Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stereotaksisk viral injektion og gradientindekslinseimplantation til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse

Published: October 8, 2021 doi: 10.3791/63049
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Zoology and Physiology, University of Wyoming, 2School of Electrical Engineering & Computer Science, University of North Dakota, 3Department of Mathematics and Statistics, University of Wyoming

ERRATUM NOTICE

Summary

Miniscope in vivo calcium imaging er en kraftfuld teknik til at studere neuronal dynamik og mikrokredsløb i frit opførende mus. Denne protokol beskriver udførelse af hjerneoperationer for at opnå god in vivo calciumbilleddannelse ved hjælp af et mikroskop.

Abstract

Et miniaturefluorescensmikroskop (miniskop) er et potent værktøj til in vivo calciumbilleddannelse fra frit opførende dyr. Det giver flere fordele i forhold til konventionelle multi-foton calciumbilleddannelsessystemer: (1) kompakt; 2) letvægtet 3) økonomisk overkommelige og (4) tillader optagelse fra frit opførende dyr. Denne protokol beskriver hjerneoperationer for dyb hjerne in vivo calciumbilleddannelse ved hjælp af et specialudviklet mikroskopoptagelsessystem. Forberedelsesproceduren består af tre trin, herunder (1) stereotaksisk injektion af virussen i det ønskede hjerneområde i en musehjerne for at mærke en bestemt undergruppe af neuroner med genetisk kodet calciumsensor; (2) implantation af gradientindekslinse (GRIN), der kan videresende calciumbillede fra dyb hjerneregion til mikroskopsystemet og (3) anbringelse af mikroskopholderen over musekraniet, hvor miniskopet kan fastgøres senere. For at udføre in vivo calciumbilleddannelse fastgøres mikroskopet på holderen, og neuronale calciumbilleder indsamles sammen med samtidige adfærdsoptagelser. Den nuværende kirurgiske protokol er kompatibel med alle kommercielle eller specialbyggede enkeltfoton- og to-fotonbilleddannelsessystemer til dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse .

Introduction

Intracellulær Ca2+ signalering er en væsentlig regulator af cellevækst, proliferation, differentiering, migration, gentranskription, sekretion og apoptose1. I neuroner styres Ca2+ signalering præcist, da dets rumlige-tidsmæssige mønster er relateret til afgørende funktioner såsom membranexcitabilitet, neurotransmitterfrigivelse og synaptisk plasticitet2.

In vivo calciumbilleddannelse er en kraftfuld teknik, der kan bruges til at afkode neurale kredsløbsrepræsentation elementær til normal dyreadfærd, identificere afvigende neuronale aktiviteter i dyremodeller af hjernesygdomme og optrævle potentielle terapeutiske mål, der kan normalisere disse ændrede kredsløb. De to almindelige in vivo calciumbilleddannelsessystemer er to-foton laser scanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 og hovedmonteret miniaturiseret mikroskopi (miniscope)7,8,9,10,11,12,13 . Den konventionelle to-fotonmikroskopi giver kommanderende fordele såsom bedre opløsning, lavere støj og lavere fotobleaching; Forsøgsdyrene skal dog være hovedfaste, hvilket begrænser de adfærdsundersøgelser, der kan udføres 3,4,5,6. I modsætning hertil er det hovedmonterede miniscope-system lille og bærbart, hvilket gør det muligt at studere en lang række adfærdstest ved hjælp af frit opførende dyr 7,8,9,10,11,12,13.

Der er to førende Ca2+ indikatorer, kemiske indikatorer 5,14 og genetisk kodede calciumindikatorer (GEKI'er)15,16. Ca2+ billeddannelse er blevet lettet ved hjælp af meget følsomme GEKI'er leveret med virale vektorer, der tillader specifik mærkning af neuroner i det målrettede kredsløb. Den kontinuerlige indsats for at forbedre følsomheden, levetiden og evnen til at mærke selv de subcellulære rum gør GECI'er ideelle til forskellige in vivo calciumbilleddannelsesundersøgelser 17,18,19.

Spredningen af lys i hjernevæv under billeddannelse begrænser den optiske penetration i dybden, selv med to-fotonmikroskopien. Gradient Index (GRIN) linsen overvinder imidlertid dette problem, da GRIN-linsen kan indlejres direkte i det biologiske væv og videresende billeder fra det dybe hjerneområde til mikroskopmålet. I modsætning til konventionelle objektiver lavet af optisk homogent materiale og kræver en kompliceret formet overflade for at fokusere og skabe billeder, er GRIN-objektivets ydeevne baseret på en gradvis brydningsindeksændring i objektivmaterialet, der opnår fokus med en plan overflade20. GRIN-objektivet kan fremstilles ned til 0,2 mm i diameter. Derfor kan en miniaturiseret GRIN-linse implanteres i den dybe hjerne uden at forårsage for meget skade.

I denne artikel præsenteres en komplet kirurgisk protokol for den dybe hjerne in vivo calciumbilleddannelse. Til demonstrationsformålet beskriver vi hjerneoperationer specifikt rettet mod den mediale præfrontale cortex (mPFC) i musehjernen og in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse via et specialbygget mikroskopsystem udviklet af Dr. Lins gruppe ved National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Den eksperimentelle procedure involverer to store hjerneoperationer. Den første operation er stereotaxisk injektion af en viral vektor, der udtrykker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den anden operation er at implantere GRIN-linsen i det samme hjerneområde. Efter genopretning fra disse hjerneoperationer er den efterfølgende procedure at anbringe mikroskopholderen (basen) på musekraniet ved hjælp af tandcement. In vivo Ca2+ billeddannelse kan udføres når som helst efter montering af miniscope på dets base. Operationsprotokollen til viral injektion og GRIN-linseimplantation er kompatibel med alle kommercielle eller specialbyggede enkeltfoton- og tofotonbilleddannelsessystemer til den dybe hjerne in vivo-calciumbilleddannelse.

Protocol

Den eksperimentelle protokol følger retningslinjerne for dyrepleje fra University of Wyoming. Musen, der anvendes i denne undersøgelse, er 6 måneder gammel mandlig C57BL / 6J. Proceduren kan bruges til at målrette mod alle dybe hjerneområder til in vivo calciumbilleddannelse. Her er det målrettede hjerneområde til demonstration musens mPFC (forreste og bageste (A / P): 1,94 mm, medial og lateral (M / L): 0,5 mm, dorsal og ventral (D / V): 1,8 mm). Denne protokol ændres på grundlag af den tidligere offentliggjorte protokol21.

1. Stereotaksisk injektion af virus i mPFC (figur 1)

  1. Forberedelse til operationen
    1. Steriliser alle de kirurgiske instrumenter ved hjælp af en autoklave og læg dem over en steril overflade.
    2. Forbered en 10 μL sprøjte ved at grundlægge den med saltvand og forfylde den med 5 μL saltvand. Fastgør sprøjten til en mikropumpe (se Materialetabel).
    3. Tænd for varmepuden, og hold temperaturen på 35 °C.
  2. Anbring musen i induktionskammeret (5" x 10" x 4", længde x bredde x højde) med 5% isofluran og 1 L/min iltstrømningshastighed. Se omhyggeligt og tæl musens åndedrætsfrekvens. Tag musen ud, når dens respirationsfrekvens falder til 1 åndedræt/ s.
    BEMÆRK: Musens vejrtrækningshastighed kan let overvåges ved at se nedadgående og opadgående af rygmuskelbevægelsen under hver indånding.
  3. Lad musen slå sig ned på et bænkområde adskilt fra det kirurgiske område. Barberingsklipperen med en barberingsklipper skal du barbere håret fra musehovedet til de første halshvirvler.
  4. Sæt musen på det stereotaxiske stadium (se Materialetabellen), og fastgør dens position med ørestænger og næseklemme. Oprethold isofluranstrømmen til det stereotaksiske stadium ved 1,5% isofluran og 0,5 L / min iltstrømningshastighed.
  5. Påfør den smørende oftalmiske øjensalve på begge øjne med en ren vatpind for at forhindre tørhed i øjnene under operationen. Vurder pedalreflekser på musen for at bekræfte, at musen er fuldt bedømret, inden operationen påbegyndes.
  6. Desinficer det hårløse område med 7,5% povidon-jodopløsning (se materialetabel) og 70% ethanol tre gange hver ved hjælp af sterile vatpinde.
  7. Injicer et lille volumen (50 μL) 2% lidokain under huden på det hårløse område.
  8. Lav et snit på 2 cm gennem huden langs midterlinjen ved hjælp af en skalpel for at udsætte kraniets lambda og bregma.
  9. Fjern fascia fra kraniet ved hjælp af tørre bomuldspindler og spidse tang.
  10. Når bregma og lambda er synlige, skal du bruge spidsen af en tandboremaskine (0,5 mm i diameter) til at måle Z-koordinaterne for bregma og lambda (se materialetabel). Juster næseholderens højde, indtil bregma og lambda ligger i samme Z-position.
  11. Find 0,5 mm tandboremaskinen i en position på A/P: 1,94 mm, M/L: 0,5 mm fra bregma. Bor gennem kraniet.
    BEMÆRK: Her, til demonstration, er den målrettede hjerneregion musens mPFC. Denne protokol kan bruges til at målrette mod enhver anden dyb hjerneregion. For eksempel, hvis det målrettede hjerneområde er Nucleus Accumbens (NAc), skal den tilsvarende position være A/P: 0,9 mm, M/L: 1,2 mm.
  12. Fjern duraen med en 30 G nålespids, og rengør alle stykker knogleaffald med 45° vinklede skarpe tang.
    BEMÆRK: Blødning er almindelig, da små blodkar kan blive brudt under rengøringstrinnet. Brug sterile vatpinde til at stoppe blødning og påfør saltvand for at vaske området. Påfør saltvand på det udsatte kranieområde for at holde det fugtigt.
  13. Læg virussen i mikrolitersprøjten ved hjælp af mikropumpens kontrolpanel. Træk 500 nL luftboble tilbage efterfulgt af 800 nL af virussen med en strømningshastighed på 50 nL / s.
    BEMÆRK: Til demonstrationsformålet injiceres her en adeno-associeret virusserotype 1 (AAV1), der udtrykker GCaMP6f (en GECI), AAV1-CamKII-GCamp6f, i mPFC'en (se materialetabellen). Titeren af virussen er 2,8 x 1013 GC / ml. Det er 1:2 fortyndet i saltvand før injektion.
  14. Placer spidsen af nålen på toppen af bregma for bare at røre ved bregma og noter Z-koordinaten for bregma. Flyt nålen over det borede hul, og injicer 100 nL af virussen for at sikre, at nålen ikke er tilstoppet.
  15. Flyt langsomt nålen ned i hjernevævet til den målrettede Z-koordinat på D/V: 1,75 mm og flyt den derefter lidt op til Z-koordinaten for D/V: 1,65 mm.
    BEMÆRK: Dette er for at skabe en lille lomme, hvor den virale opløsning kan infunderes. Hvis den målrettede hjerneregion er NAc, skal den tilsvarende målrettede Z-koordinat for D / V være 4,2 mm og derefter bevæge sig lidt op til 4,1 mm.
  16. Brug kontrolpanelet til at indstille mikropumpen til at injicere 500 nL af virussen ved en strømningshastighed på 50 nL / min. Tryk på RUN knappen på kontrolpanelet for at injicere virussen.
    BEMÆRK: Injektionen tager ca. 10 minutter. Når injektionen er overstået, skal du vente yderligere 5-10 minutter, før du tager nålen ud af hjernen. Påfør ofte saltvand for at holde det udsatte kraniet område fugtigt i injektionsperioden.
  17. Flyt nålen op og ud af hjernen. Indsprøjt 500 nL volumen to gange ved en strømningshastighed på 50 nL/s.
    BEMÆRK: Dette trin bekræfter, at et korrekt volumen af virussen er blevet administreret i hjernen. Under de første 500 nL injektioner frigives virussen efterfulgt af luftbobler. Under den anden 500 nL injektion vises luftbobler først, efterfulgt af saltvand. Sprøjten er nu klar til at indlæse virussen til den næste mus. Når operationen er færdig, rengøres mikrolitersprøjten og nålen grundigt med acetone efterfulgt af saltvand.
  18. Stil hudkanterne op, og luk forsigtigt snittet med en sutur (størrelse 4.0). Påfør antibiotika salve på det syede område for at forhindre infektion.
  19. Fjern musen fra det stereotaksiske stadium og returner den til sit hjemmebur. Anbring hjemmeburet i en 33 °C inkubator, indtil musen er ambulant.
    BEMÆRK: Det tager normalt 10-15 minutter for en mus at vågne op fra isofluranbedøvelse, før den begynder at bevæge sig rundt.
  20. Når musen begynder at bevæge sig rundt, skal du administrere ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler i 3 postkirurgiske dage (se Materialetabel). Lad musen komme sig efter operationen i 14 dage, før den forfølger GRIN-linseimplantation.

2. IMPLANTATION AF GRIN-objektiv i mPFC (figur 1)

  1. Forberedelse til operationen
    1. Den kunstige cerebrospinalvæske (ACSF) til fremstilling af 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mMNaH2PO4, 1,2 mMMgCl2, 25 mM glucose, 26 mM NaHCO3 og 2,4 mM CaCl2.
    2. Steriliser alle de kirurgiske instrumenter ved hjælp af en autoklave og læg dem over en steril overflade.
    3. Tænd for varmepuden, og hold temperaturen på 35 °C.
    4. Smelt 1% agarose og opbevar den i et vandbad ved 42 °C indtil brug.
      BEMÆRK: Den smeltede agarose kan opbevares i vandbadet i et par timer.
    5. Desinficer et GRIN-objektiv (1 mm i diameter, 4,38 mm i længden, figur 2A) i 70% ethanol i 15 minutter, overfør det til et rør fyldt med saltvand for at skylle det ordentligt inden implantering.
      BEMÆRK: GRIN-linser (se tabel over materialer) produceres via sølv- og lithium-ion-udveksling i specielle briller, hvilket gør dem giftfri og neuronvenlige 6,7. Imidlertid kan mange kommercielt tilgængelige GRIN-linser udvaskes giftige rester, hvilket forårsager neurodegeneration, hvilket gør dem uegnede til implantation i den levende hjerne til langsigtede in vivo-billeddannelsesundersøgelser. Disse GRIN-linser kan kræve belægning med biokompatible midler som parylen-C for at forhindre toksiske bivirkninger på naboneuroner22.
  2. Musen vejes og anæstesieres ved en intraperitoneal injektion af ketamin/xylazinblanding (se materialetabellen) (ketamin:100 mg/kg; Xylazin: 15 mg/kg).
    BEMÆRK: En mus, der vejer 30 g, kræver 300 μL Ketamin/Xylazin-blanding (Ketamin 100 mg/ml og Xylazin 1,5 mg/ml) til startdosis og 150 μL ketamin (10 mg/ml) til yderligere doser under operationen. For at holde musen anæstetiseret under hele den kirurgiske proces, skal yderligere doser ketamin (50 mg / kg) administreres mindst en gang i timen. Musens anæstesistadium skal overvåges ofte ved at vurdere pedalreflekser.
  3. Barber håret af det kirurgiske område med en barbermaskine og rengør håret med et vådt papirhåndklæde.
  4. Placer musen i det stereotaksiske stadium, og fastgør dens position ved at stramme næseklemmen og ørestængerne. Påfør smørende oftalmisk øjensalve på begge øjne med en steril vatpind. Bekræft, at musen er fuldt aetiseret ved at vurdere pedalreflekser.
  5. Desinficer det hårløse område med 7,5% povidon-jodopløsning og 70% ethanol tre gange hver ved hjælp af sterile vatpinde. Administrer 2 mg/kg Dexamethason intramuskulært i låret for at mindske risikoen for kirurgisk hævelse og betændelse.
  6. Injicer 50 μL 2% Lidokain under huden på operationsområdet.
  7. Brug en fin saks til at skære et 1,5 cm (højde) x 1,0 cm (base) trekantet hudområde fra den forreste side mellem øjnene til den bageste side bag lambdaen.
  8. Fjern periosteumvævet fra kraniet ved hjælp af fine tang, mikroblade og vatpinde.
    BEMÆRK: Kraniet skal rengøres grundigt og tørres, inden du fortsætter det næste trin.
  9. Påfør cyanoacrylat (se Tabel over materialer) på hudens kanter og fastgør huden til kraniet. Vent i 5 minutter, indtil cyanoacrylatet tørrer.
  10. Ved hjælp af en 0,5 mm borespids skal du justere bregma og lambda i samme vandrette plan ved at justere næseklemmens højde.
  11. Find en tandboremaskine (1,2 mm i diameter) i en position på A/P: 1,94 mm, M/L: 0,8 mm fra bregma. Bor gennem kraniet. Fjern duraen med en 30 G nålespids, og rengør alle stykker knogleaffald med 45° vinklede skarpe tang.
    BEMÆRK: Dette knogleaffald kan blokere det efterfølgende aspirationstrin, hvis det ikke fjernes helt.
  12. Fastgør en 27 G manuelt poleret stumpnål (figur 2B) til nåleholderen koblet til en robotarm vippet med en vinkel på 10° (figur 2C). Tilslut den anden ende af nåleholderen til husets vakuumsystem.
    BEMÆRK: Robotarmen (se Table of Materials) er udviklet af Dr. Lins gruppe på NIDA/IRP og styres af en specialudviklet, i øjeblikket open access-software, AutoStereota (https://github.com/liang-bo/AutoStereota)23
  13. Find spidsen af nålen til bare at røre ved bregma. Indstil Z-koordinaten for bregma til 0 ved at klikke på Bregma-knappen på AutoStereota.
  14. Indstil Input X-værdi til 0,8, Input Y-værdi til 1,94, Input Z-værdi til 1,0, og klik derefter på knappen Find for at flytte nålen til toppen af det borede hul på kraniet.
  15. Juster nålens position til midten af det eksponerede hjernevævsområde via AutoStereota.
    BEMÆRK: For at flytte nålen i laterale eller mediale retninger skal du indtaste trinværdien og klikke på Laterale eller Mediale knapper på AutoStereota. På samme måde skal du klikke på henholdsvis Rostral eller Caudal og Dorsal eller Ventral knapper for at flytte nålen i forreste eller bageste og dorsale eller ventrale retninger.
  16. Tænd for vakuummet, og begynd at skylle det udsatte hjerneområde med ACSF gennem et tyngdekraftsstyret rørsystem (se Materialetabel), der er forbundet til en 30 G-nål med en bøjet spids. ACSF bliver kontinuerligt boblet med en gasblanding på 95%O2 og 5% CO2 og filtreret gennem et 0,2 μm filter.
    BEMÆRK: ACSF-strømningshastigheden er ~ 1,5 ml/min. Udgangstrykket for gasblandingen holdes på ~ 3 psi.
  17. Aspirer hjernevæv lag for lag ved hjælp af AutoStereota-software (Figur 3).
    BEMÆRK: Aspiration af hjernevæv afsluttes i 4 runder, så der genereres en søjlelomme (1,8 mm i dybden og 1 mm i diameter).
    1. I "zStep" -sessionen skal du klikke og kontrollere den første og anden række. Indstil værdierne for den første række til 0,2 og 1. Indstil værdierne for den anden række til 0,15 og 4 (figur 3A).
    2. I sessionen "Mode" skal du indstille nålestørrelse 27 gauge og 1.2, indstille Dims 0.9. Alle andre værdier bruger standardværdier (figur 3A).
    3. Klik sekventielt på knapperne Indstil, Hold nul og Start for at starte aspirationen.
      BEMÆRK: Dette er denførste runde af aspiration. Indgangsværdier indikerer, at aspirationsdybden er 0,2 mm (fra Z-koordinaten på 0) under det første trin med 1 lag; i løbet af det andet trin er aspirationsdybden 0,15 mm, gentages kontinuerligt i 4 lag. Aspirationsopløsningen er 1,2, og diameteren er 0,9 mm. Under aspiration kan nålespidsens øjeblikkelige placering overvåges gennem sporgrafpanelet. Efter at have afsluttet denne aspirationsrunde genereres en søjlelomme med 0,8 mm dybde og 1 mm i diameter. Nålespidsen vil være tilbage til midten med Z-koordinaten på 0.
    4. I "zStep" -sessionen skal du klikke og kontrollere den første og anden række. Indstil værdierne for den første række til 1 og 1. Indstil værdierne for den anden række til 0,15 og 4 (figur 3B).
    5. I sessionen "Tilstand" skal alle værdier være de samme som den foregående runde (figur 3B).
    6. Klik sekventielt på knapperne Indstil, Hold nul og Start for at starte aspirationen.
      BEMÆRK: Dette er 2. runde af aspiration. Indgangsværdier indikerer, at aspirationsdybden er 1 mm (fra Z-koordinaten på 0) under det første trin med 1 lag; i løbet af det andet trin er aspirationsdybden 0,15 mm, gentages kontinuerligt i 4 lag. Efter at have gennemført denne aspirationsrunde genereres søjlelommen med 1,6 mm dybde og 1 mm i diameter.
    7. I "zStep" -sessionen skal du kun klikke og kontrollere den første række. Indstil værdierne for den første række til 1,8 og 1 (figur 3C).
    8. I sessionen "Mode" skal du indstille nålestørrelse 27 gauge og 2.2. Alle andre værdier forbliver de samme som i den foregående runde (figur 3C).
    9. Klik sekventielt på knapperne Indstil, Hold nul og Start for at starte aspirationen.
      BEMÆRK: Dette er den 3. runde af aspiration. Indgangsværdier angiver, at aspirationsdybden er 1,8 mm (fra Z-koordinaten på 0) med 1 lag. Aspirationsopløsningen er 2.2. Efter at have gennemført denne aspirationsrunde genereres søjlelommen med 1,8 mm dybde og 1 mm i diameter.
    10. I "zStep" -sessionen skal du kun klikke og kontrollere den første række. Indstil værdierne for den første række til 1,6 og 1 (figur 3D).
    11. I sessionen "Mode" skal du indstille nålestørrelse 27 gauge og 2.2, indstille Dims 0.6 (figur 3D).
    12. Klik sekventielt på knapperne Set, Keep Zero og Start for at starte aspirationen.
      BEMÆRK: Dette er den 4. runde af aspiration. Formålet med dette trin er at rense blod akkumuleret i lommen. Blødning er almindelig, da små blodkar bliver brudt under aspirationsprocessen. For at rense blodet grundigt skal du stoppe vandingen af ACSF i 5 minutter og derefter tænde for vanding igen. Gentag den 4. aspirationsrunde flere gange, indtil lommen er blodfri. Denne protokol kan bruges til at målrette mod andre dybe hjerneområder. For eksempel, hvis det målrettede hjerneområde er NAc, skal den endelige tilsvarende Z-koordinat for D / V være 4,4 mm.
  18. Stop vakuum og kunstvanding af ACSF. Bring nålen til +2 mm Z-koordinat og 0,5 mm forreste til midten. Anbring det sterile 1 mm GRIN-objektiv i lommen.
  19. Hold spidsen af nålen i kontakt med det eksponerede GRIN-objektiv for at sikre, at GRIN-objektivet bliver afgjort i 10° vinkel. Tryk forsigtigt på den øverste overflade af GRIN-linsen med sterilt blødt tissuepapir for at sikre, at den nederste overflade af GRIN-linsen er i kontakt med hjernevævet.
  20. Påfør den smeltede Agarose i mellemrummet mellem GRIN-linsen og hjernevævet ved hjælp af en spatel. Når Agarose danner en gel, skal du fjerne overskydende Agarose ved hjælp af et mikroblad.
  21. Rengør kraniet grundigt med saltvand og vatpinde. Lad kraniet tørre inden den efterfølgende påføring af tandcement (se materialetabel).
  22. Blandingsbrønden ud af -20 °C fryseren. Bland tandcementpulveret og katalysatorvæsken og påfør et lag selvhærdende klæbende harpikscement på kraniet; Først skal du omringe GRIN-linsen og derefter dække hele det udsatte kranium.
  23. Vent i 5 minutter, og lad det hærde helt. Fjern aspirationsnålen forsigtigt.
  24. Bland tandcementpulver, sort trækul med væske i en ren plastbrønd, og påfør et tyndt lag af blandingen oven på 1. lag tandcement. Vent i 5 minutter for at lade det hærde.
  25. Beskyt det eksponerede GRIN-objektiv ved at dække det med en tilpasset hætte lavet af et PCR-rør (figur 2D). Påfør cyanoacrylat for at fastgøre hætten til tandcementen.
  26. 1 ml forvarmet saltvand subkutant injiceres i musen efterfulgt af 0,1 mg/kg Buprenorphin. Placer musen tilbage i sit hjemmebur. Anbring hjemmeburet i en 33 °C inkubator, og overvåg musen, indtil den er ambulant. Det tager normalt 20-40 min for en mus at vågne op fra bedøvelse, før den begynder at bevæge sig rundt.
  27. Administrer ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler og overvåg musen i mindst 3 postkirurgiske dage. Lad musen komme sig efter operationen i 30 dage.

3. Anbringelse af mikroskopholder (base) på musekraniet (figur 1)

  1. Bedøm musen i et induktionskammer med 5% isofluran og 1 L / min iltstrømningshastighed, indtil dens respirationshastighed falder til 1 vejrtrækning / s.
  2. Placer musen i det stereotaxiske stadium, og fastgør dens position med ørestænger og næseklemmer. Oprethold en kontinuerlig strøm af isofluran (1,5%) og ilt (0,5 l/min).
  3. Påfør oftalmisk salve på øjnene for at holde dem fugtige. Tænd for varmepuden, og hold temperaturen på 35 °C. Bekræft, at musen er fuldt aetiseret ved at vurdere pedalreflekser.
  4. Fjern forsigtigt hætten, der dækker GRIN-objektivet, ved hjælp af spidse tang. Bor de tørrede cyanoacrylatrester fra tandcementen helt ud ved hjælp af en mikrobor (se Materialetabellen).
  5. Klip håret omkring tandcementområdet med en lille saks. Rengør snavset ved hjælp af en trykluftstøver. Brug en acetondyppet vatpind til at rengøre den øverste overflade af GRIN-objektivet.
  6. Forbered miniscopet med holderen (base).
    1. Anbring en #00-90 hex møtrik (se Tabel over materialer) i spalten i bunden og påfør cyanoacrylat for at fastgøre den der (figur 2E).
    2. Påfør et polytetrafluorethylenbånd (PTFE) tæt omkring miniskopets tråd, og trim det ekstra tape af (figur 2F).
    3. Fastgør miniskopet til bunden, og brug låseskruen til at fastgøre miniskopet til bunden (figur 2G).
    4. Tilslut miniscopet til dets kabel, og tænd for den specialudviklede, i øjeblikket åbne software, NeuView (se Tabel over materialer).
      BEMÆRK: NeuView-software er specialudviklet til miniscope in vivo calciumbilleddannelse fra Dr. Lins gruppe på NIDA / IRP 7,12. Det er åben adgang (https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0).
    5. I NeuView skal du klikke på Hardware, kontrollere LED1 og klikke på knappen Stream for at se livebillederne (figur 4A). For at stoppe live streaming skal du klikke på Stop-knappen .
    6. Sæt miniskopet i en specialbygget miniskopholdearm (figur 2H), hvis XYZ-position kan manipuleres ved hjælp af motoriserede controllere (figur 2I).
  7. Find miniskopet lige over det eksponerede GRIN-objektiv, og gør det parallelt med objektivets overflade. Bring langsomt miniskopet ned mod GRIN-objektivet, og juster dets Z-position, indtil det bedste fokusplan er fundet.
    BEMÆRK: Det bedste brændplan bestemmes ved at sammenligne flere mulige Z-positioner og vælge brændplanet med en klar visualisering af de fleste cellelegemer.
  8. Påfør det første lag tandcement omkring minoskopbasen omhyggeligt uden at ændre miniskopets position. Når cementen er hærdet, skal du forsigtigt fjerne holdearmen, så miniskopet kan stå alene på musehovedet.
    BEMÆRK: Tandcementen har tendens til at krympe efter hærdning, og den vil trække ned i miniskopet væk fra det oprindelige fokusplan. Typisk løftes miniskop Z-positionen lidt over det oprindelige brændplan, før tandcement påføres for at kompensere for den potentielle ændring.
  9. Påfør et andet lag tandcement omkring bunden for at udfylde alle hullerne og sikre, at der ikke er LED-lyslækage fra hullerne. Lad tandcementen hærde.
  10. Fjern musen fra det stereotaksiske stadium. Løsn låseskruen, og fjern miniskopet fra bunden. Sæt en 3D-printet beskyttelseshætte i bunden for at beskytte det eksponerede GRIN-objektiv, og stram låseskruen i bunden (figur 2J).
  11. Placer musen tilbage i sit hjemmebur.
    BEMÆRK: Det tager normalt 10-15 minutter for en mus at vågne op fra isofluranbedøvelse, før den begynder at bevæge sig rundt.

4. Miniscope montering og in vivo Ca2+ billeddannelse (figur 1)

  1. Monter miniskopet på bunden
    1. Bedøm musen kortvarigt i induktionskammeret (5% isofluran og 1 L/min iltgennemstrømningshastighed). Placer musen på en ren bænkoverflade.
    2. Løsn låseskruen med en lille skruetrækker, fjern beskyttelseshætten, og rengør overfladen af GRIN-linsen med en acetone-gennemblødt vatpind.
    3. Pak et PTFE-bånd tæt rundt om minoskoptråden, og fastgør miniskopet til bunden på musehovedet.
    4. Tilslut miniskopet til kablet (figur 2K), tænd NeuView-softwaren.
    5. I NeuView skal du klikke på Hardware, kontrollere LED1 og klikke på knappen Stream for at se livebillederne (figur 4A).
    6. Identificer det bedste brændplan ved at justere miniskopets position i forhold til basen, enten lidt stramning eller løsning ved hjælp af stump tang.
      BEMÆRK: Det bedste brændplan bestemmes ved at sammenligne flere mulige placeringer og vælge det med en klar visualisering af de fleste cellelegemer.
    7. Stram låseskruen og læg musen tilbage i sit hjemmebur.
    8. I NeuView skal du justere LED-lyseffekten til det optimale niveau. Klik på Capture og derefter Trigger knapper for at starte optagelsen og trykke på Stop efter 150 billeder.
      BEMÆRK: Den lavest mulige effekt bestemmer det optimale niveau af LED-effekten for at opnå et lyst nok billede. Formålet med at optage en kort video er at gøre det lettere at identificere det samme fokusplan i fremtiden for gentagen billeddannelse.
    9. Frakobl kablet fra miniskopet. Lad musen komme sig i mindst 30 minutter, før eksperimentet påbegyndes.
      BEMÆRK: For at beskytte miniskopet fjernes typisk vandflasken og trådføderen i løbet af denne korte periode. Hvis musen har brug for at blive i sit hjemmebur i længere tid, anbefales det at levere kommercielt tilgængelig diætgel (se materialetabel) i hjemmeburet.
  2. Dataindsamling til in vivo calciumbilleddannelse
    BEMÆRK: In vivo calcium Imaging kan udføres samtidigt sammen med eventuelle adfærdstest, som forskeren ønsker. Til demonstrationsformålet er eksemplet her in vivo Ca2+ billeddannelse under en åben felttest. For at nå dette mål kræves to computere. En computer er udstyret med kommerciel software (se Tabel over materialer) til at styre et kamera til automatisk at optage musens adfærd. Den anden computer er udstyret med NeuView til at styre miniskopet og optage Ca2+ billederne .
    1. Tænd for adfærdskamerasoftwaren (se Tabel over materialer) for at få vist musens adfærdsarena via en Livestream-funktion. Juster fokus manuelt på det øverste kamera (figur 2L).
    2. Vælg Trigger/Strobe , og marker "Aktivér/deaktiver udløser" (figur 4B). Klik på knappen Optag , brug Gennemse til at vælge det sted, hvor adfærdsoptagelser skal gemmes, vælg det ønskede billedformat.
      BEMÆRK: Funktionen "Trigger Control" er aktiveret for at gøre det muligt at udløse adfærdsregistreringen af NeuView-softwaren, så adfærdsrammerne og de tilsvarende calciumbilleddannelsesrammer er tidsmæssigt koblet sammen. Adfærdsoptagelsen kan gemmes i ethvert ønsket format. Adfærdsoptagelse gemmes generelt i JPEG-format i den angivne mappe.
    3. Bring musen tæt på arenaen, og tilslut miniskopet til kablet, der er knyttet til dataindsamlingssystemet (figur 2L) (se materialetabel). Musen placeres derefter i midten af arenaen.
    4. Med Livestream-funktionen i NeuView-softwaren kan du justere LED-strømmen for at optimere lysstyrken på calciumbilledet.
      BEMÆRK: For calciumbilleddannelse er optagelsesbilledhastigheden som standard 10 billeder / s.
    5. I NeuView skal du fjerne markeringen af LED1, klikke på Capture og derefter Trigger-knapperne for at starte optagelsen og trykke på Stop efter 100 billeder.
      BEMÆRK: Dette er for at optage baggrundsbilleder til ca. 100 billeder med LED-lys slukket.
    6. Klik på Start optagelse (figur 4C) i software til adfærdskameraet. I NeuView skal du kontrollere LED1, klikke på Capture og derefter Trigger-knapperne for at starte optagelsen. Hit Stop efter 3000 billeder.
      BEMÆRK: Dette er for at registrere calciumbilleddannelse og adfærd samtidigt. Open field testen er 15 min lang, typisk opdelt i tre optagesessioner hver på 5 min. Dette er for at forhindre, at miniskopet overophedes på grund af kontinuerlig brug.
    7. Gem både calciumbilleddannelse og adfærdsoptagelser i de udpegede mapper. Gentag optagelsen i yderligere to sessioner, mens du optager baggrunden før hver session, og gem alle optagelserne i den angivne mappe.
  3. Fjern miniscope fra sin base.
    1. Når optagelsen er afsluttet, skal du frakoble kablet fra miniskopet.
    2. Bedøm musen kortvarigt i induktionskammeret (5% isofluran og 1L/min iltstrømningshastighed). Placer musen på en ren, varm overflade.
  4. Skru låseskruen i bunden af, og løsn mikroskopet fra bunden. Sæt beskyttelseshætten tilbage over bunden, og stram låseskruen. Sæt musen tilbage i sit hjemmebur.

Representative Results

Figur 1 viser den skematiske eksperimentelle procedure, herunder viral injektion, GRIN-linseimplantation, anbringelse af minoskopbasen på musekraniet og in vivo-calciumbilleddannelse via et mikroskop. Hele proceduren tager ~ 2 måneder. Figur 2 viser de vigtigste komponenter beskrevet i protokollen for miniscope in vivo calcium imaging. Figur 3 viser grænsefladerne til AutoStereota-software under IMPLANTATION AF GRIN-objektiver. Figur 4 viser grænsefladerne til NeuView og adfærdsoptagelsessoftware under in vivo calciumbilleddannelse.

Resultatet af in vivo calciumbilleddannelse er afhængig af succesen med både viral injektion og GRIN linseimplantationsoperationer. Figur 5 viser en række resultater (dvs. mislykkede, suboptimale og gode) fra in vivo calciumbilleddannelsesoptagelser. I mislykkede tilfælde kan calciumbilledet virke enten mørkt eller lyst, men afslører normalt ingen eller meget få aktive neuroner. Vi forfølger typisk ikke in vivo calciumoptagelsesforsøg, hvis der er færre end fem aktive neuroner. En god in vivo calciumbilleddannelse afslører typisk flere hundrede aktive neuroner. Hvis en optagelse indeholder mindre end hundrede aktive neuroner, betragter vi det som en suboptimal optagelse.

I både suboptimale og gode optagelser in vivo blev calciumbilleddannelseseksperimenter forfulgt, og den efterfølgende dataanalyse blev udført. Film 1 viser en repræsentativ in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse fra musens mPFC. Adfærdsvideoer og calciumbilleddannelsesdata behandles normalt separat. Videoer om museadfærd kan scores manuelt. Calciumbilleddannelsesfiler behandles ved hjælp af CaImAn calciumbilledbehandlingsværktøjskassen24. Figur 6 viser et repræsentativt cellekort og flere calciumspor fra en god in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse.

Efter at have afsluttet in vivo calciumbilleddannelse er det sidste trin at bekræfte, om den virale injektion og GRIN-linseimplantation har fundet sted i den ønskede hjerneregion. Til dette formål blev musen perfunderet med fosfatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af 4% paraformaldehyd (PFA). Musehjernen blev høstet, postfixeret i 4% PFA i 12 timer og opbevaret i PBS ved 4 °C. Musehjernen blev derefter opdelt i 50 μm tykke skiver med et vibratom. Hjerneskiverne blev farvet med DAPI og observeret under mikroskopet (ikke beskrevet i protokollen)12. Figur 7 er en musehjerneskive ~ 1,94 mm forreste til bregma fra en eksperimentel mus, der viser sporet, hvor GRIN-linsen blev implanteret. Det grønne fluorescensområde under og omkring GRIN-objektivsporet indikerer udtrykket af GCaMP6f i mPFC-regionen.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over forsøgsproceduren. (A) Stereotaksisk injektion af virus i mPFC. (B) IMPLANTATION AF GRIN-objektiv i mPFC'en. C) Anbringelse af minoskopbase på musekraniet. (D) Montering af miniskop og in vivo-calciumbilleddannelse . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Hovedkomponenter, der er nødvendige for in vivo calciumbilleddannelse. (A) Et GRIN-objektiv med en diameter på 1 mm og en længde på 4,38 mm. (B) En 27 G manuelt poleret stump nål, der anvendes til hjernevævsaspiration. C) Robotarmen koblet til nåleholderen. (D) En specialfremstillet hætte fra et PCR-rør for at beskytte det eksponerede GRIN-objektiv indtil anbringelsen af minoskopbasen på musekraniet. (E) Miniscopeholderen (bunden) med en sekskantet møtrik. F) Et miniskop, hvis gevinddel er viklet ind i PTFE-båndet. (G) Et miniskop fastgjort til bunden med en låseskrue. (H) Miniskopets holdearm. (I) En specialbygget 3D-motoriseret controller, der bruges til at lette bevægelsen af miniscope i XYZ-positioner. (J) En beskyttelseshætte fastgjort på basen for at beskytte det eksponerede GRIN-objektiv, mens musen ikke udfører in vivo-calciumbilleddannelse . (K) Det miniskop, der er tilsluttet kablet. (L) Dataindsamlingssystemet til in vivo Ca2+ billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Grænseflader til AutoStereota-software under lag-for-lag hjernevævsaspiration. (A) Grænsefladen svarende til trin 2.17.1 til 2.17.3. B) Den grænseflade, der svarer til trin 2.17.4 til 2.17.6. C) Den grænseflade, der svarer til trin 2.17.7 til 2.17.9. D) Den grænseflade, der svarer til trin 2.17.10 til 2.17.12. Røde felter fremhæver inputværdierne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Grænseflader til NeuView-software og adfærdsoptagelsessoftwaren under in vivo-calciumbilleddannelse . (A) Grænsefladen til NeuView. (B,C) Grænsefladerne til adfærdsoptagelsessoftwaren. Røde felter fremhæver knapper, der skal klikkes på. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Maksimal projektionsfluorescenscelle kortlægger for at vise rækkevidden af mulige resultater. (A,B) Mislykket in vivo calciumbilleddannelse, der ikke er acceptabel til efterfølgende dataanalyse. (A) er mørk og indeholder mindre end 5 aktive neuroner. (B) er lys, men har ingen aktive neuroner. (C) Cellekortet fra en suboptimal in vivo calciumbilleddannelse, der indeholder nogle aktive neuroner. (D) Cellekortet fra en god in vivo calciumbilleddannelse, der omfatter flere hundrede aktive neuroner. Vægtstang: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentativt cellekort og calciumtransienter fra en vellykket in vivo calciumbilleddannelse. Det venstre panel er det maksimale projektionsfluorescenscellekort fra en in vivo-calciumbilleddannelsesoptagelse i mPFC under en åben felttest. Optagelsen varer i 5 min. Det højre panel viser calciumtransienter fra 15 regioner af interesse (farvematchet). Vægtstang: 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Postmortem vurdering af en eksperimentel mus. Postmortem-vurderingen for GCaMP6f-ekspression og GRIN-linseimplantation i mPFC af en eksperimentel mus. Det rektangulære område angiver vejen for IMPLANTATION AF GRIN-objektiver. Det grønne område under det IMPLANTEREDE REGION MED GRIN-linse bekræfter, at GCaMP6f blev udtrykt, og GRIN-linsen blev implanteret præcist i det ønskede hjerneområde. Cg, cingulat cortex; PrL, prælimbisk cortex; IL, infralimbisk cortex. Vægtstang: 400 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammenligninger af det specialbyggede miniscope-system på NIDA med andre mikroskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Klik her for at downloade denne tabel.

Film 1: En in vivo calciumbilleddannelsesoptagelse fra musens mPFC under en åben felttest. Til demonstrationsformål viser denne video kun 1 minuts optagelse. Den originale optagelsesbilledhastighed er 10 billeder / s. Videoen er 6 gange hurtigere end den originale optagelse. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

Et centralt spørgsmål i neurovidenskab er at forstå, hvordan neurale dynamikker og kredsløb koder og lagrer information, og hvordan de ændres i hjernesygdomme. Ved hjælp af et miniskop in vivo Ca2+ billeddannelsessystem kan individuel neural aktivitet fra flere hundrede neuroner i et lokalt mikrokredsløb overvåges samtidigt fra et frit opførende dyr. Her beskrives en detaljeret operationsprotokol for viral injektion og IMPLANTATION AF GRIN-linser for at forberede gnavere til en dyb hjerne in vivo Ca2+ billeddannelse via et specialudviklet mikroskopoptagelsessystem. Tabel 1 viser sammenligningerne af vores miniscope-system med andre kommercielt tilgængelige og specialbyggede miniscope-systemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Det er værd at bemærke, at GRIN-linseimplantation ved hjælp af den nuværende kirurgiske protokol er kompatibel med enhver kommerciel eller specialbygget enkeltfoton- og to-fotonbilleddannelsessystemer til en dyb hjerne in vivo-calciumbilleddannelse.

Fra viral injektion til dataindsamling af mikroskop in vivo calciumbilleddannelse tager hele den eksperimentelle procedure mindst 2 måneder at gennemføre. Det er en kompliceret og arbejdskrævende proces. Eksperimentets endelige succes afhænger af flere faktorer, herunder korrekt valg af GECIS'er, injektion af virus nøjagtigt i det målrettede hjerneområde, tilstrækkelig viral ekspression i den ønskede neurale population, implantation af GRIN-linsen præcist på det ønskede sted, tilstrækkelig genopretning fra operationer, samt om alvorlig betændelse opstår efter operationen, og om dyrets adfærd er alvorligt påvirket af operationer, og så videre.

To kritiske trin omfatter stereotaksisk injektion af virus og GRIN-linseimplantation. Til demonstrationsformålet blev den stereotaksiske mikroinjektion udført i musens mPFC, hvor adeno-associeret virus (AAV1) koder GCaMP6f under kontrol af CaMKII-promotor, der selektivt mærker pyramidale neuroner i mPFC. GCaMP6f blev valgt, da det er en af de hurtigste og mest følsomme calciumindikatorer med en halv henfaldstid på 71 ms15. Derudover er AAV viral ekspression af GCaMP6f langvarig (dvs. flere måneder), hvilket gør den ideel til at udføre gentagen in vivo Ca2+ billeddannelse over en lang periode til langsgående undersøgelser i musemodeller af neurodegenerative sygdomme27. Den nuværende kirurgiske protokol kan tilpasses til at målrette mod forskellige cellepopulationer i enhver anden hjerneregion. Forskellige tilgængelige virale værktøjer tillader selektiv mærkning af specifikke neurale populationer i den ønskede hjerneregion i den ønskede alder. Derudover kan forskere drage fordel af Cre-LoxP-rekombinationssystemet og forskellige tilgængelige transgene musemodeller til at udføre genetiske modifikationer og studere det adfærdsmæssige og neurale kredsløbsresultat28,29.

Et unikt træk ved den præsenterede protokol er, at den automatiserede lag-for-lag hjernevævsaspiration blev udført før GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantation. Dette opnås gennem en 27 G-nål, der er forbundet til et vakuumsystem, styret af en specialbygget robotarm og software23. Baseret på vores erfaring genererer denne metode en ensartet overflade, som GRIN-linsen kan komme i kontakt med, og forårsager mindre skade på nabovævet end manuel vævsaspiration23. Af denne grund giver denne procedure en åbenlys fordel for GRIN-objektiver med en relativt bredere diameter (f.eks. 1 mm). Vævsaspiration er dog muligvis ikke nødvendig for implantering af et GRIN-objektiv med en mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). I stedet kan den plantes direkte langs det førende spor lavet med en 30 G nål21.

Udover de to kritiske trin, der er diskuteret ovenfor, skal mange andre faktorer overvejes nøje for en vellykket operation. (1) Alle de instrumenter, der kommer i kontakt med hjernen, skal steriliseres for at forhindre infektion. (2) Alle kirurgiske trin skal udføres for at minimere skader på hjernen for at forhindre yderligere betændelse og overdreven dannelse af arvæv. (3) De anæstesidoser, der gives oprindeligt og vedligeholdes under operationen, især dem, der administreres intraperitonealt, skal overvejes nøje. Anæstesidoserne kan ændres i henhold til forskellige musestammer, da nogle kan være mere modtagelige. (4) Musens tilstand skal konstant overvåges under operationen. Endelig (5) musene skal overvåges regelmæssigt efter operationen, da der kan opstå mange komplikationer efter operationen.

Selvom en del af hjernevævet fjernes ensidigt under GRIN-linseimplantationstrinnet, observerede vi ikke nogen åbenlyse adfærdsunderskud 7,12. Vægten af miniscope er omkring 2 gram, og kablet er specialdesignet til at gøre det let og sikre, at musen let kan bære det. Miniskopet og kablet er kun fastgjort til dyret før in vivo-billeddannelse og løsnes efter billeddannelse. Hele billeddannelsesprocessen tager normalt ikke længere end 30 minutter. Derfor forhindrer disse instrumenteringer ikke musen i frit at opføre sig. Miniscope-installations- og afinstallationstrinnene har brug for en kort anæstesi (mindre end 2 minutter) med isofluran med henblik på dyrebegrænsning. Vi lader typisk musen komme sig efter den korte eksponering af isofluran i 30 minutter, før vi udfører in vivo-billeddannelse. Vi har udført miniscope in vivo calcium imaging en gang om ugen i et par uger uden at bemærke nogen indvirkning på musens sundhed og musens sociale adfærd12.

En væsentlig begrænsning i det nuværende miniscope-optagelsessystem er behovet for at forbinde mikroskopet til et kabel til dataindsamling. Tilstedeværelsen af kablet begrænser undertiden musens opgaveudførelse og begrænser optagelsen af et dyr ad gangen. For nylig er der udviklet et trådløst miniskop25,26. Dette vil udvide opgaveudførelsen og muliggøre samtidig in vivo-billeddannelse fra flere dyr i en gruppe. Desuden vil udvikling af mere følsomme GECIS'er med spektralt adskillelige bølgelængder kombineret med et dobbeltfarvet mikroskop give mere spændende muligheder for neurovidenskabelig forskning.

Disclosures

Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 og UG3NS115608.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.6mm and 1.2mm drill burrs KF technology 8000037800 For craniotomy
27-G and 30-G needle BD PrecisionGlide Needle REF 305109 and REF305106 For both surgeries
45 angled forceps Fine Science tools 11251-35 For surgeries
7.5% povidone-iodine solution (Betadine) Purdue Products L.P. NDC 67618-151-17 Surface disinfectant
Acetone Sigma-Aldrich 179124-1L GRIN lens cleaner
Agarose Sigma-Aldrich A9539-25G For GRIN lens implantation
Antibiotic ointment HeliDerm Technology 81073087 For virus injection
Anti-inflamatory drug (Ibuprofen) Johnson & Johnson Consumer Inc 30043308 Acts as pain killer after surgeries
AutoStereota NIDA/IRP github.com/liang-bo/autostereota For GRIN lens implantation
Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2) Point Grey Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C For recording behavior
Brass hex nut McMASTER-CARR 92736A112 For GRIN lens implantation
Buprenorphine Par Pharmaceuticals NDC 4202317905 For GRIN lens implantation
Calcium chloride Sigma 10043-52-4 For preparing aCSF
Commutator NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank Rocky Mountain Air Solutions BI-OX-CD5C-K For GRIN lens implantation
Compressed Oxygen tank Rocky Mountain Air Solutions OX-M-K For virus injection
Cordless Microdrill KF technology 8000037800 For craniotomy
Cyanoacrylate Henkel Coorporation # 1811182 For GRIN lens implantation
Data acquisition controller NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Data transmission cable NIDA/IRP Custom-designed Component of image acquisition system
Dental cement set C&B Metabond and Catalyst A00253revA306 and A00168revB306 For GRIN lens implantation
Dental cement set Duralay 2249D For GRIN lens implantation
Dexamethasone VETone NDC 1398503702 For GRIN lens implantation
Dextrose Sigma 50-99-7 For preparing aCSF
Diet gel Clear H20 72-06-5022 Diet Supplement for mouse
GRIN lens GRINTECH NEM-100-25-10-860-S For GRIN lens implantation
Heating Pad Physitemp Instruments LLC. #10023 To keep the mouse body warm during surgeries
Isoflurane VETone V1 502017 Anesthesia
Ketamine VETone V1 501072 For GRIN lens implantation
Lidocaine WEST-WARD NDC 0143-9575-01 Local anesthesia
Magnesium chloride hexahydrate Sigma 7791-18-6 For preparing aCSF
Microliter syringe (Hamilton) Hamilton 7653-01 For virus injection
MicroSyringe Pump Controller World Precision Instrument #178647 For virus injection
Miniscope NIDA/IRP Custom-designed For imaging
Miniscope base Protolabs Custom-designed For mounting the base
Miniscope holding arm NIDA/IRP Custom-designed For mounting the base
Miniscope protection cap Protolabs Custom-designed For protecting the miniscope
Motorized controller Thorlabs KMTS50E For mounting the base
NeuView NIDA/IRP https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0 For in vivo imaging
Ophthalmic ointment Puralube Vet Ointment NDC 17033-211-38 Ophthalmic
PCR tube Thermo Scientific AB-0622 For GRIN lens implantation
Pinch Clamp World Precision Instrument 14040 For clamping the tubing
Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape TegaSeal PTFE Tape A-A-58092 For fastening miniScope to the base
Potassium chloride Sigma 7447-40-7 For preparing aCSF
Robotic arm NIDA/IRP Custom-designed For GRIN lens implantation
Saline Hospira RL 7302 For both surgeries
Set screw DECORAH LLC. 3BT-P9005-00-0025 For screwing the brass hex nut in miniscope base
 Silicone Rubber tubing, 0.062”ID, 1/8”OD McMaster 2124T3 For irrigation of aCSF
Sodium bicarbonate Sigma 144-55-8 For preparing aCSF
Sodium chloride Sigma 7647-14-5 For preparing aCSF
Sodium phosphate monobasic Sigma 7558-80-7 For preparing aCSF
Stereotaxic stage KOPF Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic For both surgeries
Sterile cotton swab Puritan REF 806-WC For both surgeries
Surgical tools Fine Science tools 11251-35 For surgeries
Suture Sofsilk REF SS683 For virus injection
 Syringe filter (0.22 µm) Millex SLGVR33RS For filtering aCSF during GRIN lens implantation
Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f) Addgene 100834-AAV1 For virus injection
Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml
Xylazine VETone V1 510650 For GRIN lens implantation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  2. Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. Neuronal calcium signaling: function and dysfunction. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).
  3. Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex. Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).
  4. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  5. Komiyama, T., et al. Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice. Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).
  6. Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. Reorganization of corticospinal output during motor learning. Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).
  7. Barbera, G., et al. Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information. Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).
  8. Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
  9. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  10. Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
  11. Jacob, A. D., et al. A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
  12. Liang, B., et al. Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration. Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).
  13. Liberti, W. A., et al. Unstable neurons underlie a stable learned behavior. Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  15. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  16. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  17. Bassett, J. J., Monteith, G. R. Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery. Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).
  18. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  19. Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators. Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).
  20. Moore, D. T. Gradient-index optics: A review. Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).
  21. Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
  22. Yang, Y., et al. A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging. Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).
  23. Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation. Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).
  24. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  25. Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice. Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).
  26. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  27. Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy. Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).
  28. Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome. Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).
  29. McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).

Tags

Neurovidenskab udgave 176 Miniscope in vivo calciumbilleddannelse mPFC mus hjernekirurgi

Erratum

Formal Correction: Erratum: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging
Posted by JoVE Editors on 05/05/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. The Discussion was updated.

The following paragraph was added to the end of the Discussion:

Although a chunk of brain tissue is removed unilaterally during the GRIN lens implantation step, we did not observe any obvious behavior deficits7,12. The weight of the miniscope is around 2 grams and the cable is custom-designed to make it light and to ensure that the mouse can easily carry it. The miniscope and cable are only attached to the animal prior to in vivo imaging and detached after imaging. The entire imaging process usually takes no longer than 30 minutes. Therefore, these instrumentations do not prevent the mouse from freely behaving. The miniscope installation and deinstallation steps need a brief anesthesia (less than 2 minutes) with isoflurane for the purpose of animal restraining. We typically let the mouse recover from the brief exposure of isoflurane for 30 minutes before performing in vivo imaging. We have performed miniscope in vivo calcium imaging once per week for a few weeks without noticing any impact on mouse health and mouse social behavior12.

Stereotaksisk viral injektion og gradientindekslinseimplantation til dyb hjerne <em>in vivo-calciumbilleddannelse</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li,… More

Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (176), e63049, doi:10.3791/63049 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter