Summary
Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.
Abstract
Intrinsiek ongeordende eiwitten en intrinsiek ongeordende gebieden binnen eiwitten vormen een groot en functioneel significant deel van het menselijk proteoom. De zeer flexibele aard van deze sequenties stelt hen in staat om zwakke, langdurige en voorbijgaande interacties te vormen met diverse biomoleculaire partners. Specifieke maar laag-affiniteitsinteracties bevorderen promiscue binding en stellen een enkel intrinsiek ongeordend segment in staat om te communiceren met een groot aantal doelsites. Vanwege de voorbijgaande aard van deze interacties, kunnen ze moeilijk te karakteriseren zijn door structurele biologische methoden die afhankelijk zijn van eiwitten om een enkele, overheersende conformatie te vormen. Paramagnetische relaxatieverbetering NMR is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren en definiëren van de structurele onderbouwing van zwakke en voorbijgaande interacties. Een gedetailleerd protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering om de dunbevolkte ontmoetingscomplexen te karakteriseren die zich vormen tussen intrinsiek ongeordende eiwitten en hun eiwit, nucleïnezuur of andere biomoleculaire partners wordt beschreven.
Introduction
Intrinsieke stoornis (ID) beschrijft eiwitten (IDP's) of regio's binnen eiwitten (IDR's) die zich niet spontaan vouwen tot stabiele secundaire of tertiaire structuren, maar biologisch actief zijn. Over het algemeen is de functie van IDP/IDR's het vergemakkelijken van specifieke maar omkeerbare interacties met biomoleculen onder fysiologische omstandigheden1. IDP's en IDR's zijn dus betrokken bij een reeks cellulaire functies, waaronder rekrutering, organisatie en stabilisatie van multi-eiwitcomplexen, bijvoorbeeld de assemblage en activiteit van het spliceosoom2, rekrutering en organisatie van componenten op plaatsen van DNA-schade3, organisatie en stabilisatie van de rekrutering van transcriptiecomplexen4, of van de chromatine-remodeler BAF5. Bovendien worden IDP's gevonden bij signaleringsverbindingen waar hun promiscuïteit voor verschillende bindingspartners hen in staat stelt om informatieoverdracht via cellulaire eiwitnetwerken te bemiddelen6. Recent werk heeft ook een neiging aangetoond voor IDR-regio's om zelf biomoleculaire condensaten te associëren door het proces van vloeistof-vloeistoffasescheiding7. Van veel van de bovengenoemde functies met betrekking tot ID wordt nu ook gedacht dat ze een aspect van condensaatvormingomvatten 8. Ondanks het belang van ID voor biomoleculaire complexe assemblage, stabilisatie, steigers en signaaltransductie, zijn de atomaire details van hun specifieke interacties moeilijk te identificeren, omdat IDP's en IDR's meestal niet vatbaar zijn voor structureel onderzoek met behulp van röntgenkristallografie of cryogene elektronenmicroscopie.
Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een ideale techniek voor het onderzoeken van ID, omdat het niet afhankelijk is van de aanwezigheid van stijve of homogene structurele ensembles, maar rapporteert over de directe lokale omgeving van individuele kernen. De resonantiefrequentie, of chemische verschuiving, van een kern in een bepaald molecuul wordt beïnvloed door zwakke magnetische velden geïnduceerd door de lokale elektronische verdeling, die op zijn beurt afhankelijk is van bindingslengtes, hoeken, nabijheid van andere kernen, interacties met bindingspartners en andere factoren9. Elke kern fungeert dus als een unieke, locatiespecifieke structurele sonde die gevoelig is voor veranderingen in zijn lokale chemische omgeving. Ondanks deze voordelen is NMR een bulktechniek en de waargenomen chemische verschuiving is het gemiddelde van alle omgevingen die door een bepaalde kern worden bemonsterd. Een reeks NMR-technieken, waarvan er vele in dit nummer worden beschreven, zijn ontwikkeld om structurele, dynamische en kinetische informatie over hoogenergetische, laagbevolkte biomoleculaire conformaties in de gemiddelde chemische verschuiving10,11 te herstellen. Hoewel tijdelijk bevolkt, zijn identificatie en kwantificering van deze toestanden belangrijk voor het bepalen van de details van functionele mechanismen12. In het geval van IDP's en IDR's kan het conformatie-ensemble bijvoorbeeld bevooroordeeld zijn om bij voorkeur conformaties te bemonsteren die productief zijn voor de vorming van ontmoetingscomplexen met fysiologische bindingspartners. Detectie van deze toestanden, evenals identificatie van de residuspecifieke inter- en intramoleculaire interacties en dynamiek, zijn belangrijk om de onderliggende structurele mechanismen van eiwitfunctie en complexe vorming te bepalen.
Een protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering (PRE) NMR om voorbijgaande, dunbevolkte toestanden te onderzoeken die belangrijk zijn voor de vorming van IDP / IDR-gemedieerde biomoleculaire complexen wordt beschreven13. Deze benadering is nuttig voor het bestuderen van de voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties, zoals die welke de assemblage van amyloïde fibrillen uit α-synucleïne 14,15 of de zelfassociatie van FUS16 bevorderen, evenals om specifieke eiwit-eiwitinteracties te karakteriseren, zoals tussen signaaleiwitten17. Een voorbeeld van een zelf-associërende IDP wordt gepresenteerd, waarbij specifieke inter- en intramoleculaire interacties resulteren in bij voorkeur verdichte toestanden en site-specifieke interacties die zelfassociatie stimuleren.
De PRE ontstaat uit de magnetische dipolaire interactie van een kern met een paramagnetisch centrum met een isotrope g-tensor, gewoonlijk geleverd in de vorm van een ongepaard elektron op een nitroxidegroep of als een paramagnetisch metaalatoom18 (figuur 1). Hoewel atomen met anisotrope g-tensoren ook een PRE-effect produceren, is analyse van deze systemen moeilijker vanwege verstorende effecten die worden bijgedragen door de pseudo-contactverschuivingen (PCS) of residuele dipolaire koppeling (RDC)13,19. De sterkte van de interactie tussen een kern en het paramagnetische centrum is afhankelijk van de <r-6> afstand tussen de twee. Deze interactie resulteert in een toename van nucleaire relaxatiesnelheden, wat detecteerbare lijnverbreding veroorzaakt, zelfs voor langeafstandsinteracties (~ 10-35 Å), omdat het magnetische moment van het ongepaarde elektron zo sterk is20,21. Detectie van voorbijgaande toestanden met de PRE is mogelijk als aan de volgende twee voorwaarden wordt voldaan; (1) de voorbijgaande interactie is in snelle uitwisseling op de NMR-tijdschaal (waargenomen chemische verschuiving is een populatiegewogen gemiddelde van de uitwisselingstoestanden); en (2) de kernen tot paramagnetische centrumafstand is korter in de tijdelijk bevolkte toestand dan in de hoofdtoestand11. De transversale PRE wordt aangeduid Γ2 en wordt voor praktische doeleinden berekend uit het verschil in 1H transversale relaxatiesnelheden tussen een monster met een paramagnetisch centrum en een diamagnetische controle. Voor een diepgaande behandeling van de theorie van de PRE en gerelateerde pseudocontactverschuivingen in snelle en langzame uitwisselingsregimes, wordt de lezer verwezen naar de uitgebreide beoordelingen door Clore en collega's13,22. Hier wordt alleen de situatie overwogen waarin 1H N-Γ2 zich in het snelle uitwisselingsregime bevindt, waarbij vanwege de r-6-afhankelijkheid van de PRE, de waargenomen relaxatiesnelheid gerelateerd is aan zowel de afstand waartoe het paramagnetische centrum de kern nadert als de hoeveelheid tijd die het in die conformatie doorbrengt. Daarom produceren voorbijgaande conformaties die geen nauwe benadering inhouden een kleine PRE, terwijl nauwere interacties, zelfs als ze van korte duur zijn, een grotere PRE zullen produceren.
Voor IDP's wordt de PRE gebruikt om de interacties te meten en te differentiëren die plaatsvinden binnen een enkel molecuul (intramoleculair) en tussen afzonderlijke moleculen (intermoleculair). Door een paramagnetisch centrum te hechten aan een NMR zichtbaar (bijv. 15N-gelabeld) of NMR onzichtbaar (bijv. natuurlijke abundantie 14N) eiwit, kan de bron (inter- of intramoleculair) van de PRE worden bepaald (figuur 2). Plaatsgerichte mutagenese die een cysteïneresidu introduceert, is een handige benadering om een paramagnetisch centrum (spin-label) aan een eiwit23 te hechten. Verschillende soorten moleculen zijn voorgesteld voor gebruik als spinlabels, waaronder metaalchelaatvorming (op basis van EDTA) en vrije radicalen (op basis van nitroxide)24. Verschillende nitroxide spin labels zijn beschreven en zijn verkrijgbaar met verschillende cysteïne-reactieve chemische stoffen zoals methanethiosulfonaat, maleimide en iodoacetamide25,26 (figuur 1). Inherente flexibiliteit van de tag of van de linker kan problematisch zijn voor bepaalde analyses, en in deze situaties zijn verschillende strategieën voorgesteld om de beweging van de tag te beperken, bijvoorbeeld door omvangrijke chemische groepen toe te voegen of het gebruik van een tweede linker om de tag aan het eiwit te verankeren (twee site-attachment)27, 28. Bovendien kunnen in de handel verkrijgbare tags diastereomere eiwitten bevatten, maar over het algemeen zal dit niet bijdragen aan de waargenomen PRE29. Het gebruik van de 3-Maleimido-PROXYL bevestigd aan een vrije cysteïne via maleimide chemie wordt beschreven omdat het direct beschikbaar, kosteneffectief, niet-omkeerbaar is en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende de hele etiketteringsreactie in de oplossing kan worden gehandhaafd. Aangezien 3-Maleimido-PROXYL een isotrope g-tensor heeft, worden er geen PCS of RDC's geïnduceerd en kunnen dezelfde chemische verschuivingstoewijzingen worden gebruikt voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische monsters13.
De 1HN-T 2 wordt gemeten met behulp van een twee-tijdpuntstrategie (T a, Tb) waarvan eerder is aangetoond dat deze net zo nauwkeurig is als het verzamelen van een volledige evolutiereeks bestaande uit 8 tot 12 tijdpunten30. Het eerste tijdspunt (T a) wordt zo dicht bij nul ingesteld als praktisch is, en de optimale lengte van het tweede tijdspunt is afhankelijk van de grootte van de grootste verwachte PRE voor een bepaald monster en kan worden geschat vanaf: Tb ~ 1,15 / (R 2, dia + Γ 2) waarbij R 2, dia de R 2 van het diamagnetische monster13 vertegenwoordigt. Als de grootte van de grootste PREs onbekend is, is het instellen van T b op ~ één keer de 1H T 2 van het eiwit een goede eerste schatting en verder geoptimaliseerd door T2 aan te passen om het signaal naar ruis te verbeteren. Deze tweepuntsmeetstrategie vermindert de experimentele tijd die nodig is om PRE's te meten aanzienlijk en biedt tijd voor meer signaalmiddeling, vooral omdat relatief verdunde monsters worden gebruikt om de effecten van niet-specifieke contacten tussen moleculen te minimaliseren. Een op HSQC gebaseerde pulssequentie wordt gebruikt om 1H N-T2 te meten en is elders in detail beschreven30. Voor een betere gevoeligheid kunnen de harde pulsen van de voorwaartse en achterste INEPT-overdrachten worden vervangen door gevormde pulsen; als alternatief kan de reeks gemakkelijk worden geconverteerd naar een op TROSY gebaseerde uitlezing31. Aangezien IDP's doorgaans veel langere transversale relaxatiesnelheden hebben, wat resulteert in smallere lijnbreedtes (vanwege de inherente aandoening) dan bolvormige eiwitten van vergelijkbare grootte, kunnen lange acquisitietijden in de indirecte dimensie worden gebruikt om de spectrale resolutie te verbeteren en de beperking van de chemische verschuivingsdispersie die inherent is aan IDP's te verlichten.
PRE is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties, met name interacties die van voorbijgaande of laagbevolkte aard zijn. Een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een NMR-monster dat geschikt is voor het meten van PREs, inclusief stappen voor eiwitzuivering, site-directed spin-etikettering, het opzetten en kalibreren van het pulsprogramma, het verwerken en interpreteren van de NMR-gegevens, wordt verstrekt. Er worden overal belangrijke experimentele overwegingen opgemerkt die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van de gegevens en de experimentele resultaten, waaronder de monsterconcentratie, de selectie van het spinlabel en de verwijdering van paramagnetische componenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Algemene vereisten voor het protocol: eiwitzuiveringsfaciliteiten, UV-Vis-spectrometer, high-field NMR-spectrometer en besturingssoftware, nabewerkingsanalysesoftware, waaronder; NMRPipe32, Sparky 33, (of CCPN-analyse34, of NMRViewJ35).
1. Recombinante expressie en zuivering van een eiwit voor PRE-metingen
- Ontwerp een expressieconstruct voor het eiwit van belang, zodat er een enkel cysteïneresidu aanwezig is. Er zullen meerdere mutaties nodig zijn om een vrije cysteïne op verschillende posities in het eiwit van belang te introduceren36.
- Express en zuiver een natuurlijke abundantie (14N) of 15N-gelabeld monster van het eiwit van belang met behulp van een vastgesteld protocol37.
OPMERKING: E. coli-expressiesystemen bieden een kosteneffectieve en robuuste methode voor recombinante eiwitexpressie, aangezien isotopische verrijking van 15N een minimale vereiste is voor biomoleculaire heteronucleaire NMR-spectroscopie. Typische stappen zijn expressie in minimale media, chromatografische zuivering en verwijdering van affiniteitszuiveringstag. Dit protocol gaat ervan uit dat er een robuust expressie- en zuiveringsprotocol is opgesteld dat voldoende eiwit van geschikte kwaliteit kan produceren voor NMR-onderzoeken.- Houd 1 mM reductiemiddel (DTT of TCEP) in buffers bij alle zuiveringsstappen om reactie van de vrije cysteïne en vorming van intermoleculaire disulfidebindingen voor IDP's te voorkomen.
OPMERKING: Sommige systemen kunnen toleranter zijn en minder aggregatiegevoelig voor niet-reducerende omstandigheden, afhankelijk van de specifieke kenmerken van het eiwit, evenals de temperatuur, pH en het buffersysteem dat is gekozen voor zuivering38. - Verwijder affiniteitslabels die worden gebruikt voor zuivering voordat u doorgaat, omdat ze niet-specifiek op onvoorspelbare manieren met het eiwit kunnen interageren of mogelijk reactieve cysteïneresiduen kunnen bevatten die per ongeluk als een onbedoelde hechtingsplaats kunnen dienen.
- Bereid een 15N gelabeld referentiemonster zonder cysteïnemutatie(s) gemengd met een oplosbare versie van het spin-etiket om de bijdrage van oplosmiddel-PRE's te beoordelen.
- Houd 1 mM reductiemiddel (DTT of TCEP) in buffers bij alle zuiveringsstappen om reactie van de vrije cysteïne en vorming van intermoleculaire disulfidebindingen voor IDP's te voorkomen.
2. Conjugatie van het 3-Maleimido-PROXYL nitroxide spin label
- Bewaar of verwissel het gezuiverde eiwit in een ontgaste buffer met 50 mM Tris pH 7 en 1 mM TCEP; de buffer kan ook tot 8 M ureum bevatten, indien nodig om de oplosbaarheid van eiwitten te bevorderen.
Als alternatief kunt u een eiwitvoorraadoplossing snel verdunnen tot ten minste 10 volume-equivalenten ontgaste 50 mM Tris pH 7 en 1 mM TCEP-buffer. Zorg ervoor dat de eiwitconcentratie voordat u het spin-label toevoegt ten minste 100 μM is. - Voeg 3-Maleimido proxyl uit een stamoplossing toe aan 20x molaire overmaat van het eiwit van belang. Bescherm het monster tegen licht en zuurstof en incubeer het een nacht bij kamertemperatuur of 4 °C; Zacht schommelen of nutatie kan de efficiëntie van het etiketteren verbeteren.
- Bereid stockoplossingen van het spin-label door 3-Maleimido proxyl poeder op te lossen in 95% ethanol. Aliquots van de voorraad kunnen minder dan 6 maanden bij -80 °C worden bewaard.
- Kritische stap: Verwijder het niet-gereageerde vrije spin-label om niet-specifieke oplosmiddel-PRE's te voorkomen. Bereik dit door gelfiltratie of (bij voorkeur) uitgebreide dialyse van het eiwitmonster. Deze stap zal het eiwit ook introduceren in een buffer die geschikt is voor NMR.
OPMERKING: Reducerende middelen moeten vers worden bereid en compatibiliteit tussen buffercomponenten moet worden overwogen; TCEP degradeert bijvoorbeeld snel in op fosfaat gebaseerde buffers en deze combinatie moet worden vermeden39. - Behandel alle buffers die vanaf deze stap naar voren worden gebruikt met een chelaathars die selectief is voor tweewaardige en overgangsmetalen om paramagnetische ionen of spin-label quenchers te verwijderen. Als het eiwit niet kan worden opgeslagen in een NMR-buffer, concentreer het eiwit dan om snel te worden verdund tot een buffer die geschikt is voor NMR.
- Monitoring van de efficiëntie van spin-label integratie.
- Gebruik Ellman's reagens (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoëzuur) voor het kwantificeren van vrije sulfhydrylgroepen in oplossing40.
OPMERKING: Gedetailleerde protocollen zijn verkrijgbaar bij de fabrikant. Voor de doeleinden hier is het belangrijk om de opname van het spin-label te bepalen, de concentratie van vrije sulfhydrylgroepen wordt vergeleken met de totale eiwitconcentratie. Het percentage vrije sulfhydrylgroepen is het percentage moleculen waaraan geen nitroxidespcentrifugelabel is bevestigd. - Controleer de intensiteit van de piek die overeenkomt met het gelabelde cysteïneresidu om de opname van spin-label in het eiwit van belang te beoordelen.
OPMERKING: Dit is een snelle en effectieve aanpak om de mate van spin-etikettering van het eiwit te bepalen. Volledige integratie van het spin-label zal resulteren in het verdwijnen van de piek uit het spectrum. Met de slechte dispersiekarakteristiek van IDP's kan de piek die overeenkomt met het gemuteerde cysteïneresidu niet altijd gemakkelijk worden geïdentificeerd, en daarom wordt het gebruik van Ellman-reagens (stap 2.6.1) aanbevolen.
- Gebruik Ellman's reagens (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoëzuur) voor het kwantificeren van vrije sulfhydrylgroepen in oplossing40.
3. Bereid het NMR-monster voor voor het meten van intra- of intermoleculaire PRE
- Monster voorbereiden voor meting van intramoleculaire PRE
- Bereid 15N isotopisch verrijkt, spin-gelabeld eiwit tot een concentratie van ten minste 100 μM maar niet meer dan 300 μM in een buffer die geschikt is voor NMR. Het totale monstervolume (inclusief D2O) is 500 - 550 μL.
OPMERKING: Veel voorkomende NMR-buffers zijn fosfaat, acetaat, (bi)carbonaat en TRIS. Good's buffers zoals MES, HEPES kunnen ook geschikt zijn. Wees voorzichtig bij het selecteren van buffers om ervoor te zorgen dat er geen kruisreactiviteit met andere oplossingsonderdelen plaatsvindt. - Zorg ervoor dat de pH ~ 7,2 of lager is om de effecten van amideprotonuitwisseling met water te minimaliseren. Houd de zoutconcentratie zo laag mogelijk (meestal minder dan 150 mM), hoewel de primaire overweging is om de eiwitstabiliteit te behouden.
OPMERKING: Benaderingen voor het uitvoeren van NMR-experimenten in zoutrijke omstandigheden zijn elders beschreven41.
- Bereid 15N isotopisch verrijkt, spin-gelabeld eiwit tot een concentratie van ten minste 100 μM maar niet meer dan 300 μM in een buffer die geschikt is voor NMR. Het totale monstervolume (inclusief D2O) is 500 - 550 μL.
- Monster voorbereiden voor meting van intermoleculaire PRE
- Volg deze stap of stap 3.1; ze worden niet tegelijkertijd uitgevoerd. Bereid 14N natuurlijke abundantie, spin-gelabeld eiwit in de gekozen NMR-buffer.
- Bereid het eiwitmonster door 15N isotopisch verrijkt niet-spin-gelabeld eiwit te mengen met 1%-50% 14N spin-gelabeld eiwit met natuurlijke abundantie, zodat de uiteindelijke concentratie identiek is aan het in punt 3.1.1 bereide monster. Het totale monstervolume (inclusief D2O) bedraagt 500 - 550 μl.
- Empirisch optimaliseren van de verhouding van de 15N en 14N eiwitten voor elk bestudeerd eiwit. De verhoudingen van 1%, 5% en 20% van 14N-spin-gelabelde eiwitten zijn goede uitgangspunten.
OPMERKING: Een opbouw van de PRE als functie van toegevoegd 14N-spin-gelabeld eiwit duidt op een specifiek effect; de waargenomen PRE is monsterspecifiek omdat deze afhankelijk is van afstand en populatie (zoals hierboven besproken), en daarom zullen hogere verhoudingen van 14N-spin-gelabeld eiwit vereist zijn als de interactie bijzonder voorbijgaand is17.
- Breng het NMR-monster (intra- of intermoleculair) over in een NMR-buis van 5 mm die geschikt is voor gebruik in hoogveldmagneten met behulp van een glazen pipet of micropipet met lange steel (9") of micropipette. Zorg ervoor dat alle NMR-monsters 5% -10% D2O bevatten om veldvergrendeling te vergemakkelijken.
OPMERKING: NMR-buizen die polymeerpluggen gebruiken om het benodigde monstervolume te verminderen, worden niet aanbevolen voor PRE-metingen vanwege problemen met betrekking tot effectieve monstershimming.
4. Stel de NMR-spectrometer in en experimenteer specifieke parameters
- Wees uiterst voorzichtig bij het werken rond supergeleidende, high-field NMR-spectrometers.
OPMERKING: Gevaren omvatten verwondingen als gevolg van de plotselinge versnelling van metalen voorwerpen in de richting van de magneet, interferentie met geïmplanteerde medische apparaten en verstikking als gevolg van een plotselinge afgifte van N 2- en He2-gas in het geval van een magneetverdringing. In de volgende stappen wordt ervan uitgegaan dat de lezer de vereiste training heeft ondergaan, op de hoogte is van deze en andere lokale gevaren en toestemming heeft gekregen van de facility manager om de NMR-spectrometer te bedienen. Raadpleeg bij twijfel over een stap of instructie de facility manager of ervaren gebruiker om mogelijk persoonlijk letsel of schade aan de spectrometer te voorkomen. - In de volgende stappen wordt uitgegaan van een commerciële NMR-spectrometer met een moderne versie van de acquisitiebesturingssoftware. Download het pulsprogramma en de parameterbestanden en plaats ze in de juiste mappen.
OPMERKING: Een pulsprogramma en parameterset die geschikt zijn voor gebruik met een Bruker-spectrometer en TopSpin (3.2 of hoger) zijn beschikbaar op aanvraag bij de auteurs.- Kritieke stap: Bekendheid met het installeren van niet-native NMR-pulsprogramma's wordt verondersteld; Overleg indien nodig met de facility manager of een ervaren gebruiker.
- Plaats het monster in de magneet, vergrendel het 2H-signaal met het vergrendelcommando, stem het 1H-kanaal af en match het volgens de facilitaire protocollen (de exacte procedure hangt af van of de sonde is uitgerust met een remote tune and match-module).
- Pas de shims aan met behulp van de topshim-subroutine om de onderdrukking van het oplosmiddelsignaal te optimaliseren.
- Kalibreer de 1H en 15N 90° pulsen met behulp van standaardmethoden.
- Kalibreer de 1H-puls met behulp van het popt-programma (gebruik eerst pulsecal om de pulslengte te schatten).
- Kalibreer de 15N-puls ten opzichte van een standaardmonster; Zorg ervoor dat deze waarde onlangs is gekalibreerd door te overleggen met een technisch directeur of ervaren gebruiker.
- U kunt ook de 15N-puls op het monster kalibreren door een van de 90°-pulsen van een HMQC-experiment te variëren totdat een nulsignaal is bereikt.
- Bepaal de juiste demping voor gevormde pulsen met behulp van de subroutine shape tool (stdisp).
- Open het juiste pulsvormbestand door op het mappictogram te klikken. De gevormde pulsen zijn te vinden in de sectie pulsparameters van ACQUPARS.
- Laad het pulsdefinitiebestand en klik op Golfvorm analyseren > Vorm integreren. Voer de gekalibreerde 1H 90° harde puls, gewenste gevormde pulslengte en rotatie (90° of 180°) in.
- Bereken het vermogensniveau van de gevormde puls door de verandering van het vermogensniveau toe te voegen aan de demping voor de gekalibreerde 90° puls.
- Neem een standaard 1H, 15N HSQC (hsqcetfpf3gpsi) op om de veegbreedte, de draaggolffrequentie te optimaliseren en de wateronderdrukkingte controleren 25.
- Pas de veegbreedte en het aantal indirecte dimensieverhogingen aan met de opdrachten sw en td of rechtstreeks in de desbetreffende dialoogvensters. Voor het verzamelen van PRE's worden doorgaans spectrale breedten gekozen, zodat het spectrum niet wordt gevouwen.
5. Stel het 1HN-T 2-experiment in
- Kalibreer de gevormde pulsen zoals hierboven beschreven (4.4.5-4.5.7). De gevormde pulsparameterbestanden voor het PRE-experiment zijn Eburp2.1000 (90° puls), Reburp.1000 en Iburp2.1000. Voer de gekalibreerde pulslengtes in het gedeelte pulsparameters op het tabblad ACQUPARS in.
- Dit experiment meet de 1H N-T2 met behulp van de twee tijdvertragingspunten30.
- Stel de tijdvertragingen in door het vdlist-bestand te bewerken, de eerste vertraging (Ta) wordt ingesteld op 0,01 ms.
- Kies de tweede vertraging (T b) met behulp van de relatie tot de verwachte maximale PRE (T b ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) waarbij R 2,dia de R 2 van het diamagnetische monster13 vertegenwoordigt. Zonder voorkennis van de omvang van de PRE-bijdrage aan de waargenomen relaxatie, is een goed startpunt het instellen van T b op ~1x 1H T2.
- Bepaal vervolgens een geschikte waarde door de eerste stappen (verwerkt met het efp-commando) van de T- a- en T-b-spectra te vergelijken en T b zodanig aan te passen dat het signaal vervalt tot tussen 40% -50% van de beginwaarde.
OPMERKING: Deze aanpak optimaliseert het spectrale signaal-naar-ruis, een noodzakelijke overweging voor monsters die niet sterk geconcentreerd kunnen zijn (< 50 μM). Geschikte waarden van Tb zijn monsterafhankelijk, maar variëren meestal van 8 - 40 ms voor een eiwit van gemiddelde grootte.
- Bepaal het aantal complexe punten dat moet worden vastgelegd en het aantal scans voor voldoende signaalgemiddelde. Aangezien IDP's langer 15N T2 hebben dan gevouwen eiwitten van vergelijkbare grootte, kunnen langere acquisitietijden in de indirecte dimensie worden gebruikt.
OPMERKING: Deze waarde is afhankelijk van de specifieke kenmerken van het eiwit, maar kan ruwweg worden geschat op basis van de 15N T2 en worden geoptimaliseerd door signaalverval in de FID te monitoren. Voor de directe dimensie is 1024* complexe punten (13 ppm veegbreedte, 112,6 ms acquisitietijd) voldoende voor de meeste monsters. - Gebruik de opdracht expt om de experimenttijd te berekenen en start het experiment vervolgens met het commando zg.
6. Maak een diamagnetisch monster door het spinlabel te verminderen met ascorbinezuur
- Los natriumascorbaat op in de NMR-buffer en pas de pH aan de oorspronkelijke NMR-buffer aan.
- Bereken de concentratie van natriumascorbaatvoorraad zodat een 10x molair overschot aan ascorbaat over de concentratie van het spin-label kan worden toegevoegd met de minste verandering van het monstervolume. Voor een eiwitmonster van 100 μM is bijvoorbeeld een voorraad ascorbaat van 100 mM geschikt. Om het spin-etiket te verminderen, moet 5,5 μl ascorbinezuurstockoplossing worden toegevoegd, wat slechts 1 % van het totale monstervolume is.
- Voeg de vereiste hoeveelheid ascorbinezuur toe aan de NMR-buis door een druppel onder de rand van de buis te plaatsen, sluit de buis af, keer de buis voorzichtig om om te mengen en draai vervolgens op 200-400 x g gedurende 10-20 s in een met de hand aangedreven centrifuge om het monster op de bodem van de buis te bezinken.
- Wikkel de NMR-buis in folie ter bescherming tegen licht en laat de reactie minstens 3 uur duren.
- Noteer 1H N-T2 op het diamagnetische monster met dezelfde parameters die voor het paramagnetische monster worden gebruikt.
- Kalibreer de pulsen opnieuw. Ze hadden echter niet mogen veranderen van de paramagnetische metingen; Als ze significant verschillen (> verschil van 0,5 μs), overweeg dan de kwaliteit van het monster (bijv. afbraak, neerslag).
- Zorg ervoor dat alle acquisitieparameters, inclusief de opgegeven relaxatievertragingen (vdlist), het aantal dummyscans, het aantal verzamelde scans, het aantal verzamelde complexe punten, de acquisitietijd, de veegbreedtes en de draaggolffrequenties hetzelfde blijven voor de diamagnetische en paramagnetische monsters.
7. Verwerk paramagnetische en diamagnetische spectra
- Kopieer de gegevens naar de lokale computer of het werkstation waarop NMRPipe en Sparky zijn geïnstalleerd en geconfigureerd. Maak een map met de naam proc in de map met experimentgegevens die het ser-bestand bevat.
- Kopieer de NMRPipe-scripts fid.com, p3d.com en nmrproc.com naar proc (verwerkingsscripts zijn beschikbaar op aanvraag bij de auteurs).
- Gebruik het fid.com script om het Bruker data format (ser) te converteren naar NMRPipe formaat.
- Gebruik het p3D.com script om de pseudo3D-vlakken op te splitsen in afzonderlijke spectra.
- Gebruik het nmrproc.com-script om de uitvoer van het fid.com script te lezen, oplosmiddelonderdrukking, een vensterfunctie toe te passen, nullen toe te voegen aan de onbewerkte gegevens (nulvulling), fasecorrectie toe te passen, een Fouriertransformatie uit te voeren, de gegevens bij te snijden voor weergave en de verwerkte gegevens naar schijf te schrijven. Het script voert één bestand uit voor elke opgenomen ontspanningsvertraging (T a en Tb).
OPMERKING: Elk van deze scripts kan worden aangepast om de verwerking te optimaliseren voor de specifieke details van elk experiment. Tutorials en voorbeeldgegevenssets zijn opgenomen in de NMRPipe-distributie die beschikbaar is op de NMRPipe-website32. NMRDraw kan worden gebruikt voor spectrale weergave tijdens de verwerking (bijv. Het instellen van de juiste fasehoeken enz.). Beschikbare opties voor NMRPipe-opdrachten kunnen worden bekeken met behulp van het commando nmrPipe -help.
8. Resonantietoewijzingen overbrengen en piekhoogten extraheren
- Wijzig de bestandsheaderinformatie voor elk spectrumbestand (T a, Tb voor zowel paramagnetische als diamagnetische monsters) met het commando sethdr [bestandsnaam] -ndim 2.
- Gebruik Sparky om piekhoogten33 te extraheren volgens de stappen 8.3-8.5. Andere softwarepakketten, waaronder NMRPipe (NMRDraw)32, CCPN Analysis34 en NMRViewJ35 zijn ook geschikt.
- Lees de spectrale bestanden in Sparky. Bij deze stap bestaat de dataset uit één spectrum voor elke tijdpuntspectra (T a, Tb), voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische monsters, gemeten voor elke positie van het spin-label in het eiwit.
- Gebruik Sparky om pieken te kiezen (opdracht: F8, klik en sleep vervolgens) en breng toewijzingen over met behulp van het gereedschap overdrachtspieklijst uit een referentiepieklijst.
OPMERKING: Resonantietoewijzingen van het eiwit van belang zijn noodzakelijk voor sequentiespecifieke interpretatie van de waargenomen PREs36.- Stel contouren in zowel paramagnetische als diamagnetische spectra in op hetzelfde niveau. Zorg ervoor dat u de contouren zo instelt dat de spectra die na de tijdsvertraging worden verzameld, niet opzettelijk pieken uitsluiten, maar hoog genoeg zijn zodat de T-spectra niet te luidruchtig zijn.
- Sla de nieuwe pieklijsten voor elk spectrum op en neem de gemeten piekintensiteit en Sparky berekende signaal-ruisverhouding op (commando: lt om peaklist te openen, klik op opties om intensiteit en SNR-kolommen op te nemen, opdracht: opslaan).
9. Extraheer 1H N-T2 snelheden voor elk residu en bereken PRE
- Importeer de pieklijsten in spreadsheetsoftware of een voorkeursprogrammeertaal zoals Python.
OPMERKING: Voor elke spin-label positie op het eiwit zal de dataset bestaan uit vier pieklijsten met bijbehorende piekintensiteiten, één elk van T a en Tb voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische experimenten. - Bereken 1HN R2 voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische monsters met behulp van de vergelijking:
- Gebruik de bovenstaande vergelijking om de relaxatiesnelheid voor elk residu voor de paramagnetische en diamagnetische monsters te bepalen.
- Bepaal de 1H N-Γ2-snelheid voor elk residu met behulp van de vergelijking:
- Gebruik de door Sparky berekende signaal-ruisverhouding (SNR) om de onzekerheid van de piekhoogte voor elk residu te berekenen.
- Geef de fout door met behulp van de vergelijking:
- Waarnemingspunt 1HN-Γ 2 als functie van het residunummer met behulp van een spreidingsdiagram met inbegrip van de in punt 9.6 berekende fout.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intramoleculair 1HN-Γ 2 PRE's werden geregistreerd op een zelfassociatief, intrinsiek ongeordend fragment (residuen 171-264) afgeleid van het laagcomplexe domein van het RNA-bindende eiwit EWSR142 (figuur 3). Residuen in de nabijheid van het bevestigingspunt van het spinlabel (bv. residu 178 of 260 in figuur 3) zullen naar verwachting aanzienlijk worden verbreed en zijn niet detecteerbaar in het spectrum. Residuen die sequentieel van het bevestigingspunt zijn geplaatst, maar toch een verbeterde Γ2 ruimtelijk dicht (10-35 Å) bij het spinlabel lagen. In het geval van EWSR1 171-264 is het toewijzen van de bron van het PRE-effect ingewikkeld omdat het kan ontstaan uit een combinatie van inter- en intraresiducontacten en afhankelijk is van de afstand van de kern tot het paramagnetische centrum, de populatie van die conformatie en de dynamiek van de vector die het elektron en de kernspins verbindt. Verder is de omvang van PRE's die voortkomen uit intramoleculaire contacten niet concentratieafhankelijk, terwijl PRE's die voortkomen uit intermoleculaire contacten afhankelijk zijn van de concentratie en de kinetiek en dynamiek van de associatie tussen eiwitmoleculen.
Een mogelijke interpretatie van deze gegevens is dat het IDP-ensemble conformaties samplet die compacter zijn dan een uitgebreide keten. Als alternatief kunnen de PRE's voortkomen uit intermoleculaire contacten die verantwoordelijk zijn voor de zelfassociatie van EWSR1, of de PRE's kunnen voortkomen uit een combinatie van zowel intra- als intermoleculaire contacten. In het hier gepresenteerde geval blijft onbekend hoe dicht de residuen het spinlabel naderen of hoe lang ze in de buurt blijven. Met zeer flexibele moleculen zoals EWSR1 171-264 kan het moeilijk zijn om deze parameters kwalitatief te ontwarren. Door het spinlabel op verschillende residuposities te plaatsen, kunnen contacten tussen verschillende delen van de keten worden geïdentificeerd, waardoor een nauwkeurigere interpretatie ontstaat van specifieke interacties die functioneel relevant kunnen zijn voor zelfassociatie (figuur 3). Het meten van intermoleculaire PRE's (14N spin-gelabeld eiwit gemengd met 15 N niet-spin gelabeld eiwit), het gebruik van een mutatiestrategie van residuen met groter dan gemiddelde PREs (bijv. Residuen 196 of 215, figuur 3), en het gebruik van andere biofysische methoden zoals dynamische lichtverstrooiing, grootte-uitsluitingschromatografie en analytische ultracentrifugatie, zijn nuttig voor het karakteriseren van het conformatie-ensemble van een IDP.
Figuur 1: Moleculen die een ongepaard elektron en verschillende functionele groepen bevatten om de hechting aan vrije cysteïneresiduen te vergemakkelijken die meestal worden gebruikt als paramagnetische relaxatiemiddelen. Diamagnetische moleculen kunnen worden gebruikt als controles. (A) 3-Maleimido-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, vrije radicalen (3-Maleimido-PROXYL) (B) 3-Carboxy-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, vrije radicalen (3-Carboxy-PROXYL) (C) 3-(2-Iodoacetamido)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxy, vrije radicalen (3-(2 - Iodoacetamido-PROXYL) (D) 1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Methylmethethiosulfonaat (MTSL) (E) (1-Acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-δ-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonaat (Acetoxy-MTSL) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Weergave van intra- en intermoleculaire PRE. (A) Intramoleculaire PRE, de rode cirkel vertegenwoordigt de effectieve straal van een paramagnetisch centrum dat is bevestigd aan een 15N-gelabeld eiwit. Het PRE-effect neemt af met een <r-6> afhankelijkheid van de afstand tot het paramagnetische molecuul. (B) Intermoleculaire PRE, de paramagnetische groep (rode cirkel), bevindt zich op een 14N (natuurlijke abundantie) eiwit (blauw) dat onzichtbaar is voor NMR. De effecten van de paramagnetische groep op het niet-NMR actieve eiwit worden waargenomen als verhoogde ontspanningssnelheden wanneer het in nauw contact komt met het 15N-eiwit (zwart). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: 1HN-Γ 2 percentages voor residuen 171-264 van het intrinsiek ongeordende domein van EWSR1. Een serineresidu op positie (A) 178 of (B) 260 dat is gemuteerd tot een cysteïne dient als aanhechtingspunt voor een 3-Maleimido-PROXYL spin-label (rood *). Verhoogde ontspanningssnelheden treden op ter plaatse van de tag, andere plaatsen van verhoogde ontspanning zijn indicatief voor intramoleculaire interacties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een methode voor het karakteriseren van voorbijgaande interacties die bestaan bij lage populaties tussen intrinsiek ongeordende eiwitten en verschillende bindingspartners met behulp van PRE is gepresenteerd. In het getoonde voorbeeld is het eiwit zelfassociatief en kan de PRE dus ontstaan uit een combinatie van inter- en intramoleculaire interacties. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot heterogene monsters waar de interacties tussen twee verschillende eiwitten kunnen worden gekarakteriseerd. Aanvullende informatie over hoe verschillende regio's van het eiwit op elkaar inwerken, is beschikbaar door het spinlabel op verschillende posities in het eiwit te plaatsen. Bovendien kunnen, door het spin-label af te wisselen tussen NMR-actieve (15N) en NMR-inactieve (14N) soorten, de intra- en intermoleculaire bronnen van waargenomen PRE van elkaar worden onderscheiden, waardoor informatie wordt verkregen over ontmoetingscomplexen. Het hier beschreven experiment kan rapporteren over het tegenkomen van complexe interacties, zelfs als ze zich voordoen op een microseconde tijdschaal13.
Centraal in deze methode staat de opname van een spin-label tag in het eiwit van belang door hechting aan een cysteïneresidu. Sommige eiwitten kunnen een inheemse cysteïne bevatten die geschikt is (neemt niet deel aan disulfidebindingen, wordt aan het oppervlak blootgesteld) voor het bevestigen van een spin-label. Voor IDP's is blootstelling aan oplosmiddelen van cysteïne meestal geen probleem. In de meeste gevallen is het wenselijk om cysteïnes te introduceren als conservatieve mutaties (serine naar cysteïne of andere ongeladen polaire aminozuren naar cysteïne) met behulp van plaatsgerichte mutagenese43. In het gepresenteerde voorbeeld bevat het fragment van EWSR1 geen inheemse cysteïnes en is het verrijkt met serines; Het bedenken van een mutatiestrategie was dus eenvoudig. Eiwitten die inheemse cysteïne(n) bevatten, vormen een ingewikkelder geval en er moet voor worden gezorgd dat de oorspronkelijke functie niet wordt verstoord (bijvoorbeeld een structureel belangrijke disulfidebinding verbreken)44. Verder, om een enkele cysteïne op te nemen voor spin-etikettering, moeten de inheemse cysteïnes worden gemuteerd tot een residu dat niet reageert met het spin-label (geen mercapto-groep) en op basis van zijn grootte en andere eigenschappen is serine een goede vervanger voor cysteïne. Als inheemse cysteïnes moeten worden gemuteerd, is een zorgvuldige karakterisering van de mutanten vereist om ervoor te zorgen dat ze de inheemse structuur en functie behouden. Eenvoudige 1 H,15N HSQC's van mutanten in vergelijking met het wildtype-eiwit zijn krachtige indicatoren van verstoringen (zelfs klein) voor de eiwitstructuur, en deze benadering is ook nuttig voor IDP's45. Andere methoden om te overwegen zijn circulair dichroïsme, analytische ultracentrifugatie of biochemische benaderingen zoals activiteitstests46.
Technische overwegingen voor het verkrijgen van reproduceerbare, rigoureuze gegevens van hoge kwaliteit omvatten de verwijdering van ionische onzuiverheden tijdens de bereiding van het NMR-monster. Dit wordt bereikt door alle oplossingen vóór gebruik over chelaathars te laten gaan. Verder is het gebruik van een goed ontgaste buffer belangrijk tijdens de bevestiging van het nitroxide spinlabel, omdat de aanwezigheid van zuurstof de efficiëntie van etikettering kan verminderen. Diamagnetische verontreiniging zal bijdragen aan een afname van de waargenomen PRE; het effect is echter minder uitgesproken op intramoleculaire PRE's en kan worden verminderd door ΔT13 te verlagen. Daarom is het niet nodig om 100% labelopname te verkrijgen om door te gaan met het experiment, met name voor de kwalitatieve interpretatie die hier wordt gepresenteerd. Als vrije cysteïnes uit onvolledige spin-label hechting problematisch zijn, zijn sommige mercapto-reactieve chemische stoffen (bijv. Maleimide) vatbaar voor het handhaven van een reductiemiddel in het monster gedurende het experiment26. Het is belangrijk dat de paramagnetische en diamagnetische monsters zo goed mogelijk op elkaar aansluiten. Houd bij het verminderen van het spin-label met ascorbinezuur om een diamagnetische controle te creëren rekening met de verdunningsfactor die wordt geïntroduceerd door titreren in een ascorbinezuurstockoplossing. Deze verdunning kan worden geminimaliseerd door de ascorbinezuurvoorraad ten minste 10x de verwachte werkconcentratie in de NMR-buffer te handhaven.
Er zijn veel softwarepakketten beschikbaar voor het analyseren van NMR-gegevens, waaronder NMRPipe 32, Sparky 33, CCPN Analysis34, NMRViewJ35, onder anderen. De combinatie van NMRPipe voor spectrale verwerking en Sparky voor spectrale analyse (peak picking en kwantificering) werd hier beschreven vanwege het gebruiksgemak van deze combinatie. NMRPipe wordt vaak gebruikt door veel NMR-groepen voor spectrale verwerking, maar de NMRPipe-suite bevat de tools die nodig zijn voor het voltooien van alle stappen van de analyse, zij het met een aanzienlijke leercurve. Gegevens kunnen ook worden verwerkt met behulp van de NMR-spectrometerbesturingssoftware. Sparky werd gekozen voor spectrale analyse vanwege het gebruiksgemak en de snelle opname door beginnende gebruikers. Er zijn verschillende opties beschikbaar voor spectrale analyse (peak picking en het meten van piekhoogten) die gemakkelijk de functionaliteit van Sparky kunnen vervangen, waaronder CCPN-analyse of NMRViewJ. Met name veel van deze programma's hebben overlappende functionaliteiten en de gebruiker wordt geadviseerd om de combinatie van programma's te selecteren waarmee ze het meest comfortabel zijn.
Slechte chemische verschuivingsdispersie is een inherent probleem met IDP's die leiden tot significante resonantieoverlapping en introductie van fouten in de meting van de piekhoogte. Er zijn verschillende strategieën voorgesteld om dit probleem te verlichten. Een van de meest eenvoudige, en degene die hier wordt gebruikt, is om te profiteren van de lange transversale ontspanningskarakteristiek van IDP's en eenvoudigweg de acquisitietijd in de 15N (indirecte) dimensie te verlengen. Als alternatief is het HNCO-experiment met drievoudige resonantie nuttig voor het oplossen van resonantieoverlapping in IDP's vanwege de superieure dispersie van C'-resonanties. Zowel trosy- als HSQC-versies van de HNCO voor het meten van PRE's zijn voorgesteld en worden elders beschreven47. De verbeterde resolutie is echter niet altijd significant genoeg om de toegenomen complexiteit van het experiment, de langere tijd voor gegevensverzameling en de extra kosten voor het voorbereiden van een geschikt monster (verrijking van 13C) te rechtvaardigen. Dit is inderdaad het geval voor EWSR1 171-264 hier gepresenteerd, waar geen significante verbetering van het aantal niet-overlappende residuen werd waargenomen tussen een TROSY-HNCO en een 1H, 15N HSQC verzameld met een lange acquisitietijd in de indirecte dimensie.
Deze hierboven beschreven procedure richt zich op het nut van PRE-experimenten voor het karakteriseren van zwakke interacties die bestaan binnen en tussen intrinsiek ongeordende eiwitten. De PRE heeft een veel breder nut in biomoleculaire NMR, waaronder het bepalen van structurele beperkingen op lange afstand en kwantitatieve bepaling van dunbevolkte conformatietoestanden. Clore en collega's hebben bijvoorbeeld een pioniersrol gespeeld in het gebruik van de PRE om voorbijgaande interacties te detecteren en te kwantificeren die voortvloeien uit interacties tussen individuele domeinen van een enkel eiwit48 of tussen de subeenheden van geassembleerde eiwitcomplexen17. Er zijn veel voorbeelden van de PRE die wordt gebruikt om langeafstandsafstandsbeperkingen af te leiden, waaronder voor grote eiwitten49, of met nieuwe PRE-tags50, om de totale vouw van een eiwit51 te helpen bepalen, evenals in zeer paramagnetische systemen52. Ten slotte, hoewel PCS buiten het bestek van deze discussie valt, zijn ze toegepast op belangrijke biomoleculaire problemen die elders zijn beschreven53. De hierboven beschreven methode is geschikt voor het onderzoeken van de conformatie en interacties van IDP's met behulp van PREs en is ontworpen om toegankelijk te zijn voor beginnende gebruikers. Voor meer kwantitatieve benaderingen van de analyse van de PRE, wordt de gebruiker verwezen naar de vele uitstekende artikelen waarnaar wordt verwezen in 11,24,30,31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs hebben het manuscript gelezen en goedgekeurd. Er worden geen belangenconflicten aangegeven.
Acknowledgments
Wij danken Drs. Jinfa Ying en Kristin Cano voor nuttige discussies en technische assistentie. DSL is een St. Baldrick's Scholar en erkent de steun van de St. Baldrick's Foundation (634706). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Welch Foundation (AQ-2001-20190330) aan DSL, het Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant aan DSL), UTHSA Start-Up Funds aan DSL en een Greehey Graduate Fellowship in Children's Health aan CNJ. Dit werk is gebaseerd op onderzoek uitgevoerd in de Structural Biology Core Facilities, onderdeel van de Institutional Research Cores aan het University of Texas Health Science Center in San Antonio, ondersteund door het Office of the Vice President for Research en het Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 µm and 0.22 µm syringe filters | Millipore Sigma | SLHVM33RS SLGVR33RS |
Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography. |
| 100 mm Petri Dish | Fisher | FB0875713 | Agar plates for bacterial transformation. |
| 14N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 576794 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 15N Ammonium chloride | Sigma Aldrich | 299251 | Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein |
| 3 L Fernbach baffled flask | Corning | 431523 | Bacterial expression culture |
| 3-Maleimido-Proxyl | Sigma Aldrich | 253375 | Nitroxide spin label |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | Solution/protein storage |
| Amicon centrifugal filter | Millipore Sigma | UFC900308 | Protein concentration |
| Ampicillan | Sigma Aldrich | A5354 | Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid |
| Analytical balance | Oahus | 30061978 | Explorer Pro, for weighing reagents |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | AX1775 | Reduces nitroxide spin label |
| Autoclave | Sterilize glassware and culture media | ||
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | M9 media component |
| Centrifuge bottles | Thermo Fisher | 010-1459 | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Centrifuge, hand-crank | Thomas Scientific | 0241C68 | Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes |
| Chelex 100 | Sigma Aldrich | C7901 | Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions |
| Computer workstation | Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky | ||
| Deuterium oxide | Sigma Aldrich | 151882 | Needed for NMR lock signal |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | M9 media component |
| Dibasic Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | S5136 | M9 media component |
| Ellman's reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) | Thermo Fisher | 22582 | Quantification of free cystiene residues |
| High speed centrifuge tubes | Thermo Fisher | 3114-0050 | Used to clear bacterial lysate. |
| High-field NMR instrument (600 - 800 MHz) | Bruker | Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control | |
| IMAC column, HisTrap FF | Cytvia | 17528601 | Initial fractionation of crude bacterial lysate |
| Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I6758 | Induces protein expression for genes under control of lac operator |
| LB agar | Thermo Fisher | 22700025 | Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable. |
| LB broth | Thermo Fisher | 12780052 | |
| Low-pressure chromatography system | Bio-Rad | 7318300 | BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | M9 media component |
| Medium pressure chromatography system | Bio-Rad | 7880007 | BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector |
| MEM vitamin solution | Sigma Aldrich | M6895 | M9 media component |
| Microfluidizer | Avestin | EmulsiFlex-C3 | Provides rapid and efficient bacterial cell lysis |
| Micropipettes | Thermo Fisher | Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf) | |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | 1551139 | M9 media component |
| NMR pipettes | Sigma Aldrich | 255688 | To remove sample from NMR tube |
| NMR sample tube | NewEra | NE-SL5 | Suitable for high-field NMR spectrometers |
| Preparative Centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-HC | Harvest E. coli cells after recombinant protein expression |
| Round bottom polystyrene centrifuge tubes | Corning | 352057 | Clear bacterial lysate |
| Shaking incubator | Eppendorf | S44I200005 | Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S5886 | M9 media component |
| Sonicating water bath and vacuum source | Thomas Scientific | Used to degas buffer solutions | |
| Sonicator | Thermo Fisher | FB505110 | Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA |
| Spectrophotometer | Implen | OD600 Diluphotometer | Monitor growth of E.coli protein expression cultures |
| Superdex 200 16/600 size exculsion colum | Cytvia | 28989333 | Final protein purification step |
| Topspin software, version 3.2 or later | Bruker | Operating software for the NMR instrument | |
| Transformation competent E. coli cells | Thermo Fisher | C600003 | One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | ThermoFisher | 20490 | Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations |
| UV-Vis spectrophotometer | Implen | NP80 | Measure protein concentration. |
| Water bath, temperature controlled | ThermoFisher | FSGPD25 | For heat shock step of bacterial transformation |
| Yeast extract | Sigma Aldrich | Y1625 | For supplementing M9 media if required |
References
- Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 6 (3), 197-208 (2005).
- Korneta, I., Bujnicki, J. M. Intrinsic disorder in the human spliceosomal proteome. PLoS Computational Biology. 8 (8), 1002641 (2012).
- Frege, T., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteins in the nucleus of human cells. Biochemistry and Biophysics Reports. 1, 33-51 (2015).
- Liu, J., et al.
- El Hadidy, N., Uversky, V. N. Intrinsic disorder of the BAF complex: Roles in chromatin remodeling and disease development. International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), (2019).
- Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically disordered proteins in cellular signalling and regulation. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (1), 18-29 (2015).
- Brangwynne, C. P. Phase transitions and size scaling of membrane-less organelles. Journal of Cell Biology. 203 (6), 875-881 (2013).
- Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
- Cavanagh, J. Protein NMR spectroscopy : principles and practice. 1st edition. , Elsevier. (2018).
- Sekhar, A., Kay, L. E. NMR paves the way for atomic level descriptions of sparsely populated, transiently formed biomolecular conformers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (32), 12867-12874 (2013).
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Alderson, T. R., Kay, L. E. NMR spectroscopy captures the essential role of dynamics in regulating biomolecular function. Cell. 184 (3), 577-595 (2021).
- Clore, G. M., Iwahara, J. Theory, practice, and applications of paramagnetic relaxation enhancement for the characterization of transient low-population states of biological macromolecules and their complexes. Chemical Reviews. 109 (9), 4108-4139 (2009).
- Wu, K. P., Baum, J. Detection of transient interchain interactions in the intrinsically disordered protein alpha-synuclein by NMR paramagnetic relaxation enhancement. Journal of the American Chemical Society. 132 (16), 5546-5547 (2010).
- Janowska, M. K., Wu, K. P., Baum, J. Unveiling transient protein-protein interactions that modulate inhibition of alpha-synuclein aggregation by beta-synuclein, a pre-synaptic protein that co-localizes with alpha-synuclein. Scientific Reports. 5, 15164 (2015).
- Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid-liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (7), 637-648 (2019).
- Fawzi, N. L., Doucleff, M., Suh, J. Y., Clore, G. M. Mechanistic details of a protein-protein association pathway revealed by paramagnetic relaxation enhancement titration measurements. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (4), 1379-1384 (2010).
- Griffith, O. H., Waggoner, A. S. Nitroxide free radicals: spin labels for probing biomolecular structure. Accounts of Chemical Research. 2 (2), 17-24 (1969).
- Bertini, I., Luchinat, C., Parigi, G., Ravera, E. NMR of Paramagnetic Macromolecules, Applications to Metallobiomolecules and Models. 2 edn. , Elsevier Science. (2016).
- Bloembergen, N., Purcell, E. M., Pound, R. V. Relaxation effects in nuclear magnetic resonance absorption. Physical Review. 73 (7), 679-712 (1948).
- Solomon, I. Relaxation processes in a system of two spins. Physical Review. 99 (2), 559 (1955).
- Clore, G. M. Practical aspects of paramagnetic relaxation enhancement in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 564, 485-497 (2015).
- Klare, J. P. Site-directed spin labeling EPR spectroscopy in protein research. Biological Chemistry. 394 (10), 1281-1300 (2013).
- Clore, G. M., Tang, C., Iwahara, J. Elucidating transient macromolecular interactions using paramagnetic relaxation enhancement. Current Opinion in Structural Biology. 17 (5), 603-616 (2007).
- Melanson, M., Sood, A., Torok, F., Torok, M. Introduction to spin label electron paramagnetic resonance spectroscopy of proteins. Biochemistry and Molecular Biology Education. 41 (3), 156-162 (2013).
- Czogalla, A., Pieciul, A., Jezierski, A., Sikorski, A. F. Attaching a spin to a protein -- site-directed spin labeling in structural biology. Acta Biochimica Polonica. 54 (2), 235-244 (2007).
- Lindfors, H. E., de Koning, P. E., Drijfhout, J. W., Venezia, B., Ubbink, M. Mobility of TOAC spin-labelled peptides binding to the Src SH3 domain studied by paramagnetic NMR. Journal of Biomolecular NMR. 41 (3), 157-167 (2008).
- Fawzi, N. L., et al. A rigid disulfide-linked nitroxide side chain simplifies the quantitative analysis of PRE data. Journal of Biomolecular NMR. 51 (1-2), 105-114 (2011).
- Bleicken, S., et al. gem-Diethyl pyrroline nitroxide spin labels: Synthesis, EPR characterization, rotamer libraries and biocompatibility. ChemistryOpen. 8 (8), 1035 (2019).
- Iwahara, J., Tang, C., Clore, G. M. Practical aspects of 1H transverse paramagnetic relaxation enhancement measurements on macromolecules. Journal of Magnetic Resonance. 184, 185-195 (2007).
- Venditti, V., Fawzi, N. L. Probing the atomic structure of transient protein contacts by paramagnetic relaxation enhancement solution NMR. Methods in Molecular Biology. 1688, 243-255 (2018).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: a multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Lee, W., Tonelli, M., Markley, J. L. NMRFAM-SPARKY: enhanced software for biomolecular NMR spectroscopy. Bioinformatics. 31 (8), 1325-1327 (2015).
- Vranken, W. F., et al. The CCPN data model for NMR spectroscopy: development of a software pipeline. Proteins. 59 (4), 687-696 (2005).
- Johnson, B. A. Using NMRView to visualize and analyze the NMR spectra of macromolecules. Methods in Molecular Biology. 278, 313-352 (2004).
- Sjodt, M., Clubb, R. T. Nitroxide labeling of proteins and the determination of paramagnetic relaxation derived distance restraints for NMR studies. Bio-Protocol. 7 (7), (2017).
- Zhang, H., van Ingen, H. Isotope-labeling strategies for solution NMR studies of macromolecular assemblies. Current Opinion in Structural Biology. 38, 75-82 (2016).
- Rabdano, S. O., et al. Onset of disorder and protein aggregation due to oxidation-induced intermolecular disulfide bonds: case study of RRM2 domain from TDP-43. Scientific Reports. 7 (1), 11161 (2017).
- Burns, J. A., Butler, J. C., Moran, J., Whitesides, G. M. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. Journal of Organic Chemistry. 56 (8), 2648-2650 (1991).
- Ellman, G. L.
- Binbuga, B., Boroujerdi, A. F., Young, J. K. Structure in an extreme environment: NMR at high salt. Protein Science. 16 (8), 1783-1787 (2007).
- Schwartz, J. C., Cech, T. R., Parker, R. R. Biochemical properties and biological functions of FET proteins. Annual Review of Biochemistry. 84, 355-379 (2015).
- Nabuurs, S. M., de Kort, B. J., Westphal, A. H., van Mierlo, C. P. Non-native hydrophobic interactions detected in unfolded apoflavodoxin by paramagnetic relaxation enhancement. European Biophysics Journal. 39 (4), 689-698 (2010).
- Wiedemann, C., Kumar, A., Lang, A., Ohlenschlager, O. Cysteines and disulfide bonds as structure-forming units: Insights from different domains of life and the potential for characterization by NMR. Frontiers in Chemistry. 8, 280 (2020).
- Wommack, A. J., et al. NMR solution structure and condition-dependent oligomerization of the antimicrobial peptide human defensin 5. Biochemistry. 51 (48), 9624-9637 (2012).
- Taylor, A. M., et al. Detailed characterization of cysteine-less P-glycoprotein reveals subtle pharmacological differences in function from wild-type protein. British Journal of Pharmacology. 134 (8), 1609-1618 (2001).
- Hu, K., Doucleff, M., Clore, G. M. Using multiple quantum coherence to increase the 15N resolution in a three-dimensional TROSY HNCO experiment for accurate PRE and RDC measurements. Journal of Magnetic Resonance. 200 (2), 173-177 (2009).
- Anthis, N. J., Doucleff, M., Clore, G. M. Transient, sparsely populated compact states of apo and calcium-loaded calmodulin probed by paramagnetic relaxation enhancement: interplay of conformational selection and induced fit. Journal of the American Chemical Society. 133 (46), 18966-18974 (2011).
- Battiste, J. L., Wagner, G. Utilization of site-directed spin labeling and high-resolution heteronuclear nuclear magnetic resonance for global fold determination of large proteins with limited nuclear overhauser effect data. Biochemistry. 39 (18), 5355-5365 (2000).
- Donaldson, L. W., et al. Structural characterization of proteins with an attached ATCUN motif by paramagnetic relaxation enhancement NMR spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 123 (40), 9843-9847 (2001).
- Gaponenko, V., et al. Protein global fold determination using site-directed spin and isotope labeling. Protein Science. 9 (2), 302-309 (2000).
- Trindade, I. B., Invernici, M., Cantini, F., Louro, R. O., Piccioli, M. PRE-driven protein NMR structures: an alternative approach in highly paramagnetic systems. FEBS Journal. 288 (9), 3010-3023 (2021).
- Nitsche, C., Otting, G. Pseudocontact shifts in biomolecular NMR using paramagnetic metal tags. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 98-99, 20-49 (2017).
