Summary
מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.
Abstract
חלבונים בעלי אי-סדר פנימי ואזורים בעלי אי-סדר פנימי בתוך חלבונים מהווים חלק גדול ומשמעותי מבחינה תפקודית של הפרוטאום האנושי. האופי הגמיש מאוד של רצפים אלה מאפשר להם ליצור אינטראקציות חלשות, ארוכות טווח וחולפות עם שותפים ביומולקולריים מגוונים. אינטראקציות ספציפיות אך בעלות זיקה נמוכה מקדמות קשירה מופקרת ומאפשרות לפלח יחיד בעל הפרעה מהותית לקיים אינטראקציה עם מספר רב של אתרי יעד. בגלל האופי הארעי של אינטראקציות אלה, קשה לאפיין אותן באמצעות שיטות ביולוגיות מבניות המסתמכות על חלבונים כדי ליצור קונפורמציה אחת דומיננטית. NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית הוא כלי שימושי לזיהוי והגדרה של הבסיס המבני של אינטראקציות חלשות וחולפות. מתואר פרוטוקול מפורט לשימוש בשיפור הרפיה פאראמגנטי כדי לאפיין את קומפלקסי המפגש המאוכלסים בצפיפות נמוכה הנוצרים בין חלבונים בעלי הפרעה פנימית לבין החלבון, חומצת הגרעין או שותפים ביומולקולריים אחרים שלהם.
Introduction
הפרעה פנימית (ID) מתארת חלבונים (IDPs) או אזורים בתוך חלבונים (IDR) שאינם מתקפלים באופן ספונטני למבנים יציבים, משניים או שלישוניים, אך פעילים ביולוגית. באופן כללי, תפקידם של IDP / IDR הוא להקל על אינטראקציות ספציפיות אך הפיכות עם ביומולקולות בתנאים פיזיולוגיים1. לפיכך, עקורים ו-IDR מעורבים במגוון תפקודים תאיים, כולל גיוס, ארגון וייצוב של קומפלקסים מרובי חלבונים, למשל, הרכבה ופעילות של הספליסוזום2, גיוס וארגון רכיבים באתרים של נזק לדנ"א3, ארגון וייצוב הגיוס של מתחמי שעתוק4, או של מעצב הכרומטין BAF5. בנוסף, עקורים נמצאים בקשרי איתות, כאשר הפקרותם לשותפים כובלים שונים מאפשרת להם לתווך העברת מידע דרך רשתות חלבונים תאיות6. עבודה שנעשתה לאחרונה חשפה גם נטייה של אזורי IDR לקשר את עצמם ליצירת עיבויים ביומולקולריים באמצעות תהליך של הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית7. רבות מהפונקציות הנ"ל המערבות ID נחשבות כיום גם ככוללות היבט כלשהו של היווצרות עיבוי8. למרות חשיבותו של ID להרכבה ביומולקולרית מורכבת, ייצוב, פיגומים והעברת אותות, קשה לזהות את הפרטים האטומיים של האינטראקציות הספציפיות שלהם מכיוון שבדרך כלל עקורים ו- IDR אינם ניתנים לחקירה מבנית באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני.
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכניקה אידיאלית לחקר זיהוי מכיוון שהיא אינה תלויה בנוכחותם של הרכבים מבניים קשיחים או הומוגניים אלא מדווחת על הסביבה המקומית המיידית של גרעינים בודדים. תדירות התהודה, או השינוי הכימי, של גרעין במולקולה נתונה מושפעת משדות מגנטיים חלשים הנגרמים על ידי הפיזור האלקטרוני המקומי, שבתורו תלוי באורכי קשר, זוויות, קרבה של גרעינים אחרים, אינטראקציות עם שותפים קושרים וגורמים אחרים9. לפיכך, כל גרעין פועל כבדיקה מבנית ייחודית, ספציפית לאתר, הרגישה לשינויים בסביבתו הכימית המקומית. למרות יתרונות אלה, NMR היא טכניקה בתפזורת, והשינוי הכימי שנצפה הוא הממוצע של כל הסביבות שנדגמו על ידי גרעין מסוים. מגוון טכניקות NMR, שרבות מהן מתוארות בגיליון זה, פותחו כדי לשחזר מידע מבני, דינמי וקינטי על קונפורמציות ביומולקולריות בעלות אנרגיה גבוהה המאוכלסות נמוך הכלולות בשינוי הכימי הממוצע10,11. למרות שהם מאוכלסים באופן ארעי, זיהוי וכימות של מצבים אלה חשובים לקביעת הפרטים של מנגנונים פונקציונליים12. לדוגמה, במקרה של עקורים ו-IDRs, ההרכב הקונפורמטיבי עשוי להיות מוטה למדגם מועדף של קונפורמציות המועילות ליצירת מתחמי מפגש עם שותפים מחייבים פיזיולוגיים. זיהוי מצבים אלה, כמו גם זיהוי של אינטראקציות ודינמיקות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות ספציפיות לשאריות, חשובים כדי לקבוע את המנגנונים המבניים הבסיסיים של תפקוד חלבונים והיווצרות מורכבת.
פרוטוקול לשימוש ב-NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית (PRE) כדי לחקור מצבים ארעיים המאוכלסים באוכלוסייה נמוכה החשובים להיווצרות קומפלקסים ביומולקולריים בתיווך IDP / IDR מתואר13. גישה זו שימושית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון חולפות, כגון אלה המקדמות הרכבה של סיבי עמילואיד מ-α-סינוקלאין 14,15 או הקשר העצמי של FUS16, כמו גם לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות כגון בין חלבוני איתות17. מוצגת דוגמה לשיוך עצמי של IDP, שבו אינטראקציות בין-מולקולריות ספציפיות ותוך-מולקולריות גורמות למצבים דחוסים מועדפים, כמו גם אינטראקציות ספציפיות לאתר המניעות אסוציאציה עצמית.
ה-PRE נובע מהאינטראקציה הדיפולרית המגנטית של גרעין למרכז פאראמגנטי עם טנזור G איזוטרופי, המסופק בדרך כלל בצורה של אלקטרון לא מזווג על קבוצת חנקן אוקסיד או כאטום מתכת פאראמגנטי18 (איור 1). בעוד אטומים עם טנזור G אנאיזוטרופי מייצרים גם אפקט PRE, ניתוח של מערכות אלה קשה יותר בשל השפעות מבלבלות שנתרמו על ידי משמרות מגע מדומה (PCS) או צימוד דיפולרי שיורי (RDC)13,19. עוצמת האינטראקציה בין גרעין למרכז פאראמגנטי תלויה במרחק <r-6> בין השניים. אינטראקציה זו גורמת לעלייה בקצב ההרפיה הגרעינית, מה שגורם להרחבת קווים הניתנים לגילוי אפילו עבור אינטראקציות ארוכות טווח (~ 10-35 Å), מכיוון שהמומנט המגנטי של האלקטרון הבלתי מזווג הוא כה חזק20,21. זיהוי מצבים ארעיים עם PRE אפשרי אם מתקיימים שני התנאים הבאים; (1) האינטראקציה הארעית היא בחליפין מהיר על ציר הזמן של NMR (השינוי הכימי שנצפה הוא ממוצע משוקלל אוכלוסייה של המדינות המחליפות); ו-(2) מרחק הגרעינים למרכז הפאראמגנטי קצר יותר במצב המאוכלס באופן ארעי מאשר במצב העיקרי11. ה- PRE הרוחבי מסומן Γ2 ולמטרות מעשיות מחושב מההפרש בקצבי הרפיה רוחביים של 1H בין דגימה המכילה מרכז פאראמגנטי לבין בקרה דיאמגנטית. לטיפול מעמיק בתיאוריה של PRE ושינויים פסאודו-קונטאזטיים הקשורים אליה במשטרי חליפין מהירים ואיטיים מופנה הקורא לסקירות המקיפות של קלור ועמיתיו13,22. כאן, רק המצב שבו 1H N-Γ2 נמצא במשטר החליפין המהיר נחשב, שבו בגלל התלות r-6 של PRE, קצב ההרפיה שנצפה קשור הן למרחק שאליו המרכז הפאראמגנטי מתקרב לגרעין והן לכמות הזמן שהוא מבלה באותה קונפורמציה. לכן, קונפורמציות ארעיות שאינן כרוכות בגישה קרובה מייצרות PRE קטן בעוד שאינטראקציות קרובות יותר, גם אם קצרות מועד, ייצרו PRE גדול יותר.
עבור עקורים, ה- PRE משמש למדידה ולהבחנה של האינטראקציות המתרחשות בתוך מולקולה אחת (תוך מולקולרית) ובין מולקולות נפרדות (בין מולקולרית). על-ידי הצמדת מרכז פאראמגנטי לחלבון NMR גלוי (למשל, 15N-מסומן) או NMR בלתי נראה (למשל, שפע טבעי 14N), ניתן לקבוע את המקור (הבין-מולקולרי או התוך-מולקולרי) של ה-PRE (איור 2). מוטגנזה מכוונת אתר המציגה שאריות ציסטאין היא גישה נוחה להצמדת מרכז פאראמגנטי (תווית ספין) לחלבון23. מספר סוגים של מולקולות הוצעו לשימוש כתוויות ספין, כולל כלאט מתכת (מבוסס EDTA) ורדיקל חופשי (מבוסס חנקן)24. תוויות שונות של ספין חנקן תוארו והן זמינות עם כימיות תגובתיות שונות לציסטאין כגון מתאתיוסולפונט, מלימיד ויודואצטמיד25,26 (איור 1). גמישות מובנית של התג או של המקשר עלולה להיות בעייתית עבור ניתוחים מסוימים, ובמצבים אלה הוצעו אסטרטגיות שונות להגבלת תנועת התג, כגון על ידי הוספת קבוצות כימיות מגושמות או שימוש במקשר שני כדי לעגן את התג לחלבון (חיבור לשני אתרים)27, 28. בנוסף, תגים זמינים מסחרית עשויים להכיל חלבונים דיאסטריאומריים אך בדרך כלל זה לא יתרום ל- PRE29 שנצפה. השימוש ב-3-Maleimido-PROXYL המחובר לציסטאין חופשי באמצעות כימיה של maleimide מתואר מכיוון שהוא זמין, חסכוני, בלתי הפיך, וניתן לשמור על החומר המחזר tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) בתמיסה לאורך כל תגובת התוויה. מכיוון של-3-Maleimido-PROXYL יש טנזור G איזוטרופי, לא מושרים PCS או RDC, וניתן להשתמש באותן הקצאות שינוי כימיות הן עבור הדגימות הפאראמגנטיות והן עבור הדגימות הדיאמגנטיות13.
1H N-T2 נמדד באמצעות אסטרטגיית שתי נקודות זמן (T a, Tb) שהוכחה בעבר כמדויקת כמו איסוף סדרת אבולוציה מלאה המורכבת מ-8 עד 12 נקודות זמן30. נקודת הזמן הראשונה (T a) מוגדרת קרוב לאפס כמעשית, והאורך האופטימלי של נקודת הזמן השנייה תלוי בגודל ה-PRE הגדול ביותר הצפוי עבור מדגם נתון וניתן להעריך אותו מ: Tb ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) כאשר R 2,dia מייצג את R 2 של המדגם הדיאמגנטי13. אם סדר הגודל של ה- PREs הגדולים ביותר אינו ידוע, הגדרת T b ל~ פי 1H T 2 של החלבון היא הערכה ראשונית טובה וממוטבת עוד יותר על ידי התאמת T2 כדי לשפר את האות לרעש. אסטרטגיית מדידה דו-נקודתית זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן הניסוי הדרוש למדידת PREs ומאפשרת זמן לממוצע אותות רב יותר, במיוחד מכיוון שדגימות מדוללות יחסית משמשות למזעור ההשפעות של מגעים לא ספציפיים בין מולקולות. רצף פולסים מבוסס HSQC משמש למדידת 1HN-T 2 ותואר בפירוט במקום אחר30. לשיפור הרגישות, ניתן להחליף את הפולסים הקשיחים של העברות INEPT קדימה ואחורה בפולסים מעוצבים; לחלופין, הרצף מומר בקלות לקריאה31 מבוססת TROSY. מכיוון שלעקורים יש בדרך כלל שיעורי הרפיה רוחביים ארוכים בהרבה וכתוצאה מכך רוחב קו צר יותר (בשל ההפרעה המובנית) מאשר חלבונים כדוריים בגודל דומה, ניתן להשתמש בזמני רכישה ארוכים בממד העקיף כדי לשפר את הרזולוציה הספקטרלית ולהקל על מגבלת פיזור השינוי הכימי הטבועה בעקורים.
PRE הוא כלי שימושי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-חומצות גרעין, במיוחד אינטראקציות חולפות או מאוכלסות נמוך. מצורף פרוטוקול מפורט להכנת דגימת NMR המתאימה למדידת PREs, כולל שלבים לטיהור חלבונים, תיוג ספין מכוון אתר, הגדרה וכיול של תוכנית הדופק, עיבוד ופענוח נתוני NMR. לאורך כל הדרך מצוינים שיקולים ניסיוניים חשובים שעשויים להשפיע על איכות הנתונים ותוצאות הניסוי, כולל ריכוז הדגימה, בחירת תווית הספין והסרת רכיבים פאראמגנטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דרישות כלליות לפרוטוקול: מתקני טיהור חלבונים, ספקטרומטר UV-Vis, ספקטרומטר NMR שדה גבוה ותוכנת הפעלה, תוכנת ניתוח לאחר עיבוד כולל; NMRPipe32, Sparky33, (או CCPN Analysis34, או NMRViewJ35).
1. ביטוי רקומביננטי וטיהור חלבון למדידות PRE
- עצבו מבנה ביטוי לחלבון המעניין כך שתהיה שארית ציסטאין יחידה. מוטציות מרובות יידרשו כדי להכניס ציסטאין חופשי במיקומים שונים בחלבון המעניין36.
- לבטא ולטהר שפע טבעי (14N) או 15N מסומן מדגם של החלבון המעניין באמצעות פרוטוקולמבוסס 37.
הערה: מערכות ביטוי E. coli מספקות שיטה חסכונית וחזקה לביטוי חלבונים רקומביננטיים מכיוון שהעשרה איזוטופית של 15N היא דרישה מינימלית לספקטרוסקופיית NMR ביומולקולרית הטרו-גרעינית. שלבים אופייניים הם ביטוי במדיה מינימלית, טיהור כרומטוגרפי והסרת תג טיהור זיקה. פרוטוקול זה מניח שנקבע פרוטוקול ביטוי וטיהור חזק שיכול לייצר מספיק חלבון באיכות מתאימה לחקירות NMR.- שמור על חומר מקטין 1 mM (DTT או TCEP) במאגרים בכל שלבי הטיהור כדי למנוע תגובה של ציסטאין חופשי והיווצרות קשרים דיסולפידים בין-מולקולריים עבור עקורים.
הערה: מערכות מסוימות עשויות להיות סובלניות יותר ומועדות פחות לצבירה בתנאים שאינם מחזרים בהתאם למאפיינים הספציפיים של החלבון, כמו גם לטמפרטורה, ל- pH ולמערכת החיץ שנבחרו לטיהור38. - הסר תגי זיקה המשמשים לטיהור לפני שתמשיך, מכיוון שהם עשויים לתקשר באופן לא ספציפי עם החלבון בדרכים בלתי צפויות או אולי להכיל שאריות ציסטאין תגובתי שעלולות לשמש בשוגג כאתר התקשרות לא מכוון.
- הכינו דגימת ייחוס מסומנת של 15N ללא מוטציות ציסטאין מעורבבות עם גרסה מסיסה של תווית הספין כדי להעריך את תרומתם של PREs ממסים.
- שמור על חומר מקטין 1 mM (DTT או TCEP) במאגרים בכל שלבי הטיהור כדי למנוע תגובה של ציסטאין חופשי והיווצרות קשרים דיסולפידים בין-מולקולריים עבור עקורים.
2. הצמדת תווית הספין 3-Maleimido-PROXYL nitroxide
- לאחסן או להחליף את החלבון המטוהר לתוך מאגר degassed המכיל 50 mM Tris pH 7 ו 1 mM TCEP; המאגר עשוי להכיל גם עד 8 M אוריאה במידת הצורך כדי לסייע למסיסות החלבון.
לחלופין, דללו במהירות תמיסת מלאי חלבונים ללפחות 10 שווה ערך לנפח של מאגר TCEP של 50 mM Tris pH 7 ו-1 mM TCEP. ודא שריכוז החלבון לפני הוספת תווית ספין הוא לפחות 100 מיקרומטר. - הוסף 3-Maleimido proxyl מתמיסת מלאי עודף מולארי פי 20 של החלבון המעניין. להגן על הדגימה מפני אור וחמצן ולדגור לילה בטמפרטורת החדר או 4 °C (75 °F); נדנוד עדין או אגוז עשוי לשפר את יעילות התוויה.
- הכן תמיסות מלאי של תווית הספין על ידי המסת אבקת 3-Maleimido proxyl באתנול 95%. Aliquots של המניות ניתן לאחסן ב -80 °C למשך פחות מ 6 חודשים.
- שלב קריטי: הסר את תווית הספין החופשית ללא תגובה כדי למנוע PREs ממסים לא ספציפיים. השג זאת על ידי סינון ג'ל או (רצוי) דיאליזה נרחבת של דגימת החלבון. שלב זה גם יכניס את החלבון למאגר המתאים ל-NMR.
הערה: יש להכין חומרים מחזרים טריים, ולשקול תאימות בין רכיבי חיץ; לדוגמה, TCEP מתפרק במהירות במאגרים מבוססי פוספט, ויש להימנע משילוב זה39. - טפל בכל החוצצים המשמשים משלב זה ואילך עם שרף כלציה סלקטיבי למתכות דו-ערכיות ומתכות מעבר כדי להסיר יונים פאראמגנטיים או מרווה תווית ספין. אם לא ניתן לאחסן את החלבון במאגר NMR, רכז את החלבון כדי להיות מדולל במהירות לתוך חיץ מתאים NMR.
- מעקב אחר היעילות של שילוב תוויות ספין.
- השתמש בריאגנט של אלמן (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) לכימות קבוצות סולפידריל חופשי בתמיסה40.
הערה: פרוטוקולים מפורטים זמינים מהיצרן. למטרות כאן, חשוב לקבוע שילוב של תווית ספין, הריכוז של קבוצות sulfhydryl חופשי מושווה עם ריכוז חלבון כולל. אחוז קבוצות הגופרית החופשית הוא אחוז המולקולות שאין להן תווית ספין חנקן מחוברת. - עקוב אחר עוצמת השיא המתאימה לשאריות הציסטאין המתויגות כדי לשפוט שילוב תווית ספין בחלבון המעניין.
הערה: זוהי גישה מהירה ויעילה לקביעת מידת תיוג הספין של החלבון. שילוב מלא של תווית הספין יביא להיעלמות הפסגה מהספקטרום. עם הפיזור הירוד האופייני לעקורים, לא תמיד ניתן לזהות בקלות את השיא המתאים לשאריות הציסטאין המוטנטיות, ולכן מומלץ להשתמש בריאגנט של אלמן (שלב 2.6.1).
- השתמש בריאגנט של אלמן (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) לכימות קבוצות סולפידריל חופשי בתמיסה40.
3. הכנת דגימת NMR למדידת PRE תוך-מולקולרי או בין-מולקולרי
- הכנת דגימה למדידה של PRE תוך-מולקולרי
- הכינו 15N חלבון מועשר איזוטופית עם תווית ספין לריכוז של לפחות 100 מיקרומטר אך לא יותר מ-300 מיקרומטר במאגר המתאים ל-NMR. נפח הדגימה הכולל (כולל D2O) הוא 500 - 550 μL.
הערה: מאגרי NMR נפוצים כוללים פוספט, אצטט, (בי)קרבונט ו-TRIS. גם מאגרים של גוד כמו MES, HEPES עשויים להתאים. נקוט משנה זהירות בעת בחירת מאגרים כדי להבטיח שלא תהיה תגובתיות צולבת עם רכיבי פתרון אחרים. - ודא כי ה- pH הוא ~ 7.2 או נמוך יותר כדי למזער את ההשפעות של חילופי פרוטונים אמיד עם מים. שמרו על ריכוז מלח נמוך ככל האפשר (בדרך כלל פחות מ -150 מילימול), אם כי השיקול העיקרי הוא לשמור על יציבות החלבון.
הערה: גישות לביצוע ניסויי NMR בתנאים עתירי מלח תוארו במקום אחר41.
- הכינו 15N חלבון מועשר איזוטופית עם תווית ספין לריכוז של לפחות 100 מיקרומטר אך לא יותר מ-300 מיקרומטר במאגר המתאים ל-NMR. נפח הדגימה הכולל (כולל D2O) הוא 500 - 550 μL.
- הכנת דגימה למדידת PRE בין-מולקולרית
- בצע שלב זה או שלב 3.1; הם אינם מבוצעים בו זמנית. הכינו 14N בשפע טבעי, חלבון מסומן בספין במאגר NMR שנבחר.
- הכינו את דגימת החלבון על ידי ערבוב 15N חלבון מועשר איזוטופית שאינו מסומן בספין עם 1%-50% 14N חלבון בעל תווית ספין בשפע טבעי, כך שהריכוז הסופי יהיה זהה לדגימה שהוכנה ב-3.1.1. נפח הדגימה הכולל (כולל D2O) הוא 500 - 550 μL.
- אופטימיזציה אמפירית של היחס בין חלבוני 15N ו- 14N עבור כל חלבון שנחקר. היחס של 1%, 5% ו-20% של 14חלבונים בעלי תווית N-spin הם נקודות התחלה טובות.
הערה: הצטברות של PRE כפונקציה של תוספת של 14חלבונים בעלי תווית N-spin מצביעה על השפעה ספציפית; ה-PRE שנצפה הוא ספציפי לדגימה מכיוון שהוא תלוי במרחק ובאוכלוסייה (כפי שנדון לעיל), ולכן יידרשו יחסים גבוהים יותר של 14חלבון מסומן ב-N-spin אם האינטראקציה חולפת במיוחד17.
- העבירו את דגימת ה-NMR (תוך-מולקולרית או בין-מולקולרית) לצינור NMR בקוטר 5 מ"מ המתאים לשימוש במגנטים בעלי שדה גבוה באמצעות פיפטת זכוכית או מיקרופיפטה בעלת גזע ארוך (9 אינץ'). ודא שכל דגימות ה- NMR כוללות 5%-10% מ- D2O כדי להקל על נעילת השדה.
הערה: צינורות NMR המשתמשים בתקעי פולימר כדי להפחית את נפח הדגימה הדרוש אינם מומלצים למדידות PRE עקב קשיים הקשורים לשיימינג דגימה יעיל.
4. הגדר ספקטרומטר NMR והתנסה בפרמטרים ספציפיים
- יש לנקוט משנה זהירות בעבודה סביב ספקטרומטרים של NMR מוליכי-על בעלי שדה גבוה.
הערה: הסכנות כוללות פציעות עקב האצה פתאומית של חפצים מתכתיים לכיוון המגנט, הפרעה למכשירים רפואיים מושתלים וחנק עקב שחרור פתאומי של גז N 2 ו- He2 במקרה של מרווה מגנטית. השלבים הבאים יוצאים מנקודת הנחה שהקורא עבר את ההכשרה הנדרשת, מודע לסיכונים מקומיים אלה ואחרים, וקיבל אישור ממנהל המתקן להפעיל את ספקטרומטר התמ"ג. במקרה של ספק לגבי צעד או הוראה, התייעץ עם מנהל המתקן או המשתמש המנוסה כדי למנוע פגיעה גופנית פוטנציאלית או נזק לספקטרומטר. - השלבים הבאים מניחים ספקטרומטר NMR מסחרי המריץ גרסה מודרנית של תוכנת בקרת הרכישה. הורד את תוכנית הדופק ואת קבצי הפרמטרים ומקם אותם בספריות המתאימות.
הערה: תוכנית פולסים וערכת פרמטרים המתאימים לשימוש עם ספקטרומטר Bruker ו- TopSpin (3.2 ואילך) זמינים על פי בקשה מהמחברים.- שלב קריטי: היכרות עם התקנת תוכניות דופק NMR שאינן מקוריות משוערות; התייעץ עם מנהל המתקן או משתמש מנוסה במידת הצורך.
- הניחו את הדגימה במגנט, נעלו את האות 2H באמצעות פקודת הנעילה, כוונו והתאימו את ערוץ 1H בהתאם לפרוטוקולי המתקן (ההליך המדויק יהיה תלוי אם הגשושית מצוידת במודול כוונון והתאמה מרחוק).
- התאם את ה- shims באמצעות שגרת topshim כדי לייעל את דיכוי אות הממס.
- כייל את הפולסים של 1H ו- 15N 90° בשיטות סטנדרטיות.
- כייל את פעימת 1H באמצעות תוכנית popt (השתמש תחילה בפולסקל כדי להעריך את אורך הדופק).
- כיול פולס 15N כנגד מדגם סטנדרטי; ודא שערך זה כויל לאחרונה על-ידי דיון עם מנהל טכני או משתמש מנוסה.
- לחלופין, כייל את פעימת 15N על הדגימה על ידי שינוי אחת מהפולסים של 90° של ניסוי HMQC עד לקבלת אות אפס.
- קבע את ההנחתה הנכונה עבור פולסים מעוצבים באמצעות שגרת הכלי צורה (stdisp).
- פתח את קובץ צורת הדופק המתאים על ידי לחיצה על סמל התיקייה. הפולסים המעוצבים נמצאים בסעיף פרמטרי הדופק של ACQUPARS.
- טען את קובץ הגדרת הדופק ולחץ על נתח צורת גל > שלב צורה. הזן את הפולס הקשיח המכויל של 1H 90°, אורך הפולס הרצוי והסיבוב (90° או 180°).
- חשב את רמת ההספק של הפולס המעוצב על-ידי הוספת השינוי ברמת ההספק להנחתה עבור הפולס המכויל של 90°.
- הקלט HSQC סטנדרטי של 1H, 15N (hsqcetfpf3gpsi) כדי למטב את רוחב הטאטוא, תדירות הנשא ולבדוק את דיכוי המים25.
- התאם את רוחב הניקוי ואת מספר הפרשי הממדים העקיפים באמצעות הפקודות sw ו- td או ישירות בתיבות הדו-שיח המתאימות. בדרך כלל, לאיסוף PREs, רוחבים ספקטרליים נבחרים כך שהספקטרום אינו מקופל.
5. הגדר את ניסוי 1HN-T 2
- כיול הפולסים המעוצבים כמתואר לעיל (4.4.5-4.5.7). קובצי פרמטרי הדופק המעוצבים עבור ניסוי PRE הם Eburp2.1000 (פולס 90°), Reburp.1000 ו- Iburp2.1000. הזינו את אורכי הפולסים המכוילים באזור פרמטרי הפולס בכרטיסייה ACQUPARS .
- ניסוי זה מודד את 1H N-T2 באמצעות גישת שתי נקודות עיכוב זמן30.
- הגדר את עיכובי הזמן על ידי עריכת קובץ ה- vdlist, ההשהיה הראשונה (Ta) מוגדרת ל- 0.01 ms.
- בחר את ההשהיה השנייה, (T b) באמצעות הקשר ל- PRE המרבי הצפוי (T b ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) כאשר R 2,dia מייצג את R 2 של הדגימה הדיאמגנטית13. ללא ידע מוקדם על גודל תרומת PRE להרפיה הנצפית, נקודת התחלה טובה היא הגדרת T b ל~ 1x 1H T2.
- לאחר מכן קבע ערך מתאים על ידי השוואת ההפרשים הראשונים (מעובדים עם הפקודה efp) של ספקטרום T a ו- T b והתאמת Tb כך שהאות דועך ל- 40%-50% מערכו ההתחלתי.
הערה: גישה זו ממטבת את האות הספקטרלי לרעש, שיקול הכרחי עבור דגימות שאינן יכולות להיות מרוכזות מאוד (< 50 מיקרומטר). ערכים מתאימים של Tb הם תלויי דגימה אך בדרך כלל נעים בין 8 - 40 מילישניות עבור חלבון בגודל ממוצע.
- קבע את מספר הנקודות המורכבות להקלטה ואת מספר הסריקות לממוצע אות מספיק. מכיוון שלעקורים יש 15N T2 ארוכים יותר מאשר חלבונים מקופלים בגודל דומה, ניתן להשתמש בזמני רכישה ארוכים יותר בממד העקיף.
הערה: ערך זה תלוי במאפיינים הספציפיים של החלבון, אך ניתן להעריך אותו באופן גס מתוך 15N T2 ולמטב אותו על ידי ניטור דעיכת אות ב- FID. עבור הממד הישיר, 1024* נקודות מורכבות (רוחב טאטוא של 13 עמודים לדקה, זמן רכישה של 112.6 אלפיות השנייה) מספיקות לרוב הדגימות. - השתמש בפקודה expt כדי לחשב את זמן הניסוי ולאחר מכן התחל את הניסוי עם הפקודה zg.
6. הכינו דגימה דיאמגנטית על ידי הפחתת תווית הספין עם חומצה אסקורבית
- המסת נתרן אסקורבט במאגר NMR והתאמת ה- pH כך שיתאים למאגר ה- NMR המקורי.
- חשב את הריכוז של מלאי נתרן אסקורבט כך שניתן יהיה להוסיף עודף מולארי פי 10 של אסקורבט על ריכוז תווית הספין עם השינוי הקטן ביותר בנפח הדגימה. לדוגמה, עבור דגימת חלבון של 100 מיקרומטר, מלאי של 100 מילימטר של אסקורבט מתאים. הפחתת תווית הספין תדרוש הוספת 5.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי חומצה אסקורבית, שהם רק 1% מנפח הדגימה הכולל.
- הוסף את הכמות הנדרשת של חומצה אסקורבית לצינור NMR על ידי הנחת טיפה מתחת לשפת הצינור, סגור את הצינור, הפוך בזהירות את הצינור כדי לערבב, ולאחר מכן סובב ב 200-400 x גרם במשך 10-20 שניות בצנטריפוגה ידנית כדי ליישב את הדגימה בתחתית הצינור.
- עטפו את צינור ה-NMR בנייר כסף כדי להגן מפני אור ולאפשר לתגובה להימשך לפחות 3 שעות.
- הקלט 1HN-T 2 על הדגימה הדיאמגנטית באמצעות אותם פרמטרים המשמשים לדגימה הפאראמגנטית.
- כיול מחדש של הפולסים. עם זאת, הם לא היו צריכים להשתנות מן המדידות פאראמגנטיות; אם הם שונים באופן משמעותי (> הבדל של 0.5 מיקרוגרם), שקול את איכות המדגם (למשל, השפלה, משקעים).
- ודא שכל פרמטרי הרכישה, כולל עיכובי ההרפיה שצוינו (vdlist), מספר סריקות הדמה, מספר הסריקות שנאספו, מספר הנקודות המורכבות שנאספו, זמן הרכישה, רוחב הטאטוא ותדרי הנשא יישארו זהים עבור הדגימות הדיאמגנטיות והפאראמגנטיות.
7. תהליך ספקטרום פאראמגנטי ודיאמגנטי
- העתק את הנתונים למחשב מקומי או לתחנת עבודה שבה מותקנים ומוגדרים NMRPipe ו- Sparky. צור תיקייה בשם proc בספריית נתוני הניסוי המכילה את קובץ ser.
- העתק את סקריפטי NMRPipe fid.com, p3d.com ו- nmrproc.com לתוך proc (סקריפטים לעיבוד זמינים לפי בקשה מהמחברים).
- השתמש בסקריפט fid.com כדי להמיר את תבנית הנתונים Bruker (ser) לתבנית NMRPipe.
- השתמש בסקריפט p3D.com כדי לפצל את מישורי הפסאודו-3D לספקטרום נפרד.
- השתמש בסקריפט nmrproc.com כדי לקרוא את הפלט של סקריפט fid.com, להחיל דיכוי ממס, פונקציית חלון, לצרף אפסים לנתונים הגולמיים (אפס מילוי), להחיל תיקון פאזה, לבצע המרת פורייה, לחתוך את הנתונים לתצוגה ולכתוב את הנתונים המעובדים לדיסק. הסקריפט יפיק קובץ אחד עבור כל עיכוב הרפיה שנרשם (T a ו- Tb).
הערה: כל אחד מסקריפטים אלה ניתן להתאמה אישית כדי למטב את העיבוד עבור הפרטים הספציפיים של כל ניסוי. ערכות לימוד וערכות נתונים לדוגמה כלולות בהתפלגות NMRPipe הזמינה באתר האינטרנט של NMRPipe32. NMRDraw עשוי לשמש לצפייה ספקטרלית במהלך העיבוד (למשל, קביעת זוויות פאזה נכונות וכו'). ניתן להציג את האפשרויות הזמינות עבור פקודות NMRPipe באמצעות הפקודה nmrPipe -help.
8. העברת משימות תהודה וחילוץ גבהים שיא
- שנה את פרטי כותרת הקובץ עבור כל קובץ ספקטרום (T a, Tb עבור דגימות פאראמגנטיות ודיאמגנטיות כאחד) באמצעות הפקודה sethdr [filename] -ndim 2.
- השתמש ב- Sparky כדי לחלץ גובה שיא33 לפי השלבים 8.3-8.5. חבילות תוכנה אחרות, כולל NMRPipe (NMRDraw)32, CCPN Analysis 34 ו- NMRViewJ35 מתאימות גם הן.
- קרא את הקבצים הספקטרליים לתוך Sparky. בשלב זה מערך הנתונים יכלול ספקטרום אחד עבור כל ספקטרום נקודת זמן (T a, Tb), הן עבור הדגימות הפאראמגנטיות והן עבור הדגימות הדיאמגנטיות, הנמדדות עבור כל מיקום של תווית הספין בחלבון.
- השתמש ב- Sparky כדי לבחור פסגות (פקודה: F8, ולאחר מכן לחץ וגרור) ולהעביר הקצאות באמצעות הכלי העברת רשימת שיאים מרשימת שיא של הפניות.
הערה: הקצאות תהודה של החלבון המעניין נחוצות לפרשנות ספציפית לרצף של PREs36 שנצפו.- הגדר קווי מתאר הן בספקטרום פאראמגנטי והן בספקטרום דיאמגנטי באותה רמה. הקפד להגדיר את קווי המתאר כך שהספקטרום שנאסף לאחר עיכוב הזמן לא יכלול בכוונה פסגות אלא יהיה גבוה מספיק כדי שהספקטרום Ta לא יהיה רועש מדי.
- שמור את רשימות הפסגות החדשות עבור כל ספקטרום וכלול את עוצמת השיא הנמדדת ואת יחס האות לרעש המחושב של Sparky (פקודה: lt כדי לפתוח את רשימת המיקרים, לחץ על אפשרויות כדי לכלול עמודות עוצמה ו- SNR, פקודה: שמור).
9. לחלץ 1H N-T2 שיעורים עבור כל שארית ולחשב PRE
- ייבא את רשימות השיא לתוכנת גיליונות אלקטרוניים או לשפת תכנות מועדפת כגון Python.
הערה: עבור כל מיקום תווית ספין על החלבון, מערך הנתונים יכלול ארבע רשימות שיא עם עוצמות שיא קשורות, אחת של T a ו- Tb עבור הניסויים הפאראמגנטיים והדיאמגנטיים כאחד. - חשב 1HN R2 עבור הדגימות הפאראמגנטיות והדיאמגנטיות באמצעות המשוואה:
- השתמש במשוואה לעיל כדי לקבוע את קצב ההרפיה עבור כל שארית עבור הדגימות הפרמגנטיות והדיאמגנטיות.
- קבע את קצב 1H N-Γ2 עבור כל שארית באמצעות המשוואה:
- השתמש ביחס אות לרעש (SNR) המחושב של Sparky כדי לחשב את אי הוודאות של גובה השיא עבור כל שאריות.
- הפצת השגיאה באמצעות המשוואה:
- חלקה 1HN-Γ 2 כפונקציה של מספר השאריות באמצעות תרשים פיזור כולל השגיאה המחושבת ב- 9.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intramolecular 1H N-Γ2 PREs תועדו על מקטע בעל שיוך עצמי והפרעה מהותית (שאריות 171-264) שמקורו בתחום הסיבוכיות הנמוכה של החלבון קושר הרנ"א EWSR142 (איור 3). שאריות בסמיכות רציפה לנקודת החיבור של תווית הספין (לדוגמה, שאריות 178 או 260 באיור 3) צפויות להתרחב באופן משמעותי ואינן ניתנות לגילוי בספקטרום. שאריות במרווחים רציפים מנקודת החיבור אך מראות Γ משופרת 2 היו קרובות מרחבית (10-35 Å) לתווית הספין. במקרה של EWSR1 171-264, ייחוס מקור אפקט PRE הוא מסובך מכיוון שהוא עשוי לנבוע משילוב של מגעים בין-שאריים ותוך-שאריות ותלוי במרחק מהגרעין למרכז הפאראמגנטי, באוכלוסיית אותה קונפורמציה ובדינמיקה של הווקטור המחבר בין האלקטרונים לספין הגרעיני. יתר על כן, סדר הגודל של PREs הנובעים ממגעים תוך-מולקולריים אינו תלוי ריכוז, בעוד ש-PREs הנובעים ממגעים בין-מולקולריים תלויים בריכוז, כמו גם בקינטיקה ובדינמיקה של הקשר בין מולקולות חלבון.
פרשנות אפשרית לנתונים אלה היא שהרכב העקורים דוגם קונפורמציות קומפקטיות יותר משרשרת מורחבת. לחלופין, ה-PREs יכולים לנבוע ממגעים בין-מולקולריים האחראים לקשר העצמי של EWSR1, או שה-PREs יכולים לנבוע משילוב של מגעים תוך-מולקולריים ובין-מולקולריים. במקרה המוצג כאן, מה שנותר לא ידוע הוא עד כמה קרובות השאריות לתווית הספין או כמה זמן הן נשארות בסמיכות. עם מולקולות גמישות מאוד כגון EWSR1 171-264, זה יכול להיות קשה להתיר איכותית פרמטרים אלה. על-ידי הצבת תווית הספין במיקומים שונים של שאריות, ניתן לזהות מגעים בין חלקים שונים של השרשרת, מה שמספק פרשנות מדויקת יותר של אינטראקציות ספציפיות שעשויות להיות רלוונטיות מבחינה תפקודית לקשר עצמי (איור 3). מדידת PREs בין-מולקולריים (14N חלבון מסומן בספין מעורבב עם 15 N חלבון שאינו מסומן בספין), שימוש באסטרטגיה מוטציונית של שאריות עם PREs גדולים מהממוצע (למשל, שאריות 196 או 215, איור 3), ושימוש בשיטות ביופיזיקליות אחרות כגון פיזור אור דינמי, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ואולטרה-צנטריפוגה אנליטית, שימושיים לאפיון ההרכב הקונפורמטיבי של IDP.
איור 1: מולקולות שמכילות אלקטרון לא מזווג וקבוצות תפקודיות שונות כדי להקל על ההתקשרות לשאריות ציסטאין חופשיות שמשמשות בדרך כלל כסוכני הרפיה פאראמגנטיים. מולקולות דיאמגנטיות עשויות לשמש כבקרות. (A) 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, רדיקלים חופשיים (3-Maleimido-PROXYL) (B) 3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, רדיקלים חופשיים (3-Carboxy-PROXYL) (C) 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, רדיקלים חופשיים (3-(2 - Iodoacetamido-PROXYL) (D) 1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) מתיל מתאתיוסולפונט (MTSL) (E) (1-אצטוקסי-2,2,5,5-טטרמתיל-δ-3-פירולין-3-מתיל) מתאתיוסולפונט (אצטוקסי-MTSL) לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תיאור של PRE, תוך-מולקולרי ובין-מולקולרי. (A) PRE, העיגול האדום מייצג את הרדיוס האפקטיבי של מרכז פאראמגנטי המחובר לחלבון המסומן ב-15N. אפקט PRE פוחת עם תלות <r-6> במרחק מהמולקולה הפאראמגנטית. (B) PRE, הקבוצה הפאראמגנטית (עיגול אדום), ממוקמת על חלבון 14N (שפע טבעי) (כחול) שאינו נראה ל-NMR. ההשפעות של הקבוצה הפאראמגנטית על החלבון הפעיל שאינו NMR נצפות כשיעורי הרפיה מוגברים כאשר הוא בא במגע קרוב עם חלבון 15N (שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: 1H N-Γ2 שיעורים עבור שאריות 171-264 של התחום הלא מסודר במהותו של EWSR1. שארית סרין במיקום (A) 178 או (B) 260 שעברה מוטציה לציסטאין משמשת כנקודת החיבור לתווית ספין 3-Maleimido-PROXYL (אדום *). שיעורי הרפיה מוגברים מתרחשים במיקום התג, אתרים אחרים של הרפיה מוגברת מעידים על אינטראקציות תוך מולקולריות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוצגה שיטה לאפיון אינטראקציות חולפות הקיימות באוכלוסיות נמוכות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית לבין שותפים קושרים שונים באמצעות PRE. בדוגמה המוצגת, החלבון הוא שיוך עצמי, ולכן PRE עשוי לנבוע משילוב של אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות. שיטה זו מורחבת בקלות לדגימות הטרוגניות שבהן ניתן לאפיין את האינטראקציות בין שני חלבונים שונים. מידע משלים על האופן שבו אזורים שונים של החלבון מתקשרים זמין על ידי הצבת תווית הספין במיקומים שונים בתוך החלבון. בנוסף, על ידי החלפת תווית הספין בין מינים פעילים של NMR (15N) ו-NMR לא פעילים (14N), ניתן להבדיל בין המקורות התוך-מולקולריים והבין-מולקולריים של PRE שנצפה, ולספק מידע על קומפלקסים של מפגשים. הניסוי המתואר כאן יכול לדווח על אינטראקציות מורכבות גם אם הן מתרחשות בסקאלת זמן של מיקרו-שנייה13.
מרכזי בשיטה זו הוא שילוב של תג תווית ספין לתוך החלבון המעניין על ידי התקשרות לשאריות ציסטאין. חלבונים מסוימים עשויים להכיל ציסטאין טבעי המתאים (אינו משתתף בקשרים דיסולפידים, חשוף בפני השטח) להצמדת תווית ספין. עבור עקורים, חשיפה ממס של ציסטאין היא בדרך כלל לא בעיה. ברוב המקרים, רצוי להציג ציסטאין כמוטציות שמרניות (סרין לציסטאין או חומצות אמינו קוטביות לא טעונות אחרות לציסטאין) באמצעות מוטגנזה מכוונת אתר43. בדוגמה המוצגת, המקטע של EWSR1 אינו מכיל ציסטאין טבעי ומועשר בסרין; לפיכך, תכנון אסטרטגיה מוטציונית היה פשוט. חלבונים המכילים ציסטאין(ים) טבעיים מציגים מקרה מורכב יותר, ויש להקפיד לא לשבש את התפקוד הטבעי (למשל, לשבור קשר דיסולפיד חשוב מבחינה מבנית)44. יתר על כן, כדי לשלב ציסטאין יחיד עבור תיוג ספין, הציסטאין המקומי חייב להיות מוטציה לשאריות שאינן מגיבות עם תווית ספין (ללא קבוצת מרקפטו) ובהתבסס על גודלו ותכונות אחרות, סרין הוא תחליף טוב לציסטאין. אם יש צורך במוטציה של ציסטאין טבעי, נדרש אפיון זהיר של המוטנטים כדי להבטיח שהם שומרים על המבנה והתפקוד הטבעיים הוא חיוני. פשוט 1 H,15N HSQCs של מוטנטים בהשוואה לחלבון wildtype הם אינדיקטורים רבי עוצמה של הפרעות (אפילו מינוריות) למבנה החלבון, וגישה זו שימושית גם עבור עקורים45. שיטות אחרות שיש לשקול הן דיכרואיזם מעגלי, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית, או גישות ביוכימיות כגון מבחני פעילות46.
שיקולים טכניים להשגת נתונים הניתנים לשחזור, קפדניים ואיכותיים כוללים הסרת זיהומים יוניים במהלך הכנת דגימת NMR. זה מושג על ידי העברת כל הפתרונות על שרף chelating לפני השימוש. יתר על כן, שימוש בחיץ degassed כראוי חשוב במהלך החיבור של תווית הספין nitroxide כמו נוכחות של חמצן יכול להפחית את היעילות של תיוג. זיהום דיאמגנטי יתרום לירידה ב- PRE; עם זאת, ההשפעה פחות בולטת על PREs תוך-מולקולריים וניתן להפחית אותה על ידי הפחתת ΔT13. לכן, אין צורך להשיג 100% שילוב תווית כדי להמשיך בניסוי, במיוחד עבור הפרשנות האיכותית המוצגת כאן. אם ציסטאין חופשי מחיבור לא שלם של תווית ספין הוא בעייתי, כמה כימיות תגובתיות מרקפטו (למשל, מלימיד) מקובלות על שמירה על חומר מחזר בדגימה לאורך כל הניסוי26. חשוב שהדגימות הפאראמגנטיות והדיאמגנטיות יתאימו זו לזו ככל האפשר. בעת הפחתת תווית הספין עם חומצה אסקורבית כדי ליצור בקרה דיאמגנטית, שקול את גורם הדילול שהוכנס מטיטרציה בתמיסת מלאי חומצה אסקורבית. ניתן למזער דילול זה על ידי שמירה על מלאי החומצה האסקורבית לפחות פי 10 מריכוז העבודה הצפוי במאגר NMR.
ישנן חבילות תוכנה רבות זמינות לניתוח נתוני NMR, כולל NMRPipe 32, Sparky 33, CCPN Analysis34, NMRViewJ35, בין היתר. השילוב של NMRPipe לעיבוד ספקטרלי וספארקי לאנליזה ספקטרלית (פיק שיא וכימות יתר) תואר כאן בשל קלות השימוש בשילוב זה. NMRPipe משמש בדרך כלל קבוצות NMR רבות לעיבוד ספקטרלי, אך חבילת NMRPipe מכילה את הכלים הדרושים להשלמת כל שלבי הניתוח, אם כי עם עקומת למידה משמעותית. הנתונים עשויים להיות מעובדים גם באמצעות תוכנת בקרת ספקטרומטר NMR. Sparky נבחרה לניתוח ספקטרלי בגלל קלות השימוש שלה וקליטה מהירה על ידי משתמשים מתחילים. ישנן מספר אפשרויות זמינות עבור ניתוח ספקטרלי (ליקוט שיא ומדידת גובה שיא) שיכולים בקלות להחליף את הפונקציונליות של Sparky כולל CCPN אנליזה, או NMRViewJ. יש לציין, רבות של תוכניות אלה יש פונקציות חופפות ואת המשתמש מומלץ לבחור את שילוב של תוכניות שבו הם הכי נוח.
פיזור כימי לקוי הוא בעיה מובנית בעקורים המובילה לחפיפה משמעותית בתהודה ולהכנסת טעויות למדידת גובה השיא. אסטרטגיות שונות הוצעו כדי להקל על בעיה זו. אחת הפשוטות ביותר, וזו הנהוגה כאן, היא לנצל את ההרפיה הרוחבית הארוכה המאפיינת עקורים ופשוט להאריך את זמן הרכישה בממד 15N (עקיף). לחלופין, ניסוי HNCO בתהודה משולשת שימושי לפתרון חפיפת תהודה בעקורים עקב הפיזור המעולה של תהודה C. הן גרסאות TROSY והן HSQC של HNCO למדידת PREs הוצעו ומתוארות במקום אחר47. עם זאת, הרזולוציה המשופרת אינה תמיד משמעותית מספיק כדי להצדיק את הגדלת מורכבות הניסוי, זמן איסוף נתונים ארוך יותר ועלות נוספת להכנת מדגם מתאים (העשרה של 13צלזיוס). זה אכן המקרה של EWSR1 171-264 שהוצג כאן, שם לא נצפה שיפור משמעותי במספר השאריות שאינן חופפות בין TROSY-HNCO לבין 1H, 15N HSQC שנאסף עם זמן רכישה ארוך בממד העקיף.
הליך זה שתואר לעיל מתמקד בתועלת של ניסויי PRE לאפיון אינטראקציות חלשות הקיימות בתוך ובין חלבונים בעלי הפרעה פנימית. ל-PRE יש תועלת רחבה הרבה יותר ב-NMR ביומולקולרי, כולל קביעת מגבלות מבניות ארוכות טווח וקביעה כמותית של מצבי קונפורמציה המאוכלסים בדלילות. לדוגמה, קלור ועמיתיו היו חלוצים בשימוש ב-PRE כדי לזהות ולכמת אינטראקציות חולפות הנובעות מאינטראקציות בין תחומים בודדים של חלבוןיחיד 48 או בין תת-יחידות של קומפלקסים חלבוניים מורכבים17. ישנן דוגמאות רבות של PRE המשמש להפקת ריסון מרחק לטווח ארוך, כולל עבור חלבונים גדולים49, או עם תגי PRE חדשים 50, כדי לעזור לקבוע את הקפל הכולל של חלבון51, כמו גם במערכות פאראמגנטיות מאוד52. לבסוף, בעוד PCS הוא מעבר לטווח של דיון זה, הם יושמו על בעיות ביומולקולריות חשובות אשר תוארו במקום אחר53. השיטה שהוצגה לעיל מתאימה לבדיקת הקונפורמציה והאינטראקציות של עקורים באמצעות PREs ונועדה להיות נגישה למשתמשים מתחילים. לקבלת גישות כמותיות יותר לניתוח של PRE, המשתמש מופנה למאמרים מצוינים רבים המוזכרים בתוך 11,24,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד. לא מוכרזים ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר ג'ינפה יינג וד"ר קריסטין קאנו על דיונים מועילים וסיוע טכני. DSL הוא מלגאי סנט בלדריק ומכיר בתמיכת קרן סנט בלדריק (634706). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן וולש (AQ-2001-20190330) ל-DSL, קרן מקס ומיני טומרלין וולקר (מענק חוקר צעיר של קרן וולקר ל-DSL), קרנות סטארט-אפ של UTHSA ל-DSL, ומלגת בוגר גריהי בבריאות ילדים ל-CNJ. עבודה זו מבוססת על מחקר שנערך במתקני הליבה של ביולוגיה מבנית, חלק מליבות המחקר המוסדיות במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו בתמיכת משרד סגן הנשיא למחקר ומרכז הסרטן מייס גילוי תרופות וביולוגיה מבנית משאב משותף (NIH P30 CA054174).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 - 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
References
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
- Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
- Liu, J., et al.
- El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Cavanagh, J. Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , Elsevier. (2018).
- Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
- Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
- Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
- Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
- Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
- Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
- Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
- Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , Elsevier Science. (2016).
- Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
- Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
- Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
- Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
- Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
- Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
- Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein -- site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
- Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
- Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
- Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
- Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
- Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
- Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
- Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
- Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
- Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
- Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
- Ellman, G. L.
- Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
- Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
- Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
- Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
- Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
- Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
- Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
- Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
- Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
- Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
- Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
- Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
- Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).
