Neuroscience

स्टीरियोटैक्सिक वायरल इंजेक्शन और वीवो कैल्शियम इमेजिंग में गहरे मस्तिष्क के लिए ग्रेडिएंट-इंडेक्स लेंस आरोपण

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63049

Rashmi Thapa¹, Bo Liang², Rongsong Liu³, Yun Li¹

¹Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, ²School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, ³Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

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Summary

विवो कैल्शियम इमेजिंग में मिनीस्कोप स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहों में न्यूरोनल गतिशीलता और माइक्रोसर्किट का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यह प्रोटोकॉल एक मिनीस्कोप का उपयोग करके विवो कैल्शियम इमेजिंग में अच्छा हासिल करने के लिए मस्तिष्क सर्जरी करने का वर्णन करता है।

Abstract

एक लघु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप (miniscope) स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों से vivo कैल्शियम इमेजिंग में के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यह पारंपरिक मल्टी-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग सिस्टम पर कई फायदे प्रदान करता है: (1) कॉम्पैक्ट; (2) हल्के भारित; (3) सस्ती; और (4) स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों से रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल एक कस्टम-विकसित मिनीस्कोप रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग करके विवो कैल्शियम इमेजिंग में गहरे मस्तिष्क के लिए मस्तिष्क सर्जरी का वर्णन करता है। तैयारी प्रक्रिया में तीन चरण शामिल हैं, जिनमें (1) आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर के साथ न्यूरॉन्स के एक विशिष्ट उपसमूह को लेबल करने के लिए माउस मस्तिष्क के वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में वायरस को इंजेक्ट करना शामिल है; (2) ग्रेडिएंट-इंडेक्स (GRIN) लेंस का आरोपण जो कैल्शियम छवि को गहरे मस्तिष्क क्षेत्र से मिनीस्कोप सिस्टम तक रिले कर सकता है; और (3) माउस खोपड़ी पर मिनीस्कोप धारक चिपकाना जहां मिनिस्कोप को बाद में संलग्न किया जा सकता है। विवो कैल्शियम इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए, मिनीस्कोप को धारक पर बांधा जाता है, और न्यूरोनल कैल्शियम छवियों को एक साथ व्यवहार रिकॉर्डिंग के साथ एकत्र किया जाता है। वर्तमान सर्जरी प्रोटोकॉल विवो कैल्शियम इमेजिंग में गहरे मस्तिष्क के लिए किसी भी वाणिज्यिक या कस्टम-निर्मित एकल-फोटॉन और दो-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत है।

Introduction

इंट्रासेल्युलर सीए^{2 +} सिग्नलिंग सेल विकास, प्रसार, भेदभाव, प्रवासन, जीन प्रतिलेखन, स्राव और एपोप्टोसिस¹ का एक आवश्यक नियामक है। न्यूरॉन्स में, Ca^{2 +} सिग्नलिंग को ठीक से नियंत्रित किया जाता है क्योंकि इसका स्पैटियो-टेम्पोरल पैटर्न झिल्ली उत्तेजना, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी² जैसे महत्वपूर्ण कार्यों से संबंधित है।

विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक शक्तिशाली तकनीक है जिसका उपयोग सामान्य पशु व्यवहारों के लिए मौलिक तंत्रिका सर्किट प्रतिनिधित्व को डीकोड करने के लिए किया जा सकता है, मस्तिष्क विकारों के पशु मॉडल में अनियमित न्यूरोनल गतिविधियों की पहचान करता है, और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को उजागर करता है जो इन परिवर्तित सर्किटरियों को सामान्य कर सकते हैं। विवो कैल्शियम इमेजिंग सिस्टम में दो आम दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ^3,4,5,6 और हेड-माउंटेड लघुकृत माइक्रोएंडोस्कोपी (^{मिनीस्कोप}) 7,8,9,10,11,12,13 हैं . पारंपरिक दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी कमांडिंग फायदे प्रदान करती है जैसे कि बेहतर रिज़ॉल्यूशन, कम शोर, और कम फोटोब्लीचिंग; हालांकि, प्रयोगात्मक जानवरों को सिर-तय करने की आवश्यकता होती है, जो व्यवहार^{अध्ययनों} को सीमित करता है जो ^3,4,5,6 किया जा सकता ^है। इसके विपरीत, हेड-माउंटेड मिनोस्कोप सिस्टम छोटा और पोर्टेबल है, जिससे जानवरों को स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों का उपयोग करके विभिन्न प्रकार के व्यवहार परीक्षणों का अध्ययन करना संभव हो जाता है 7,8,9,10,11,12,13।

दो प्रमुख सीए^{2 +} संकेतक, रासायनिक संकेतक ^5,14 और आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) ^15,16 हैं। सीए^{2 +} इमेजिंग को वायरल वैक्टर के साथ वितरित अत्यधिक संवेदनशील जीईसीआई का उपयोग करके सुविधाजनक बनाया गया है जो लक्षित सर्किट में न्यूरॉन्स के विशिष्ट लेबलिंग की अनुमति देता है। संवेदनशीलता, दीर्घायु, और यहां तक कि उपकोशिकीय डिब्बों को लेबल करने की क्षमता को बढ़ाने के लिए निरंतर प्रयास, जीईसीआई को विवो कैल्शियम इमेजिंग अध्ययन ों में विभिन्न के लिए आदर्श बनाता है 17,18,19।

इमेजिंग के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों में प्रकाश का प्रकीर्णन ऑप्टिकल प्रवेश को गहराई से सीमित करता है, यहां तक कि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ भी। हालांकि, ग्रेडिएंट इंडेक्स (GRIN) लेंस इस मुद्दे पर काबू पा लेता है क्योंकि GRIN लेंस को सीधे जैविक ऊतकों में एम्बेडेड किया जा सकता है और माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए गहरे मस्तिष्क क्षेत्र से छवियों को रिले किया जा सकता है। ऑप्टिकल रूप से समरूप सामग्री से बने पारंपरिक लेंस के विपरीत और ध्यान केंद्रित करने और छवियों को बनाने के लिए एक जटिल आकार की सतह की आवश्यकता होती है, GRIN लेंस प्रदर्शन लेंस सामग्री के भीतर एक क्रमिक अपवर्तक सूचकांक परिवर्तन पर आधारित होता है जो एक विमान सतह²⁰ के साथ ध्यान केंद्रित करता है। GRIN लेंस व्यास में 0.2 मिमी के लिए नीचे गढ़ा जा सकता है। इसलिए, एक लघुकृत GRIN लेंस को बहुत अधिक नुकसान पहुंचाए बिना गहरे मस्तिष्क में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।

इस लेख में, विवो कैल्शियम इमेजिंग में गहरे मस्तिष्क के लिए एक पूर्ण सर्जरी प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्रदर्शन उद्देश्य के लिए, हम विशेष रूप से माउस मस्तिष्क के औसत दर्जे के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (एमपीएफसी) को लक्षित करने वाले मस्तिष्क सर्जरी का वर्णन करते हैं और विवो कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग में एक कस्टम-निर्मित मिनीस्कोप सिस्टम के माध्यम से डॉ लिन के समूह द्वारा विकसित किया गया है, जो नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन ड्रग एब्यूज (एनआईडीए / आईआरपी) ^7,12 में डॉ लिन के समूह द्वारा विकसित किया गया है। प्रयोगात्मक प्रक्रिया में दो प्रमुख मस्तिष्क सर्जरी शामिल हैं। पहली सर्जरी स्टीरियोटैक्सिक रूप से एमपीएफसी में GCaMP6f (एक GECI) व्यक्त करने वाले एक वायरल वेक्टर को इंजेक्ट कर रही है। दूसरी सर्जरी एक ही मस्तिष्क क्षेत्र में GRIN लेंस प्रत्यारोपित करने के लिए है। इन मस्तिष्क सर्जरी से वसूली के बाद, बाद की प्रक्रिया दंत सीमेंट का उपयोग करके माउस खोपड़ी पर मिनीस्कोप धारक (आधार) को चिपकाना है। विवो में सीए^{2 +} इमेजिंग को इसके आधार पर मिनोस्कोप को माउंट करने के बाद किसी भी समय किया जा सकता है। वायरल इंजेक्शन और GRIN लेंस आरोपण के लिए सर्जरी प्रोटोकॉल विवो कैल्शियम इमेजिंग में गहरे मस्तिष्क के लिए किसी भी वाणिज्यिक या कस्टम-निर्मित एकल-फोटॉन और दो-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत है।

Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल व्योमिंग विश्वविद्यालय के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करता है। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया माउस 6 महीने का पुरुष C57BL / 6J है। इस प्रक्रिया का उपयोग विवो कैल्शियम इमेजिंग के लिए किसी भी गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। यहां, प्रदर्शन के लिए, लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र माउस एमपीएफसी (पूर्वकाल और पीछे (ए / पी): 1.94 मिमी, औसत दर्जे का और पार्श्व (एम / एल): 0.5 मिमी, पृष्ठीय और वेंट्रल (डी / वी): 1.8 मिमी) है। यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल²¹ के आधार पर संशोधित किया गया है।

1. mPFC में वायरस के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन (चित्रा 1)

सर्जरी की तैयारी
1. एक आटोक्लेव का उपयोग करके सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें और उन्हें एक बाँझ सतह पर रखें।
2. एक 10 μL सिरिंज तैयार यह खारा के साथ भड़काना और खारा के 5 μL के साथ prefilling द्वारा. सिरिंज को एक माइक्रोपंप में संलग्न करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
3. हीटिंग पैड को चालू करें और 35 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें।
माउस को प्रेरण कक्ष (5"x 10"x 4", लंबाई x चौड़ाई x ऊंचाई) में 5% आइसोफ्लुरेन और ऑक्सीजन प्रवाह दर के 1 एल / मिनट के साथ रखें। माउस की श्वसन दर को ध्यान से देखें और गिनें। माउस को बाहर निकालें एक बार इसकी श्वसन दर 1 सांस / सेकंड तक कम हो जाती है।
नोट: माउस की साँस लेने की दर को प्रत्येक साँस लेने के दौरान पीठ की मांसपेशियों के आंदोलन के नीचे और ऊपर की ओर देखकर आसानी से निगरानी की जा सकती है।
माउस को सर्जिकल क्षेत्र से अलग बेंचटॉप क्षेत्र पर बसने की अनुमति दें। शेविंग क्लिपर के साथ, माउस सिर से पहले गर्भाशय ग्रीवा कशेरुकाओं तक बालों को शेव करें।
स्टीरियोटैक्सिक चरण पर माउस को व्यवस्थित करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कान की सलाखों और नाक क्लिप के साथ अपनी स्थिति को सुरक्षित करें। 1.5% isoflurane और ऑक्सीजन प्रवाह दर के 0.5 एल / मिनट पर स्टीरियोटैक्सिक चरण में आइसोफ्लुरेन प्रवाह को बनाए रखें।
सर्जरी के दौरान आंखों की शुष्कता को रोकने के लिए एक साफ कपास झाड़ू के साथ दोनों आंखों पर चिकनाई नेत्र आंख मरहम लागू करें। माउस पर पेडल रिफ्लेक्सेस का आकलन करें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि सर्जरी शुरू करने से पहले माउस पूरी तरह से एनेस्थेटिक है।
7.5% पोविडोन-आयोडीन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) और 70% इथेनॉल के साथ बाल रहित क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, जिसमें बाँझ कपास स्वैब का उपयोग करके प्रत्येक तीन बार होता है।
बालरहित क्षेत्र की त्वचा के नीचे 2% लिडोकेन की एक छोटी मात्रा (50 μL) इंजेक्ट करें।
खोपड़ी के लैम्ब्डा और ब्रेग्मा को उजागर करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करके मिडलाइन के साथ त्वचा के माध्यम से 2 सेमी चीरा बनाएं।
सूखे कपास swabs और नुकीले संदंश की मदद से खोपड़ी से प्रावरणी निकालें।
ब्रेग्मा और लैम्ब्डा दिखाई देने के बाद, ब्रेग्मा और लैम्ब्डा के जेड निर्देशांक को मापने के लिए एक दंत ड्रिल (व्यास में 0.5 मिमी) की नोक का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)। नाक धारक की ऊंचाई को समायोजित करें जब तक कि ब्रेग्मा और लैम्ब्डा एक ही जेड स्थिति में झूठ न बोलें।
ए / पी की स्थिति के लिए 0.5 मिमी डेंटल ड्रिल का पता लगाएं: 1.94 मिमी, एम / एल: ब्रेग्मा से 0.5 मिमी। खोपड़ी के माध्यम से ड्रिल करें।
नोट:: यहाँ, प्रदर्शन के लिए, लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र माउस mPFC है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी अन्य गहरे मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र नाभिक Accumbens (NAc) है, तो संबंधित स्थिति A / P: 0.9 मिमी, M / L: 1.2 मिमी होनी चाहिए।
एक 30 जी सुई टिप का उपयोग कर ड्यूरा निकालें और 45 ° angled तेज संदंश का उपयोग कर हड्डी के मलबे के सभी टुकड़ों को साफ।
नोट: रक्तस्राव आम है क्योंकि सफाई चरण के दौरान छोटी रक्त वाहिकाएं टूट सकती हैं। रक्तस्राव को रोकने के लिए बाँझ कपास स्वैब का उपयोग करें और क्षेत्र को धोने के लिए खारा लागू करें। इसे नम रखने के लिए उजागर खोपड़ी क्षेत्र में खारा लागू करें।
माइक्रोपंप के नियंत्रण कक्ष का उपयोग करके वायरस को माइक्रोलीटर सिरिंज में लोड करें। 500 nL एयर बबल को वापस ले लें, इसके बाद 50 nL / s की प्रवाह दर पर वायरस के 800 nL को वापस लें।
नोट: प्रदर्शन उद्देश्य के लिए, यहां, एक एडेनो-संबद्ध वायरस सेरोटाइप 1 (AAV1) GCaMP6f (एक GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f को व्यक्त करता है, mPFC में इंजेक्ट किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। वायरस का टिटर 2.8 x 10¹³ जीसी / एमएल है। यह इंजेक्शन से पहले खारा में 1: 2 पतला है।
बस bregma को छूने के लिए bregma के शीर्ष पर सुई की नोक जगह और नीचे bregma के जेड-निर्देशांक नोट. सुई को ड्रिल किए गए छेद के ऊपर ले जाएं और यह सुनिश्चित करने के लिए वायरस के 100 एनएल को इंजेक्ट करें कि सुई भरी हुई नहीं है।
धीरे-धीरे मस्तिष्क के ऊतकों में सुई को डी / वी के लक्षित जेड-निर्देशांक में ले जाएं: 1.75 मिमी और फिर इसे डी / वी के जेड-निर्देशांक तक थोड़ा सा ले जाएं: 1.65 मिमी।
नोट:: यह वायरल समाधान infused किया जा करने के लिए के लिए एक छोटी जेब बनाने के लिए है। यदि लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र एनएसी है, तो डी / वी का संबंधित लक्षित जेड-निर्देशांक 4.2 मिमी होना चाहिए, और फिर 4.1 मिमी तक थोड़ा आगे बढ़ना चाहिए।
माइक्रोपंप को 50 एनएल / मिनट की प्रवाह दर पर वायरस के 500 एनएल इंजेक्ट करने के लिए सेट करने के लिए नियंत्रण कक्ष का उपयोग करें। वायरस को इंजेक्ट करने के लिए नियंत्रण कक्ष पर रन बटन दबाएं।
नोट: इंजेक्शन के बारे में 10 मिनट लगेगा. इंजेक्शन खत्म होने के बाद, मस्तिष्क से सुई निकालने से पहले अतिरिक्त 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन की अवधि के दौरान उजागर खोपड़ी क्षेत्र को नम रखने के लिए अक्सर खारा लागू करें।
सुई को मस्तिष्क से ऊपर और बाहर ले जाएं। 500 nL वॉल्यूम को 50 nL/s की प्रवाह दर पर दो बार इंजेक्ट करें।
नोट:: यह चरण पुष्टि करता है कि वायरस की एक उचित मात्रा मस्तिष्क में प्रशासित किया गया है। पहले 500 एनएल इंजेक्शन के दौरान, वायरस जारी किया जाता है, इसके बाद हवा के बुलबुले होते हैं। दूसरे 500 एनएल इंजेक्शन के दौरान, हवा के बुलबुले पहले दिखाई देते हैं, उसके बाद खारा होता है। सिरिंज अब अगले माउस के लिए वायरस लोड करने के लिए तैयार है। एक बार सर्जरी हो जाने के बाद, माइक्रोलीटर सिरिंज और सुई को एसीटोन के साथ अच्छी तरह से साफ किया जाता है, जिसके बाद खारा होता है।
त्वचा के किनारों को पंक्तिबद्ध करें और ध्यान से एक सिवनी (आकार 4.0) के साथ चीरा बंद करें। संक्रमण को रोकने के लिए सिले हुए क्षेत्र पर एंटीबायोटिक मरहम लागू करें।
स्टीरियोटैक्सिक चरण से माउस को हटा दें और इसे अपने घर के पिंजरे में वापस कर दें। घर के पिंजरे को 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें जब तक कि माउस एम्बुलेटरी न हो जाए।
नोट: आमतौर पर माउस को आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया से जागने के लिए 10-15 मिनट लगते हैं, इससे पहले कि यह चारों ओर घूमना शुरू हो जाए।
माउस के चारों ओर घूमना शुरू करने के बाद, 3 पोस्टसर्जिकल दिनों के लिए नॉनस्टेरॉइडल एंटी-इंफ्लेमेटरी दवाओं का प्रशासन करें ( सामग्री की तालिका देखें)। माउस को GRIN लेंस आरोपण का पीछा करने से पहले 14 दिनों के लिए सर्जरी से ठीक होने दें।

2. MPFC में GRIN लेंस आरोपण (चित्रा 1)

सर्जरी की तैयारी
1. कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) तैयार करें जिसमें NaCl का 124 mM, KCl का 2.5 mM, NaH 2 PO₄ का_1.25mM,_MgCl 2 का 1.2 mM, ग्लूकोज का 25 mM, NaHCO₃ का 26 mM और CaCl₂ का 2.4 mM शामिल है।
2. एक आटोक्लेव का उपयोग करके सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें और उन्हें एक बाँझ सतह पर रखें।
3. हीटिंग पैड को चालू करें और 35 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें।
4. 1% Agarose पिघलाएं और उपयोग करने तक इसे 42 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें।
  नोट: पिघला हुआ agarose घंटे की एक जोड़ी के लिए पानी के स्नान में रखा जा सकता है.
5. 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में एक GRIN लेंस (व्यास में 1 मिमी, लंबाई में 4.38 मिमी, चित्रा 2A) को कीटाणुरहित करें, इसे प्रत्यारोपण से पहले इसे ठीक से कुल्ला करने के लिए खारा से भरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  नोट: GRIN लेंस (सामग्री की तालिका देखें) विशेष चश्मे में चांदी और लिथियम-आयन विनिमय के माध्यम से उत्पादित किए जाते हैं, जिससे उन्हें गैर-विषाक्त और न्यूरॉन के अनुकूल ^6,7 प्रदान किया जाता ^है। हालांकि, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GRIN लेंस विषाक्त अवशेषों को लीच कर सकते हैं, जिससे न्यूरोडीजेनेरेशन हो सकता है, जिससे उन्हें विवो इमेजिंग अध्ययनों में लंबी अवधि के लिए लाइव मस्तिष्क में आरोपण के लिए अनुपयुक्त बना दिया जाता है। इन GRIN लेंस पड़ोसी न्यूरॉन्स²² पर विषाक्त दुष्प्रभावों को रोकने के लिए पेरिलीन-सी जैसे बायोकंपैटिबल एजेंटों के साथ कोटिंग की आवश्यकता हो सकती है।
माउस का वजन करें और इसे केटामाइन / Xylazine मिश्रण के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा एनेस्थेटिक करें ( सामग्री की तालिका देखें) (केटामाइन: 100 मिलीग्राम / किग्रा; Xylazine: 15 मिलीग्राम / किग्रा)।
नोट: 30 ग्राम वजन वाले माउस को प्रारंभिक खुराक के लिए केटामाइन / Xylazine मिश्रण (केटामाइन 100 मिलीग्राम / एमएल और Xylazine 1.5 मिलीग्राम / एमएल) के 300 μL और सर्जरी के दौरान अतिरिक्त खुराक के लिए केटामाइन (10 मिलीग्राम / एमएल) के 150 μL की आवश्यकता होती है। माउस को पूरी सर्जिकल प्रक्रिया के दौरान एनेस्थेटिक रखने के लिए, केटामाइन (50 मिलीग्राम / किग्रा) की अतिरिक्त खुराक को प्रति घंटे कम से कम एक बार प्रशासित करने की आवश्यकता होती है। माउस के संज्ञाहरण चरण को पेडल रिफ्लेक्सेस का आकलन करके अक्सर निगरानी करने की आवश्यकता होती है।
एक शेवर के साथ सर्जिकल क्षेत्र से बालों को शेव करें और गीले पेपर तौलिया का उपयोग करके बालों को साफ करें।
माउस को स्टीरियोटैक्सिक चरण में रखें और नाक क्लिप और कान की सलाखों को कसकर अपनी स्थिति को सुरक्षित करें। एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ दोनों आंखों पर चिकनाई नेत्र नेत्र मरहम लागू होते हैं। पुष्टि करें कि माउस पूरी तरह से पेडल सजगता का आकलन करके anesthetized है।
7.5% पोविडोन-आयोडीन समाधान और 70% इथेनॉल के साथ बाल रहित क्षेत्र को कीटाणुरहित करें प्रत्येक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करके प्रत्येक तीन बार। सर्जरी से संबंधित सूजन और सूजन के जोखिम को कम करने के लिए जांघ में इंट्रामस्क्युलर रूप से डेक्सामेथासोन के 2 मिलीग्राम / किलोग्राम का प्रशासन करें।
सर्जरी क्षेत्र की त्वचा के नीचे 2% लिडोकेन के 50 μL इंजेक्ट करें।
एक 1.5 सेमी (ऊंचाई) x 1.0 सेमी (आधार) त्रिकोणीय त्वचा क्षेत्र को एक्साइज करने के लिए एक ठीक कैंची का उपयोग करें, आंखों के बीच पूर्वकाल की ओर से लैम्ब्डा के पीछे की ओर।
ठीक संदंश, माइक्रो-ब्लेड, और कपास swabs का उपयोग कर खोपड़ी से periosteum ऊतक निकालें।
नोट: खोपड़ी को अगले चरण का पीछा करने से पहले अच्छी तरह से साफ और सुखाया जाना चाहिए।
त्वचा के किनारों पर साइनोएक्रिलेट ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें और त्वचा को खोपड़ी से जोड़ें। 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि साइनोएक्रिलेट सूख न जाए।
एक 0.5 मिमी ड्रिल burr टिप की मदद से, नाक क्लिप की ऊंचाई को समायोजित करके एक ही क्षैतिज विमान में bregma और lambda संरेखित करें।
ए / पी की स्थिति के लिए एक दंत ड्रिल (व्यास में 1.2 मिमी) का पता लगाएं: 1.94 मिमी, एम / एल: ब्रेग्मा से 0.8 मिमी। खोपड़ी के माध्यम से ड्रिल करें। एक 30 जी सुई टिप का उपयोग कर ड्यूरा निकालें और 45 ° angled तेज संदंश का उपयोग कर हड्डी के मलबे के सभी टुकड़ों को साफ।
नोट: यह हड्डी मलबे बाद की आकांक्षा चरण को अवरुद्ध कर सकते हैं यदि पूरी तरह से नहीं हटाया गया है।
एक 27 जी मैन्युअल रूप से पॉलिश कुंद अंत सुई (चित्रा 2 बी) सुई धारक के लिए 10 ° के कोण के साथ झुकाहुआ एक रोबोट हाथ के लिए युग्मित संलग्न (चित्रा 2C). सुई धारक के दूसरे छोर को घर के वैक्यूम सिस्टम से कनेक्ट करें।
नोट: रोबोटिक आर्म (सामग्री की तालिका देखें) NIDA / IRP में डॉ लिन के समूह द्वारा विकसित की गई है और एक कस्टम-विकसित, वर्तमान में ओपन-एक्सेस सॉफ़्टवेयर, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota) ²³ द्वारा नियंत्रित की जाती है।
बस bregma को छूने के लिए सुई की नोक का पता लगाएं। AutoStereota पर Bregma बटन पर क्लिक करके Bregma के Z-निर्देशांक को 0 पर सेट करें.
इनपुट एक्स मान को 0.8 पर सेट करें, इनपुट वाई मान को 1.94 पर, इनपुट जेड मान को 1.0 पर, फिर खोपड़ी पर ड्रिल किए गए छेद के शीर्ष पर सुई को स्थानांतरित करने के लिए ढूँढें बटन पर क्लिक करें।
AutoStereota के माध्यम से उजागर मस्तिष्क ऊतक क्षेत्र के केंद्र में सुई की स्थिति को समायोजित करें।
नोट:: पार्श्व या औसत दर्जे की दिशाओं में सुई ले जाने के लिए, चरण मान दर्ज करें और AutoStereota पर पार्श्व या औसत दर्जे का बटन पर क्लिक करें। इसी तरह, सुई को पूर्वकाल या पीछे और पृष्ठीय या वेंट्रल दिशाओं में स्थानांतरित करने के लिए, क्रमशः रोस्ट्रल या पुच्छल और पृष्ठीय या वेंट्रल बटन पर क्लिक करें।
वैक्यूम को चालू करें और एक गुरुत्वाकर्षण-नियंत्रित टयूबिंग सिस्टम के माध्यम से एसीएसएफ के साथ उजागर मस्तिष्क क्षेत्र को धोना शुरू करें ( सामग्री की तालिका देखें) एक मुड़ी हुई नोक के साथ 30 जी सुई से जुड़ा हुआ है। ACSF लगातार 95% O 2 और 5% CO₂के गैस मिश्रण के साथ bubbled हो जाता है और_{एक 0.2} μm फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है।
नोट: ACSF प्रवाह दर ~ 1.5 mL / मिनट है। गैस मिश्रण का आउटपुट दबाव ~ 3 साई पर रखा जाता है।
AutoStereota सॉफ्टवेयर की मदद से एस्पिरेट मस्तिष्क ऊतक परत-दर-परत (चित्र 3).
नोट: मस्तिष्क के ऊतकों की आकांक्षा 4 दौर में पूरी हो जाती है ताकि एक कॉलम पॉकेट (गहराई में 1.8 मिमी और व्यास में 1 मिमी) उत्पन्न हो।
1. "zStep" सत्र में, क्लिक करें और पहली और दूसरी पंक्तियों की जाँच करें। पहली पंक्ति के लिए मान 0.2 और 1 पर सेट करें. दूसरी पंक्ति के लिए मानों को 0.15 और 4 (चित्र 3A) पर सेट करें.
2. "मोड" सत्र में, सुई का आकार 27 गेज और 1.2 सेट करें, 0.9 Dims सेट करें । अन्य सभी मान डिफ़ॉल्ट मानों का उपयोग करते हैं (चित्र 3A).
3. आकांक्षा शुरू करने के लिए सेट, Keep Zero और Start बटन पर क्रमिक रूप से क्लिक करें।
  नोट: यह आकांक्षा का 1^st दौर है। इनपुट मान इंगित करते हैं कि आकांक्षा गहराई 0.2 मिमी (0 के जेड-निर्देशांक से) 1 परत के साथ पहले चरण के दौरान है; दूसरे चरण के दौरान, आकांक्षा की गहराई 0.15 मिमी है, जो लगातार 4 परतों के लिए दोहराई जाती है। आकांक्षा संकल्प 1.2 है, और व्यास 0.9 मिमी है। आकांक्षा के दौरान, सुई की नोक के तत्काल स्थान को ट्रैक ग्राफ पैनल के माध्यम से मॉनिटर किया जा सकता है। इस आकांक्षा दौर को पूरा करने के बाद, गहराई में 0.8 मिमी और व्यास में 1 मिमी के साथ एक कॉलम पॉकेट उत्पन्न होता है। सुई की नोक 0 के जेड-निर्देशांक के साथ केंद्र में वापस आ जाएगी।
4. "zStep" सत्र में, क्लिक करें और पहली और दूसरी पंक्तियों की जाँच करें। पहली पंक्ति के लिए मान ों को 1 और 1 पर सेट करें. दूसरी पंक्ति के लिए मान 0.15 और 4 (चित्र 3B) पर सेट करें.
5. "मोड" सत्र में, सभी मानों को पिछले दौर (चित्रा 3B) के समान रखें.
6. आकांक्षा शुरू करने के लिए सेट, Keep Zero और Start बटन पर क्रमिक रूप से क्लिक करें।
  नोट: यह आकांक्षा का 2^वां दौर है। इनपुट मान इंगित करते हैं कि आकांक्षा गहराई 1 परत के साथ पहले चरण के दौरान 1 मिमी (0 के जेड-निर्देशांक से) है; दूसरे चरण के दौरान, आकांक्षा की गहराई 0.15 मिमी है, जो लगातार 4 परतों के लिए दोहराई जाती है। इस आकांक्षा दौर को पूरा करने के बाद, गहराई में 1.6 मिमी और व्यास में 1 मिमी के साथ स्तंभ जेब उत्पन्न होती है।
7. "zStep" सत्र में, क्लिक करें और केवल पहली पंक्ति की जाँच करें। पहली पंक्ति के लिए मानों को 1.8 और 1 (चित्र 3C) पर सेट करें.
8. "मोड" सत्र में, सुई का आकार 27 गेज और 2.2 सेट करें। अन्य सभी मान पिछले दौर (चित्रा 3 C) के समान ही रहते हैं।
9. आकांक्षा शुरू करने के लिए सेट, Keep Zero और Start बटन पर क्रमिक रूप से क्लिक करें।
  नोट: यह आकांक्षा का 3^rd दौर है। इनपुट मान इंगित करते हैं कि आकांक्षा गहराई 1 परत के साथ 1.8 मिमी (0 के जेड-निर्देशांक से) है। आकांक्षा संकल्प 2.2 है। इस आकांक्षा दौर को पूरा करने के बाद, गहराई में 1.8 मिमी और व्यास में 1 मिमी के साथ स्तंभ जेब उत्पन्न होती है।
10. "zStep" सत्र में, क्लिक करें और केवल पहली पंक्ति की जाँच करें। पहली पंक्ति के लिए मानों को 1.6 और 1 (चित्र 3D) पर सेट करें.
11. "मोड" सत्र में, सुई का आकार 27 गेज और 2.2 सेट करें, डिम्स 0.6 (चित्रा 3 डी) सेट करें।
12. आकांक्षा शुरू करने के लिए सेट, Keep Zero और Start बटन पर क्रमिक रूप से क्लिक करें।
  नोट: यह आकांक्षा का 4^वां दौर है। इस कदम का उद्देश्य जेब में जमा रक्त को साफ करना है। रक्तस्राव आम है क्योंकि आकांक्षा प्रक्रिया के दौरान छोटी रक्त वाहिकाएं फट जाती हैं। रक्त को अच्छी तरह से साफ करने के लिए, 5 मिनट के लिए एसीएसएफ की सिंचाई को रोकें और फिर सिंचाई को फिर से चालू करें। आकांक्षा के 4^वें दौर को कई बार दोहराएं जब तक कि जेब रक्त मुक्त न हो जाए। इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी अन्य गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र एनएसी है, तो डी / वी का अंतिम संबंधित जेड-निर्देशांक 4.4 मिमी होना चाहिए।
एसीएसएफ के वैक्यूम और सिंचाई को रोकें। सुई को +2 मिमी जेड-समन्वय और केंद्र में 0.5 मिमी पूर्वकाल में लाएं। जेब में बाँझ 1mm GRIN लेंस जगह.
उजागर GRIN लेंस के संपर्क में सुई की नोक रखें सुनिश्चित करने के लिए GRIN लेंस 10 ° कोण पर बसे जा रहा है. धीरे से बाँझ नरम टिशू पेपर के साथ GRIN लेंस की ऊपरी सतह दबाएँ यह सुनिश्चित करने के लिए कि GRIN लेंस की निचली सतह मस्तिष्क के ऊतकों के संपर्क में है।
एक स्पैटुला की मदद से GRIN लेंस और मस्तिष्क के ऊतकों के बीच के अंतर में पिघले हुए Agarose लागू होते हैं। Agarose एक जेल बनाने के बाद, एक माइक्रो ब्लेड का उपयोग कर अतिरिक्त Agarose निकालें।
खारा और कपास swabs के साथ अच्छी तरह से खोपड़ी साफ. खोपड़ी को बाद के दंत सीमेंट ( सामग्री की तालिका देखें) आवेदन से पहले सूखने की अनुमति दें।
-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से मिश्रण को अच्छी तरह से बाहर निकालें। दंत सीमेंट पाउडर और उत्प्रेरक तरल मिश्रण और खोपड़ी पर स्व-इलाज चिपकने वाला राल सीमेंट की एक परत लागू; सबसे पहले, GRIN लेंस को घेरें और फिर पूरे उजागर खोपड़ी को कवर करें।
5 मिनट तक प्रतीक्षा करें और इसे पूरी तरह से कठोर होने दें। आकांक्षा सुई को ध्यान से निकालें।
एक साफ प्लास्टिक कुएं में, तरल के साथ दंत सीमेंट पाउडर, काले लकड़ी का कोयला मिलाएं, और दंत सीमेंट की पहली परत के शीर्ष पर मिश्रण की एक पतली परत लागू करें। इसे सख्त होने देने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
एक पीसीआर ट्यूब (चित्रा 2 डी) से बने एक अनुकूलित टोपी के साथ इसे कवर करके उजागर GRIN लेंस की रक्षा करें। दंत सीमेंट के लिए टोपी संलग्न करने के लिए साइनोएक्रिलेट लागू करें।
माउस में चमड़े के नीचे चमड़े के नीचे के 1 मिलीलीटर को इंजेक्ट करें, इसके बाद 0.1 मिलीग्राम / किलोग्राम बुप्रेनोर्फिन। माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस रखें। घर के पिंजरे को 33 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें और माउस की निगरानी करें जब तक कि यह एम्बुलेटरी न हो जाए। माउस को चारों ओर घूमने से पहले एनेस्थीसिया से जागने में आमतौर पर 20-40 मिनट लगते हैं।
नॉनस्टेरॉइडल विरोधी भड़काऊ दवाओं का प्रशासन करें और कम से कम 3 पोस्टसर्जिकल दिनों के लिए माउस की निगरानी करें। माउस को 30 दिनों के लिए सर्जरी से ठीक होने दें।

3. माउस खोपड़ी (चित्रा 1) के लिए miniscope धारक (आधार) चिपकाना

माउस को 5% आइसोफ्लुरेन और 1 एल / मिनट ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ एक प्रेरण कक्ष में एनेस्थेटिकाइज़ करें जब तक कि इसकी श्वसन दर 1 साँस / सेकंड तक कम न हो जाए।
माउस को स्टीरियोटैक्सिक चरण में रखें और कान की सलाखों और नाक क्लिप के साथ अपनी स्थिति को सुरक्षित करें। आइसोफ्लुरेन (1.5%) और ऑक्सीजन (0.5 एल / मिनट) का निरंतर प्रवाह बनाए रखें।
उन्हें नम रखने के लिए इसकी आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं। हीटिंग पैड को चालू करें और 35 डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें। पुष्टि करें कि माउस पूरी तरह से पेडल सजगता का आकलन करके anesthetized है।
उस कैप को हटा दें जो ग्रिन लेंस को धीरे से नुकीले संदंश का उपयोग करके कवर करता है। दंत सीमेंट से सूखे साइनोएक्रिलेट अवशेषों को पूरी तरह से माइक्रोड्रिल का उपयोग करके ड्रिल करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
छोटे कैंची के साथ दंत सीमेंट क्षेत्र के आसपास के बालों को काटें। संपीड़ित-हवा डस्टर की मदद से मलबे को साफ करें। GRIN लेंस की ऊपरी सतह को साफ करने के लिए एक एसीटोन डुबोया हुआ कपास झाड़ू का उपयोग करें।
इसके धारक (आधार) के साथ मिनोस्कोप तैयार करें।
1. आधार में मौजूद स्लॉट में एक # 00-90 हेक्स अखरोट ( सामग्री की तालिका देखें) रखें और इसे वहां सुरक्षित करने के लिए साइनोएक्रिलेट लागू करें (चित्रा 2 ई)।
2. एक polytetrafluoroethylene (PTFE) टेप कसकर miniscope के धागे के चारों ओर लागू होते हैं और अतिरिक्त टेप (चित्रा 2F) को ट्रिम करें।
3. आधार के लिए miniscope जकड़ना और आधार के लिए miniscope को सुरक्षित करने के लिए लॉकिंग पेंच का उपयोग करें (चित्रा 2 जी).
4. मिनीस्कोप को अपने केबल से कनेक्ट करें और कस्टम-विकसित, वर्तमान में ओपन-एक्सेस सॉफ़्टवेयर, न्यूव्यू ( सामग्री की तालिका देखें) को चालू करें।
  नोट: NeuView सॉफ़्टवेयर NIDA / IRP ^7,12 पर डॉ लिन के समूह से विवो कैल्शियम इमेजिंग में miniscope के लिए कस्टम-विकसित है। यह ओपन एक्सेस (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0) है।
5. NeuView में, हार्डवेयर क्लिक करें, LED1 की जाँच करें, और लाइव छवियाँ (चित्र4A) देखने के लिए स्ट्रीम बटन क्लिक करें. लाइव स्ट्रीमिंग को रोकने के लिए, स्टॉप बटन पर क्लिक करें।
6. एक कस्टम-निर्मित मिनीस्कोप होल्डिंग आर्म (चित्रा 2 एच) में मिनीस्कोप को व्यवस्थित करें, जिसकी XYZ स्थिति को मोटरचालित नियंत्रकों (चित्रा 2I) का उपयोग करके हेरफेर किया जा सकता है।
उजागर GRIN लेंस के ठीक ऊपर miniscope का पता लगाएं और इसे लेंस की सतह के समानांतर बनाते हैं। धीरे-धीरे ग्रिन लेंस की ओर मिनोस्कोप को नीचे लाएं और अपनी जेड स्थिति को समायोजित करें जब तक कि फोकस का सबसे अच्छा विमान नहीं मिल जाता है।
नोट: सबसे अच्छा फोकल प्लेन कई संभावित जेड पदों की तुलना करके और अधिकांश सेल निकायों के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन के साथ फोकल प्लेन का चयन करके निर्धारित किया जाता है।
मिनीस्कोप की स्थिति को बदले बिना मिनोस्कोप बेस के चारों ओर दंत सीमेंट की पहली परत को सावधानीसे लागू करें। सीमेंट के सख्त होने के बाद, धीरे से होल्डिंग आर्म को हटा दें ताकि मिनीस्कोप माउस सिर पर अपने दम पर खड़ा हो सके।
नोट: दंत सीमेंट सख्त होने के बाद सिकुड़जाता है, और यह फोकस के मूल विमान से दूर मिनीस्कोप को नीचे खींच लेगा। आमतौर पर मिनोस्कोप जेड स्थिति को संभावित परिवर्तन की क्षतिपूर्ति के लिए दंत सीमेंट लागू करने से पहले मूल फोकल प्लेन के ऊपर थोड़ा ऊपर उठाया जाता है।
सभी अंतराल को भरने के लिए आधार के चारों ओर दंत सीमेंट की दूसरी परत लागू करें और यह सुनिश्चित करें कि अंतराल से कोई एलईडी प्रकाश रिसाव न हो। डेंटल सीमेंट को सख्त होने दें।
स्टीरियोटैक्सिक चरण से माउस निकालें। लॉकिंग पेंच को ढीला करें और आधार से मिनीस्कोप को अलग करें। उजागर GRIN लेंस की रक्षा करने और आधार में लॉकिंग पेंच को कसने के लिए आधार में एक 3 डी मुद्रित सुरक्षात्मक टोपी रखो (चित्रा 2 जे)।
माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस रखें।
नोट: आमतौर पर माउस को आइसोफ्लुरेन एनेस्थीसिया से जागने के लिए 10-15 मिनट लगते हैं, इससे पहले कि यह चारों ओर घूमना शुरू हो जाए।

4. Miniscope बढ़ते और विवो Ca ^{2 +} इमेजिंग में (चित्रा 1)

मिनीस्कोप को इसके आधार पर माउंट करें
1. प्रेरण कक्ष में संक्षेप में माउस को बेहोश करें (5% आइसोफ्लुरेन और 1 एल / मिनट ऑक्सीजन प्रवाह दर)। माउस को एक साफ बेंच सतह पर रखें।
2. एक छोटे से पेचकश के साथ लॉकिंग पेंच को ढीला करें, सुरक्षात्मक टोपी को हटा दें और एक एसीटोन-भिगोए हुए कपास झाड़ू के साथ GRIN लेंस की सतह को साफ करें।
3. एक PTFE टेप कसकर miniscope धागे के चारों ओर लपेटें और माउस सिर पर अपने आधार के लिए miniscope जकड़ना.
4. मिनीस्कोप को केबल (चित्रा 2K) से कनेक्ट करें, NeuView सॉफ़्टवेयर चालू करें.
5. NeuView में, हार्डवेयर क्लिक करें, LED1 की जाँच करें, और लाइव छवियाँ (चित्र4A) देखने के लिए स्ट्रीम बटन क्लिक करें.
6. आधार के सापेक्ष मिनोस्कोप की स्थिति को समायोजित करके सबसे अच्छे फोकल प्लेन की पहचान करें, या तो कुंद संदंश की मदद से थोड़ा कसना या ढीला करना।
  नोट: सबसे अच्छा फोकल प्लेन कई संभावित स्थानों की तुलना करके और अधिकांश सेल निकायों के स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन के साथ एक का चयन करके निर्धारित किया जाता है।
7. लॉकिंग पेंच को कसें और माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस रखें।
8. NeuView में, इष्टतम स्तर के लिए एलईडी प्रकाश शक्ति समायोजित करें। कैप्चर पर क्लिक करें और फिर रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए ट्रिगर बटन और 150 फ्रेम के बाद स्टॉप हिट करें ।
  नोट: सबसे कम संभव शक्ति एक उज्ज्वल पर्याप्त छवि प्राप्त करने के लिए एलईडी शक्ति के इष्टतम स्तर को निर्धारित करता है। एक छोटे से वीडियो को रिकॉर्ड करने का उद्देश्य भविष्य में दोहराए जाने वाले इमेजिंग के लिए एक ही फोकल विमान की पहचान करने की सुविधा प्रदान करना है।
9. मिनीस्कोप से केबल डिस्कनेक्ट करें। प्रयोग शुरू करने से पहले माउस को कम से कम 30 मिनट के लिए ठीक होने दें।
  नोट: मिनीस्कोप की रक्षा करने के लिए, आमतौर पर, पानी की बोतल और तार खाद्य फीडर को इस छोटी अवधि के दौरान हटा दिया जाता है। यदि माउस को लंबे समय तक अपने घर के पिंजरे में रहने की आवश्यकता है, तो घर के पिंजरे में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आहार जेल ( सामग्री की तालिका देखें) की आपूर्ति करने की सिफारिश की जाती है।
Vivo कैल्शियम इमेजिंग में के लिए डेटा अधिग्रहण
नोट: विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक साथ किसी भी व्यवहार परीक्षण है कि शोधकर्ता की इच्छाओं के साथ आयोजित किया जा सकता है. प्रदर्शन उद्देश्य के लिए, उदाहरण यहां एक खुले क्षेत्र परीक्षण के दौरान विवो सीए^{2 +} इमेजिंग में है। इस लक्ष्य को पूरा करने के लिए, दो कंप्यूटरों की आवश्यकता होती है। माउस व्यवहार को स्वचालित रूप से रिकॉर्ड करने के लिए एक कैमरे को नियंत्रित करने के लिए एक कंप्यूटर वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) से सुसज्जित है। अन्य कंप्यूटर Miniscope को नियंत्रित करने के लिए और Ca^{2 +} छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए NeuView के साथ सुसज्जित है।
1. एक Livestream फ़ंक्शन के माध्यम से माउस व्यवहार क्षेत्र को देखने के लिए व्यवहार कैमरा सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) को चालू करें। मैन्युअल रूप से शीर्ष कैमरे (चित्रा 2L) का फोकस समायोजित करें।
2. ट्रिगर/स्ट्रोब का चयन करें और "ट्रिगर सक्षम/अक्षम करें" (चित्रा 4B) की जाँच करें। रिकॉर्ड बटन क्लिक करें, उस स्थान का चयन करने के लिए ब्राउज़ करें का उपयोग करें जहाँ व्यवहार रिकॉर्डिंग सहेजी जाएगी, इच्छित छवि स्वरूप का चयन करें.
  नोट:: "ट्रिगर नियंत्रण" फ़ंक्शन व्यवहार रिकॉर्डिंग NeuView सॉफ़्टवेयर द्वारा ट्रिगर किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए सक्षम किया गया है ताकि व्यवहार फ़्रेम और संबंधित कैल्शियम इमेजिंग फ़्रेम अस्थायी रूप से एक साथ युग्मित हैं। व्यवहार रिकॉर्डिंग को किसी भी वांछित प्रारूप में सहेजा जा सकता है। व्यवहार रिकॉर्डिंग आमतौर पर निर्दिष्ट फ़ोल्डर में JPEG स्वरूप में सहेजी जाती है।
3. माउस को क्षेत्र के करीब लाएं और मिनीस्कोप को डेटा अधिग्रहण प्रणाली (चित्रा 2L) से जुड़े केबल से कनेक्ट करें (सामग्री की तालिका देखें)। माउस को फिर अखाड़े के केंद्र में रखा जाता है।
4. NeuView सॉफ्टवेयर के Livestream समारोह के साथ, कैल्शियम छवि की चमक का अनुकूलन करने के लिए एलईडी शक्ति को समायोजित करें।
  नोट:: कैल्शियम इमेजिंग के लिए, रिकॉर्डिंग फ़्रेम दर डिफ़ॉल्ट रूप से 10 फ़्रेम/
5. NeuView में, LED1 को अनचेक करें, कैप्चर पर क्लिक करें और फिर रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए बटन को ट्रिगर करें, और 100 फ्रेम के बाद रोकें हिट करें ।
  नोट:: यह एलईडी प्रकाश बंद के साथ के बारे में 100 फ्रेम के लिए पृष्ठभूमि छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए है।
6. व्यवहार कैमरा सॉफ़्टवेयर में, रिकॉर्डिंग प्रारंभ करें (चित्र4C) क्लिक करें. NeuView में, LED1 की जाँच करें, कैप्चर पर क्लिक करें, और फिर रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए बटन ट्रिगर करें। हिट 3000 फ्रेम के बाद बंद करो .
  नोट:: यह कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार एक साथ रिकॉर्ड करने के लिए है। ओपन-फील्ड परीक्षण 15 मिनट लंबा होता है, आमतौर पर 5 मिनट के प्रत्येक तीन रिकॉर्डिंग सत्रों में टूट जाता है। यह निरंतर उपयोग के कारण मिनोस्कोप को ओवरहीटिंग से रोकने के लिए है।
7. निर्दिष्ट फ़ोल्डरों में कैल्शियम इमेजिंग और व्यवहार रिकॉर्डिंग दोनों सहेजें। प्रत्येक सत्र से पहले पृष्ठभूमि को रिकॉर्ड करते समय दो और सत्रों के लिए रिकॉर्डिंग को दोहराएं और सभी रिकॉर्डिंग को निर्दिष्ट फ़ोल्डर में सहेजें।
इसके आधार से मिनीस्कोप को अलग करें।
1. रिकॉर्डिंग के पूरा होने के बाद, केबल को मिनीस्कोप से डिस्कनेक्ट करें।
2. प्रेरण कक्ष में माउस को संक्षेप में एनेस्थेटिक करें (5% आइसोफ्लुरान और ऑक्सीजन प्रवाह दर का 1एल / मिनट)। माउस को एक साफ, गर्म सतह पर रखें।
आधार में लॉकिंग पेंच को खोलें और आधार से मिनीस्कोप को अलग करें। वापस आधार पर सुरक्षात्मक टोपी रखो और ताला पेंच कस. माउस को अपने घर के पिंजरे में वापस रखो।

Representative Results

चित्रा 1 योजनाबद्ध प्रयोगात्मक प्रक्रिया को दर्शाता है, जिसमें वायरल इंजेक्शन, GRIN लेंस आरोपण, माउस खोपड़ी के लिए मिनीस्कोप बेस का चिपकाना, और एक मिनीस्कोप के माध्यम से विवो कैल्शियम इमेजिंग शामिल है। पूरी प्रक्रिया ~ 2 महीने लगते हैं। चित्रा 2 विवो कैल्शियम इमेजिंग में मिनीस्कोप के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित प्रमुख घटकों को दर्शाता है। चित्रा 3 GRIN लेंस आरोपण के दौरान AutoStereota सॉफ्टवेयर के इंटरफेस प्रदर्शित करता है. चित्रा 4 Vivo कैल्शियम इमेजिंग में के दौरान NeuView और व्यवहार रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर के इंटरफेस प्रदर्शित करता है.

विवो कैल्शियम इमेजिंग का परिणाम वायरल इंजेक्शन और GRIN लेंस आरोपण सर्जरी दोनों की सफलता पर निर्भर करता है। चित्रा 5 विवो कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग में से परिणामों की एक श्रृंखला (यानी, असफल, सबऑप्टिमल, और अच्छा) दिखाता है। असफल मामलों में, कैल्शियम छवि या तो अंधेरे या उज्ज्वल दिखाई दे सकती है, लेकिन आमतौर पर कोई या बहुत कम सक्रिय न्यूरॉन्स का पता चलता है। हम आमतौर पर विवो कैल्शियम रिकॉर्डिंग प्रयोगों में आगे नहीं बढ़ते हैं यदि पांच से कम सक्रिय न्यूरॉन्स हैं। विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक अच्छा आमतौर पर सक्रिय न्यूरॉन्स के कई सैकड़ों से पता चलता है। यदि किसी रिकॉर्डिंग में सौ से कम सक्रिय न्यूरॉन्स होते हैं, तो हम इसे एक सबऑप्टिमल रिकॉर्डिंग मानते हैं।

विवो कैल्शियम इमेजिंग प्रयोगों में सबऑप्टिमल और अच्छी रिकॉर्डिंग दोनों में पीछा किया गया था, और बाद के डेटा विश्लेषण का प्रदर्शन किया गया था। मूवी 1 माउस एमपीएफसी से विवो कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग में एक प्रतिनिधि दिखाता है। व्यवहार वीडियो और कैल्शियम इमेजिंग डेटा आमतौर पर अलग से संसाधित होते हैं। माउस व्यवहार वीडियो मैन्युअल रूप से स्कोर किया जा सकता है। कैल्शियम इमेजिंग फ़ाइलों CaImAn कैल्शियम छवि प्रसंस्करण टूलबॉक्स²⁴ का उपयोग करके संसाधित कर रहे हैं। चित्रा 6 एक प्रतिनिधि सेल मानचित्र और विवो कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग में एक अच्छा से कई कैल्शियम निशान से पता चलता है.

विवो कैल्शियम इमेजिंग में पूरा करने के बाद, अंतिम चरण यह पुष्टि करना है कि क्या वायरल इंजेक्शन और GRIN लेंस आरोपण वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में हुआ है। इस उद्देश्य के लिए, माउस को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ परफ्यूज किया गया था, जिसके बाद 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) था। माउस मस्तिष्क काटा गया था, 12 घंटे के लिए 4% पीएफए में पोस्टफिक्स किया गया था, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में संग्रहीत किया गया था। माउस मस्तिष्क को तब एक वाइब्रेटोम के साथ 50 μm मोटी स्लाइस में विभाजित किया गया था। मस्तिष्क के स्लाइस को डीएपीआई के साथ दाग दिया गया था और माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था (प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है)¹²। चित्रा 7 एक माउस मस्तिष्क टुकड़ा ~ 1.94 मिमी पूर्वकाल एक प्रयोगात्मक माउस से bregma करने के लिए है, जहां GRIN लेंस प्रत्यारोपित किया गया था ट्रैक दिखा रहा है. GRIN लेंस ट्रैक के नीचे और उसके आसपास का हरा प्रतिदीप्ति क्षेत्र mPFC क्षेत्र में GCaMP6f की अभिव्यक्ति को इंगित करता है।

चित्र 1: प्रयोगात्मक प्रक्रिया का योजनाबद्ध अवलोकन। (A) mPFC में वायरस का स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन। (बी) एमपीएफसी में ग्रिन लेंस आरोपण। (C) माउस खोपड़ी के लिए miniscope आधार चिपकाना. (डी) मिनीस्कोप बढ़ते और विवो कैल्शियम इमेजिंग में। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 2: विवो कैल्शियम इमेजिंग में के लिए आवश्यक मुख्य घटक। (ए) 1 मिमी व्यास और 4.38 मिमी लंबाई के साथ एक GRIN लेंस। (बी) ए 27 जी मैन्युअल रूप से पॉलिश कुंद अंत सुई मस्तिष्क ऊतक आकांक्षा के लिए इस्तेमाल किया. (c) रोबोटिक भुजा सुई धारक के साथ युग्मित होती है। (डी) माउस खोपड़ी पर मिनीस्कोप आधार के चिपकने तक उजागर GRIN लेंस की रक्षा के लिए एक पीसीआर ट्यूब से एक कस्टम-निर्मित टोपी। (ई) एक हेक्स अखरोट के साथ मिनीस्कोप धारक (आधार)। (च) एक मिनीस्कोप जिसका धागा भाग PTFE टेप के साथ लपेटा जाता है। (जी) एक मिनीस्कोप एक लॉकिंग पेंच के साथ अपने आधार पर बांधा जाता है। (ज) हाथ धारण करने वाला मिनीस्कोप। (I) XYZ पदों में मिनीस्कोप के आंदोलन को सुविधाजनक बनाने के लिए उपयोग किया जाने वाला एक कस्टम-निर्मित 3 D मोटर चालित नियंत्रक। (जे) एक सुरक्षात्मक टोपी उजागर GRIN लेंस की रक्षा के लिए आधार पर बांधा जाता है, जबकि माउस विवो कैल्शियम इमेजिंग में प्रदर्शन नहीं कर रहा है। (के) केबल से जुड़ा मिनीस्कोप। (एल) विवो सीए^{2 +} इमेजिंग में डेटा अधिग्रहण प्रणाली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्र 3: परत-दर-परत मस्तिष्क ऊतक आकांक्षा के दौरान ऑटोस्टेरियोटा सॉफ़्टवेयर के इंटरफेस। (A) चरण 2.17.1 से 2.17.3 के अनुरूप इंटरफ़ेस। (बी) चरण 2.17.4 से 2.17.6 के अनुरूप इंटरफ़ेस। (C) चरण 2.17.7 से 2.17.9 के अनुरूप इंटरफ़ेस। (D) चरण 2.17.10 से 2.17.12 के अनुरूप इंटरफ़ेस। लाल बक्से इनपुट मानों को हाइलाइट करते हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 4: NeuView सॉफ्टवेयर के इंटरफेस और विवो कैल्शियम इमेजिंग में के दौरान व्यवहार रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर. (ए) न्यूव्यू का इंटरफ़ेस। (B, C) व्यवहार रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर के इंटरफ़ेस. लाल बक्से बटन को हाइलाइट करते हैं जिन्हें क्लिक करने की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 5: संभावित परिणामों की सीमा दिखाने के लिए अधिकतम प्रक्षेपण प्रतिदीप्ति सेल मानचित्र. (A,B) विवो कैल्शियम इमेजिंग में असफल जो बाद के डेटा विश्लेषण के लिए स्वीकार्य नहीं है. (ए) अंधेरा है और इसमें 5 से कम सक्रिय न्यूरॉन्स होते हैं। (बी) उज्ज्वल है लेकिन इसमें कोई सक्रिय न्यूरॉन्स नहीं है। (सी) विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक सबऑप्टिमल से सेल मानचित्र जिसमें कुछ सक्रिय न्यूरॉन्स होते हैं। (डी) विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक अच्छा से सेल मानचित्र जिसमें कई सैकड़ों सक्रिय न्यूरॉन्स शामिल हैं। स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 6: प्रतिनिधि सेल मानचित्र और विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक सफल से कैल्शियम transients. बायां पैनल एक खुले क्षेत्र परीक्षण के दौरान एमपीएफसी में एक इन विवो कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग से अधिकतम प्रक्षेपण प्रतिदीप्ति सेल मानचित्र है। रिकॉर्डिंग 5 मिनट तक चलती है। सही पैनल ब्याज के 15 क्षेत्रों (रंग मिलान) से कैल्शियम transients से पता चलता है. स्केल बार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 7: एक प्रयोगात्मक माउस का पोस्टमार्टम मूल्यांकन। GCaMP6f अभिव्यक्ति और एक प्रयोगात्मक माउस के mPFC में GRIN लेंस आरोपण के लिए पोस्टमार्टम मूल्यांकन. आयताकार क्षेत्र GRIN लेंस आरोपण के लिए पथ को इंगित करता है। GRIN लेंस प्रत्यारोपित क्षेत्र के तहत हरा क्षेत्र पुष्टि करता है कि GCaMP6f व्यक्त किया गया था, और GRIN लेंस को वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में ठीक से प्रत्यारोपित किया गया था। सीजी, सिंगुलेट कॉर्टेक्स; PrL, प्रीलिम्बिक कॉर्टेक्स; आईएल, इन्फ्रालिम्बिक कॉर्टेक्स। स्केल बार: 400 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: अन्य मिनीस्कोप सिस्टम ^{7,8,9,10,11,13,25,26} ^के साथ NIDA में कस्टम-निर्मित मिनीस्कोप सिस्टम ^की तुलना। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

मूवी 1: एक खुले क्षेत्र परीक्षण के दौरान माउस एमपीएफसी से एक इन विवो कैल्शियम इमेजिंग रिकॉर्डिंग। प्रदर्शन उद्देश्यों के लिए, यह वीडियो केवल 1 मिनट की रिकॉर्डिंग दिखाता है। मूल रिकॉर्डिंग फ़्रेम दर 10 फ़्रेम/ वीडियो मूल रिकॉर्डिंग की तुलना में 6 गुना तेज है। इस फिल्म को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

तंत्रिका विज्ञान में एक केंद्रीय प्रश्न यह समझ रहा है कि तंत्रिका गतिशीलता और सर्किट जानकारी को कैसे एन्कोड और स्टोर करते हैं, और मस्तिष्क रोगों में उन्हें कैसे बदल दिया जाता है। विवो सीए^{2 +} इमेजिंग सिस्टम में एक मिनोस्कोप का उपयोग करते हुए, स्थानीय माइक्रोसर्किट के भीतर कई सैकड़ों न्यूरॉन्स से व्यक्तिगत तंत्रिका गतिविधि को एक साथ स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवर से मॉनिटर किया जा सकता है। यहां, वायरल इंजेक्शन और GRIN लेंस आरोपण के लिए एक विस्तृत सर्जरी प्रोटोकॉल को एक कस्टम-विकसित मिनीस्कोप रिकॉर्डिंग सिस्टम के माध्यम से विवो सीए^{2 +} इमेजिंग में एक गहरे मस्तिष्क के लिए कृन्तकों को तैयार करने के लिए वर्णित किया गया है। तालिका 1 अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और कस्टम-निर्मित मिनीस्कोप सिस्टम ^{7,8,9,10,11,13,25,26} के साथ हमारे मिनीस्कोप सिस्टम ^की तुलना दिखाती ^है। यह ध्यान देने योग्य है कि वर्तमान सर्जिकल प्रोटोकॉल का उपयोग करके GRIN लेंस आरोपण विवो कैल्शियम इमेजिंग में एक गहरे मस्तिष्क के लिए किसी भी वाणिज्यिक या कस्टम-निर्मित एकल-फोटॉन और दो-फोटॉन इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत है।

वायरल इंजेक्शन से लेकर विवो कैल्शियम इमेजिंग में मिनीस्कोप के डेटा अधिग्रहण तक, पूरी प्रयोगात्मक प्रक्रिया को पूरा करने में कम से कम 2 महीने लगते हैं। यह एक जटिल और श्रम-गहन प्रक्रिया है। प्रयोग की अंतिम सफलता कई कारकों पर निर्भर करती है, जिसमें जीईसीआई की उचित पसंद, लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र में सटीक रूप से वायरस का इंजेक्शन, वांछित तंत्रिका आबादी में पर्याप्त वायरल अभिव्यक्ति, वांछित स्थान पर ग्रिन लेंस का आरोपण, सर्जरी से पर्याप्त वसूली, साथ ही साथ, क्या गंभीर सूजन सर्जरी के बाद होती है, और क्या जानवर का व्यवहार सर्जरी से गंभीर रूप से प्रभावित होता है, और क्या जानवरों का व्यवहार सर्जरी से गंभीर रूप से प्रभावित होता है, और इसी तरह।

दो महत्वपूर्ण चरणों में वायरस के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन और GRIN लेंस आरोपण शामिल हैं। प्रदर्शन के उद्देश्य के लिए, स्टीरियोटैक्सिक माइक्रोइंजेक्शन माउस एमपीएफसी में किया गया था, जिसमें एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी 1) कैमकेआईआई प्रमोटर के नियंत्रण में GCaMP6f एन्कोडिंग करता है जो चुनिंदा रूप से एमपीएफसी में पिरामिड न्यूरॉन्स को लेबल करता है। GCaMP6f को चुना गया था क्योंकि यह 71 ms¹⁵ के आधे क्षय समय के साथ सबसे तेज़ और सबसे संवेदनशील कैल्शियम संकेतकों में से एक है। इसके अलावा, GCaMP6f की AAV वायरल अभिव्यक्ति लंबे समय तक चलने वाली है (यानी, कई महीने), यह न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के माउस मॉडल में अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए एक लंबी अवधि में विवो सीए^{2 +} इमेजिंग में दोहराए जाने वाले प्रदर्शन के लिए आदर्श बनाता^है। वर्तमान सर्जरी प्रोटोकॉल को किसी भी अन्य मस्तिष्क क्षेत्र में विभिन्न सेल आबादी को लक्षित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विभिन्न उपलब्ध वायरल उपकरण वांछित उम्र में वांछित मस्तिष्क क्षेत्र में विशिष्ट तंत्रिका आबादी के चयनात्मक लेबलिंग की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, शोधकर्ता जेनेटिक संशोधनों को पूरा करने और व्यवहार और तंत्रिका सर्किटरी परिणाम^28,29 का अध्ययन करने के लिए क्रे-लोक्सपी पुनर्संयोजन प्रणाली और विभिन्न उपलब्ध ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का लाभ उठा सकते ^हैं।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल की एक अनूठी विशेषता यह है कि स्वचालित परत-दर-परत मस्तिष्क ऊतक आकांक्षा GRIN लेंस (व्यास में 1 मिमी) आरोपण से पहले की गई थी। यह एक वैक्यूम सिस्टम से जुड़ी 27 जी सुई के माध्यम से प्राप्त किया जाता है, जिसे कस्टम-निर्मित रोबोटिक आर्म और सॉफ्टवेयर²³ द्वारा नियंत्रित किया जाता है। हमारे अनुभव के आधार पर, यह विधि GRIN लेंस से संपर्क करने के लिए एक समान सतह उत्पन्न करती है और मैनुअल ऊतक आकांक्षा²³ की तुलना में पड़ोसी ऊतक को कम नुकसान पहुंचाती है। इस कारण से, यह प्रक्रिया अपेक्षाकृत व्यापक व्यास (जैसे, 1 मिमी) के साथ GRIN लेंस के लिए एक स्पष्ट लाभ लाती है। हालांकि, एक छोटे व्यास (0.5 मिमी या 0.25 मिमी) के साथ एक GRIN लेंस को प्रत्यारोपित करने के लिए ऊतक आकांक्षा आवश्यक नहीं हो सकती है। इसके बजाय, इसे सीधे 30 जी सुई²¹ के साथ बनाए गए अग्रणी ट्रैक के साथ लगाया जा सकता है।

ऊपर चर्चा किए गए दो महत्वपूर्ण चरणों के अलावा, एक सफल ऑपरेशन के लिए कई अन्य कारकों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। (1) संक्रमण को रोकने के लिए मस्तिष्क से संपर्क करने वाले सभी उपकरणों को निष्फल किया जाना चाहिए। (2) आगे की सूजन और अत्यधिक निशान ऊतक गठन को रोकने के लिए मस्तिष्क को नुकसान को कम करने के लिए सभी सर्जरी चरणों को करने की आवश्यकता होती है। (3) शुरू में दी गई संज्ञाहरण खुराक और सर्जरी के दौरान बनाए रखा जाता है, विशेष रूप से इंट्रापेरिटोनियल रूप से प्रशासित, ध्यान से विचार करने की आवश्यकता है। संज्ञाहरण खुराक को विभिन्न माउस उपभेदों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है, क्योंकि कुछ अधिक संवेदनशील हो सकते हैं। (4) सर्जरी के दौरान माउस की स्थिति की लगातार निगरानी करने की आवश्यकता होती है। अंत में, (5) चूहों को सर्जरी के बाद नियमित रूप से निगरानी करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि सर्जरी के बाद कई जटिलताएं हो सकती हैं।

यद्यपि मस्तिष्क के ऊतकों का एक हिस्सा GRIN लेंस आरोपण चरण के दौरान एकतरफा हटा दिया जाता है, हमने किसी भी स्पष्ट व्यवहार घाटे ^7,12 का निरीक्षण नहीं किया। मिनीस्कोप का वजन लगभग 2 ग्राम है और केबल को हल्का बनाने और यह सुनिश्चित करने के लिए कस्टम-डिज़ाइन किया गया है कि माउस इसे आसानी से ले जा सकता है। मिनीस्कोप और केबल केवल विवो इमेजिंग से पहले जानवर से जुड़े होते हैं और इमेजिंग के बाद अलग हो जाते हैं। पूरी इमेजिंग प्रक्रिया में आमतौर पर 30 मिनट से अधिक समय नहीं लगता है। इसलिए, ये इंस्ट्रूमेंटेशन माउस को स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने से नहीं रोकते हैं। Miniscope स्थापना और deinstallation चरणों पशु नियंत्रण के उद्देश्य के लिए isoflurane के साथ एक संक्षिप्त संज्ञाहरण (2 मिनट से कम) की आवश्यकता है। हम आमतौर पर माउस को विवो इमेजिंग में प्रदर्शन करने से पहले 30 मिनट के लिए आइसोफ्लुरेन के संक्षिप्त जोखिम से ठीक होने देते हैं। हमने माउस स्वास्थ्य और माउस सामाजिक व्यवहार¹² पर किसी भी प्रभाव को देखे बिना कुछ हफ्तों के लिए प्रति सप्ताह एक बार विवो कैल्शियम इमेजिंग में मिनीस्कोप का प्रदर्शन किया है।

वर्तमान मिनीस्कोप रिकॉर्डिंग सिस्टम की एक प्रमुख सीमा डेटा अधिग्रहण के लिए माइक्रोस्कोप को केबल से जोड़ने की आवश्यकता है। केबल की उपस्थिति कभी-कभी माउस कार्य प्रदर्शन को प्रतिबंधित करती है और एक समय में एक जानवर की रिकॉर्डिंग को सीमित करती है। हाल ही में, एक वायरलेस^{मिनीस्कोप 25,26} विकसित किया गया है। यह कार्य प्रदर्शन को व्यापक बनाएगा और एक समूह में कई जानवरों से विवो इमेजिंग में एक साथ अनुमति देगा। इसके अलावा, दोहरे रंग के मिनीस्कोप के साथ संयुक्त वर्णक्रमीय वियोज्य तरंग दैर्ध्य के साथ अधिक संवेदनशील जीईसीआई विकसित करना तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के लिए अधिक रोमांचक संभावनाएं प्रदान करेगा।

Disclosures

लेखकों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की रिपोर्ट नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) 5P20GM121310, R61NS115161, और UG3NS115608 से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs	KF technology	8000037800	For craniotomy
27-G and 30-G needle	BD PrecisionGlide Needle	REF 305109 and REF305106	For both surgeries
45 angled forceps	Fine Science tools	11251-35	For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine)	Purdue Products L.P.	NDC 67618-151-17	Surface disinfectant
Acetone	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN lens cleaner
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539-25G	For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment	HeliDerm Technology	81073087	For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)	Johnson & Johnson Consumer Inc	30043308	Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota	NIDA/IRP	github.com/liang-bo/autostereota	For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	For recording behavior
Brass hex nut	McMASTER-CARR	92736A112	For GRIN lens implantation
Buprenorphine	Par Pharmaceuticals	NDC 4202317905	For GRIN lens implantation
Calcium chloride	Sigma	10043-52-4	For preparing aCSF
Commutator	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank	Rocky Mountain Air Solutions	BI-OX-CD5C-K	For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank	Rocky Mountain Air Solutions	OX-M-K	For virus injection
Cordless Microdrill	KF technology	8000037800	For craniotomy
Cyanoacrylate	Henkel Coorporation	# 1811182	For GRIN lens implantation
Data acquisition controller	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Data transmission cable	NIDA/IRP	Custom-designed	Component of image acquisition system
Dental cement set	C&B Metabond and Catalyst	A00253revA306 and A00168revB306	For GRIN lens implantation
Dental cement set	Duralay	2249D	For GRIN lens implantation
Dexamethasone	VETone	NDC 1398503702	For GRIN lens implantation
Dextrose	Sigma	50-99-7	For preparing aCSF
Diet gel	Clear H20	72-06-5022	Diet Supplement for mouse
GRIN lens	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	For GRIN lens implantation
Heating Pad	Physitemp Instruments LLC.	#10023	To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane	VETone	V1 502017	Anesthesia
Ketamine	VETone	V1 501072	For GRIN lens implantation
Lidocaine	WEST-WARD	NDC 0143-9575-01	Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	7791-18-6	For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton)	Hamilton	7653-01	For virus injection
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instrument	#178647	For virus injection
Miniscope	NIDA/IRP	Custom-designed	For imaging
Miniscope base	Protolabs	Custom-designed	For mounting the base
Miniscope holding arm	NIDA/IRP	Custom-designed	For mounting the base
Miniscope protection cap	Protolabs	Custom-designed	For protecting the miniscope
Motorized controller	Thorlabs	KMTS50E	For mounting the base
NeuView	NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	For in vivo imaging
Ophthalmic ointment	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	Ophthalmic
PCR tube	Thermo Scientific	AB-0622	For GRIN lens implantation
Pinch Clamp	World Precision Instrument	14040	For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape	TegaSeal PTFE Tape	A-A-58092	For fastening miniScope to the base
Potassium chloride	Sigma	7447-40-7	For preparing aCSF
Robotic arm	NIDA/IRP	Custom-designed	For GRIN lens implantation
Saline	Hospira	RL 7302	For both surgeries
Set screw	DECORAH LLC.	3BT-P9005-00-0025	For screwing the brass hex nut in miniscope base
Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD	McMaster	2124T3	For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate	Sigma	144-55-8	For preparing aCSF
Sodium chloride	Sigma	7647-14-5	For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic	Sigma	7558-80-7	For preparing aCSF
Stereotaxic stage	KOPF	Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic	For both surgeries
Sterile cotton swab	Puritan	REF 806-WC	For both surgeries
Surgical tools	Fine Science tools	11251-35	For surgeries
Suture	Sofsilk	REF SS683	For virus injection
Syringe filter (0.22 µm)	Millex	SLGVR33RS	For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)	Addgene	100834-AAV1	For virus injection
		Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine	VETone	V1 510650	For GRIN lens implantation

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits⁷^,¹². The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior¹².

Neuroscience

स्टीरियोटैक्सिक वायरल इंजेक्शन और वीवो कैल्शियम इमेजिंग में गहरे मस्तिष्क के लिए ग्रेडिएंट-इंडेक्स लेंस आरोपण

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Representative Results

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