Summary
En protokol til anvendelse af paramagnetisk afslapningsforbedring NMR-spektroskopi til påvisning af svage og forbigående inter- og intramolekylære interaktioner i iboende uordnede proteiner præsenteres.
Abstract
Iboende uordnede proteiner og iboende uordnede regioner i proteiner udgør en stor og funktionelt signifikant del af det humane proteom. Den meget fleksible karakter af disse sekvenser giver dem mulighed for at danne svage, langtrækkende og forbigående interaktioner med forskellige biomolekylære partnere. Specifikke, men alligevel lavaffinitetsinteraktioner fremmer promiskuøs binding og gør det muligt for et enkelt iboende forstyrret segment at interagere med en lang række målsteder. På grund af den forbigående karakter af disse interaktioner kan de være vanskelige at karakterisere ved strukturelle biologiske metoder, der er afhængige af proteiner til at danne en enkelt, dominerende konformation. Paramagnetisk afslapningsforbedring NMR er et nyttigt værktøj til at identificere og definere den strukturelle understøttelse af svage og forbigående interaktioner. En detaljeret protokol til brug af paramagnetisk afslapningsforbedring til at karakterisere de lavt befolkede mødekomplekser, der dannes mellem iboende uordnede proteiner og deres protein, nukleinsyre eller andre biomolekylære partnere, er beskrevet.
Introduction
Intrinsic disorder (ID) beskriver proteiner (IDP'er) eller regioner inden for proteiner (IDR'er), der ikke spontant folder sig ind i stabile sekundære eller tertiære strukturer, men er biologisk aktive. Generelt er funktionen af IDP / IDR'er at lette specifikke, men reversible interaktioner med biomolekyler under fysiologiske forhold1. Således er IDP'er og IDR'er involveret i en række cellulære funktioner, herunder rekruttering, organisering og stabilisering af multiproteinkomplekser, for eksempel samling og aktivitet af spliceosom2, rekruttering og organisering af komponenter på steder med DNA-skade3, organisering og stabilisering af rekrutteringen af transkriptionskomplekser4 eller af kromatinremodeleren BAF5. Derudover findes IDP'er ved signalering af nexuser, hvor deres promiskuitet for forskellige bindingspartnere gør det muligt for dem at formidle informationsoverførsel gennem cellulære proteinnetværk6. Nyligt arbejde har også afsløret en tilbøjelighed for IDR-regioner til selvassociering af dannelse af biomolekylære kondensater gennem processen med væske-væskefaseseparation7. Mange af de førnævnte funktioner, der involverer ID, menes nu også at involvere et aspekt af kondensatdannelse8. På trods af ID's betydning for biomolekylær kompleks samling, stabilisering, stilladser og signaltransduktion er de atomare detaljer om deres specifikke interaktioner vanskelige at identificere, da IDP'er og IDR'er typisk ikke er modtagelige for strukturelle undersøgelser ved hjælp af røntgenkrystallografi eller kryogen elektronmikroskopi.
Kernemagnetisk resonans (NMR) er en ideel teknik til undersøgelse af ID, da den ikke er afhængig af tilstedeværelsen af stive eller homogene strukturelle ensembler, men rapporterer om det umiddelbare lokale miljø for individuelle kerner. Resonansfrekvensen eller det kemiske skift af en kerne i et givet molekyle påvirkes af svage magnetfelter induceret af den lokale elektroniske fordeling, som igen er afhængig af bindingslængder, vinkler, nærhed af andre kerner, interaktioner med bindingspartnere og andre faktorer9. Således fungerer hver kerne som en unik, stedspecifik strukturel sonde, der er følsom over for ændringer i dets lokale kemiske miljø. På trods af disse fordele er NMR en bulkteknik, og det observerede kemiske skift er gennemsnittet af alle de miljøer, der udtages af en bestemt kerne. En række NMR-teknikker, hvoraf mange er beskrevet i dette nummer, er blevet udviklet til at genvinde strukturel, dynamisk og kinetisk information om højenergiske, lavt befolkede biomolekylære konformationer indeholdt i det gennemsnitlige kemiske skift10,11. Selv om disse tilstande er forbigående befolket, er identifikation og kvantificering vigtig for at bestemme detaljerne i funktionelle mekanismer12. For eksempel kan konformationsensemblet i tilfælde af IDP'er og IDR'er være forudindtaget til fortrinsvis at prøve konformationer, der er produktive til dannelse af mødekomplekser med fysiologiske bindingspartnere. Påvisning af disse tilstande samt identifikation af de restspecifikke inter- og intramolekylære interaktioner og dynamikker er vigtige for at bestemme de underliggende strukturelle mekanismer for proteinfunktion og kompleks dannelse.
En protokol til brug af paramagnetisk afslapningsforbedring (PRE) NMR til at undersøge forbigående, lavt befolkede tilstande, der er vigtige for dannelsen af IDP / IDR-medierede biomolekylære komplekser, er beskrevet13. Denne tilgang er nyttig til at studere de forbigående protein-proteininteraktioner, såsom dem, der fremmer samlingen af amyloidfibriller fra α-synuclein 14,15 eller selvforeningen af FUS16, samt at karakterisere specifikke protein-proteininteraktioner, såsom mellem signalproteiner17. Et eksempel på en selvassocierende IDP præsenteres, hvor specifikke inter- og intramolekylære interaktioner resulterer i fortrinsvis komprimerede tilstande såvel som stedspecifikke interaktioner, der driver selvforening.
PRE stammer fra den magnetiske dipolære interaktion mellem en kerne og et paramagnetisk center med en isotrop g-tensor, der almindeligvis leveres i form af en uparret elektron på en nitrogenoxidgruppe eller som et paramagnetisk metalatom18 (figur 1). Mens atomer med anisotrope g-tensorer også producerer en PRE-effekt, er analyse af disse systemer vanskeligere på grund af forvirrende effekter bidraget af pseudokontaktskift (PCS) eller resterende dipolær kobling (RDC)13,19. Styrken af interaktionen mellem en kerne og det paramagnetiske centrum afhænger af afstanden på <r-6> mellem de to. Denne interaktion resulterer i en stigning i nukleare afslapningshastigheder, hvilket forårsager detekterbar linjeudvidelse selv for langtrækkende interaktioner (~ 10-35 Å), fordi det magnetiske moment for den uparrede elektron er så stærk20,21. Påvisning af forbigående tilstande med PRE er mulig, hvis følgende to betingelser er opfyldt; (1) den forbigående interaktion er i hurtig udveksling på NMR-tidsskalaen (observeret kemisk skift er et befolkningsvægtet gennemsnit af udvekslingstilstandene); og (2) kernerne til paramagnetisk centerafstand er kortere i den forbigående befolkede tilstand end i den store tilstand11. Den tværgående PRE betegnes Γ2 og beregnes til praktiske formål ud fra forskellen i 1H tværgående afslapningshastigheder mellem en prøve indeholdende et paramagnetisk center og en diamagnetisk kontrol. For en dybdegående behandling af teorien om PRE og relaterede pseudokontaktskift i hurtige og langsomme udvekslingsregimer henvises læseren til de omfattende anmeldelser af Clore og kolleger13,22. Her overvejes kun situationen, hvor 1HN-Γ 2 er i hurtigudvekslingsregimet, hvor den observerede afslapningshastighed på grund af PRE's r-6-afhængighed er relateret til både den afstand, som det paramagnetiske center nærmer sig kernen såvel som den tid, den bruger i denne konformation. Derfor producerer forbigående konformationer, der ikke involverer en tæt tilgang, en lille PRE, mens tættere interaktioner, selvom de er kortvarige, vil producere en større PRE.
For internt fordrevne anvendes PRE til at måle og differentiere interaktionerne inden for et enkelt molekyle (intramolekylært) og mellem separate molekyler (intermolekylært). Ved at fastgøre et paramagnetisk center til et NMR-synligt (f.eks. 15N-mærket) eller NMR-usynligt (f.eks. naturligt overflod 14N) protein, kan kilden (inter- eller intramolekylær) til PRE bestemmes (figur 2). Site-rettet mutagenese, der introducerer en cysteinrest, er en bekvem tilgang til at vedhæfte et paramagnetisk center (spin-label) til et protein23. Flere typer molekyler er blevet foreslået til brug som spin-etiketter, herunder metalchelatering (EDTA-baseret) og frie radikaler (nitrogenoxidbaseret)24. Forskellige nitrogenoxidspinetiketter er blevet beskrevet og fås med forskellige cystein-reaktive kemikalier, såsom methenethiosulfonat, maleimid og iodoacetamid25,26 (figur 1). Mærkets eller linklinkerens iboende fleksibilitet kan være problematisk i forbindelse med visse analyser, og i disse situationer er der foreslået forskellige strategier for at begrænse mærkets bevægelse, f.eks. ved at tilføje omfangsrige kemiske grupper eller brugen af en anden linker til at forankre mærket til proteinet (fastgørelse på to steder)27. 28. Derudover kan kommercielt tilgængelige mærker indeholde diastereomere proteiner, men generelt vil dette ikke bidrage til den observerede PRE29. Anvendelsen af 3-maleimido-PROXYL bundet til en fri cystein via maleimidkemi er beskrevet, da det er let tilgængeligt, omkostningseffektivt, ikke-reversibelt, og reduktionsmidlet tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) kan opretholdes i opløsningen gennem hele mærkningsreaktionen. Da 3-Maleimido-PROXYL har en isotrop g-tensor, induceres der ingen PCS eller RDC'er, og de samme kemiske skiftopgaver kan bruges til både de paramagnetiske og diamagnetiske prøver13.
1HN-T 2 måles ved hjælp af en to-punktsstrategi (T a, Tb), der tidligere har vist sig at være lige så nøjagtig som at indsamle en fuld evolutionsserie bestående af 8 til 12 tidspunkter30. Det første tidspunkt (T a) er sat så tæt på nul som praktisk muligt, og den optimale længde af det andet tidspunkt afhænger af størrelsen af den største forventede PRE for en given prøve og kan estimeres ud fra: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2), hvor R 2,dia repræsenterer R2 i den diamagnetiske prøve13. Hvis størrelsen af de største PRE'er er ukendt, er indstilling af T b til ~ en gange proteinets 1H T2 et godt indledende estimat og yderligere optimeret ved at justere T2 for at forbedre signalet til støj. Denne topunktsmålestrategi reducerer signifikant den eksperimentelle tid, der kræves for at måle PRE'er, og giver tid til mere signalgennemsnit, især da relativt fortyndede prøver bruges til at minimere virkningerne af ikke-specifikke kontakter mellem molekyler. En HSQC-baseret pulssekvens bruges til at måle 1H N-T2 og er beskrevet detaljeret andetsteds30. For at forbedre følsomheden kan de hårde impulser fra INEPT-overførsler fremad og tilbage erstattes med formede impulser; alternativt konverteres sekvensen let til en TROSY-baseret aflæsning31. Da internt fordrevne typisk har meget længere tværgående afslapningshastigheder, hvilket resulterer i smallere linjebredder (på grund af den iboende lidelse) end globulære proteiner af samme størrelse, kan lange erhvervelsestider i den indirekte dimension bruges til at forbedre spektralopløsningen og lindre den kemiske forskydningsdispersionsbegrænsning, der er iboende for internt fordrevne.
PRE er et nyttigt værktøj til at studere protein-protein og protein-nukleinsyre interaktioner, især interaktioner, der er forbigående eller lavt befolket. Der gives en detaljeret protokol til forberedelse af en NMR-prøve, der er egnet til måling af PRE'er, herunder trin til proteinoprensning, stedrettet spinmærkning, opsætning og kalibrering af pulsprogrammet, behandling og fortolkning af NMR-dataene. Vigtige eksperimentelle overvejelser bemærkes overalt, der kan påvirke datakvaliteten og eksperimentelle resultater, herunder prøvekoncentration, valg af spin-etiket og fjernelse af paramagnetiske komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Generelle krav til protokollen: proteinrensningsfaciliteter, UV-Vis-spektrometer, højfelts NMR-spektrometer og driftssoftware, software til efterbehandlingsanalyse, herunder; NMRPipe32, Sparky 33 (eller CCPN-analyse 34 eller NMRViewJ35).
1. Rekombinant ekspression og oprensning af et protein til PRE-målinger
- Design en ekspressionskonstruktion for proteinet af interesse, så der er en enkelt cysteinrest til stede. Flere mutationer vil være nødvendige for at indføre en fri cystein på forskellige positioner i proteinet af interesse36.
- Ekspress og rens en naturlig forekomst (14N) eller 15N-mærket prøve af proteinet af interesse ved hjælp af en etableret protokol37.
BEMÆRK: E . coli-ekspressionssystemer giver omkostningseffektiv og robust metode til rekombinant proteinekspression, da isotopberigelse af 15N er et minimalt krav til biomolekylær heteronuklear NMR-spektroskopi. Typiske trin er udtryk i minimale medier, kromatografisk oprensning og fjernelse af affinitetsrensningsmærke. Denne protokol forudsætter, at der er etableret en robust ekspressions- og oprensningsprotokol, der kan producere tilstrækkeligt protein af passende kvalitet til NMR-undersøgelser.- Der opretholdes 1 mM reduktionsmiddel (DTT eller TCEP) i buffere ved alle rensningstrin for at forhindre reaktion af det frie cystein og dannelse af intermolekylære disulfidbindinger for internt fordrevne.
BEMÆRK: Nogle systemer kan være mere tolerante og mindre aggregerede tilbøjelige til ikke-reducerende forhold afhængigt af proteinets specifikke egenskaber samt temperatur, pH og buffersystem valgt til rensning38. - Fjern affinitetsmærker, der bruges til oprensning, før du fortsætter, da de ikke specifikt kan interagere med proteinet på uforudsigelige måder eller muligvis indeholde reaktive cysteinrester, der utilsigtet kan tjene som et utilsigtet fastgørelsessted.
- Der fremstilles en 15N-mærket referenceprøve uden cysteinmutation(er) blandet med en opløselig version af spin-etiketten for at vurdere bidraget fra opløsningsmiddel-PRE'er.
- Der opretholdes 1 mM reduktionsmiddel (DTT eller TCEP) i buffere ved alle rensningstrin for at forhindre reaktion af det frie cystein og dannelse af intermolekylære disulfidbindinger for internt fordrevne.
2. Konjugering af 3-Maleimido-PROXYL nitrogenoxid spin etiketten
- Det rensede protein opbevares eller ombyttes til en afgasset buffer indeholdende 50 mM Tris pH 7 og 1 mM TCEP bufferen kan også indeholde op til 8 M urinstof, hvis det er nødvendigt for at fremme proteinopløseligheden.
Alternativt fortyndes en proteinstamopløsning hurtigt til mindst 10 volumenækvivalenter af afgasset 50 mM Tris pH 7 og 1 mM TCEP-buffer. Sørg for, at proteinkoncentrationen inden tilsætning af spin-label er mindst 100 μM. - Tilsæt 3-Maleimido proxyl fra en stamopløsning til 20x molært overskud af proteinet af interesse. Prøven beskyttes mod lys og ilt, og den inkuberes natten over ved stuetemperatur eller 4 °C. Blid rocking eller nutation kan forbedre mærkningseffektiviteten.
- Forbered stamopløsninger af spin-etiketten ved at opløse 3-Maleimido proxyl pulver i 95% ethanol. Alikvoter af stammen kan opbevares ved -80 °C i mindre end 6 måneder.
- Kritisk trin: Fjern den ikke-reagerede gratis spin-etiket for at forhindre ikke-specifikke opløsningsmiddel-PRE'er. Opnå dette ved gelfiltrering eller (helst) omfattende dialyse af proteinprøven. Dette trin vil også introducere proteinet i en buffer, der er egnet til NMR.
BEMÆRK: Reduktionsmidler skal fremstilles friske, og kompatibilitet mellem bufferkomponenter skal overvejes; TCEP nedbrydes f.eks. hurtigt i fosfatbaserede buffere, og denne kombination bør undgås39. - Behandl alle buffere, der anvendes fra dette skridt fremad, med en chelaterende harpiks, der er selektiv til divalente metaller og overgangsmetaller for at fjerne paramagnetiske ioner eller spin-label quenchers. Hvis proteinet ikke kan opbevares i en NMR-buffer, koncentreres proteinet, så det hurtigt kan fortyndes i en buffer, der er egnet til NMR.
- Overvågning af effektiviteten af spin-label inkorporering.
- Der anvendes Ellmans reagens (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoesyre) til kvantificering af frie sulfhydrylgrupper i opløsning40.
BEMÆRK: Detaljerede protokoller er tilgængelige fra producenten. Til formålet her er det vigtigt at bestemme inkorporering af spin-etiketten, koncentrationen af frie sulfhydrylgrupper sammenlignes med den samlede proteinkoncentration. Procentdelen af frie sulfhydrylgrupper er procentdelen af molekyler, der ikke har en nitrogenoxid spin etiket vedhæftet. - Overvåg intensiteten af toppen svarende til den mærkede cysteinrest for at bedømme spin-label inkorporering i proteinet af interesse.
BEMÆRK: Dette er en hurtig og effektiv tilgang til at bestemme graden af spinmærkning af proteinet. Fuldstændig inkorporering af spin-mærket vil resultere i, at toppen forsvinder fra spektret. Med den ringe dispersionskarakteristik for internt fordrevne kan den top, der svarer til den mutante cysteinrest, ikke altid let identificeres, og det anbefales derfor at anvende Ellmans reagens (trin 2.6.1).
- Der anvendes Ellmans reagens (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoesyre) til kvantificering af frie sulfhydrylgrupper i opløsning40.
3. Forbered NMR-prøve til måling af intra- eller intermolekylær PRE
- Forbered prøve til måling af intramolekylær PRE
- Der fremstilles 15N isotopisk beriget, spinmærket protein til en koncentration på mindst 100 μM, men ikke over 300 μM i en buffer, der er egnet til NMR. Det samlede prøvevolumen (inklusive D2O) er 500 - 550 μL.
BEMÆRK: Almindelige NMR-buffere omfatter fosfat, acetat, (bi)carbonat og TRIS. Good's buffere såsom MES, HEPES kan også være passende. Vær forsigtig, når du vælger buffere for at sikre, at der ikke er krydsreaktivitet med andre opløsningskomponenter. - Sørg for, at pH er ~ 7,2 eller lavere for at minimere virkningerne af amidprotonudveksling med vand. Hold saltkoncentrationen så lav som muligt (typisk mindre end 150 mM), selvom den primære overvejelse er at opretholde proteinstabilitet.
BEMÆRK: Tilgange til udførelse af NMR-eksperimenter under forhold med højt saltindhold er beskrevet andetsteds41.
- Der fremstilles 15N isotopisk beriget, spinmærket protein til en koncentration på mindst 100 μM, men ikke over 300 μM i en buffer, der er egnet til NMR. Det samlede prøvevolumen (inklusive D2O) er 500 - 550 μL.
- Forbered prøve til måling af intermolekylær PRE
- Følg dette trin eller trin 3.1; De udføres ikke samtidigt. Forbered 14N naturlig overflod, spin-mærket protein i den valgte NMR-buffer.
- Proteinprøven fremstilles ved at blande 15N isotopisk beriget ikke-spin-mærket protein med 1%-50% 14N spinmærket protein med naturlig overflod, således at slutkoncentrationen er identisk med prøven fremstillet i 3.1.1. Det samlede prøvevolumen (inklusive D2O) er 500 - 550 μL.
- Empirisk optimere forholdet mellem 15N og 14N proteiner for hvert undersøgt protein. Forholdet på 1%, 5% og 20% af 14N-spin-mærket protein er gode udgangspunkter.
BEMÆRK: En opbygning af PRE som funktion af tilsat 14N-spin-mærket protein indikerer en specifik effekt; den observerede PRE er prøvespecifik, da den afhænger af afstand og population (som diskuteret ovenfor), og derfor kræves højere forhold på 14N-spin-mærket protein, hvis interaktionen er særlig forbigående17.
- NMR-prøven (enten intra- eller intermolekylær) overføres til et 5 mm NMR-rør, der er egnet til brug i højfeltmagneter ved hjælp af en glaspipette eller mikropipette med lang stilk (9"). Sørg for, at alle NMR-prøver inkluderer 5%-10% af D2O for at lette feltlåsning.
BEMÆRK: NMR-rør, der bruger polymerpropper til at reducere det nødvendige prøvevolumen, anbefales ikke til PRE-målinger på grund af vanskeligheder relateret til effektiv prøveshimming.
4. Opsæt NMR-spektrometer og eksperimentér specifikke parametre
- Vær yderst forsigtig, når du arbejder omkring superledende NMR-spektrometre med højt felt.
BEMÆRK: Farer omfatter skader på grund af den pludselige acceleration af metalgenstande mod magneten, interferens med implanteret medicinsk udstyr og kvælning på grund af en pludselig frigivelse af N2- ogHe2-gas i tilfælde af magnetdæmpning. De følgende trin forudsætter, at læseren har gennemgået den krævede uddannelse, er opmærksom på disse og andre lokale farer og har modtaget godkendelse fra facilitetslederen til at betjene NMR-spektrometeret. Hvis du er i tvivl om et trin eller en instruktion, skal du rådføre dig med facilitetslederen eller den erfarne bruger for at forhindre potentiel personskade eller beskadigelse af spektrometeret. - Følgende trin forudsætter et kommercielt NMR-spektrometer, der kører en moderne version af anskaffelseskontrolsoftwaren. Download pulsprogrammet og parameterfilerne, og placer dem i de relevante mapper.
BEMÆRK: Et pulsprogram og parametersæt, der er egnet til brug med et Bruker-spektrometer og TopSpin (3.2 eller nyere), er tilgængelige efter anmodning fra forfatterne.- Kritisk trin: Kendskab til installation af ikke-native NMR-pulsprogrammer antages; Rådfør dig med facilitetschefen eller en erfaren bruger, hvis det er nødvendigt.
- Placer prøven i magneten, lås på 2H-signalet ved hjælp af Lock-kommandoen, indstil og match 1H-kanalen i henhold til facilitetsprotokoller (den nøjagtige procedure afhænger af, om sonden er udstyret med et fjernindstillings- og matchmodul).
- Juster shims ved hjælp af topshim-subrutinen for at optimere undertrykkelsen af opløsningsmiddelsignalet.
- Kalibrer 1H og 15N 90° impulserne ved hjælp af standardmetoder.
- Kalibrer 1H-pulsen ved hjælp af popt-programmet (brug pulsecal først til at estimere pulslængden).
- 15N-pulsen kalibreres mod en standardprøve; Sørg for, at denne værdi er blevet kalibreret for nylig ved at diskutere med en teknisk direktør eller erfaren bruger.
- Alternativt kalibreres 15N-pulsen på prøven ved at variere en af 90 ° impulserne i et HMQC-eksperiment, indtil der opnås et nulsignal.
- Bestem den korrekte dæmpning for formede impulser ved hjælp af formværktøjet (stdisp) subrutine.
- Åbn den relevante pulsformfil ved at klikke på mappeikonet. De formede impulser findes i afsnittet om pulsparametre i ACQUPARS.
- Indlæs pulsdefinitionsfilen, og klik på Analysér bølgeform > Integrer form. Indtast den kalibrerede 1H 90° hårde puls, den ønskede formede pulslængde og rotation (90° eller 180°).
- Beregn effektniveauet for den formede puls ved at tilføje ændringen af effektniveau til dæmpningen for den kalibrerede 90° puls.
- Optag en standard 1H, 15N HSQC (hsqcetfpf3gpsi) for at optimere fejebredde, bærefrekvens og kontrollere vandundertrykkelse25.
- Juster fejebredden og antallet af indirekte dimensionsintervaller ved hjælp af kommandoerne sw og td eller direkte i de relevante dialogbokse. Typisk vælges spektralbredder til indsamling af PRE'er, så spektret ikke foldes.
5. Opsæt 1HN-T 2-eksperimentet
- De formede impulser kalibreres som beskrevet ovenfor (4.4.5-4.5.7). De formede pulsparameterfiler til PRE-eksperimentet er Eburp2.1000 (90° puls), Reburp.1000 og Iburp2.1000. Indtast de kalibrerede pulslængder i afsnittet pulsparametre under fanen ACQUPARS .
- Dette eksperiment måler 1H N-T2 ved hjælp af metoden med to tidsforsinkelsespunkter30.
- Indstil tidsforsinkelserne ved at redigere vdlist-filen, den første forsinkelse (Ta) er indstillet til 0,01 ms.
- Vælg den anden forsinkelse (T b) ved hjælp af forholdet til den forventede maksimale PRE (T b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2), hvor R 2,dia repræsenterer R 2 i den diamagnetiske prøve13. Uden forudgående kendskab til størrelsen af PRE's bidrag til den observerede afslapning er et godt udgangspunkt at indstille T b til ~1x 1H T2.
- Bestem derefter en passende værdi ved at sammenligne de første trin (behandlet med efp-kommandoen) af T- a- og T b-spektrene og justere T b, således at signalet henfalder til mellem 40% -50% af dets oprindelige værdi.
BEMÆRK: Denne fremgangsmåde optimerer spektralsignal-til-støj, en nødvendig overvejelse for prøver, der ikke kan koncentreres stærkt (< 50 μM). Egnede værdier af Tb er prøveafhængige, men varierer typisk fra 8 - 40 ms for et protein af gennemsnitlig størrelse.
- Bestem antallet af komplekse punkter, der skal registreres, og antallet af scanninger for tilstrækkelig signalgennemsnit. Da internt fordrevne har længere 15N T2 end foldede proteiner af sammenlignelig størrelse, kan der anvendes længere anskaffelsestider i den indirekte dimension.
BEMÆRK: Denne værdi afhænger af proteinets specifikke egenskaber, men kan groft estimeres ud fra 15N T2 og optimeres ved at overvåge signalhenfaldet i FID'en. For den direkte dimension er 1024* komplekse punkter (13 ppm fejebredde, 112,6 ms anskaffelsestid) tilstrækkeligt til de fleste prøver. - Brug kommandoen expt til at beregne eksperimenttiden, og start derefter eksperimentet med kommandoen zg.
6. Lav en diamagnetisk prøve ved at reducere spin-label med ascorbinsyre
- Natriumascorbat opløses i NMR-bufferen, og pH-værdien justeres, så den svarer til den oprindelige NMR-buffer.
- Koncentrationen af natriumascorbatstammen beregnes, således at der kan tilsættes et 10x molært overskud af ascorbat i forhold til spin-etikettens koncentration med mindst mulig ændring af prøvevolumen. For eksempel er en 100 mM proteinprøve passende til en 100 mM bestand ascorbat. For at reducere spin-mærkningen kræves der tilsætning af 5,5 μL stamopløsning af ascorbinsyre, hvilket kun svarer til 1 % af det samlede prøvevolumen.
- Tilsæt den nødvendige mængde ascorbinsyre til NMR-røret ved at placere en dråbe under rørets kant, hætte røret, vend forsigtigt røret for at blande, og drej derefter ved 200-400 x g i 10-20 s i en håndsvinget centrifuge for at bundfælde prøven i bunden af røret.
- Pak NMR-røret ind i folie for at beskytte mod lys og lad reaktionen fortsætte i mindst 3 timer.
- Der registreres 1HN-T2 på den diamagnetiske prøve med de samme parametre, som anvendes til den paramagnetiske prøve.
- Kalibrer impulserne igen. De burde dog ikke have ændret sig fra de paramagnetiske målinger; Hvis de er signifikant forskellige (> 0,5 μs forskel), skal du overveje prøvekvaliteten (f.eks. Nedbrydning, nedbør).
- Sørg for, at alle anskaffelsesparametre, herunder de angivne afslapningsforsinkelser (vdlist), antal dummyscanninger, antal indsamlede scanninger, antal indsamlede komplekse punkter, anskaffelsestid, fejebredder og bærefrekvenser forbliver de samme for de diamagnetiske og paramagnetiske prøver.
7. Proces paramagnetiske og diamagnetiske spektre
- Kopiér dataene til den lokale computer eller arbejdsstation, hvor NMRPipe og Sparky er installeret og konfigureret. Opret en mappe med navnet proc i eksperimentdatamappen, der indeholder serfilen.
- Kopier NMRPipe-scripts fid.com, p3d.com og nmrproc.com til proc (behandlingsscripts er tilgængelige efter anmodning fra forfatterne).
- Brug scriptet fid.com til at konvertere Bruker-dataformatet (ser) til NMRPipe-format.
- Brug p3D.com-scriptet til at opdele pseudo3D-planerne i individuelle spektre.
- Brug nmrproc.com-scriptet til at læse outputtet af fid.com-scriptet, anvende opløsningsmiddelundertrykkelse, en vinduesfunktion, tilføje nuller til rådataene (nulfyldning), anvende fasekorrektion, udføre en Fourier-transformation, trimme dataene til visning og skrive de behandlede data til disken. Scriptet udsender en fil for hver registreret afslapningsforsinkelse (T a og Tb).
BEMÆRK: Hvert af disse scripts kan tilpasses for at optimere behandlingen for de specifikke detaljer i hvert eksperiment. Selvstudier og eksempler på datasæt er inkluderet i NMRPipe-distributionen, der er tilgængelig fra NMRPipe-webstedet32. NMRDraw kan anvendes til spektralvisning under behandling (f.eks. indstilling af korrekte fasevinkler osv.). Indstillinger tilgængelige for NMRPipe-kommandoer kan ses ved hjælp af kommandoen nmrPipe -help.
8. Overfør resonanstildelinger og udtræk tophøjder
- Skift filoverskriftsoplysningerne for hver spektrumfil (T a, Tb for både paramagnetiske og diamagnetiske prøver) ved hjælp af kommandoen sethdr [filnavn] -ndim 2.
- Brug Sparky til at udtrække tophøjder33 ved at følge trin 8.3-8.5. Andre softwarepakker, herunder NMRPipe (NMRDraw)32, CCPN Analysis34 og NMRViewJ35 er også passende.
- Læs spektralfilerne i Sparky. På dette trin vil datasættet bestå af et spektrum for hver tidspunktspektre (T a, Tb) for både de paramagnetiske og diamagnetiske prøver, målt for hver position af spin-etiketten i proteinet.
- Brug Sparky til at vælge toppe (kommando: F8, klik og træk derefter) og overfør tildelinger ved hjælp af værktøjet til liste over overførselstoppe fra en referencetopliste.
BEMÆRK: Resonanstildelinger af det pågældende protein er nødvendige for sekvensspecifik fortolkning af de observerede PRE'er36.- Indstil konturer i både paramagnetiske og diamagnetiske spektre til samme niveau. Sørg for at indstille konturerne, så spektrene indsamlet efter tidsforsinkelsen ikke med vilje udelukker toppe, men er høje nok, så T-a-spektrene ikke er alt for støjende.
- Gem de nye toplister for hvert spektrum, og inkluder den målte spidsintensitet og Sparky beregnet signal / støjforhold (kommando: lt for at åbne peaklist, klik på indstillinger for at inkludere intensitet og SNR-kolonner, kommando: gem).
9. Der ekstraheres 1H N-T2 for hver restkoncentration, og PRE beregnes
- Importer toplisterne til regnearkssoftware eller et foretrukket programmeringssprog som Python.
BEMÆRK: For hver spin-label position på proteinet vil datasættet bestå af fire toplister med tilhørende topintensiteter, en hver af T a og Tb for både de paramagnetiske og diamagnetiske eksperimenter. - 1HN R2 beregnes for både de paramagnetiske og diamagnetiske prøver ved hjælp af ligningen:
- Brug ovenstående ligning til at bestemme afslapningshastigheden for hver rest for de paramagnetiske og diamagnetiske prøver.
- Hastigheden1 HN-Γ 2 bestemmes for hver restkoncentration ved hjælp af ligningen:
- Brug det beregnede signal / støjforhold (SNR) til at beregne usikkerheden ved tophøjden for hver rest.
- Udbrede fejlen ved hjælp af ligningen:
- Plot 1HN-Γ 2 som funktion af restkoncentrationens antal ved hjælp af et spredningsplot, herunder fejlen beregnet i 9.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intramolekylære 1H N-Γ2 PRE'er blev registreret på et selvassocierende, iboende uordnet fragment (rester 171-264) afledt af lavkompleksitetsdomænet af det RNA-bindende protein EWSR142 (figur 3). Restkoncentrationer i umiddelbar sekventiel nærhed af spin-label-fastgørelsespunktet (f.eks. rest 178 eller 260 i figur 3) forventes at blive væsentligt udvidet og kan ikke påvises i spektret. Rester, der er sekventielt fordelt fra fastgørelsespunktet, men alligevel viser forbedret Γ2, var rumligt tæt (10-35 Å) på spin-etiketten. I tilfælde af EWSR1 171-264 er det kompliceret at tildele kilden til PRE-effekten, da den kan opstå ved en kombination af inter- og intra-restkontakter og er afhængig af afstanden fra kernen til det paramagnetiske centrum, populationen af denne konformation og dynamikken i vektoren, der forbinder elektronen og nukleare spins. Endvidere er størrelsen af PRE'er, der stammer fra intramolekylære kontakter, ikke koncentrationsafhængig, mens PRE'er, der stammer fra intermolekylære kontakter, afhænger af koncentrationen såvel som kinetikken og dynamikken i sammenhængen mellem proteinmolekyler.
En mulig fortolkning af disse data er, at IDP-ensemblet prøver konformationer, der er mere kompakte end en forlænget kæde. Alternativt kan PRE'erne opstå fra intermolekylære kontakter, der er ansvarlige for selvassocieringen af EWSR1, eller PRE'erne kan være fra en kombination af både intra- og intermolekylære kontakter. I det tilfælde, der præsenteres her, er det stadig ukendt, hvor tæt resterne nærmer sig spin-etiketten, eller hvor længe de forbliver i umiddelbar nærhed. Med meget fleksible molekyler som EWSR1 171-264 kan det være svært kvalitativt at adskille disse parametre. Ved at placere spin-mærket på forskellige restkoncentrationer kan kontakter mellem forskellige dele af kæden identificeres, hvilket giver en mere nøjagtig fortolkning af specifikke interaktioner, der kan være funktionelt relevante for selvassociering (figur 3). Måling af intermolekylære PRE'er (14N spin-mærket protein blandet med 15 N ikke-spin-mærket protein), anvendelse af en mutationsstrategi for rester med større end gennemsnitlige PRE'er (f.eks. Rester 196 eller 215, figur 3) og anvendelse af andre biofysiske metoder såsom dynamisk lysspredning, størrelsesudelukkelseskromatografi og analytisk ultracentrifugering er nyttige til karakterisering af et IDP's konformationelle ensemble.
Figur 1: Molekyler indeholdende en uparret elektron og forskellige funktionelle grupper for at lette fastgørelse til frie cysteinrester, der typisk anvendes som paramagnetiske afslapningsmidler. Diamagnetiske molekyler kan anvendes som kontrol. a) 3-maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, frie radikaler (3-maleimido-PROXYL) (B) 3-carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, frie radikaler (3-carboxy-PROXYL) (C) 3-(2-iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, frie radikaler (3-(2 - iodoacetamido-PROXYL) (D) 1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) methylmethanethiosulfonat (MTSL) (E) (1-Acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-δ-3-pyrrolin-3-methyl) Methanethiosulfonat (Acetoxy-MTSL) Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Skildring af intra- og intermolekylær PRE. (A) Intramolekylær PRE, den røde cirkel repræsenterer den effektive radius af et paramagnetisk center bundet til et 15N-mærket protein. PRE-effekten falder med en <r-6> afhængighed af afstand fra det paramagnetiske molekyle. (B) Intermolekylær PRE, den paramagnetiske gruppe (rød cirkel), er placeret på et 14N (naturligt overflod) protein (blå), der er usynligt for NMR. Virkningerne af den paramagnetiske gruppe på det ikke-NMR aktive protein observeres som øgede afslapningshastigheder, når det kommer i tæt kontakt med 15N-proteinet (sort). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: 1HN-Γ 2 satser for restkoncentrationer 171-264 af det iboende uordnede domæne af EWSR1. En serinrest i position (A) 178 eller (B) 260, der er muteret til en cystein, tjener som fastgørelsespunkt for en 3-Maleimido-PROXYL spin-etiket (rød *). Øgede afslapningshastigheder forekommer på mærkets placering, andre steder med øget afslapning er tegn på intramolekylære interaktioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En metode til karakterisering af forbigående interaktioner, der eksisterer ved lave populationer mellem iboende uordnede proteiner og forskellige bindingspartnere, der bruger PRE, er blevet præsenteret. I det viste eksempel er proteinet selvassocierende, og PRE kan således opstå ved en kombination af inter- og intramolekylære interaktioner. Denne metode udvides let til heterogene prøver, hvor interaktionerne mellem to forskellige proteiner kan karakteriseres. Supplerende information om, hvordan forskellige regioner af proteinet interagerer, er tilgængelig ved at placere spin-etiketten på forskellige positioner i proteinet. Ved at skifte spin-label mellem NMR aktive (15N) og NMR inaktive (14N) arter, kan de intra- og intermolekylære kilder til observeret PRE desuden differentieres fra hinanden og give information om mødekomplekser. Eksperimentet, der er skitseret her, kan rapportere om komplekse interaktioner, selvom de forekommer på en mikrosekundtidsskala13.
Centralt for denne metode er inkorporeringen af et spin-label mærke i proteinet af interesse ved fastgørelse til en cysteinrest. Nogle proteiner kan indeholde en indfødt cystein, der er egnet (deltager ikke i disulfidbindinger, er overfladeeksponeret) til fastgørelse af en spin-etiket. For internt fordrevne er opløsningsmiddeleksponering af cystein normalt ikke et problem. I de fleste tilfælde er det ønskeligt at indføre cysteiner som konservative mutationer (serin til cystein eller andre uladede polære aminosyrer til cystein) ved anvendelse af stedrettet mutagenese43. I det præsenterede eksempel indeholder fragmentet af EWSR1 ikke indfødte cysteiner og er beriget med seriner; Således var det ligetil at udtænke en mutationsstrategi. Proteiner, der indeholder naturligt cystein(er), udgør et mere kompliceret tilfælde, og man skal passe på ikke at forstyrre den naturlige funktion (f.eks. bryde en strukturelt vigtig disulfidbinding)44. For at inkorporere en enkelt cystein til spin-mærkning skal de indfødte cysteiner muteres til en rest, der ikke reagerer med spin-etiketten (ingen mercapto-gruppe) og baseret på dens størrelse og andre egenskaber er serin en god erstatning for cystein. Hvis indfødte cysteiner skal muteres, kræves omhyggelig karakterisering af mutanterne for at sikre, at de opretholder oprindelig struktur og funktion er afgørende. Simple 1 H,15N HSQC'er af mutanter sammenlignet med vildtypeproteinet er kraftige indikatorer for forstyrrelser (selv mindre) i proteinstrukturen, og denne tilgang er også nyttig for internt fordrevne45. Andre metoder til overvejelse er cirkulær dikroisme, analytisk ultracentrifugering eller biokemiske tilgange såsom aktivitetsassays46.
Tekniske overvejelser for at opnå reproducerbare, stringente data af høj kvalitet omfatter fjernelse af ioniske urenheder under forberedelsen af NMR-prøven. Dette opnås ved at føre alle opløsninger over chelaterende harpiks inden brug. Endvidere er det vigtigt at bruge en korrekt afgasset buffer under fastgørelsen af nitrogenoxidspinetiketten, da tilstedeværelsen af ilt kan reducere effektiviteten af mærkning. Diamagnetisk kontaminering vil bidrage til et fald i den observerede PRE; effekten er imidlertid mindre udtalt på intramolekylære PRE'er og kan reduceres ved at reducere ΔT13. Det er derfor ikke nødvendigt at opnå 100% etiketinkorporering for at fortsætte eksperimentet, især for den kvalitative fortolkning, der præsenteres her. Hvis frie cysteiner fra ufuldstændig spin-label-vedhæftning er problematiske, er nogle mercapto-reaktive kemikalier (f.eks. maleimid) modtagelige for at opretholde et reduktionsmiddel i prøven under hele eksperimentet26. Det er vigtigt, at de paramagnetiske og diamagnetiske prøver matcher hinanden så tæt som muligt. Når centrifugeringsetiketten reduceres med ascorbinsyre for at skabe en diamagnetisk kontrol, skal man overveje den fortyndingsfaktor, der indføres ved titrering i en stamopløsning af ascorbinsyre. Denne fortynding kan minimeres ved at holde ascorbinsyrestammen mindst 10x den forventede arbejdskoncentration i NMR-bufferen.
Der er mange softwarepakker til rådighed til analyse af NMR-data, herunder NMRPipe 32, Sparky 33, CCPN Analysis34, NMRViewJ35, blandt andre. Kombinationen af NMRPipe til spektralbehandling og Sparky til spektralanalyse (peak picking og kvantificering) blev beskrevet her på grund af brugervenligheden af denne kombination. NMRPipe bruges almindeligvis af mange NMR-grupper til spektralbehandling, men NMRPipe-pakken indeholder de nødvendige værktøjer til at gennemføre alle trin i analysen, omend med en betydelig indlæringskurve. Data kan også behandles ved hjælp af NMR-spektrometerstyringssoftwaren. Sparky blev valgt til spektralanalyse på grund af dets brugervenlighed og hurtige optagelse af nybegyndere. Der er flere muligheder til rådighed for spektralanalyse (peak picking og måling af tophøjder), der let kan erstatte funktionaliteten af Sparky, herunder CCPN Analysis eller NMRViewJ. Især har mange af disse programmer overlappende funktioner, og brugeren rådes til at vælge den kombination af programmer, som de er mest komfortable med.
Dårlig kemisk skiftspredning er et iboende problem med internt fordrevne, hvilket fører til betydelig resonansoverlapning og indførelse af fejl i målingen af tophøjde. Der er foreslået forskellige strategier for at afhjælpe dette problem. En af de mest ligetil, og den, der anvendes her, er at drage fordel af den lange tværgående afslapning, der er karakteristisk for internt fordrevne, og simpelthen forlænge erhvervelsestiden i dimensionen 15N (indirekte). Alternativt er det tredobbelte resonans HNCO-eksperiment nyttigt til løsning af resonansoverlapning i IDP'er på grund af den overlegne spredning af C 'resonanser. Både STROSY- og HSQC-versionerne af HNCO til måling af PRE'er er blevet foreslået og er beskrevet andetsteds47. Den forbedrede opløsning er imidlertid ikke altid signifikant nok til at berettige forsøgets øgede kompleksitet, længere tid til dataindsamling og ekstra omkostninger til forberedelse af en passende prøve (berigelse på 13C). Dette er faktisk tilfældet for EWSR1 171-264, der præsenteres her, hvor der ikke blev observeret nogen signifikant forbedring i antallet af ikke-overlappende restkoncentrationer mellem en TROSY-HNCO og en 1H, 15N HSQC indsamlet med lang anskaffelsestid i den indirekte dimension.
Denne procedure skitseret ovenfor fokuserer på nytten af PRE-eksperimenter til karakterisering af svage interaktioner, der findes inden for og mellem iboende uordnede proteiner. PRE har en meget bredere anvendelighed i biomolekylær NMR, herunder bestemmelse af langtrækkende strukturelle begrænsninger og kvantitativ bestemmelse af tyndt befolkede konformationstilstande. For eksempel har Clore og kolleger været banebrydende for brugen af PRE til at detektere og kvantificere forbigående interaktioner, der opstår som følge af interaktioner mellem individuelle domæner af et enkelt protein48 eller mellem underenhederne af samlede proteinkomplekser17. Der er mange eksempler på, at PRE bruges til at udlede afstandsbegrænsninger over store afstande, herunder for store proteiner49 eller med nye PRE-mærker50 for at hjælpe med at bestemme den samlede fold af et protein51 såvel som i stærkt paramagnetiske systemer52. Selv om PCS ligger uden for rammerne af denne diskussion, er de endelig blevet anvendt på vigtige biomolekylære problemer, som er beskrevet andetsteds53. Metoden præsenteret ovenfor er egnet til at undersøge konformation og interaktioner mellem internt fordrevne ved hjælp af PRE'er og er designet til at være tilgængelig for nybegyndere. For mere kvantitative tilgange til analysen af PRE, henvises brugeren til de mange fremragende artikler, der henvises til inden for 11,24,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere har læst og godkendt manuskriptet. Der erklæres ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Jinfa Ying og Kristin Cano for nyttige diskussioner og teknisk assistance. DSL er en St. Baldrick's Scholar og anerkender støtten fra St. Baldrick's Foundation (634706). Dette arbejde blev delvist støttet af Welch Foundation (AQ-2001-20190330) til DSL, Max og Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant til DSL), UTHSA Start-Up Funds til DSL og et Greehey Graduate Fellowship in Children's Health til CNJ. Dette arbejde er baseret på forskning udført i Structural Biology Core Facilities, en del af de institutionelle forskningskerner ved University of Texas Health Science Center i San Antonio støttet af Office of the Vice President for Research og Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 - 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
References
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
- Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
- Liu, J., et al.
- El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Cavanagh, J. Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , Elsevier. (2018).
- Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
- Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
- Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
- Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
- Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
- Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
- Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
- Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , Elsevier Science. (2016).
- Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
- Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
- Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
- Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
- Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
- Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
- Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein -- site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
- Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
- Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
- Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
- Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
- Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
- Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
- Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
- Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
- Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
- Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
- Ellman, G. L.
- Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
- Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
- Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
- Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
- Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
- Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
- Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
- Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
- Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
- Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
- Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
- Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
- Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).
