dvs. flera månader), vilket gör det idealiskt för att utföra repetitiv in vivo Ca2+ avbildning under en lång period för longitudinella studier i musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar27. Det nuvarande operationsprotokollet kan anpassas för att rikta in sig på olika cellpopulationer i någon annan hjärnregion. Olika tillgängliga virala verktyg möjliggör selektiv märkning av specifika neurala populationer i önskad hjärnregion vid önskad ålder. Dessutom kan forskare dra nytta av Cre-LoxP-rekombinationssystemet och olika tillgängliga transgena musmodeller för att utföra genetiska modifieringar och studera beteendemässiga och neurala kretsar resultat28,29.

En unik egenskap hos det presenterade protokollet är att den automatiserade skikt-för-lager-hjärnvävnadsaspirationen utfördes före GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantation. Detta uppnås genom en 27 G nål ansluten till ett vakuumsystem, styrd av en specialbyggd robotarm och programvara23. Baserat på vår erfarenhet genererar denna metod en enhetlig yta för GRIN-linsen att kontakta och orsakar mindre skada på den närliggande vävnaden än manuell vävnadsaspiration23. Av denna anledning ger denna procedur en uppenbar fördel för GRIN-linser med en relativt större diameter (t.ex. 1 mm). Vävnadsaspiration kanske dock inte är nödvändig för att implantera en GRIN-lins med en mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). Istället kan den planteras direkt längs det ledande spåret med en 30 G nål21.

Förutom de två kritiska stegen som diskuterats ovan måste många andra faktorer noggrant övervägas för en framgångsrik operation. (1) Alla instrument som kommer i kontakt med hjärnan bör steriliseras för att förhindra infektion. (2) Alla kirurgiska steg måste utföras för att minimera skador på hjärnan för att förhindra ytterligare inflammation och överdriven ärrvävnadsbildning. (3) De anestesidoser som ges initialt och upprätthålls under operationen, särskilt de som administreras intraperitonealt, måste noggrant övervägas. Anestesidoserna kan modifieras enligt olika musstammar, eftersom vissa kan vara mer mottagliga. (4) Musens tillstånd måste övervakas ständigt under operationen. Slutligen, (5) mössen måste övervakas regelbundet efter operationen, eftersom många komplikationer kan uppstå efter operationen.

Även om en bit hjärnvävnad avlägsnas ensidigt under GRIN-linsimplantationssteget, observerade vi inga uppenbara beteendeunderskott 7,12. Miniskopets vikt är cirka 2 gram och kabeln är specialdesignad för att göra den lätt och för att säkerställa att musen enkelt kan bära den. Miniskopet och kabeln fästs endast på djuret före in vivo-avbildning och lossas efter avbildning. Hela avbildningsprocessen tar vanligtvis inte längre än 30 minuter. Därför hindrar dessa instrumentationer inte musen från att bete sig fritt. Miniskopinstallations- och avinstallationsstegen behöver en kort anestesi (mindre än 2 minuter) med isofluran för djurhållning. Vi låter vanligtvis musen återhämta sig från den korta exponeringen av isofluran i 30 minuter innan vi utför in vivo-avbildning. Vi har utfört miniskop in vivo kalciumavbildning en gång i veckan i några veckor utan att märka någon inverkan på musens hälsa och musens sociala beteende12.

En stor begränsning av det nuvarande miniskopinspelningssystemet är behovet av att ansluta mikroskopet till en kabel för datainsamling. Närvaron av kabeln begränsar ibland musens uppgiftsprestanda och begränsar inspelningen av ett djur i taget. Nyligen har ett trådlöst miniskop utvecklats25,26. Detta kommer att bredda uppgiftsprestandan och möjliggöra samtidig in vivo-avbildning från flera djur i en grupp. Dessutom kommer utvecklingen av mer känsliga GECI med spektralt separerbara våglängder i kombination med ett dubbelfärgsminiskop att erbjuda mer spännande möjligheter för neurovetenskaplig forskning.

Disclosures

Författarna rapporterar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av bidrag från National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 och UG3NS115608.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs KF technology 8000037800 For craniotomy
27-G and 30-G needle BD PrecisionGlide Needle REF 305109 and REF305106 For both surgeries
45 angled forceps Fine Science tools 11251-35 For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) Purdue Products L.P. NDC 67618-151-17 Surface disinfectant
Acetone Sigma-Aldrich 179124-1L GRIN lens cleaner
Agarose Sigma-Aldrich A9539-25G For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment HeliDerm Technology 81073087 For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) Johnson & Johnson Consumer Inc 30043308 Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota NIDA/IRP github.com/liang-bo/autostereota For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) Point Grey Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C For recording behavior
Brass hex nut McMASTER-CARR 92736A112 For GRIN lens implantation
Buprenorphine Par Pharmaceuticals NDC 4202317905 For GRIN lens implantation
Calcium chloride Sigma 10043-52-4 For preparing aCSF
Commutator NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank Rocky Mountain Air Solutions BI-OX-CD5C-K For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank Rocky Mountain Air Solutions OX-M-K For virus injection
Cordless Microdrill KF technology 8000037800 For craniotomy
Cyanoacrylate Henkel Coorporation # 1811182 For GRIN lens implantation
Data acquisition controller NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Data transmission cable NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Dental cement set C&B Metabond and Catalyst A00253revA306 and A00168revB306 For GRIN lens implantation
Dental cement set Duralay 2249D For GRIN lens implantation
Dexamethasone VETone NDC 1398503702 For GRIN lens implantation
Dextrose Sigma 50-99-7 For preparing aCSF
Diet gel Clear H20 72-06-5022 Diet Supplement for mouse
GRIN lens GRINTECH NEM-100-25-10-860-S For GRIN lens implantation
Heating Pad Physitemp Instruments LLC. #10023 To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane VETone V1 502017 Anesthesia
Ketamine VETone V1 501072 For GRIN lens implantation
Lidocaine WEST-WARD NDC 0143-9575-01 Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 7791-18-6 For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton) Hamilton 7653-01 For virus injection
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instrument #178647 For virus injection
Miniscope NIDA/IRP Custom-designed For imaging
Miniscope base Protolabs Custom-designed For mounting the base
Miniscope holding arm NIDA/IRP Custom-designed For mounting the base
Miniscope protection cap Protolabs Custom-designed For protecting the miniscope
Motorized controller Thorlabs KMTS50E For mounting the base
NeuView NIDA/IRP https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 For in vivo imaging
Ophthalmic ointment Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Ophthalmic
PCR tube Thermo Scientific AB-0622 For GRIN lens implantation
Pinch Clamp World Precision Instrument 14040 For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape TegaSeal PTFE Tape A-A-58092 For fastening miniScope to the base
Potassium chloride Sigma 7447-40-7 For preparing aCSF
Robotic arm NIDA/IRP Custom-designed For GRIN lens implantation
Saline Hospira RL 7302 For both surgeries
Set screw DECORAH LLC. 3BT-P9005-00-0025 For screwing the brass hex nut in miniscope base
 Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD McMaster 2124T3 For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate Sigma 144-55-8 For preparing aCSF
Sodium chloride Sigma 7647-14-5 For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic Sigma 7558-80-7 For preparing aCSF
Stereotaxic stage KOPF Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic For both surgeries
Sterile cotton swab Puritan REF 806-WC For both surgeries
Surgical tools Fine Science tools 11251-35 For surgeries
Suture Sofsilk REF SS683 For virus injection
 Syringe filter (0.22 µm) Millex SLGVR33RS For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) Addgene 100834-AAV1 For virus injection
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine VETone V1 510650 For GRIN lens implantation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  5. Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
  6. Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
  7. Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
  8. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  9. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  10. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  11. Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  12. Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
  13. Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  17. Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
  18. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  19. Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
  20. Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
  21. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  22. Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
  23. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  25. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
  26. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  27. Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).
  28. Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
  29. McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).

Tags

Neurovetenskap Utgåva 176 Miniskop in vivo kalciumavbildning mPFC mus hjärnkirurgi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

Stereotaxisk viral injektion och gradientindexlinsimplantation för djup hjärna <em>in vivo</em> kalciumavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li,… More

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (176), e63049, doi:10.3791/63049 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter