Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stereotoksisk viral injeksjon og gradient-indeks linse implantasjon for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63049
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

ERRATUM NOTICE

Summary

Miniskop in vivo kalsiumavbildning er en kraftig teknikk for å studere nevrondynamikk og mikrokretser i fritt oppførende mus. Denne protokollen beskriver å utføre hjerneoperasjoner for å oppnå god in vivo kalsiumavbildning ved hjelp av et miniskop.

Abstract

Et miniatyrfluorescensmikroskop (miniskop) er et potent verktøy for in vivo kalsiumavbildning fra fritt oppførende dyr. Det gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle multi-photon kalsiumavbildningssystemer: (1) kompakt; (2) nedtonet; (3) rimelig; og (4) tillater opptak fra fritt oppførende dyr. Denne protokollen beskriver hjerneoperasjoner for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning ved hjelp av et spesialutviklet miniskopopptakssystem. Forberedelsesprosedyren består av tre trinn, inkludert (1) stereotaxically injisere viruset i ønsket hjerneregion av en musehjerne for å merke en bestemt undergruppe av nevroner med genetisk kodet kalsiumsensor; (2) implantasjon av gradient-indeks (GRIN) linse som kan videresende kalsium bilde fra dyp hjerne region til miniskopsystemet; og (3) feste miniskopholderen over museskallen der miniskopet kan festes senere. For å utføre in vivo kalsiumavbildning, er miniskopet festet på holderen, og nevronale kalsiumbilder samles sammen med samtidige atferdsopptak. Den nåværende kirurgi protokollen er kompatibel med noen kommersielle eller spesialbygde single-photon og to-photon bildebehandling systemer for dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.

Introduction

Intracellulær Ca2+ signalering er en viktig regulator for cellevekst, spredning, differensiering, migrasjon, gentranskripsjon, sekresjon og apoptose1. I nevroner kontrolleres Ca2+ signalering nøyaktig siden det romlige-temporale mønsteret er relatert til viktige funksjoner som membraneksitabilitet, nevrotransmitterutløsning og synaptisk plastisitet2.

In vivo kalsiumavbildning er en kraftig teknikk som kan brukes til å dekode nevral kretsrepresentasjon elementær til normal dyreatferd, identifisere avvikende nevronaktiviteter i dyremodeller av hjernesykdommer, og avdekke potensielle terapeutiske mål som kan normalisere disse endrede kretsene. De to vanlige in vivo kalsiumavbildningssystemene er tofoton laserskanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 og hodemontert miniatyrisert mikroskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Den konvensjonelle to-fotonmikroskopien gir kommanderende fordeler som bedre oppløsning, lavere støy og lavere fotobleaching; De eksperimentelle dyrene må imidlertid være hodefaste, noe som begrenser atferdsstudiene som kan utføres 3,4,5,6. Derimot er det hodemonterte miniskopsystemet lite og bærbart, noe som gjør det mulig å studere et bredt utvalg av atferdstester ved hjelp av fritt oppfører dyr 7,8,9,10,11,12,13.

Det er to ledende Ca2+ indikatorer, kjemiske indikatorer 5,14 og genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer)15,16. Ca2 + avbildning har blitt tilrettelagt ved å bruke svært sensitive GECIer levert med virale vektorer som tillater spesifikk merking av nevroner i den målrettede kretsen. Den kontinuerlige innsatsen for å forbedre følsomheten, levetiden og evnen til å merke selv de subcellulære rommene, gjør GECIer ideelle for ulike in vivo kalsiumavbildningsstudier 17,18,19.

Spredningen av lys i hjernevev under avbildning begrenser den optiske penetrasjonen i dybden, selv med to-fotonmikroskopi. Gradient Index (GRIN)-objektivet overvinner imidlertid dette problemet, da GRIN-objektivet kan bygges direkte inn i det biologiske vevet og videresende bilder fra den dype hjerneregionen til mikroskopmålet. I motsetning til konvensjonell linse laget av optisk homogent materiale og krever en komplisert formet overflate for å fokusere og lage bilder, er GRIN-linseytelsen basert på en gradvis brytningsindeksendring i linsematerialet som oppnår fokus med en planoverflate20. GRIN linse kan fremstilles ned til 0,2 mm i diameter. Derfor kan en miniatyrisert GRIN-linse implanteres i den dype hjernen uten å forårsake for mye skade.

I denne artikkelen presenteres en komplett kirurgiprotokoll for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning. For demonstrasjonsformålet beskriver vi hjerneoperasjoner spesielt rettet mot medial prefrontal cortex (mPFC) av musehjernen og in vivo kalsiumavbildningsopptak via et spesialbygd miniskopsystem utviklet av Dr. Lins gruppe ved National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Den eksperimentelle prosedyren involverer to store hjerneoperasjoner. Den første operasjonen er stereotaktisk injisere en viral vektor som uttrykker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den andre operasjonen er å implantere GRIN-linsen i samme hjerneregion. Etter utvinning fra disse hjerneoperasjonene, er den påfølgende prosedyren å feste miniskopholderen (basen) på museskallen ved hjelp av tannsement. In vivo Ca2+ avbildning kan utføres når som helst etter montering av miniskopet på basen. Kirurgiprotokollen for viral injeksjon og GRIN linseimplantasjon er kompatibel med alle kommersielle eller spesialbygde enkeltfoton- og tofotonavbildningssystemer for dyp hjernein vivo kalsiumavbildning.

Protocol

Den eksperimentelle protokollen følger retningslinjene for dyrepleie ved University of Wyoming. Musen som brukes i denne studien er 6 måneder gammel mannlig C57BL / 6J. Prosedyren kan brukes til å målrette mot dype hjerneregioner for in vivo kalsiumavbildning. Her, for demonstrasjon, er det målrettede hjerneområdet musen mPFC (fremre og bakre (A / P): 1,94 mm, medial og lateral (M / L): 0,5 mm, dorsal og ventral (D / V): 1,8 mm). Denne protokollen endres basert på den tidligere publiserte protokollen21.

1. Stereotoksisk injeksjon av virus i mPFC (figur 1)

  1. Forberedelse til operasjonen
    1. Steriliser alle kirurgiske instrumenter ved hjelp av en autoklav og legg dem over en steril overflate.
    2. Forbered en 10 μL sprøyte ved å grunne den med saltvann og forfylle den med 5 μL saltvann. Fest sprøyten til en mikropumpe (se Materialfortegnelse).
    3. Slå på varmeputen og hold temperaturen ved 35 °C.
  2. Plasser musen i induksjonskammeret (5 x 10 x 4 tommer, lengde x bredde x høyde) med 5 % isofluran og 1 l/min oksygenstrøm. Se nøye på og tell musens åndedrettsfrekvens. Ta ut musen når åndedrettsfrekvensen minker til 1 pust/s.
    MERK: Musens pustefrekvens kan enkelt overvåkes ved å se nedover og oppover ryggmuskelbevegelsen under hver innånding.
  3. La musen slå seg ned på et benkeplateområde atskilt fra det kirurgiske området. Med en barberingsklipper barberer du håret av fra musehodet til de første livmorhalsvirvlene.
  4. Sett musen på stereotaxic scenen (se Tabell over materialer) og sikre sin posisjon med ørestenger og neseklips. Oppretthold isofluranstrømmen til det stereotaktiske stadiet ved 1,5% isofluran og 0,5 l / min oksygenstrømhastighet.
  5. Påfør smøre oftalmisk øyesalve på begge øynene med en ren bomullspinne for å forhindre tørrhet i øynene under operasjonen. Vurder pedal reflekser på musen for å bekrefte at musen er fullt bedøvet før du starter operasjonen.
  6. Desinfiser det hårløse området med 7,5% povidon-jodoppløsning (se Materialbord) og 70% etanol tre ganger hver ved hjelp av sterile bomullspinne.
  7. Injiser et lite volum (50 μL) av 2% lidokain under huden på det hårløse området.
  8. Lag et 2 cm snitt gjennom huden langs midtlinjen ved hjelp av en skalpell for å eksponere lambda og bregma i skallen.
  9. Fjern fascia fra skallen ved hjelp av tørre bomullspinne og spisse tang.
  10. Etter at bregma og lambda er synlige, bruk spissen av en tannborer burr (0,5 mm i diameter) for å måle Z-koordinatene til bregma og lambda (se Materialtabellen). Juster høyden på neseholderen til bregma og lambda ligger i samme Z-posisjon.
  11. Plasser den 0,5 mm tannborehullet i en posisjon på A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm fra bregmaen. Bor gjennom skallen.
    MERK: Her, for demonstrasjon, er den målrettede hjerneregionen musen mPFC. Denne protokollen kan brukes til å målrette mot alle andre dype hjerneregioner. Hvis for eksempel det målrettede hjerneområdet er Nucleus Accumbens (NAc), bør den tilsvarende posisjonen være A/P: 0,9 mm, M/L: 1,2 mm.
  12. Fjern duraen med en 30 G nålespiss og rengjør alle biter av benrester med 45° vinklede skarpe tang.
    MERK: Blødning er vanlig, da små blodårer kan bli revnet under rengjøringstrinnet. Bruk sterile bomullspinne for å stoppe blødning og påfør saltvann for å vaske området. Påfør saltvann på det eksponerte skalleområdet for å holde det fuktig.
  13. Last viruset inn i mikrolitersprøyten ved hjelp av mikropumpens kontrollpanel. Trekk ut 500 nL luftboble etterfulgt av 800 nL av viruset med en strømningshastighet på 50 nL/s.
    MERK: For demonstrasjonsformålet injiseres her en adeno-assosiert virusservotype 1 (AAV1) som uttrykker GCaMP6f (en GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, i mPFC (se Materialfortegnelse). Titeret av viruset er 2,8 x 1013 GC / ml. Det er 1:2 fortynnet i saltvann før injeksjon.
  14. Plasser spissen av nålen på toppen av bregmaen for å bare berøre bregmaen og notere ned Z-koordinaten til bregma. Beveg nålen over det borede hullet og injiser 100 nL av viruset for å sikre at nålen ikke er tilstoppet.
  15. Beveg nålen sakte ned i hjernevevet til den målrettede Z-koordinaten til D/V: 1,75 mm og beveg den deretter litt opp til Z-koordinaten til D/V: 1,65 mm.
    MERK: Dette er for å lage en liten lomme for den virale løsningen som skal infunderes. Hvis den målrettede hjerneregionen er NAc, bør den tilsvarende målrettede Z-koordinaten til D / V være 4,2 mm, og deretter bevege seg litt opp til 4,1 mm.
  16. Bruk kontrollpanelet til å stille inn mikropumpen til å injisere 500 nL av viruset med en strømningshastighet på 50 nL/min. Trykk på RUN-knappen på kontrollpanelet for å injisere viruset.
    MERK: Injeksjonen tar ca. 10 min. Etter at injeksjonen er over, vent i ytterligere 5-10 minutter før du tar nålen ut av hjernen. Påfør ofte saltvann for å holde det eksponerte skalleområdet fuktig i injeksjonsperioden.
  17. Flytt nålen opp og ut av hjernen. Injiser 500 nL volum to ganger med strømningshastigheten på 50 nL/s.
    MERK: Dette trinnet bekrefter at et riktig volum av viruset har blitt administrert i hjernen. I løpet av de første 500 nL injeksjonene frigjøres viruset, etterfulgt av luftbobler. Under den andre 500 nL-injeksjonen vises luftbobler først, etterfulgt av saltvann. Sprøyten er nå klar til å laste viruset for neste mus. Når operasjonen er ferdig, rengjøres mikrolitersprøyten og nålen grundig med aceton etterfulgt av saltvann.
  18. Still opp hudkantene og lukk snittet forsiktig med en sutur (størrelse 4.0). Påfør antibiotikasalve på det sydde området for å forhindre infeksjon.
  19. Fjern musen fra stereotaxic scenen og returner den til hjemmeburet. Plasser hjemmeburet i en 33 °C inkubator til musen er ambulerende.
    MERK: Det tar vanligvis 10-15 min for en mus å våkne opp fra isofluranbedøvelse før den begynner å bevege seg rundt.
  20. Etter at musen begynner å bevege seg rundt, administrer ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler i 3 postsurgiske dager (se Materialfortegnelse). La musen komme seg etter operasjonen i 14 dager før du forfølger GRIN linse implantasjon.

2. GRIN-objektivimplantasjon i mPFC (figur 1)

  1. Forberedelse til operasjonen
    1. Forbered den kunstige cerebrospinalvæsken (ACSF) som inneholder 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1,2 mM MgCl2, 25 mM glukose, 26 mM NaHCO3 og 2,4 mM CaCl2.
    2. Steriliser alle kirurgiske instrumenter ved hjelp av en autoklav og legg dem over en steril overflate.
    3. Slå på varmeputen og hold temperaturen ved 35 °C.
    4. Smelt 1% Agarose og hold det i et vannbad ved 42 °C til bruk.
      MERK: Den smeltede agarose kan holdes i vannbadet i et par timer.
    5. Desinfiser et GRIN-objektiv (1 mm i diameter, 4,38 mm i lengde, figur 2A) i 70 % etanol i 15 minutter, overfør det til et rør fylt med saltvann for å skylle det ordentlig før implantering.
      MERK: GRIN-linser (se Materialbord) produseres via sølv- og litium-ion-utveksling i spesielle briller, noe som gjør dem giftfrie og nevronvennlige 6,7. Imidlertid kan mange kommersielt tilgjengelige GRIN-linser lekke giftige rester, noe som forårsaker nevrodegenerasjon, noe som gjør dem uegnet til implantasjon i levende hjerne for langsiktige in vivo-bildestudier. Disse GRIN-linsene kan kreve belegg med biokompatible midler som parylen-C for å forhindre giftige bivirkninger på nærliggende nevroner22.
  2. Vei musen og bedøv den ved en intraperitoneal injeksjon av Ketamin/Xylazine-blanding (se Materialfortegnelse) (Ketamin:100 mg/kg; Xylazine: 15 mg/kg).
    MERK: En mus som veier 30 g krever 300 μL Ketamin/Xylazine-blanding (Ketamin 100 mg/ml og Xylazin 1,5 mg/ml) for den første dosen og 150 μL Ketamin (10 mg/ml) for ytterligere doser under operasjonen. For å holde musen bedøvet under hele kirurgisk prosess, må ytterligere doser av Ketamin (50 mg / kg) administreres minst en gang i timen. Anestesistadiet av musen må overvåkes ofte ved å vurdere pedalreflekser.
  3. Barber håret av det kirurgiske området med en barbermaskin og rengjør håret med et vått papirhåndkle.
  4. Plasser musen i stereotaxic scenen og sikre sin posisjon ved å stramme neseklips og ørestenger. Påfør smøring av oftalmisk øyesalve på begge øynene med en steril bomullspinne. Bekreft at musen er fullstendig bedøvet ved å vurdere pedal reflekser.
  5. Desinfiser det hårløse området med 7,5% povidon-jodoppløsning og 70% etanol tre ganger hver ved hjelp av sterile bomullspinne. Administrer 2 mg/kg Deksametason intramuskulært i låret for å redusere risikoen for kirurgirelatert hevelse og betennelse.
  6. Injiser 50 μL 2% Lidokain under huden på operasjonsområdet.
  7. Bruk en fin saks til å skille ut et 1,5 cm (høyde) x 1,0 cm trekantet hudområde, fra den fremre siden mellom øynene til den bakre siden bak lambdaen.
  8. Fjern periosteumvevet fra skallen ved hjelp av fine tang, mikroblad og bomullspinne.
    MERK: Skallen skal rengjøres grundig og tørkes før neste trinn forfølges.
  9. Påfør cyanoakrylat (se Materialfortegnelse) på kantene av huden og fest huden til skallen. Vent i 5 min til cyanoacrylaten tørker.
  10. Ved hjelp av en 0,5 mm borergravspiss justerer du bregma og lambda i samme horisontale plan ved å justere høyden på neseklemmen.
  11. Finn en tannborerør (1,2 mm i diameter) til en posisjon på A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm fra bregmaen. Bor gjennom skallen. Fjern duraen med en 30 G nålespiss og rengjør alle biter av benrester med 45° vinklede skarpe tang.
    MERK: Dette benrester kan blokkere det påfølgende aspirasjonstrinnet hvis det ikke fjernes helt.
  12. Fest en 27 G manuelt polert stump nål (figur 2B) til nåleholderen koblet til en robotarm vippet med en vinkel på 10° (figur 2C). Koble den andre enden av nåleholderen til husvakuumsystemet.
    MERK: Robotarmen (se Materialfortegnelser) er utviklet av Dr. Lins gruppe ved NIDA/IRP og styres av en spesialutviklet programvare med åpen tilgang, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Finn spissen av nålen for å bare berøre bregmaen. Sett Z-koordinaten til bregma til 0 ved å klikke på Bregma-knappen på AutoStereota.
  14. Sett Input X-verdien til 0,8, Input Y-verdien til 1,94, Input Z-verdien til 1,0, og klikk deretter på Finn-knappen for å flytte nålen til toppen av det borede hullet på skallen.
  15. Juster nålens posisjon til midten av det eksponerte hjernevevsområdet via AutoStereota.
    MERK: For å flytte nålen i side- eller medialretninger, skriv inn trinnverdien og klikk på Lateral - eller Medial-knappene på AutoStereota. På samme måte, for å flytte nålen i fremre eller bakre og dorsale eller ventrale retninger, klikk på henholdsvis Rostral - eller Caudal - og Dorsal - eller Ventral-knappene .
  16. Slå på vakuumet og begynn å skylle det eksponerte hjerneområdet med ACSF gjennom et tyngdekraftkontrollert rørsystem (se Materialbord) koblet til en 30 G nål med bøyd spiss. ACSF blir kontinuerlig boblet med en gassblanding på 95% O2 og 5% CO2 og filtrert gjennom et 0,2 μm filter.
    MERK: ACSF-strømningshastigheten er ~ 1,5 ml/min. Gassblandingens utgangstrykk holdes på ~ 3 psi.
  17. Aspirer hjernevev lag for lag ved hjelp av AutoStereota-programvare (Figur 3).
    MERK: Aspirasjon av hjernevev fullføres i 4 runder slik at en søylelomme (1,8 mm i dybden og 1 mm i diameter) genereres.
    1. I "zStep" -økten klikker du og sjekker første og andre rad. Sett verdiene for den første raden til 0,2 og 1. Sett verdiene for den andre raden til 0,15 og 4 (figur 3A).
    2. I "Mode"-økten angir du Nålstørrelse 27 Gauge og 1.2, sett Dims 0.9. Alle andre verdier bruker standardverdier (figur 3A).
    3. Klikk sekvensielt på Knappene Angi, Behold null og Start for å starte aspirasjonen.
      MERK: Dette er 1m aspirasjonsrunde. Inndataverdier angir at aspirasjonsdybden er 0,2 mm (fra Z-koordinaten på 0) i det første trinnet med 1 lag; I løpet av det andre trinnet er aspirasjonsdybden 0, 15 mm, kontinuerlig gjentatt for 4 lag. Aspirasjonsoppløsningen er 1,2, og diameteren er 0, 9 mm. Under aspirasjon kan den umiddelbare plasseringen av nålespissen overvåkes gjennom sporgrafpanelet. Etter å ha fullført denne aspirasjonsrunden, genereres en søylelomme med 0,8 mm i dybden og 1 mm i diameter. Nålespissen vil være tilbake til midten med Z-koordinaten på 0.
    4. I "zStep" -økten klikker du og sjekker første og andre rad. Sett verdiene for den første raden til 1 og 1. Sett verdiene for den andre raden til 0,15 og 4 (figur 3B).
    5. I "Mode"-økten beholder du alle verdier på samme måte som forrige runde (figur 3B).
    6. Klikk sekvensielt på Knappene Angi, Behold null og Start for å starte aspirasjonen.
      MERK: Dette er denandre runden med aspirasjon. Inngangsverdier indikerer at aspirasjonsdybden er 1 mm (fra Z-koordinaten på 0) i det første trinnet med 1 lag; I løpet av det andre trinnet er aspirasjonsdybden 0, 15 mm, kontinuerlig gjentatt for 4 lag. Etter å ha fullført denne aspirasjonsrunden, genereres kolonnelommen med 1,6 mm i dybden og 1 mm i diameter.
    7. I "zStep" -økten klikker du og sjekker bare den første raden. Sett verdiene for den første raden til 1,8 og 1 (figur 3C).
    8. I "Mode"-økten angir du Nålstørrelse 27 Gauge og 2.2. Alle andre verdier forblir de samme som i forrige runde (figur 3C).
    9. Klikk sekvensielt på Knappene Angi, Behold null og Start for å starte aspirasjonen.
      MERK: Dette er 3rd runde av aspirasjon. Inngangsverdier indikerer at aspirasjonsdybden er 1,8 mm (fra Z-koordinaten på 0) med 1 lag. Ambisjonsoppløsningen er 2,2. Etter å ha fullført denne aspirasjonsrunden, genereres søylelommen med 1,8 mm i dybden og 1 mm i diameter.
    10. I "zStep" -økten klikker du og sjekker bare den første raden. Sett verdiene for den første raden til 1,6 og 1 (figur 3D).
    11. I "Mode"-økten angir du Nålstørrelse 27 Gauge og 2.2, sett Dims 0.6 (Figur 3D).
    12. Klikk sekvensielt på knappene Angi, Behold null og Start for å starte aspirasjonen.
      MERK: Dette er denfjerde aspirasjonsrunden. Hensikten med dette trinnet er å rense ut blod akkumulert i lommen. Blødning er vanlig ettersom små blodårer blir revet under aspirasjonsprosessen. For å rense ut blod grundig, stopp vanningen av ACSF i 5 min og slå deretter på vanning igjen. Gjenta denfjerde aspirasjonsrunden flere ganger til lommen er blodfri. Denne protokollen kan brukes til å målrette mot andre dype hjerneregioner. Hvis for eksempel det målrettede hjerneområdet er NAc, skal den endelige tilsvarende Z-koordinaten til D/V være 4,4 mm.
  18. Stopp vakuum og vanning av ACSF. Ta nålen til +2 mm Z-koordinat og 0,5 mm fremre til midten. Plasser den sterile 1 mm GRIN-linsen i lommen.
  19. Hold nålens spiss i kontakt med den eksponerte GRIN-linsen for å sikre at GRIN-objektivet settes i 10° vinkel. Trykk forsiktig på den øvre overflaten av GRIN-objektivet med sterilt mykt vevspapir for å sikre at den nedre overflaten av GRIN-objektivet er i kontakt med hjernevevet.
  20. Påfør smeltet Agarose i gapet mellom GRIN-linsen og hjernevevet ved hjelp av en slikkepott. Etter at Agarose danner en gel, fjern overflødig Agarose ved hjelp av et mikroblad.
  21. Rengjør skallen grundig med saltvann og bomullspinne. La skallen tørke før påfølgende tannsement (se Materialfortegnelse) påføring.
  22. Ta ut blandebrønnen fra -20 °C fryser. Bland tannsementpulveret og katalysatorvæsken og påfør et lag med selvherdende limharpikssement på skallen; Først omgir du GRIN-objektivet og dekker deretter hele den eksponerte skallen.
  23. Vent i 5 min og la den herdes helt. Fjern aspirasjonsnålen forsiktig.
  24. Bland dental sementpulver, svart trekull med væske, i en ren plastbrønn, og påfør et tynt lag av blandingen på toppen av det første laget av tannsement. Vent i 5 min for å la det herdes.
  25. Beskytt den eksponerte GRIN-linsen ved å dekke den med en tilpasset hette laget av et PCR-rør (figur 2D). Påfør cyanoakrylat for å feste hetten til tannsementen.
  26. Injiser 1 ml prewarmed saltvann subkutant i musen etterfulgt av 0,1 mg/kg Buprenorfin. Plasser musen tilbake i hjemmeburet. Plasser hjemmeburet i en 33 °C inkubator og overvåk musen til den er ambulerende. Det tar vanligvis 20-40 min for en mus å våkne opp fra anestesi før den begynner å bevege seg rundt.
  27. Administrer ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler og overvåk musen i minst 3 postsurgiske dager. La musen komme seg etter operasjonen i 30 dager.

3. Feste miniskopholderen (basen) til museskallen (figur 1)

  1. Bedøv musen i et induksjonskammer med 5% isofluran og 1 l / min oksygenstrømningshastighet til luftveiene reduseres til 1 pust / s.
  2. Plasser musen i stereotaxic scenen og sikre sin posisjon med ørestenger og neseklips. Oppretthold en kontinuerlig strømning av isofluran (1,5%) og oksygen (0,5 l/min).
  3. Påfør oftalmisk salve på øynene for å holde dem fuktige. Slå på varmeputen og hold temperaturen ved 35 °C. Bekreft at musen er fullstendig bedøvet ved å vurdere pedal reflekser.
  4. Fjern hetten som dekker GRIN-objektivet forsiktig ved hjelp av spisse tang. Bor av de tørkede cyanoacrylatrester fra tannsementen helt ved hjelp av en mikrodrill (se Materialtabell).
  5. Klipp håret rundt tannsementområdet med liten saks. Rengjør ruskene ved hjelp av en trykkluftduster. Bruk en aceton dyppet bomullspinne for å rengjøre den øvre overflaten av GRIN-linsen.
  6. Forbered miniskopet med holderen (basen).
    1. Plasser en sekskantmutter #00-90 (se Materialbord) i sporet som finnes i sokkelen, og påfør cyanoakrylat for å feste den der (figur 2E).
    2. Påfør et polytetrafluoretylenbånd (PTFE) tett rundt miniskopets tråd og trim av det ekstra båndet (figur 2F).
    3. Fest miniskopet til sokkelen og bruk låseskruen til å feste miniskopet til sokkelen (figur 2G).
    4. Koble miniskopet til kabelen og slå på den spesialutviklede programvaren NeuView (se Materialfortegnelse).
      MERK: NeuView programvare er spesialutviklet for miniskop in vivo kalsium avbildning fra Dr. Lin gruppe på NIDA / IRP 7,12. Det er åpen tilgang (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. I NeuView klikker du på Maskinvare, merker av for LED1 og klikker stream-knappen for å vise livebildene (figur 4A). For å stoppe live streaming, klikk på Stopp-knappen .
    6. Sett miniskopet inn i en spesialbygd miniskopholderarm (figur 2H) hvis XYZ-posisjon kan manipuleres ved hjelp av motoriserte kontrollere (figur 2I).
  7. Finn miniskopet rett over det eksponerte GRIN-objektivet og gjør det parallelt med overflaten på objektivet. Ta sakte ned miniskopet mot GRIN-objektivet og juster Z-posisjonen til det beste fokusplanet er funnet.
    MERK: Det beste fokusplanet bestemmes ved å sammenligne flere mulige Z-posisjoner og velge fokusplanet med en klar visualisering av de fleste cellelegemer.
  8. Påfør det første laget av tannsement rundt miniskopbasen nøye uten å endre miniskopets posisjon. Etter at sementen er herdet, fjern forsiktig holderarmen slik at miniskopet kan stå alene på musehodet.
    MERK: Tannsementen har en tendens til å krympe etter herding, og den vil dra miniskopet bort fra det opprinnelige fokusplanet. Vanligvis er miniskop Z-posisjonen litt løftet over det opprinnelige brennplanet før du bruker tannsement for å kompensere for den potensielle endringen.
  9. Påfør et andre lag med tannsement rundt basen for å fylle alle hullene og sikre at det ikke er noen LED-lyslekkasje fra hullene. La tannsementen herdes.
  10. Fjern musen fra stereotaxic scenen. Løsne låseskruen og løsne miniskopet fra sokkelen. Sett en 3D-trykt beskyttelseshette inn i sokkelen for å beskytte den eksponerte GRIN-linsen og stram låseskruen i sokkelen (figur 2J).
  11. Plasser musen tilbake i hjemmeburet.
    MERK: Det tar vanligvis 10-15 min for en mus å våkne opp fra isofluranbedøvelse før den begynner å bevege seg rundt.

4. Montering av miniskop og in vivo Ca2+ avbildning (figur 1)

  1. Monter miniskopet på basen
    1. Bedøv musen kort i induksjonskammeret (5% isofluran og 1 l / min oksygenstrømningshastighet). Plasser musen på et rent benkoverflate.
    2. Løsne låseskruen med en liten skrutrekker, fjern beskyttelseshetten og rengjør overflaten på GRIN-linsen med en aceton-gjennomvåt bomullspinne.
    3. Pakk et PTFE-tape tett rundt miniskoptråden og fest miniskopet til basen på musehodet.
    4. Koble miniskopet til kabelen (figur 2K), slå på NeuView-programvaren.
    5. I NeuView klikker du på Maskinvare, merker av for LED1 og klikker stream-knappen for å vise livebildene (figur 4A).
    6. Identifiser det beste fokusplanet ved å justere miniskopets posisjon i forhold til basen, enten litt stramming eller løsning ved hjelp av stumpe tang.
      MERK: Det beste fokusplanet bestemmes ved å sammenligne flere mulige steder og velge det med en klar visualisering av de fleste cellelegemer.
    7. Stram låseskruen og plasser musen tilbake i hjemmeburet.
    8. I NeuView justerer du LED-lyseffekten til det optimale nivået. Klikk på Capture og deretter Trigger-knappene for å starte innspillingen og trykke på Stopp etter 150 bilder.
      MERK: Den lavest mulige effekten bestemmer det optimale nivået på LED-effekten for å oppnå et lyst nok bilde. Hensikten med å spille inn en kort video er å legge til rette for å identifisere det samme fokusplanet i fremtiden for repeterende avbildning.
    9. Koble kabelen fra miniskopet. La musen komme seg i minst 30 minutter før du starter eksperimentet.
      MERK: For å beskytte miniskopet fjernes vanligvis vannflasken og trådmateren i løpet av denne korte tidsperioden. Hvis musen trenger å holde seg i hjemmeburet lenger, anbefales det å levere kommersielt tilgjengelig diettgel (se Materialbord) i hjemmeburet.
  2. Datainnsamling for in vivo kalsiumavbildning
    MERK: In vivo kalsiumavbildning kan utføres samtidig sammen med eventuelle atferdstester som forskeren ønsker. For demonstrasjonsformålet er eksemplet her invo Ca2+ avbildning under en åpen felttest. To datamaskiner kreves for å oppnå dette målet. Én datamaskin er utstyrt med kommersiell programvare (se Materialfortegnelse) for å kontrollere et kamera for å registrere museatferd automatisk. Den andre datamaskinen er utstyrt med NeuView for å kontrollere miniskopet og for å spille inn Ca2 + -bildene.
    1. Slå på programvaren for virkemåtekameraet (se Tabell over materialer) for å vise musevirkemåtearenaen gjennom en Livestream-funksjon. Juster fokuset på det øverste kameraet manuelt (figur 2L).
    2. Velg Utløser/Strobe og merk av for Aktiver/deaktiver utløser (figur 4B). Klikk På spill inn-knappen , bruk Bla gjennom for å velge plasseringen der atferdsopptak skal lagres, velg ønsket bildeformat.
      MERK: "Trigger Control" -funksjonen er aktivert for å tillate at atferdsopptaket utløses av NeuView-programvaren, slik at atferdsrammene og de tilsvarende kalsiumavbildningsrammene er temporalt koblet sammen. Atferdsopptaket kan lagres i hvilket som helst ønsket format. Innspilling av virkemåte lagres vanligvis i JPEG-format i den angitte mappen.
    3. Ta musen nær arenaen og koble miniskopet til kabelen som er koblet til datainnsamlingssystemet (figur 2L) (se Materialfortegnelse). Musen plasseres deretter i midten av arenaen.
    4. Med Livestream-funksjonen til NeuView-programvaren justerer du LED-kraften for å optimalisere lysstyrken til kalsiumbildet.
      MERK: For kalsiumavbildning er opptaksrammen som standard 10 bilder/s.
    5. I NeuView fjerner du merket for LED1, klikker på Capture og deretter Trigger-knappene for å starte innspillingen, og trykker stopp etter 100 bilder.
      MERK: Dette er for å spille inn bakgrunnsbilder for omtrent 100 bilder med LED-lys av.
    6. I programvaren for kameraets virkemåte klikker du på Start opptak (figur 4C). I NeuView, sjekk LED1, klikk på Capture, og deretter Trigger-knapper for å starte innspillingen. Trykk stopp etter 3000 bilder.
      MERK: Dette er for å registrere kalsiumavbildning og oppførsel samtidig. Testen med åpent felt er 15 minutter lang, vanligvis delt inn i tre innspillingsøkter hver på 5 minutter. Dette for å forhindre at miniskopet overopphetes på grunn av kontinuerlig bruk.
    7. Lagre både kalsiumavbildning og atferdsopptak i de angitte mappene. Gjenta innspillingen for to økter til mens du spiller inn bakgrunnen før hver økt, og lagre alle opptakene i den angitte mappen.
  3. Koble miniskopet fra basen.
    1. Når opptaket er fullført, kobler du kabelen fra miniskopet.
    2. Bedøv musen kort i induksjonskammeret (5% isofluran og 1L / min oksygenstrømhastighet). Plasser musen på en ren, varm overflate.
  4. Skru ut låseskruen i sokkelen og løsne miniskopet fra sokkelen. Sett beskyttelseshetten tilbake over sokkelen og stram låseskruen. Sett musen tilbake i hjemmeburet.

Representative Results

Figur 1 viser den skjematiske eksperimentelle prosedyren, inkludert viral injeksjon, GRIN-objektivimplantasjon, festing av miniskopbasen til museskallen og in vivo kalsiumavbildning via et miniskop. Hele prosedyren tar ~ 2 måneder. Figur 2 viser hovedkomponentene som er beskrevet i protokollen for miniskop in vivo kalsiumavbildning. Figur 3 viser grensesnittene til AutoStereota-programvaren under GRIN-objektivimplantasjon. Figur 4 viser grensesnittene til NeuView og programvare for innspilling av atferd under in vivo kalsiumavbildning.

Utfallet av in vivo kalsiumavbildning er avhengig av suksessen til både viral injeksjon og GRIN linse implantasjon operasjoner. Figur 5 viser en rekke resultater (dvs. mislykket, suboptimal og god) fra in vivo kalsiumavbildningsopptak. I mislykkede tilfeller kan kalsiumbildet virke enten mørkt eller lyst, men avslører vanligvis ingen eller svært få aktive nevroner. Vi forfølger vanligvis ikke in vivo kalsiumopptaksforsøk hvis det er færre enn fem aktive nevroner. En god in vivo kalsiumavbildning avslører vanligvis flere hundre aktive nevroner. Hvis et opptak inneholder mindre enn hundre aktive nevroner, anser vi det som et suboptimalt opptak.

I både suboptimale og gode opptak ble in vivo kalsiumavbildningsforsøk forfulgt, og den påfølgende dataanalysen ble utført. Film 1 viser en representativ in vivo kalsiumavbildning opptak fra musen mPFC. Atferdsvideoer og kalsiumavbildningsdata behandles vanligvis separat. Videoer med museatferd kan scores manuelt. Kalsiumavbildningsfiler behandles ved hjelp av CaImAn kalsiumbildebehandlingsverktøykasse24. Figur 6 viser et representativt cellekart og flere kalsiumspor fra et godt in vivo kalsiumavbildningsopptak.

Etter å ha fullført in vivo kalsiumavbildning, er det siste trinnet å bekrefte om viral injeksjon og GRIN linse implantasjon har skjedd i ønsket hjerneregion. Til dette formål ble musen perfundert med fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av 4% paraformaldehyd (PFA). Musehjernen ble høstet, postfixed i 4% PFA i 12 timer, og lagret i PBS ved 4 °C. Musehjernen ble deretter seksjonert i 50 μm tykke skiver med en vibratom. Hjerneskivene ble farget med DAPI og observert under mikroskopet (ikke beskrevet i protokollen)12. Figur 7 er en musehjerneskive ~ 1,94 mm fremre til bregma fra en eksperimentell mus, som viser sporet der GRIN-objektivet ble implantert. Den grønne fluorescensområdet under og rundt GRIN-linsesporet indikerer uttrykket for GCaMP6f i mPFC-regionen.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over eksperimentell prosedyre. (A) Stereotaxic injeksjon av virus i mPFC. (B) GRIN-objektivimplantasjon i mPFC. (C) Feste miniskopbase til museskallen. (D) Montering av miniskop og in vivo kalsiumavbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Hovedkomponenter som trengs for in vivo kalsiumavbildning. (A) Et GRIN-objektiv med en diameter på 1 mm og en lengde på 4,38 mm. (B) En 27 G manuelt polert stump-end nål som brukes til hjernevevsaspirasjon. (C) Robotarmen koblet til nåleholderen. (D) En skreddersydd hette fra et PCR-rør for å beskytte den eksponerte GRIN-linsen til festingen av miniskopbasen på museskallen. (E) Miniskopholderen (basen) med en sekskantmutter. (F) Et miniskop der gjengedelen er pakket inn i PTFE-båndet. (G) Et miniskop festet til basen med en låseskrue. (H) Miniskopet holder armen. (I) En spesialbygd 3D-motorisert kontroller som brukes til å lette bevegelsen av miniskop i XYZ-posisjoner. (J) En beskyttelseshette festet på basen for å beskytte den eksponerte GRIN-linsen mens musen ikke utfører in vivo kalsiumavbildning. (K) Miniskopet som er koblet til kabelen. (L) Datainnsamlingssystemet for in vivo Ca2+ avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Grensesnitt av AutoStereota-programvare under lag-for-lag hjernevevsaspirasjon. (A) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.1 til 2.17.3. (B) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.4 til 2.17.6. (C) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.7 til 2.17.9. (D) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.10 til 2.17.12. Røde bokser uthever inndataverdiene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Grensesnitt av NeuView-programvare og programvaren for innspilling av atferd under in vivo kalsiumavbildning. (A) Grensesnittet til NeuView. (B,C) Grensesnittene til programvaren for innspilling av oppførsel. Røde bokser uthever knapper som må klikkes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Maksimal projeksjonsfluorescenscellekart for å vise omfanget av mulige utfall. (A,B) Mislykket in vivo kalsiumavbildning som ikke er akseptabelt for etterfølgende dataanalyse. (A) er mørk og inneholder mindre enn 5 aktive nevroner. (B) er lys, men har ingen aktive nevroner. (C) Cellekartet fra en suboptimal in vivo kalsiumavbildning som inneholder noen aktive nevroner. (D) Cellekartet fra en god in vivo kalsiumavbildning som inkluderer flere hundre aktive nevroner. Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Representativt cellekart og kalsiumtransienter fra en vellykket in vivo kalsiumavbildning. Det venstre panelet er det maksimale projeksjonsfluorescenscellekartet fra et in vivo kalsiumavbildningsopptak i mPFC under en åpen felttest. Innspillingen varer i 5 min. Høyre panel viser kalsium forbigående fra 15 regioner av interesse (fargetilpasset). Skala bar: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Postmortem vurdering av en eksperimentell mus. Postmortem-vurderingen for GCaMP6f-uttrykk og GRIN-objektivimplantasjon i mPFC av en eksperimentell mus. Det rektangulære området angir banen for GRIN-objektivimplantasjon. Det grønne området under GRIN-objektivet implantert region bekrefter at GCaMP6f ble uttrykt, og GRIN-linsen ble implantert nettopp i ønsket hjerneregion. Cg, cingulate cortex; PrL, prelimb cortex; IL, infralimb cortex. Skalastang: 400 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Sammenligninger av det spesialbygde miniskopsystemet ved NIDA med andre miniskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Film 1: Et in vivo kalsium bildeopptak fra musen mPFC under en åpen felttest. For demonstrasjonsformål viser denne videoen bare 1 min innspilling. Den opprinnelige opptaksbildefrekvensen er 10 bilder/ s. Videoen er 6 ganger raskere enn den opprinnelige innspillingen. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Discussion

Et sentralt spørsmål innen nevrovitenskap er å forstå hvordan nevral dynamikk og kretser koder og lagrer informasjon, og hvordan de endres i hjernesykdommer. Ved hjelp av et miniskop in vivo Ca2+ bildebehandlingssystem kan individuell nevral aktivitet fra flere hundre nevroner i en lokal mikrokrets overvåkes samtidig fra et fritt oppførende dyr. Her er en detaljert kirurgiprotokoll for viral injeksjon og GRIN linseimplantasjon beskrevet for å forberede gnagere for en dyp hjerne in vivo Ca2 + avbildning via et spesialutviklet miniskopopptakssystem. Tabell 1 viser sammenligningene av vårt miniskopsystem med andre kommersielt tilgjengelige og spesialbygde miniskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Det er verdt å merke seg at GRIN linse implantasjon ved hjelp av den nåværende kirurgiske protokollen er kompatibel med noen kommersielle eller spesialbygde single-photon og to-photon bildebehandling systemer for en dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.

Fra viral injeksjon til datainnsamling av miniskop in vivo kalsiumavbildning tar hele eksperimentell prosedyre minst 2 måneder å fullføre. Det er en komplisert og arbeidsintensiv prosess. Den endelige suksessen til eksperimentet avhenger av flere faktorer, inkludert riktig valg av GECIer, injeksjon av virus nøyaktig i det målrettede hjerneområdet, tilstrekkelig viralt uttrykk i ønsket nevral populasjon, implantasjon av GRIN-linse nettopp på ønsket sted, tilstrekkelig gjenoppretting fra operasjoner, samt om alvorlig betennelse oppstår etter operasjonen, og om dyrets oppførsel er sterkt påvirket av operasjoner, og så videre.

To kritiske trinn inkluderer stereotaxic injeksjon av virus og GRIN linse implantasjon. For demonstrasjonsformålet ble stereotaxisk mikroinjeksjon utført i musen mPFC, med adeno-assosiert virus (AAV1) koding GCaMP6f under kontroll av CaMKII promotor som selektivt merker pyramidale nevroner i mPFC. GCaMP6f ble valgt da det er en av de raskeste og mest følsomme kalsiumindikatorene med en halv forfallstid på 71 ms15. I tillegg er AAV viralt uttrykk for GCaMP6f langvarig (dvs. flere måneder), noe som gjør det ideelt for å utføre repeterende in vivo Ca2 + avbildning over en lang periode for langsgående studier i musemodeller av nevrodegenerative sykdommer27. Den nåværende kirurgiprotokollen kan tilpasses for å målrette mot forskjellige cellepopulasjoner i en hvilken som helst annen hjerneregion. Ulike tilgjengelige virale verktøy tillater selektiv merking av spesifikke nevrale populasjoner i ønsket hjerneregion i ønsket alder. I tillegg kan forskere dra nytte av Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet og ulike tilgjengelige transgene musemodeller for å utføre genetiske modifikasjoner og studere det atferdsmessige og nevrale kretsutfallet28,29.

Et unikt trekk ved den presenterte protokollen er at den automatiserte lag-for-lag hjernevevsaspirasjonen ble utført før GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantasjon. Dette oppnås gjennom en 27 G nål koblet til et vakuumsystem, styrt av en spesialbygd robotarm og programvare23. Basert på vår erfaring genererer denne metoden en jevn overflate for GRIN-linsen å kontakte og forårsaker mindre skade på nabovevet enn manuell vevsaspirasjon23. Av denne grunn gir denne prosedyren en åpenbar fordel for GRIN-linser med en relativt bredere diameter (f.eks. 1 mm). Vevsaspirasjon er imidlertid kanskje ikke nødvendig for å implantere en GRIN-linse med mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). I stedet kan den plantes direkte langs det ledende sporet laget med en 30 G nål21.

I tillegg til de to kritiske trinnene som er diskutert ovenfor, må mange andre faktorer vurderes nøye for en vellykket operasjon. (1) Alle instrumenter som kommer i kontakt med hjernen, bør steriliseres for å forhindre infeksjon. (2) Alle operasjonstrinn må utføres for å minimere skade på hjernen for å forhindre ytterligere betennelse og overdreven arrvevsdannelse. (3) Anestesidosene som gis i utgangspunktet og vedlikeholdes under operasjonen, spesielt de som administreres intraperitonealt, må vurderes nøye. Anestesidosene kan endres i henhold til forskjellige musestammer, da noen kan være mer utsatt. (4) Tilstanden til musen må overvåkes kontinuerlig under operasjonen. Til slutt, (5) musene må regelmessig overvåkes etter operasjonen, da mange komplikasjoner kan oppstå etter operasjonen.

Selv om en del av hjernevev fjernes ensidig under GRIN-linseimplantasjonstrinnet, observerte vi ingen åpenbare atferdsunderskudd 7,12. Vekten på miniskopet er rundt 2 gram og kabelen er spesialdesignet for å gjøre den lett og for å sikre at musen enkelt kan bære den. Miniskopet og kabelen festes kun til dyret før in vivo-avbildning og løsnes etter avbildning. Hele bildebehandlingsprosessen tar vanligvis ikke mer enn 30 minutter. Derfor forhindrer disse instrumenteringene ikke at musen oppfører seg fritt. Miniskopets installasjons- og avinstallasjonstrinn trenger en kort anestesi (mindre enn 2 minutter) med isofluran med det formål å begrense dyr. Vi lar vanligvis musen komme seg etter den korte eksponeringen av isofluran i 30 minutter før du utfører in vivo-avbildning. Vi har utført miniskop in vivo kalsiumavbildning en gang i uken i noen uker uten å merke noen innvirkning på musens helse og mus sosial oppførsel12.

En stor begrensning i det nåværende miniskopopptakssystemet er behovet for å koble mikroskopet til en kabel for datainnsamling. Tilstedeværelsen av kabelen begrenser noen ganger musens oppgaveytelse og begrenser registreringen av ett dyr om gangen. Nylig har et trådløst miniskop blitt utviklet 25,26. Dette vil utvide oppgaveytelsen og tillate samtidig in vivo-avbildning fra flere dyr i en gruppe. Videre vil utvikling av mer sensitive GECIer med spektralt separerbare bølgelengder kombinert med et miniskop med to farger gi mer spennende muligheter for nevrovitenskapelig forskning.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet støttes av tilskudd fra National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 og UG3NS115608.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs KF technology 8000037800 For craniotomy
27-G and 30-G needle BD PrecisionGlide Needle REF 305109 and REF305106 For both surgeries
45 angled forceps Fine Science tools 11251-35 For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) Purdue Products L.P. NDC 67618-151-17 Surface disinfectant
Acetone Sigma-Aldrich 179124-1L GRIN lens cleaner
Agarose Sigma-Aldrich A9539-25G For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment HeliDerm Technology 81073087 For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) Johnson & Johnson Consumer Inc 30043308 Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota NIDA/IRP github.com/liang-bo/autostereota For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) Point Grey Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C For recording behavior
Brass hex nut McMASTER-CARR 92736A112 For GRIN lens implantation
Buprenorphine Par Pharmaceuticals NDC 4202317905 For GRIN lens implantation
Calcium chloride Sigma 10043-52-4 For preparing aCSF
Commutator NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank Rocky Mountain Air Solutions BI-OX-CD5C-K For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank Rocky Mountain Air Solutions OX-M-K For virus injection
Cordless Microdrill KF technology 8000037800 For craniotomy
Cyanoacrylate Henkel Coorporation # 1811182 For GRIN lens implantation
Data acquisition controller NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Data transmission cable NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Dental cement set C&B Metabond and Catalyst A00253revA306 and A00168revB306 For GRIN lens implantation
Dental cement set Duralay 2249D For GRIN lens implantation
Dexamethasone VETone NDC 1398503702 For GRIN lens implantation
Dextrose Sigma 50-99-7 For preparing aCSF
Diet gel Clear H20 72-06-5022 Diet Supplement for mouse
GRIN lens GRINTECH NEM-100-25-10-860-S For GRIN lens implantation
Heating Pad Physitemp Instruments LLC. #10023 To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane VETone V1 502017 Anesthesia
Ketamine VETone V1 501072 For GRIN lens implantation
Lidocaine WEST-WARD NDC 0143-9575-01 Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 7791-18-6 For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton) Hamilton 7653-01 For virus injection
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instrument #178647 For virus injection
Miniscope NIDA/IRP Custom-designed For imaging
Miniscope base Protolabs Custom-designed For mounting the base
Miniscope holding arm NIDA/IRP Custom-designed For mounting the base
Miniscope protection cap Protolabs Custom-designed For protecting the miniscope
Motorized controller Thorlabs KMTS50E For mounting the base
NeuView NIDA/IRP https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 For in vivo imaging
Ophthalmic ointment Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Ophthalmic
PCR tube Thermo Scientific AB-0622 For GRIN lens implantation
Pinch Clamp World Precision Instrument 14040 For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape TegaSeal PTFE Tape A-A-58092 For fastening miniScope to the base
Potassium chloride Sigma 7447-40-7 For preparing aCSF
Robotic arm NIDA/IRP Custom-designed For GRIN lens implantation
Saline Hospira RL 7302 For both surgeries
Set screw DECORAH LLC. 3BT-P9005-00-0025 For screwing the brass hex nut in miniscope base
 Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD McMaster 2124T3 For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate Sigma 144-55-8 For preparing aCSF
Sodium chloride Sigma 7647-14-5 For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic Sigma 7558-80-7 For preparing aCSF
Stereotaxic stage KOPF Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic For both surgeries
Sterile cotton swab Puritan REF 806-WC For both surgeries
Surgical tools Fine Science tools 11251-35 For surgeries
Suture Sofsilk REF SS683 For virus injection
 Syringe filter (0.22 µm) Millex SLGVR33RS For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) Addgene 100834-AAV1 For virus injection
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine VETone V1 510650 For GRIN lens implantation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  5. Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
  6. Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
  7. Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
  8. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  9. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  10. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  11. Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  12. Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
  13. Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  17. Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
  18. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  19. Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
  20. Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
  21. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  22. Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
  23. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  25. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
  26. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  27. Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).
  28. Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
  29. McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 176 Miniskop in vivo kalsiumavbildning mPFC mus hjernekirurgi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

Stereotoksisk viral injeksjon og gradient-indeks linse implantasjon for dyp hjerne <em>in vivo</em> kalsiumavbildning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li,… More

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (176), e63049, doi:10.3791/63049 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter