Summary
Viene presentato un protocollo per l'applicazione della spettroscopia NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare interazioni inter- e intra-molecolari deboli e transitorie in proteine intrinsecamente disordinate.
Abstract
Le proteine intrinsecamente disordinate e le regioni intrinsecamente disordinate all'interno delle proteine costituiscono una parte ampia e funzionalmente significativa del proteoma umano. La natura altamente flessibile di queste sequenze consente loro di formare interazioni deboli, a lungo raggio e transitorie con diversi partner biomolecolari. Interazioni specifiche ma a bassa affinità promuovono il legame promiscuo e consentono a un singolo segmento intrinsecamente disordinato di interagire con una moltitudine di siti target. A causa della natura transitoria di queste interazioni, possono essere difficili da caratterizzare con metodi di biologia strutturale che si basano sulle proteine per formare una singola conformazione predominante. La NMR di miglioramento del rilassamento paramagnetico è uno strumento utile per identificare e definire la base strutturale delle interazioni deboli e transitorie. Viene descritto un protocollo dettagliato per l'utilizzo del potenziamento del rilassamento paramagnetico per caratterizzare i complessi di incontro scarsamente popolati che si formano tra proteine intrinsecamente disordinate e la loro proteina, acido nucleico o altri partner biomolecolari.
Introduction
Il disturbo intrinseco (ID) descrive proteine (IDP) o regioni all'interno delle proteine (IDR) che non si ripiegano spontaneamente in strutture secondarie o terziarie stabili ma sono biologicamente attive. In generale, la funzione degli IDP/IDR è quella di facilitare interazioni specifiche ma reversibili con le biomolecole in condizioni fisiologiche1. Pertanto, gli IDP e gli IDR sono coinvolti in una serie di funzioni cellulari, tra cui il reclutamento, l'organizzazione e la stabilizzazione di complessi multiproteici, ad esempio, l'assemblaggio e l'attività dello spliceosoma2, il reclutamento e l'organizzazione dei componenti nei siti di danno al DNA3, l'organizzazione e la stabilizzazione del reclutamento dei complessi di trascrizione4 o del rimodellatore della cromatina BAF5. Inoltre, gli IDP si trovano nei nessi di segnalazione in cui la loro promiscuità per diversi partner di legame consente loro di mediare il trasferimento di informazioni attraverso le reti proteiche cellulari6. Recenti lavori hanno anche rivelato una propensione per le regioni IDR ad auto-associare condensati biomolecolari formanti attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido7. Molte delle funzioni sopra menzionate che coinvolgono l'ID sono ora pensate per coinvolgere alcuni aspetti della formazione di condensa8. Nonostante l'importanza dell'ID per l'assemblaggio di complessi biomolecolari, la stabilizzazione, l'impalcatura e la trasduzione del segnale, i dettagli atomici delle loro interazioni specifiche sono difficili da identificare poiché gli IDP e gli IDR non sono tipicamente suscettibili di indagini strutturali utilizzando la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica criogenica.
La risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica ideale per studiare l'ID in quanto non dipende dalla presenza di insiemi strutturali rigidi o omogenei, ma riferisce sull'ambiente locale immediato dei singoli nuclei. La frequenza di risonanza, o spostamento chimico, di un nucleo in una data molecola è influenzata da deboli campi magnetici indotti dalla distribuzione elettronica locale, che a sua volta dipende dalle lunghezze di legame, dagli angoli, dalla vicinanza di altri nuclei, dalle interazioni con i partner di legame e da altri fattori9. Pertanto, ogni nucleo agisce come una sonda strutturale unica e specifica del sito sensibile ai cambiamenti nel suo ambiente chimico locale. Nonostante questi vantaggi, la NMR è una tecnica di massa e lo spostamento chimico osservato è la media di tutti gli ambienti campionati da un particolare nucleo. Una serie di tecniche NMR, molte delle quali sono descritte in questo numero, sono state sviluppate per recuperare informazioni strutturali, dinamiche e cinetiche su conformazioni biomolecolari ad alta energia e scarsamente popolate contenute nello spostamento chimico medio10,11. Sebbene popolati transitoriamente, l'identificazione e la quantificazione di questi stati sono importanti per determinare i dettagli dei meccanismi funzionali12. Ad esempio, nel caso degli IDP e degli IDR, l'insieme conformazionale può essere distorto per campionare preferenzialmente conformazioni che sono produttive per la formazione di complessi di incontro con partner di legame fisiologici. L'individuazione di questi stati, così come l'identificazione delle interazioni e dinamiche inter- e intra-molecolari specifiche del residuo, sono importanti per determinare i meccanismi strutturali sottostanti alla funzione e alla formazione delle proteine.
Viene descritto un protocollo per l'utilizzo della NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico (PRE) per studiare stati transitori e scarsamente popolati importanti per la formazione di complessi biomolecolari mediati da IDP/IDR13. Questo approccio è utile per studiare le interazioni transitorie proteina-proteina come quelle che promuovono l'assemblaggio di fibrille amiloidi da α-sinucleina 14,15 o l'autoassociazione di FUS16, nonché per caratterizzare specifiche interazioni proteina-proteina come tra proteine di segnalazione17. Viene presentato un esempio di IDP auto-associante, in cui specifiche interazioni inter- e intra-molecolari si traducono in stati preferenzialmente compattati e interazioni sito-specifiche che guidano l'auto-associazione.
Il PRE deriva dall'interazione dipolare magnetica di un nucleo ad un centro paramagnetico con un tensore g isotropo, comunemente fornito sotto forma di un elettrone spaiato su un gruppo nitroxide o come atomo metallico paramagnetico18 (Figura 1). Mentre gli atomi con tensori g anisotropi producono anche un effetto PRE, l'analisi di questi sistemi è più difficile a causa degli effetti confondenti forniti dagli spostamenti pseudo-di contatto (PCS) o dall'accoppiamento dipolare residuo (RDC)13,19. La forza dell'interazione tra un nucleo e il centro paramagnetico dipende dalla distanza <r-6> tra i due. Questa interazione si traduce in un aumento dei tassi di rilassamento nucleare, che causa un allargamento della linea rilevabile anche per interazioni a lungo raggio (~10-35 Å), perché il momento magnetico dell'elettrone spaiato è così forte20,21. Il rilevamento di stati transitori con il PRE è possibile se sono soddisfatte le seguenti due condizioni; (1) l'interazione transitoria è in rapido scambio sulla scala temporale NMR (lo spostamento chimico osservato è una media ponderata per la popolazione degli stati di scambio); e (2) la distanza tra nuclei e centro paramagnetico è più breve nello stato popolato transitoriamente che nello stato maggiore11. Il PRE trasversale è indicato con Γ2 e, per motivi pratici, è calcolato dalla differenza nei tassi di rilassamento trasversale 1H tra un campione contenente un centro paramagnetico e un controllo diamagnetico. Per una trattazione approfondita della teoria del PRE e dei relativi spostamenti pseudo-di contatto nei regimi di scambio rapido e lento, si rimanda il lettore alle recensioni complete di Clore e collaboratori13,22. Qui, viene considerata solo la situazione in cui 1H N-Γ2 è nel regime di scambio veloce, dove a causa della dipendenza r-6 del PRE, il tasso di rilassamento osservato è correlato sia alla distanza a cui il centro paramagnetico si avvicina al nucleo sia alla quantità di tempo che trascorre in quella conformazione. Pertanto, le conformazioni transitorie che non implicano un approccio ravvicinato producono un piccolo PRE mentre interazioni più strette, anche se di breve durata, produrranno un PRE più grande.
Per gli IDP, il PRE viene utilizzato per misurare e differenziare le interazioni che si verificano all'interno di una singola molecola (intramolecolare) e tra molecole separate (intermolecolari). Attaccando un centro paramagnetico a una proteina NMR visibile (ad esempio, 15N-marcata) o NMR invisibile (ad esempio, abbondanza naturale 14N), è possibile determinare la fonte (inter- o intra-molecolare) del PRE (Figura 2). La mutagenesi sito-diretta che introduce un residuo di cisteina è un approccio conveniente per attaccare un centro paramagnetico (spin-label) a una proteina23. Sono stati proposti diversi tipi di molecole per l'uso come etichette di spin, tra cui la chelazione dei metalli (a base di EDTA) e i radicali liberi (a base di nitroxide)24. Sono state descritte varie etichette di spin nitroxide e sono disponibili con diverse sostanze chimiche reattive alla cisteina come metanetiosolfonato, maleimmide e iodoacetamide25,26 (Figura 1). La flessibilità intrinseca del tag o del linker può essere problematica per alcune analisi e, in queste situazioni, sono state proposte diverse strategie per limitare il movimento del tag, ad esempio aggiungendo gruppi chimici ingombranti o l'uso di un secondo linker per ancorare il tag alla proteina (attacco a due siti)27, 28. Inoltre, i tag disponibili in commercio possono contenere proteine diastereomeriche, ma generalmente ciò non contribuirà al PRE29 osservato. L'uso del 3-Maleimido-PROXYL legato ad una cisteina libera tramite chimica maleimmide è descritto poiché è prontamente disponibile, economico, non reversibile e l'agente riducente tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) può essere mantenuto nella soluzione per tutta la reazione di etichettatura. Poiché 3-Maleimido-PROXYL ha un tensore g isotropo, non vengono indotti PCS o RDC e le stesse assegnazioni di spostamento chimico possono essere utilizzate sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici13.
L'1HN-T 2 viene misurato utilizzando una strategia a due punti temporali (T a, Tb) che in precedenza ha dimostrato di essere accurata quanto la raccolta di una serie di evoluzione completa composta da 8 a 12 punti temporali30. Il primo punto temporale (T a) è fissato il più vicino possibile allo zero e la lunghezza ottimale del secondo punto temporale dipende dalla grandezza del PRE più grande atteso per un dato campione e può essere stimato da: Tb ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) dove R 2,dia rappresenta l'R 2 del campione diamagnetico13. Se la grandezza dei PRE più grandi è sconosciuta, impostare T b a ~ una volta l'1H T 2 della proteina è una buona stima iniziale e ulteriormente ottimizzata regolando T2 per migliorare il segnale al rumore. Questa strategia di misurazione a due punti riduce significativamente il tempo sperimentale necessario per misurare i PR e consente di calcolare la media del segnale, in particolare perché vengono utilizzati campioni relativamente diluiti per ridurre al minimo gli effetti dei contatti non specifici tra le molecole. Una sequenza di impulsi basata su HSQC viene utilizzata per misurare 1H N-T2 ed è stata descritta in dettaglio altrove30. Per una migliore sensibilità, gli impulsi duri dei trasferimenti INEPT avanti e indietro possono essere sostituiti con impulsi sagomati; in alternativa, la sequenza viene prontamente convertita in una lettura basata su TROSY31. Poiché gli IDP hanno tipicamente tassi di rilassamento trasversale molto più lunghi con conseguenti larghezze di linea più strette (a causa del disturbo intrinseco) rispetto alle proteine globulari di dimensioni simili, lunghi tempi di acquisizione nella dimensione indiretta possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione spettrale e alleviare la limitazione della dispersione dello spostamento chimico inerente agli IDP.
PRE è uno strumento utile per studiare le interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico, in particolare le interazioni che sono transitorie o scarsamente popolate. Viene fornito un protocollo dettagliato per la preparazione di un campione NMR adatto alla misurazione dei PRE, comprese le fasi per la purificazione delle proteine, l'etichettatura dello spin diretto al sito, l'impostazione e la calibrazione del programma di impulsi, l'elaborazione e l'interpretazione dei dati NMR. Importanti considerazioni sperimentali sono notate in tutto ciò che può influire sulla qualità dei dati e sui risultati sperimentali, compresa la concentrazione del campione, la selezione dell'etichetta di spin e la rimozione dei componenti paramagnetici.
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Protocol
Requisiti generali per il protocollo: impianti di purificazione delle proteine, spettrometro UV-Vis, spettrometro NMR ad alto campo e software operativo, software di analisi post-elaborazione compreso; NMRPipe32, Sparky33, (o CCPN Analysis34, o NMRViewJ35).
1. Espressione ricombinante e purificazione di una proteina per misure PRE
- Progettare un costrutto di espressione per la proteina di interesse in modo che sia presente un singolo residuo di cisteina. Saranno necessarie mutazioni multiple per introdurre una cisteina libera in diverse posizioni nella proteina di interesse36.
- Esprimere e purificare un campione di abbondanza naturale (14N) o 15N-marcato della proteina di interesse utilizzando un protocollo stabilito37.
NOTA: I sistemi di espressione di E. coli forniscono un metodo economico e robusto per l'espressione di proteine ricombinanti poiché l'arricchimento isotopico di 15N è un requisito minimo per la spettroscopia NMR eteronucleare biomolecolare. I passaggi tipici sono l'espressione in mezzi minimi, la purificazione cromatografica e la rimozione del tag di purificazione di affinità. Questo protocollo presuppone che sia stato stabilito un robusto protocollo di espressione e purificazione in grado di produrre proteine sufficienti di qualità adeguata per le indagini NMR.- Mantenere 1 mM di agente riducente (DTT o TCEP) nei tamponi in tutte le fasi di purificazione per prevenire la reazione della cisteina libera e la formazione di legami disolfuro intermolecolari per gli IDP.
NOTA: Alcuni sistemi possono essere più tolleranti e meno inclini all'aggregazione di condizioni non riducenti a seconda delle caratteristiche specifiche della proteina, nonché della temperatura, del pH e del sistema tampone scelto per la purificazione38. - Rimuovere i tag di affinità utilizzati per la purificazione prima di procedere poiché possono interagire in modo non specifico con la proteina in modi imprevedibili o possibilmente contenere residui reattivi di cisteina che potrebbero inavvertitamente servire come sito di attaccamento non intenzionale.
- Preparare un campione di riferimento marcato con 15N senza mutazioni della cisteina miscelato con una versione solubile dello spin-label per valutare il contributo dei PRE del solvente.
- Mantenere 1 mM di agente riducente (DTT o TCEP) nei tamponi in tutte le fasi di purificazione per prevenire la reazione della cisteina libera e la formazione di legami disolfuro intermolecolari per gli IDP.
2. Coniugazione dell'etichetta di spin nitroxide 3-Maleimido-PROXYL
- Conservare o scambiare la proteina purificata in un tampone degassato contenente 50 mM Tris pH 7 e 1 mM TCEP; il tampone può anche contenere fino a 8 M di urea, se necessario per favorire la solubilità delle proteine.
In alternativa, diluire rapidamente una soluzione madre proteica in almeno 10 equivalenti di volume di tampone Tris pH 7 da 50 mM degassato e tampone TCEP da 1 mM. Assicurarsi che la concentrazione proteica prima di aggiungere spin-label sia di almeno 100 μM. - Aggiungere 3-Maleimido proxyl da una soluzione madre a 20x molare in eccesso della proteina di interesse. Proteggere il campione dalla luce e dall'ossigeno e incubare per una notte a temperatura ambiente o 4 °C; Un leggero oscillolamento o nutazione può migliorare l'efficienza dell'etichettatura.
- Preparare le soluzioni stock dell'etichetta di spin sciogliendo la polvere proxy 3-Maleimido in etanolo al 95%. Le aliquote dello stock possono essere conservate a -80 °C per meno di 6 mesi.
- Passaggio critico: rimuovere l'etichetta di spin libero non reagito per evitare pre di solvente non specifici. Ottenere questo risultato mediante filtrazione su gel o (preferibilmente) dialisi estesa del campione proteico. Questo passaggio introdurrà anche la proteina in un tampone adatto per la RMN.
NOTA: gli agenti riducenti devono essere preparati freschi e deve essere considerata la compatibilità tra i componenti tampone; ad esempio, il TCEP si degrada rapidamente in tamponi a base di fosfato e questa combinazione dovrebbe essere evitata39. - Trattare tutti i tamponi utilizzati da questo passo in avanti con una resina chelante selettiva per metalli bivalenti e di transizione per rimuovere ioni paramagnetici o quencher spin-label. Se la proteina non può essere immagazzinata in un tampone NMR, concentrare la proteina da diluire rapidamente in un tampone adatto per la NMR.
- Monitoraggio dell'efficienza dell'incorporazione di etichette di spin.
- Utilizzare il reagente di Ellman (acido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) per quantificare i gruppi sulfidrilici liberi nella soluzione40.
NOTA: i protocolli dettagliati sono disponibili presso il produttore. Ai fini qui, è importante determinare l'incorporazione dell'etichetta di spin, la concentrazione di gruppi sulfidrilici liberi viene confrontata con la concentrazione proteica totale. La percentuale di gruppi sulfidrilici liberi è la percentuale di molecole che non hanno un'etichetta di spin nitroxide attaccata. - Monitorare l'intensità del picco corrispondente al residuo di cisteina marcato per giudicare l'incorporazione spin-label nella proteina di interesse.
NOTA: Questo è un approccio rapido ed efficace per determinare il grado di etichettatura di spin della proteina. L'incorporazione completa dell'etichetta di spin comporterà la scomparsa del picco dallo spettro. Con la scarsa dispersione caratteristica degli IDP, il picco corrispondente al residuo mutante di cisteina potrebbe non essere sempre facilmente identificato, e quindi si raccomanda l'uso del reagente di Ellman (fase 2.6.1).
- Utilizzare il reagente di Ellman (acido 5,5-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) per quantificare i gruppi sulfidrilici liberi nella soluzione40.
3. Preparare il campione NMR per misurare la PRE intra o intermolecolare
- Preparare il campione per la misurazione della PRE intramolecolare
- Preparare 15N proteine arricchite isotopicamente, marcate con spin ad una concentrazione di almeno 100 μM ma non superiore a 300 μM in un tampone adatto per NMR. Il volume totale del campione (incluso D2O) è compreso tra 500 e 550 μL.
NOTA: I tamponi NMR comuni includono fosfato, acetato, (bi)carbonato e TRIS. Anche i buffer di Good come MES, HEPES possono essere appropriati. Prestare attenzione quando si selezionano i buffer per garantire che non vi sia cross-reattività con altri componenti della soluzione. - Assicurarsi che il pH sia ~ 7,2 o inferiore per ridurre al minimo gli effetti dello scambio protonico ammidico con acqua. Mantenere la concentrazione di sale il più bassa possibile (in genere inferiore a 150 mM), anche se la considerazione principale è quella di mantenere la stabilità proteica.
NOTA: Gli approcci per condurre esperimenti NMR in condizioni di alta salsedine sono stati descritti altrove41.
- Preparare 15N proteine arricchite isotopicamente, marcate con spin ad una concentrazione di almeno 100 μM ma non superiore a 300 μM in un tampone adatto per NMR. Il volume totale del campione (incluso D2O) è compreso tra 500 e 550 μL.
- Preparare il campione per la misurazione della PRE intermolecolare
- Seguire questo passaggio o passaggio 3.1; Non vengono eseguiti contemporaneamente. Preparare 14N di abbondanza naturale, proteine marcate con spin nel tampone NMR scelto.
- Preparare il campione proteico mescolando 15N proteine arricchite isotopicamente non marcate con spin con proteine marcate con spin ad abbondanza naturale 1%-50% 14N, in modo che la concentrazione finale sia identica al campione preparato al punto 3.1.1. Il volume totale del campione (incluso D2O) è compreso 500 - 550 μL.
- Ottimizzare empiricamente il rapporto tra le proteine 15N e 14N per ogni proteina studiata. I rapporti di 1%, 5% e 20% di 14proteine marcate con N-spin sono buoni punti di partenza.
NOTA: Un accumulo del PRE in funzione dell'aggiunta di 14proteine marcate con N-spin indica un effetto specifico; il PRE osservato è specifico del campione poiché dipende dalla distanza e dalla popolazione (come discusso sopra), e quindi saranno necessari rapporti più elevati di 14proteine marcate con N-spin se l'interazione è particolarmente transitoria17.
- Trasferire il campione NMR (intra- o intermolecolare) in un tubo NMR da 5 mm appropriato per l'uso in magneti ad alto campo utilizzando una pipetta di vetro a gambo lungo (9") o una micropipetta. Assicurarsi che tutti i campioni NMR includano il 5% -10% di D2O per facilitare il blocco del campo.
NOTA: i tubi NMR che utilizzano tappi polimerici per ridurre il volume di campione necessario non sono raccomandati per le misurazioni PRE a causa delle difficoltà legate all'efficace spessomazione del campione.
4. Impostare lo spettrometro NMR e sperimentare parametri specifici
- Prestare estrema attenzione quando si lavora intorno a spettrometri NMR superconduttori ad alto campo.
NOTA: I pericoli includono lesioni dovute all'improvvisa accelerazione di oggetti metallici verso il magnete, interferenze con dispositivi medici impiantati e asfissia dovuta a un improvviso rilascio di gas N 2 e He2 in caso di spegnimento del magnete. I seguenti passaggi presuppongono che il lettore abbia seguito la formazione richiesta, sia a conoscenza di questi e di altri pericoli locali e abbia ricevuto l'approvazione dal gestore della struttura per utilizzare lo spettrometro NMR. In caso di dubbi su un passo o un'istruzione, consultare il responsabile della struttura o l'utente esperto per prevenire potenziali lesioni personali o danni allo spettrometro. - I passaggi seguenti presuppongono uno spettrometro NMR commerciale che esegue una versione moderna del software di controllo dell'acquisizione. Scaricare il programma di impulsi e i file dei parametri e inserirli nelle directory appropriate.
NOTA: Un programma di impulsi e un set di parametri adatti per l'uso con uno spettrometro Bruker e TopSpin (3.2 o successivo) sono disponibili su richiesta degli autori.- Passaggio critico: si presuppone familiarità con l'installazione di programmi a impulsi NMR non nativi; Consultare il responsabile della struttura o un utente esperto, se necessario.
- Posizionare il campione nel magnete, bloccare il segnale 2H utilizzando il comando Lock, sintonizzare e abbinare il canale 1H secondo i protocolli della struttura (la procedura esatta dipenderà dal fatto che la sonda sia dotata di un modulo di sintonizzazione e corrispondenza remoto).
- Regolare gli spessori utilizzando la subroutine topshim per ottimizzare la soppressione del segnale del solvente.
- Calibrare gli impulsi 1H e 15N 90° utilizzando metodi standard.
- Calibrare l'impulso 1H utilizzando il programma popt (utilizzare prima pulsecal per stimare la lunghezza dell'impulso).
- Calibrare l'impulso di 15N rispetto a un campione standard; Assicurati che questo valore sia stato calibrato di recente discutendo con un direttore tecnico o un utente esperto.
- In alternativa, calibrare l'impulso di 15N sul campione variando uno degli impulsi a 90° di un esperimento HMQC fino a raggiungere un segnale nullo.
- Determinare l'attenuazione corretta per gli impulsi sagomati utilizzando la subroutine dello strumento forma (stdisp).
- Aprire il file di forma dell'impulso appropriato facendo clic sull'icona della cartella. Gli impulsi sagomati si trovano nella sezione dei parametri di impulso di ACQUPARS.
- Caricare il file di definizione dell'impulso e fare clic su Analizza forma d'onda > Integra forma. Immettere l'impulso duro calibrato di 1H 90°, la lunghezza dell'impulso sagomato desiderato e la rotazione (90° o 180°).
- Calcolare il livello di potenza dell'impulso sagomato aggiungendo la variazione del livello di potenza all'attenuazione per l'impulso calibrato a 90°.
- Registrare uno standard 1H, 15N HSQC (hsqcetfpf3gpsi) per ottimizzare la larghezza di sweep, la frequenza del supporto e controllare la soppressione dell'acqua25.
- Regolare la larghezza della sweep e il numero di incrementi di quota indiretti utilizzando i comandi sw e td o direttamente nelle finestre di dialogo appropriate. Tipicamente, per la raccolta di PRE, le larghezze spettrali vengono scelte in modo che lo spettro non sia piegato.
5. Impostare l'esperimento 1HN-T 2
- Calibrare gli impulsi sagomati come descritto sopra (4.4.5-4.5.7). I file dei parametri dell'impulso sagomato per l'esperimento PRE sono Eburp2.1000 (impulso a 90°), Reburp.1000 e Iburp2.1000. Immettere le lunghezze di impulso calibrate nella sezione dei parametri di impulso della scheda ACQUPARS .
- Questo esperimento misura 1 H N-T2 usando l'approccio a due punti di ritardo30.
- Impostare i ritardi modificando il file vdlist, il primo ritardo (Ta) è impostato su 0,01 ms.
- Scegliere il secondo ritardo, (T b) utilizzando la relazione con il PRE massimo atteso (T b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) dove R 2,dia rappresenta l'R 2 del campione diamagnetico13. Senza una conoscenza preliminare dell'entità del contributo PRE al rilassamento osservato, un buon punto di partenza è impostare T b a ~1x 1H T2.
- Quindi determinare un valore adatto confrontando i primi incrementi (elaborati con il comando efp) degli spettri T a e T b e regolando T b in modo tale che il segnale decada tra il 40% e il 50% del suo valore iniziale.
NOTA: Questo approccio ottimizza il rapporto segnale-rumore spettrale, una considerazione necessaria per i campioni che non possono essere altamente concentrati (< 50 μM). I valori appropriati di Tb dipendono dal campione, ma in genere variano da 8 a 40 ms per una proteina di dimensioni medie.
- Determinare il numero di punti complessi da registrare e il numero di scansioni per una media del segnale sufficiente. Poiché gli IDP hanno 15N T 2 più lunghi rispetto alle proteine ripiegate di dimensioni comparabili, possono essere utilizzati tempi di acquisizione più lunghi nella dimensione indiretta.
NOTA: Questo valore dipende dalle caratteristiche specifiche della proteina, ma può essere approssimativamente stimato dal 15N T2 e ottimizzato monitorando il decadimento del segnale nel FID. Per la dimensione diretta, 1024* punti complessi (larghezza di sweep 13 ppm, tempo di acquisizione 112,6 ms) sono sufficienti per la maggior parte dei campioni. - Utilizzare il comando expt per calcolare il tempo dell'esperimento e quindi avviare l'esperimento con il comando zg.
6. Fai un campione diamagnetico riducendo lo spin-label con acido ascorbico
- Sciogliere l'ascorbato di sodio nel tampone NMR e regolare il pH in modo che corrisponda al tampone NMR originale.
- Calcolare la concentrazione di sodio ascorbato in modo che un eccesso molare di ascorbato di 10x sulla concentrazione dell'etichetta di spin possa essere aggiunto con la minima variazione del volume del campione. Ad esempio, per un campione proteico da 100 μM, è appropriato uno stock di ascorbato di 100 mM. La riduzione dell'etichetta di spin richiederà l'aggiunta di 5,5 μL di soluzione madre di acido ascorbico, che è solo l'1 % del volume totale del campione.
- Aggiungere la quantità necessaria di acido ascorbico al tubo NMR posizionando una goccia sotto il bordo del tubo, tappare il tubo, capovolgere con attenzione il tubo per miscelare e quindi ruotare a 200-400 x g per 10-20 s in una centrifuga a manovella per depositare il campione sul fondo del tubo.
- Avvolgere il tubo NMR in un foglio per proteggerlo dalla luce e lasciare che la reazione proceda per almeno 3 ore.
- Registrare 1H N-T2 sul campione diamagnetico utilizzando gli stessi parametri utilizzati per il campione paramagnetico.
- Ricalibrare gli impulsi. Tuttavia, non avrebbero dovuto cambiare dalle misurazioni paramagnetiche; Se sono significativamente diversi (> differenza di 0,5 μs), considerare la qualità del campione (ad esempio, degradazione, precipitazione).
- Assicurarsi che tutti i parametri di acquisizione, inclusi i ritardi di rilassamento specificati (vdlist), il numero di scansioni fittizie, il numero di scansioni raccolte, il numero di punti complessi raccolti, il tempo di acquisizione, le larghezze di scansione e le frequenze portanti rimangano gli stessi per i campioni diamagnetici e paramagnetici.
7. Spettri paramagnetici e diamagnetici di processo
- Copiare i dati nel computer locale o nella workstation in cui sono installati e configurati NMRPipe e Sparky. Creare una cartella denominata proc nella directory dei dati dell'esperimento che contiene il file ser.
- Copiare gli script NMRPipe fid.com, p3d.com e nmrproc.com in proc (gli script di elaborazione sono disponibili su richiesta degli autori).
- Utilizzare lo script fid.com per convertire il formato dati Bruker (ser) in formato NMRPipe.
- Utilizzare lo script p3D.com per dividere i piani pseudo3D in singoli spettri.
- Utilizzare lo script nmrproc.com per leggere l'output dello script fid.com, applicare la soppressione del solvente, una funzione finestra, aggiungere zeri ai dati grezzi (riempimento zero), applicare la correzione di fase, eseguire una trasformazione di Fourier, tagliare i dati per la visualizzazione e scrivere i dati elaborati su disco. Lo script produrrà un file per ogni ritardo di rilassamento registrato (T a e Tb).
NOTA: ognuno di questi script è personalizzabile per ottimizzare l'elaborazione per i dettagli specifici di ogni esperimento. Tutorial e set di dati di esempio sono inclusi nella distribuzione NMRPipe disponibile sul sito Web NMRPipe32. NMRDraw può essere utilizzato per la visualizzazione spettrale durante l'elaborazione (ad esempio, impostando angoli di fase corretti, ecc.). Le opzioni disponibili per i comandi NMRPipe possono essere visualizzate utilizzando il comando nmrPipe -help.
8. Trasferisci le assegnazioni di risonanza ed estrai le altezze dei picchi
- Modificare le informazioni di intestazione del file per ogni file dello spettro (T a, Tb per campioni paramagnetici e diamagnetici) utilizzando il comando sethdr [nome file] -ndim 2.
- Utilizzare Sparky per estrarre le altezze di picco33 seguendo i passaggi 8.3-8.5. Altri pacchetti software, tra cui NMRPipe (NMRDraw)32, CCPN Analysis 34 e NMRViewJ35 sono anche appropriati.
- Leggi i file spettrali in Sparky. In questa fase il set di dati sarà costituito da uno spettro per ogni spettro del punto temporale (T a, Tb), sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici, misurati per ogni posizione dello spin-label nella proteina.
- Usa Sparky per selezionare i picchi (comando: F8, quindi fai clic e trascina) e trasferisci le assegnazioni utilizzando lo strumento Trasferisci elenco picchi da un elenco di picchi di riferimento.
NOTA: Le assegnazioni di risonanza della proteina di interesse sono necessarie per l'interpretazione specifica della sequenza dei PREs osservati36.- Imposta i contorni in entrambi gli spettri paramagnetici e diamagnetici allo stesso livello. Assicurati di impostare i contorni in modo che gli spettri raccolti dopo il ritardo non escludano intenzionalmente i picchi ma siano abbastanza alti in modo che gli spettri Ta non siano eccessivamente rumorosi.
- Salvare le nuove liste di picco per ogni spettro e includere l'intensità di picco misurata e il rapporto segnale/rumore calcolato da Sparky (comando: lt per aprire la lista dei picchi, fare clic sulle opzioni per includere l'intensità e le colonne SNR, comando: salva).
9. Estrarre 1HN-T 2 tassi per ogni residuo e calcolare PRE
- Importa gli elenchi dei picchi in un software per fogli di calcolo o in un linguaggio di programmazione preferito come Python.
NOTA: Per ogni posizione spin-label sulla proteina, il set di dati sarà costituito da quattro liste di picco con intensità di picco associate, una ciascuna di T a e Tb sia per gli esperimenti paramagnetici che diamagnetici. - Calcolare 1HN R2 sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici usando l'equazione:
- Utilizzare l'equazione precedente per determinare la velocità di rilassamento per ciascun residuo per i campioni paramagnetici e diamagnetici.
- Determinare il tasso 1H N-Γ2 per ciascun residuo usando l'equazione:
- Utilizzare il rapporto segnale/rumore calcolato Sparky (SNR) per calcolare l'incertezza dell'altezza di picco per ciascun residuo.
- Propagare l'errore utilizzando l'equazione:
- Grafico 1HN-Γ 2 in funzione del numero di residui utilizzando un grafico a dispersione comprendente l'errore calcolato al punto 9.6.
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Representative Results
I PREs intramolecolari 1H N-Γ2 sono stati registrati su un frammento auto-associante, intrinsecamente disordinato (residui 171-264) derivato dal dominio a bassa complessità della proteina legante l'RNA EWSR142 (Figura 3). Si prevede che i residui in stretta prossimità sequenziale del punto di attacco dell'etichetta di spin (ad esempio, il residuo 178 o 260 nella figura 3) siano significativamente ampliati e non siano rilevabili nello spettro. I residui distanziati sequenzialmente dal punto di attacco ma mostrano un aumento Γ2 erano spazialmente vicini (10-35 Å) all'etichetta di spin. Nel caso di EWSR1 171-264, attribuire la fonte dell'effetto PRE è complicato poiché può derivare da una combinazione di contatti inter- e intra-residuo e dipende dalla distanza dal nucleo al centro paramagnetico, dalla popolazione di quella conformazione e dalla dinamica del vettore che collega l'elettrone e gli spin nucleari. Inoltre, l'entità delle PER derivanti da contatti intramolecolari non dipende dalla concentrazione, mentre le PER derivanti da contatti intermolecolari dipendono dalla concentrazione, nonché dalla cinetica e dinamica dell'associazione tra molecole proteiche.
Una possibile interpretazione di questi dati è che l'insieme IDP campiona conformazioni che sono più compatte di una catena estesa. In alternativa, le PREs potrebbero derivare da contatti intermolecolari responsabili dell'auto-associazione di EWSR1, o le PREs potrebbero essere da una combinazione di contatti intra e intermolecolari. Nel caso qui presentato, ciò che rimane sconosciuto è quanto i residui si avvicinino all'etichetta di spin o per quanto tempo rimangano nelle immediate vicinanze. Con molecole altamente flessibili come EWSR1 171-264, può essere difficile districare qualitativamente questi parametri. Posizionando l'etichetta di spin in diverse posizioni dei residui, è possibile identificare i contatti tra le diverse parti della catena, fornendo un'interpretazione più accurata di interazioni specifiche che possono essere funzionalmente rilevanti per l'auto-associazione (Figura 3). La misurazione dei PRE intermolecolari (proteina marcata con spin 14 N mescolata con proteina marcata con 15 N non marcata con spin), impiegando una strategia mutazionale di residui con PRE superiori alla media (ad esempio, residui 196 o 215, Figura 3) e utilizzando altri metodi biofisici come la diffusione dinamica della luce, la cromatografia ad esclusione dimensionale e l'ultracentrifugazione analitica, sono utili per caratterizzare l'insieme conformazionale di un IDP.
Figura 1: Molecole contenenti un elettrone spaiato e vari gruppi funzionali per facilitare l'attaccamento ai residui di cisteina libera che sono tipicamente usati come agenti di rilassamento paramagnetico. Le molecole diamagnetiche possono essere utilizzate come controlli. (A) 3-maleimido-2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidinilossi, radicale libero (3-maleimido-PROXYL) (B) 3-carbossi-2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidinilossi, radicale libero (3-carbossi-PROXYL) (C) 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidinilossi, radicale libero (3-(2 - Iodoacetamido-PROXYL) (D) 1-ossil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-3-il) metil metanosolfonato (MTSL) (E) (1-acetossi-2,2,5,5-tetrametil-δ-3-pirrolina-3-metile) Metanetosisolfonato (acetossi-MTSL) Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Rappresentazione di PR intra- e intermolecolari. (A) Pre intramolecolare, il cerchio rosso rappresenta il raggio effettivo di un centro paramagnetico attaccato a una proteina marcata con 15N. L'effetto PRE diminuisce con una dipendenza <r-6> dalla distanza dalla molecola paramagnetica. (B) Il PRE intermolecolare, il gruppo paramagnetico (cerchio rosso), si trova su una proteina 14N (abbondanza naturale) (blu) che è invisibile alla NMR. Gli effetti del gruppo paramagnetico sulla proteina attiva non-NMR sono osservati come aumento dei tassi di rilassamento quando entra in stretto contatto con la proteina 15N (nero). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: 1HN-Γ 2 tassi per i residui 171-264 del dominio intrinsecamente disordinato di EWSR1. Un residuo di serina in posizione (A) 178 o (B) 260 che è stato mutato in una cisteina funge da punto di attacco per un'etichetta di spin-label 3-Maleimido-PROXYL (rosso *). L'aumento dei tassi di rilassamento si verifica nella posizione del tag, altri siti di maggiore rilassamento sono indicativi di interazioni intramolecolari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
È stato presentato un metodo per caratterizzare le interazioni transitorie che esistono in popolazioni basse tra proteine intrinsecamente disordinate e vari partner di legame che utilizzano PRE. Nell'esempio mostrato, la proteina è auto-associante, e quindi la PRE può derivare da una combinazione di interazioni inter e intramolecolari. Questo metodo è facilmente esteso a campioni eterogenei in cui le interazioni tra due diverse proteine possono essere caratterizzate. Informazioni complementari su come interagiscono le diverse regioni della proteina sono disponibili posizionando l'etichetta di spin in diverse posizioni all'interno della proteina. Inoltre, alternando lo spin-label tra specie NMR attive (15N) e NMR inattive (14N), le fonti intra- e inter-molecolari di PRE osservate possono essere differenziate l'una dall'altra, fornendo informazioni sui complessi di incontro. L'esperimento qui descritto può riferire su interazioni complesse di incontro anche se si verificano su una scala temporale di microsecondi13.
Centrale per questo metodo è l'incorporazione di un tag spin-label nella proteina di interesse mediante attaccamento a un residuo di cisteina. Alcune proteine possono contenere una cisteina nativa che è adatta (non partecipa ai legami disolfuro, è esposta in superficie) per attaccare un'etichetta di spin. Per gli IDP, l'esposizione al solvente della cisteina di solito non è un problema. Nella maggior parte dei casi, è auspicabile introdurre cisteine come mutazioni conservative (serina a cisteina o altri amminoacidi polari non caricati a cisteina) utilizzando la mutagenesi sito-diretta43. Nell'esempio presentato, il frammento di EWSR1 non contiene cisteine native ed è arricchito in serine; Pertanto, l'elaborazione di una strategia mutazionale è stata semplice. Le proteine che contengono cisteina nativa presentano un caso più complicato e bisogna fare attenzione a non interrompere la funzione nativa (ad esempio, rompere un legame disolfuro strutturalmente importante)44. Inoltre, per incorporare una singola cisteina per l'etichettatura di spin, le cisteine native devono essere mutate in un residuo che non reagisce con l'etichetta di spin (nessun gruppo mercapto) e in base alle sue dimensioni e ad altre proprietà, la serina è un buon sostituto della cisteina. Se le cisteine native devono essere mutate, è necessaria un'attenta caratterizzazione dei mutanti per garantire che mantengano la struttura e la funzione nativa è essenziale. I semplici HSQC 1 H,15N di mutanti rispetto alla proteina wildtype sono potenti indicatori di perturbazioni (anche minori) alla struttura della proteina, e questo approccio è utile anche per gli IDP45. Altri metodi da considerare sono il dicroismo circolare, l'ultracentrifugazione analitica o approcci biochimici come i saggi di attività46.
Le considerazioni tecniche per ottenere dati riproducibili, rigorosi e di alta qualità includono la rimozione delle impurità ioniche durante la preparazione del campione NMR. Ciò si ottiene facendo passare tutte le soluzioni sulla resina chelante prima dell'uso. Inoltre, l'uso di un tampone correttamente degassato è importante durante l'attacco dell'etichetta di spin nitroxide poiché la presenza di ossigeno può ridurre l'efficienza dell'etichettatura. La contaminazione diamagnetica contribuirà ad una diminuzione del PRE osservato; tuttavia, l'effetto è meno pronunciato sulle PRE intramolecolari e può essere ridotto diminuendo il ΔT13. Pertanto, non è necessario ottenere l'incorporazione dell'etichetta al 100% per procedere con l'esperimento, in particolare per l'interpretazione qualitativa qui presentata. Se le cisteine libere da attaccamento incompleto dell'etichetta di spin sono problematiche, alcune chimiche mercapto-reattive (ad esempio, maleimmide) sono suscettibili di mantenere un agente riducente nel campione per tutto l'esperimento26. È importante che i campioni paramagnetici e diamagnetici corrispondano il più strettamente possibile. Quando si riduce lo spin-label con acido ascorbico per creare un controllo diamagnetico, considerare il fattore di diluizione introdotto dalla titolazione in una soluzione madre di acido ascorbico. Questa diluizione può essere minimizzata mantenendo lo stock di acido ascorbico almeno 10 volte la concentrazione di lavoro prevista nel tampone NMR.
Sono disponibili molti pacchetti software per l'analisi dei dati NMR, tra cui NMRPipe 32, Sparky 33, CCPN Analysis34, NMRViewJ35, tra gli altri. La combinazione di NMRPipe per l'elaborazione spettrale e Sparky per l'analisi spettrale (peak picking e quantificazione) è stata descritta qui a causa della facilità d'uso di questa combinazione. NMRPipe è comunemente usato da molti gruppi NMR per l'elaborazione spettrale, ma la suite NMRPipe contiene gli strumenti necessari per completare tutte le fasi dell'analisi, anche se con una curva di apprendimento significativa. I dati possono anche essere elaborati utilizzando il software di controllo dello spettrometro NMR. Sparky è stato scelto per l'analisi spettrale per la sua facilità d'uso e la rapida adozione da parte degli utenti inesperti. Sono disponibili diverse opzioni per l'analisi spettrale (peak picking e misurazione delle altezze dei picchi) che possono facilmente sostituire le funzionalità di Sparky, inclusa l'analisi CCPN o NMRViewJ. In particolare, molti di questi programmi hanno funzionalità sovrapposte e si consiglia all'utente di selezionare la combinazione di programmi con cui sono più a loro agio.
La scarsa dispersione dello spostamento chimico è un problema intrinseco degli IDP che porta a una significativa sovrapposizione di risonanza e all'introduzione di errori nella misurazione dell'altezza del picco. Sono state proposte diverse strategie per alleviare questo problema. Uno dei più semplici, e quello impiegato qui, è quello di sfruttare la lunga caratteristica di rilassamento trasversale degli IDP e semplicemente estendere il tempo di acquisizione nella dimensione 15N (indiretta). In alternativa, l'esperimento HNCO a tripla risonanza è utile per risolvere la sovrapposizione di risonanza negli IDP a causa della dispersione superiore delle risonanze C'. Sono state proposte entrambe le versioni TROSY e HSQC dell'HNCO per la misurazione dei PRE, descritte altrove47. Tuttavia, la risoluzione migliorata non è sempre abbastanza significativa da giustificare la maggiore complessità dell'esperimento, tempi più lunghi per la raccolta dei dati e costi aggiuntivi per la preparazione di un campione adatto (arricchimento di 13C). Questo è effettivamente il caso di EWSR1 171-264 qui presentato, dove non è stato osservato alcun miglioramento significativo nel numero di residui non sovrapposti tra un TROSY-HNCO e un HSQC 1H, 15N raccolti con un lungo tempo di acquisizione nella dimensione indiretta.
Questa procedura descritta sopra si concentra sull'utilità degli esperimenti PRE per caratterizzare le interazioni deboli che esistono all'interno e tra proteine intrinsecamente disordinate. Il PRE ha un'utilità molto più ampia nella NMR biomolecolare, compresa la determinazione di restrizioni strutturali a lungo raggio e la determinazione quantitativa di stati conformazionali scarsamente popolati. Ad esempio, Clore e collaboratori hanno aperto la strada all'uso del PRE per rilevare e quantificare le interazioni transitorie derivanti dalle interazioni tra singoli domini di una singola proteina48 o tra le subunità di complessi proteici assemblati17. Ci sono molti esempi del PRE usato per derivare restrizioni a distanza a lungo raggio, anche per le proteine di grandi dimensioni49, o con nuovi tag PRE50, per aiutare a determinare la piega complessiva di una proteina51, così come in sistemi altamente paramagnetici52. Infine, mentre le PCS esulano dallo scopo di questa discussione, sono state applicate a importanti problemi biomolecolari che sono stati descritti altrove53. Il metodo presentato sopra è adatto per sondare la conformazione e le interazioni degli IDP utilizzando le PR ed è stato progettato per essere accessibile agli utenti inesperti. Per approcci più quantitativi all'analisi del PRE, l'utente è rimandato ai molti articoli eccellenti referenziati all'interno di 11,24,30,31.
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Disclosures
Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto. Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Ringraziamo i dottori Jinfa Ying e Kristin Cano per le utili discussioni e l'assistenza tecnica. DSL è un St. Baldrick's Scholar e riconosce il sostegno della St. Baldrick's Foundation (634706). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Welch Foundation (AQ-2001-20190330) a DSL, dal Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL), UTHSA Start-Up Funds a DSL e da una Greehey Graduate Fellowship in Children's Health a CNJ. Questo lavoro si basa sulla ricerca condotta nelle Structural Biology Core Facilities, parte dei nuclei di ricerca istituzionali presso l'Health Science Center dell'Università del Texas a San Antonio supportati dall'Ufficio del Vice Presidente per la Ricerca e dal Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 - 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
References
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
- Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
- Liu, J., et al.
- El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Cavanagh, J. Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , Elsevier. (2018).
- Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
- Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
- Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
- Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
- Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
- Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
- Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
- Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , Elsevier Science. (2016).
- Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
- Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
- Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
- Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
- Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
- Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
- Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein -- site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
- Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
- Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
- Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
- Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
- Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
- Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
- Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
- Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
- Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
- Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
- Ellman, G. L.
- Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
- Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
- Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
- Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
- Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
- Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
- Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
- Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
- Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
- Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
- Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
- Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
- Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).
