Forbedring af reproducerbarheden for at imødekomme minimal information til undersøgelser af ekstracellulære vesikler 2018-retningslinjer i nanopartikelsporingsanalyse

Summary

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) er en meget anvendt metode til at karakterisere ekstracellulære vesikler. Dette papir fremhæver NTA eksperimentelle parametre og kontroller plus en ensartet metode til analyse og karakterisering af prøver og fortyndingsmidler, der er nødvendige for at supplere de retningslinjer, der er foreslået af MISEV2018 og EV-TRACK for reproducerbarhed mellem laboratorier.

Abstract

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) har været en af flere karakteriseringsmetoder, der anvendes til ekstracellulær vesikelforskning (EV) siden 2006. Mange mener, at NTA-instrumenter og deres softwarepakker let kan bruges efter minimal træning, og at størrelseskalibrering er mulig internt. Da både NTA-erhvervelse og softwareanalyse udgør EV-karakterisering, behandles de i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Derudover er de blevet overvåget af Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) for at forbedre robustheden af EV-eksperimenter (f.eks. minimere eksperimentel variation på grund af ukontrollerede faktorer).

På trods af bestræbelser på at tilskynde til rapportering af metoder og kontroller undlader mange offentliggjorte forskningsartikler at rapportere kritiske indstillinger, der er nødvendige for at gengive de originale NTA-observationer. Få papirer rapporterer NTA-karakteriseringen af negative kontroller eller fortyndingsmidler, åbenbart forudsat at kommercielt tilgængelige produkter, såsom fosfatbufret saltvand eller ultrarent destilleret vand, er partikelfrie. Tilsvarende rapporteres positive kontroller eller størrelsesstandarder sjældent af forskere for at verificere partikelstørrelse. Stokes-Einstein-ligningen indeholder prøveviskositet og temperaturvariabler for at bestemme partikelforskydning. Rapportering af den stabile laserkammertemperatur under hele prøvevideosamlingen er derfor en vigtig kontrolforanstaltning for nøjagtig replikering. Filtrering af prøver eller fortyndingsmidler rapporteres heller ikke rutinemæssigt, og i så fald er filterets specifikationer (producent, membranmateriale, porestørrelse) og opbevaringsbetingelser sjældent inkluderet. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV)'s minimumsstandarder for acceptable eksperimentelle detaljer bør omfatte en veldokumenteret NTA-protokol til karakterisering af elbiler. Følgende eksperiment giver bevis for, at en NTA-analyseprotokol skal etableres af den enkelte forsker og indgå i metoderne til publikationer, der bruger NTA-karakterisering som en af mulighederne for at opfylde MISEV2018-kravene til enkelt vesikelkarakterisering.

Introduction

Nøjagtig og repeterbar analyse af elbiler og andre nanometerskalerede partikler giver mange udfordringer på tværs af forskning og industri. Det har været vanskeligt at kopiere forskning i elbiler, til dels på grund af den manglende ensartethed i rapporteringen af de nødvendige parametre i forbindelse med dataindsamling. For at afhjælpe disse mangler foreslog ISEV industriretningslinjer som et minimalt sæt biokemiske, biofysiske og funktionelle standarder for EV-forskere og offentliggjorde dem som en holdningserklæring, almindeligvis benævnt MISEV2014¹. Det accelererende tempo i EV-forskningen krævede en opdateret retningslinje, og "MISEV2018: a position statement of the ISEV" udvidede MISEV2014-retningslinjerne². MISEV2018-papiret indeholdt tabeller, konturer af foreslåede protokoller og trin, der skulle følges for at dokumentere specifik EV-associeret karakterisering. Som en yderligere foranstaltning for at lette fortolkningen og replikeringen af eksperimenter blev EV-TRACK udviklet som en crowd-sourcing vidensbase (http://evtrack.org) for at muliggøre en mere gennemsigtig rapportering af EV-biologi og den metode, der anvendes til offentliggjorte resultater³. På trods af disse anbefalinger til standardiseret rapportering af metoder lider feltet fortsat med hensyn til replikering og bekræftelse af offentliggjorte resultater.

I tilpasning til National Institutes of Health's og National Science Foundations indsats for kvalitetsvurderingsværktøjer antyder dette papir, at ISEV kræver standardiseret rapportering af metoder og detaljer, så datavurderingsværktøjer kan anvendes med det formål at replikere resultater mellem laboratorier. Rapportering af cellekilder, cellekulturprocedurer og EV-isolationsmetoder er vigtige faktorer for at definere EV-populationens kvaliteter. Blandt NTA-instrumenter gør faktorer som detektionsindstillinger, brydningsindekset for bærervæske, heterogene partikelpopulationer, der bidrager til polydispersitet, mangel på standardiserede rapporteringskrav og fraværende intra- og interobservatørmåleresultater NTA-sammenligning mellem laboratorier vanskelig eller umulig.

NTA har i brug siden 2006 og er en populær metode til bestemmelse af nanopartikelstørrelse og koncentration, der i øjeblikket anvendes af ca. 80% af EV-forskerne⁴. MISEV2018-retningslinjerne kræver to former for enkelt-vesicle-analyse, hvoraf NTA er en af de populære muligheder. NTA fortsætter med at være i almindelig brug til EV-karakterisering på grund af dens brede tilgængelighed, lave omkostninger pr. Prøve og dens ligefremme grundlæggende teori (Stokes-Einstein-ligningen). EV-vurdering fra NTA genererer en partikelstørrelsesfordeling og koncentrationsestimat ved hjælp af laserlysspredning og brownsk bevægelsesanalyse, med den nedre detektionsgrænse bestemt af EV'ens brydningsindeks. Ved anvendelse af en væskeprøve med kendt viskositet og temperatur spores elbilernes baner for at bestemme deres gennemsnitlige kvadratiske forskydning i to dimensioner. Dette gør det muligt at beregne partikeldiffusionskoefficienten og konvertere til en kugleækvivalent hydrodynamisk diameter ved en modificeret Stokes-Einstein-ligning ^5,6,7. NTA's partikel-til-partikel-analyse har mindre interferens fra agglomerater eller større partikler i en heterogen population af elbiler end andre metoder til karakterisering⁷. Mens nogle få større partikler har minimal indflydelse på størrelsesnøjagtigheden, resulterer tilstedeværelsen af lige små mængder store, høje lysspredningspartikler i en bemærkelsesværdig reduktion i detektionen af mindre partikler på grund af reduceret software EV-detektion og sporing⁸. Som måleteknik anses NTA generelt for ikke at være forudindtaget mod større partikler eller aggregater af partikler, men kan løse populationer af flere størrelser gennem individuel partikelanalyse⁹. På grund af brugen af lysspredning af partikler er en af begrænsningerne ved NTA-analyse, at partikler som støv, plast eller pulver med lignende brydnings- og størrelsesattributter sammenlignet med elbiler ikke kan differentieres fra faktiske elbiler ved denne karakteriseringsmetode.

NanoSight LM10 (nanopartikelstørrelsesanalysator) og LM14 (lasermodul) er blevet solgt siden 2006, og selvom nyere modeller af dette instrument er blevet udviklet, findes denne særlige model i mange kernefaciliteter og betragtes som en pålidelig arbejdshest. Træning er nødvendig for korrekt optimering af NTA-indstillingerne til målinger af størrelse og koncentration i høj opløsning. De to vigtige indstillinger, der er nødvendige for optimale videooptagelser, er (1) kameraniveauet og (2) detektionstærsklen. Disse skal fastsættes af driftslederen på grundlag af prøvens egenskaber. En af de største begrænsninger ved NTA-analyse er anbefalingen af prøvekoncentrationer mellem 10⁷ og 10⁹ partikler/ml, for at opnå denne prøvefortynding kan det være nødvendigt¹⁰. Opløsninger, der anvendes til fortynding, såsom fosfatbufret saltvand, 0,15 M saltvand eller ultrarent vand, er sjældent fri for partikler under 220 μm i størrelse, hvilket kan påvirke NTA-målingerne. NTA-karakterisering af de opløsninger, der anvendes til fortynding, skal udføres på samme kameraniveau og detektionstærskel som de nanopartikelprøver, der analyseres. Størrelsen og koncentrationen af nanopartikler, der er til stede i fortyndingsmidler, der anvendes til fortyndinger af EV-prøver, indgår sjældent i publikationer, der involverer NTA-analyse af EV'er.

Denne protokol bruger NTA-analyse af syntetiske EV-lignende liposomer evalueret ved hjælp af udvalgte kameraniveauer, detektionstærskler og mekanisk filtrering af prøverne til at analysere de systematiske virkninger af kameraniveau, detektionstærskel eller prøvefiltrering på NTA-datasættet. Liposomer blev syntetiseret som beskrevet i Supplerende fil S1. Syntetiske liposomer blev anvendt i dette eksperiment på grund af deres størrelse ensartethed, fysiske egenskaber og stabilitet i opbevaring ved 4 ° C. Selv om der kunne have været anvendt faktiske prøver af elbiler, kan heterogeniciteten og stabiliteten af elbiler under opbevaring have kompliceret denne undersøgelse og dens fortolkning. Ligheder i NTA-rapporterne fra (A) liposomer og (B) EV'er indikerer, at de systematiske virkninger, der afsløres for liposomer i dette papir, sandsynligvis også vil gælde for EV-karakterisering (figur 1). Tilsammen understøtter disse resultater forestillingen om, at fuldstændig rapportering af kritiske softwareindstillinger og beskrivelsen af prøvebehandling, såsom fortyndingsvæske, fortynding og filtrering, påvirker reproducerbarheden af NTA-data.

Formålet med dette papir er at demonstrere, at variation af NTA-indstillingerne (temperatur, kameraniveau og detektionstærskel) og prøveforberedelse ændrer de indsamlede resultater: systematiske, signifikante forskelle i størrelse og koncentration blev opnået. Da NTA er en af de populære muligheder for at opfylde MISEV2018-karakteriseringsspecifikationen, viser disse resultater vigtigheden af at rapportere prøveforberedelse og NTA-indstillinger for at sikre reproducerbarhed.

Figur 1: Repræsentative NTA-rapporter for at sammenligne liposomer med elbiler. (A) Liposomer: ufiltreret prøve karakteriseret på NTA den 12. marts 2020. (B) Elbiler: ufiltreret prøve karakteriseret på NTA den 26. august 2021. Forkortelser: NTA = Nanopartikelsporingsanalyse; ELBILER = ekstracellulære vesikler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Protocol

1. Generelle retningslinjer for protokollen

1. Oprethold mikroskopet på et luftbord eller som minimum på et vibrationsfrit bord. Sørg for, at fremmede vibrationer (f.eks. Fodtapning på gulvet, berøring af bordet, dørlukninger, laboratorietrafik) holdes på et minimum.
2. Indstil og oprethold lasermodulets temperatur ved en konstant temperatur for alle videooptagelser.
   BEMÆRK: Den valgte temperatur var 25 °C, fordi analysatoren af nanopartikelstørrelse blev kalibreret ved denne temperatur. Derfor er det vigtigt, at alle brugere af instrumentet kender og bruger den kalibrerede temperatur. Rumtemperatur er ikke en acceptabel indstilling, fordi den kan variere.
3. Sørg for, at alle fortyndingsmidler, også kaldet negative kontroller (f.eks. Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS), ultrarent destilleret vand [DW]), alle er NTA-karakteriserede ved hjælp af det samme kameraniveau og detektionstærskel som de nanopartikelprøver, der måles. Brug karakteriseret DPBS til skylning af lasermodulet og fortynding af prøver. Faktor forurenende stoffer i den negative kontrol DPBS i prøveresultater, hvis deres niveauer er signifikante.
4. Opbevar prøver ved 4 °C inden evalueringen, og frys dem aldrig, da dette ville nedbryde liposomprøven. Varm prøver/standarder/fortyndingsmidler til stuetemperatur i 30 minutter før analysen.
   BEMÆRK: Prøvehåndteringen var specifik for det materiale, der blev undersøgt.
5. Evaluer prøve og standarder ved hjælp af hurtig måling for at etablere en passende fortynding for at opnå 10⁷ til 10⁹ partikler / ml (ca. 50 til 100 partikler / NTA-videoskærm) bestemt til at være optimal til NTA-analyser.
   BEMÆRK: Forfatterne har fundet ud af, at partikelkoncentrationer i den højere ende af dette interval giver mere konsistente og reproducerbare resultater.
6. Udfyld alle relevante felter i feltet Capture under fanen SOP for både Hurtige målinger og Standardmålinger , herunder den anvendte fortynding og fortyndingsfortynding.

2. Forberedelse af størrelseskalibreringsstandarder på 50 nm og 100 nm

BEMÆRK: Se tabellen over materialer.

1. 50 nm størrelse Overførselsstandarder fortyndet 1:5.000
   1. Der tilsættes 2 μL af 50 nm-standarderne til 9.998 μL 0,22 μm-filtreret 10 mM kaliumchlorid (KCl)/0,03 % Tween 20 i ultrarent DW i et konisk rør med to gange skyllet 15 ml. Den fortyndede 50 nm-standard opbevares ved 4 °C i op til et år.
2. 100 nm størrelse Overførselsstandarder fortyndet 1:333
   1. Tilsæt 30 μL af 100 nm-standarderne til 9.970 μL 0,22 μm-filtreret 10 mM KCl/0,03% Tween 20 i ultrarent DW i et to gange skyllet 15 ml konisk rør. Den fortyndede 100 nm-standard opbevares ved 4 °C i op til et år.

3. Rengøring og samling af lasermodulet

1. Undersøg visuelt lasermodulet og flowcelledækselvinduerne for ridser eller ufuldkommenheder.
   BEMÆRK: Hvis en af glasoverfladen er ridset, kan billeddannelsen blive påvirket.
2. Rengør begge glasoverflader forsigtigt med en linserenser og linsepapir af god kvalitet. Brug ikke servietter eller køkkenrulle på glasoverflader.
3. Sørg for, at O-ringtætningen sidder korrekt i rillen på flowcelledækslet inden montering.
4. Placer flowcelledækslet på lasermodulet, og sikre, at de elektriske kontakter er i den rigtige retning. Anbring de 4 fjederbelastede tommelskruer gennem flowcellepladen, og engager lasermodulets gevind, men stram ikke individuelt.
5. Sæt ensartet tryk ned på flowcelledækslet, stram tommelfingerskruerne ensartet på en skiftevis diagonal måde, indtil de sidder tæt. Stram kun tommelskruerne, indtil de er stramme med fingeren. Stram ikke for meget.
   BEMÆRK: Ujævn stramning af tommelskruerne kan knække lasermodulets overflade. Nyere designede tommelskruer vil "bunde ud" ved det rette tryk og undgå mulig overtætning.

4. Skylleprocedure for lasermodulet før og mellem prøverne

1. Brug en nyåbnet beholder med DPBS og alikvote i tredobbelt skyllede 15 ml polypropylenrør. Sørg for, at produkter, der anvendes til at skylle eller fortynde prøver, er NTA-karakteriserede inden brug (se trin 1.3).
2. Skyl to 1 ml tuberkulinsprøjter med sliplåsadaptere 3 gange med 1 ml DPBS for at fjerne eventuelle partiklerester. Brug begge port som input, men brug det konsekvent under eksperimentet. Brug ikke større sprøjter på grund af faren for at bryde sprøjteporte fra sprøjtens øgede vægt og størrelse.
3. Fjern og kassér stemplet fra 1^. tuberkulinsprøjten, og indsæt det i den resterende port for at fungere som et ugyldigt fortyndings-/prøvereservoir.
   BEMÆRK: Manglende fjernelse af stemplet vil medføre øget tryk i prøvekammeret og lækage omkring tætningen.
4. Fyld den 2^. sprøjte med 1 ml DPBS og fastgør den til indløbsporten på flowcelledækslet.
5. Hold lasermodulet vippet med udløbssprøjteporten hævet for at gøre det muligt at rense luft fra kammeret, når DPBS injiceres langsomt i lasermodulet.
6. Skyl de resterende DPBS fra lasermodulet ved at injicere 1 ml luft i indløbsporten. Gentag skylning 2 gange mere.
7. Tøm lasermodulet så fuldstændigt som muligt efter den sidste skylning.
   BEMÆRK: Grundig, omhyggelig skylning er nødvendig efter NTA-analyse af 50 nm-standarden, da disse partikler vedvarer i lasermodulet. Lasermodulet er nu klar til brug.

5. Placering af lasermodulet på mikroskoptrinnet

1. Find lasermodulets fokusjusteringsstyrer på mikroskopets arm (figur 2), og juster dem ved hjælp af fokusknappen.

Figur 2: Vejledning til justering af lasermodulfokus. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Mod mikroskopet skal du placere lasermodulet i det rillede trin og forsigtigt skubbe det så langt som muligt til højre.
   BEMÆRK: Hvis det gøres omhyggeligt, vil justeringen og brændpunktet være lettere at lokalisere mellem prøverne.
3. Tænd vippekontakten på laserkontrolboksen.

6. Fokusering og placering af lasermodulet

BEMÆRK: Dette skal udføres med væske i kammeret.

1. Indlæs NTA-softwaren (se tabellen over materialer) fra skrivebordet.
   BEMÆRK: Der kan opstå en fejl, "Temperatur H/W ikke fundet på COM3." Du skal blot lukke og genåbne softwaren for at rette den.
2. Klik på Start kamera under fanen Capture i boksen i øverste venstre hjørne. Hvis kameraet slukker automatisk efter 5 minutter, skal du blot klikke på Start kamera igen for at genstarte det.
3. På samme fane skal du justere kameraniveauet til 14 til 16 for at gøre laserlinjen lysere og forenkle partikelidentifikation og -fokus.
4. Afdiriger billedet fra kameraet til okularerne ved at flytte den øverste skyder i venstre side af hovedstykket ind eller ud.
5. Find området med øget tæthed, almindeligvis omtalt som tommelfingeraftrykket. Centrer og fokuser tommelfingeraftrykket lodret i synsfeltet.
   BEMÆRK: Laserlinjen vil være til venstre for aftrykket. Mørkning af rummet kan hjælpe med at lette lokalisering af tommelfingeraftrykket og fokus på laserlinjen.
6. Centrer laserlinjen i synsfeltet; flyt den øverste skyder for at aflede lyset til kameraet som observeret på computerskærmen.
   BEMÆRK: Laserlinjen, der nu er synlig på skærmen, er et spejlbillede af okularvisningen; venstre i okularerne vil være lige på computerskærmen.
7. Juster fokus for at skærpe billedet af individuelle partikler i bevægelse på skærmen med fokusknappen.
   BEMÆRK: På grund af fokusdybden vil alle partiklerne ikke være i fokus, hvilket er acceptabelt. Selv partikler, der er lidt ude af fokus, vil blive fanget af kameraet og analyseret af softwaren.

7. Indlæsning af standarder/prøver/fortyndingsmiddel i lasermodulet til NTA-analyse

1. 1 ml standard/prøve/fortyndingsmiddel trækkes op i en skyllet 1 ml tuberkulinsprøjte, og den fastgøres til indløbsporten på flowcelledækslet. Fremryk stemplet, indtil der er tydeligt væske i den åbne sprøjte, der er fastgjort til udløbsporten.
2. I kameravisningen skal du flytte til højre for laserlinjen til et område med et ensartet antal partikler. Juster om nødvendigt den lodrette retning for at centrere de vandrette lysbånd. Fokuser igen, indtil det højeste antal partikler er i betragtning. Sørg for, at denne position opretholdes så tæt som muligt for alle efterfølgende foranstaltninger.
3. Juster kameraniveauet til det punkt, hvor symbolet Mørk information blinker med mellemrum til og fra øverst til højre i kameravisningen.
   BEMÆRK: Dette hjælper med at sikre, at der foretages et ensartet valg af kameraniveau på det mindste følsomhedsniveau for hver dataindsamlingsserie.
   BEMÆRK: Kameraniveau kan ikke ændres under optagelse.

8. Validering af kalibrering

BEMÆRK: Det anbefales at validere modulkalibreringen ved hjælp af størrelsesstandarder (se punkt 2) inden prøveanalysen. Rutinemæssig validering er nødvendig for at sikre nøjagtige målinger. I et flerbrugerlaboratorium kan individuelle brugerjusteringer af softwarekonfigurationsindstillinger utilsigtet forårsage unøjagtig dataindsamling. For kritisk dataindsamling er daglig validering et spørgsmål om god laboratoriepraksis. Valideringens daglige reproducerbarhed skal medtages i de rapporterede resultater. Kalibreringen indstilles typisk af teknikeren og kan ikke justeres af den enkelte bruger, medmindre brugeren har administratoradgang. Dette forhindrer uautoriseret omkonfiguration af individuelle brugere.

1. Varme fortyndede standarder (se punkt 2) til stuetemperatur i 30 minutter.
2. Hvirvel hvirvelløst standarderne og derefter belastning som beskrevet i afsnit 7.
3. Udfør prøve NTA som beskrevet i punkt 10 og registrer værdier til efterfølgende beregning af variationskoefficienten, som skal være mindre end 2 %, hvis den kalibreres korrekt.

9. Optimering af prøvekoncentration for NTA

BEMÆRK: Skærmen skal indeholde mellem 50 og 100 målbare partikler, når kameraniveauet og prøvekoncentrationen justeres korrekt. Hvis der er spørgsmål om, hvorvidt en prøve har et passende partikelantal, kan der køres en hurtig måling på prøven på dette tidspunkt (se trin 9.1 til 9.7). Det bruges til at vurdere prøveegenskaberne hurtigt inden længere videooptagelse. Fanen Hurtig måling findes under fanen SOP i det nederste midterste felt.

1. Indstil Capture-varigheden til 30 s.
2. Accepter det eksisterende basisfilnavn, eller indtast et nyt filnavn ved at klikke på fanen ... for et nyt lagerwebsted for genererede data.
3. Marker afkrydsningsfeltet for Måltemperatur , og indtast den ønskede temperatur.
4. Indlæs eksemplet som tidligere beskrevet (trin 7.1), og klik på Opret og kør script.
5. Vent på, at antallet af partikler pr. ramme vises nederst til højre på videoskærmen efter afslutningen af 30 s-videoen. Hvis antallet af partikler er større end 100, skylles lasermodulet 3 gange (som tidligere beskrevet i trin 4.6).
6. Fortynd prøven til det ønskede koncentrationsområde under anvendelse af det karakteriserede fortyndingsstof.
7. Læg den korrekt fortyndede prøve i det skyllede lasermodul, og kør hurtigmålingen for at kontrollere, at prøven ligger inden for det acceptable område.

10. Prøve NTA

BEMÆRK: Fanen Standardmåling findes under fanen SOP i den nederste midterste boks og bruges til rutinemæssig prøveanalyse (se trin 10.1 til 10.12).

1. Indstil varigheden til 30 eller 60 s og antallet af videoer til 5.
2. Accepter det eksisterende basisfilnavn, eller indtast et nyt filnavn ved at klikke på fanen ... for et nyt lagerwebsted for genererede data.
3. Marker afkrydsningsfeltet for Måltemperatur , og indtast den ønskede temperatur.
4. Klik på Opret script for at genbruge denne standardmåling.
5. Når eksemplet er indlæst som beskrevet i afsnit 7, og eksperimentet er klar til at køre, skal du klikke på Opret og kør script.
6. Udfyld felterne i pop op-skærmbilledet Angiv rapportdetaljer med oplysninger om operatøren, prøvebeskrivelse, fortynding af prøven og anvendt fortyndingsmiddel.
   BEMÆRK: Disse oplysninger vil blive registreret og trykt på den endelige forsøgsrapport.
7. Når alle ønskede felter er udfyldt, skal du klikke på OK for at starte scriptet.
   BEMÆRK: Hvis måltemperatur blev valgt, stabiliserer varmelegemet prøven i lasermodulet til den ønskede temperatur i 5 s, før scriptet kan fortsætte med målingen. Diagnosepanelet i nederste venstre hjørne af skærmen læser HEATER ON og viser prøvens temperatur.
8. Før hver videooptagelse skal du kigge efter en prompt om at fremme stemplet manuelt. Injicer ~ 0,05 ml af prøven i laserkammeret, og lad partiklerne komme til "hvile" (dvs. ikke flyde), og klik derefter på OK.
9. Vent på, at feltet Bekræftelse af indstillinger vises, når den 5. videooptagelse er^afsluttet, og at feltet Proces blinker. Indstil registreringstærsklen for behandling af prøven ved at notere antallet af blå kryds, der markerer partikler på skærmen, da rammerne avanceres manuelt fra bunden af videoskærmen. Hvis der er mere end 3-4 blå kryds, der markerer partikler på hver skærm, når billeder er avancerede, skal du øge detektionstærsklen.
   BEMÆRK: De blå kryds på de enkelte partikler er analoge med "sværm" -effekten i flowcytometri og bør minimeres for optimal nøjagtighed og reproducerbarhed af dataindsamling.
10. Klik på Indstillinger OK , når registreringstærsklen er acceptabel.
11. Vent på, at videoerne behandles automatisk, og et histogram over resultater og en dialogboksmeddelelse om færdiggørelse vises, før du klikker på OK.
12. Når feltet Eksporter indstillinger vises, skal du gemme resultaterne ved at klikke på Eksporter.
    BEMÆRK: Alle resultater fra videoer og analyser gemmes i destinationsfilen, der er defineret i trin 10.2. Dette kræver en stor mængde opbevaring. Overvåg og overfør til en sekundær lagerenhed efter behov.

11. Genanalyse af den aktuelle prøve ved forskellige detektionstærskler

BEMÆRK: Umiddelbart efter NTA-analyse (trin 10) kan dataene analyseres igen ved hjælp af forskellige indstillinger for registreringstærskel. Kameraniveau kan dog ikke ændres efter optagelse.

1. Fremhæv alle 5 af de optagelsesvideoer, der er anført i det aktuelle eksperiment.
2. Klik på Behandl valgte filer, og vent på, at feltet Bekræftelse af indstilling vises, og feltet Proces blinker for at ændre registreringstærskelværdien.
3. Juster registreringstærsklen til det ønskede niveau, og klik på Indstilling OK.
4. Vent på, at videoerne behandles automatisk, og et histogram over resultater og en dialogboksmeddelelse om færdiggørelse vises, før du klikker på OK.
5. Klik på Eksportér indstillinger. Når der udføres yderligere evalueringer af den seneste prøve, skal du sørge for at klikke på feltet Eksportér resultater i pop op-vinduet Aktuelle eksperiment , da pop op-boksen Eksportér resultater ikke vises efter genanalysen af eksemplet.
   BEMÆRK: Da der ikke er nogen påmindelser om at gøre dette, kan det let overses, og analysen vil gå tabt. De underliggende data forbliver dog og kan genanalyses senere.

12. Analyse af arkiverede filer

BEMÆRK: Hvis tidligere analyserede eksperimenter ikke er blevet gemt, eller der skal foretages yderligere analyse af disse prøver, kan de enkelte filer genindlæses i NTA-softwaren for yderligere detektionstærskelevalueringer . Ændringer af kameraniveau kan ikke ændres efter optagelse.

1. Indlæs NTA-softwaren fra skrivebordet.
2. Klik på fanen Analyse i det nederste midterpanel.
3. Klik på Åbn eksperiment, og naviger til den ønskede .nano-fil.
   BEMÆRK: De videofiler, der er knyttet til det valgte .nano-eksperiment, skal være i samme mappe som hovedeksperimentfilen; Ellers vises der en fejl, når du prøver at behandle filerne. De første 6 cifre i filnavnet er den dato, hvor eksperimentet blev kørt (xx-xx-xx). De sidste 6 cifre i filnavnet er det tidspunkt, hvor videoen blev optaget (xx-xx-xx) og den individuelle videoidentifikator. PDF-filen for hvert kombineret eksperiment viser de inkluderede .nano-filer til den pågældende analyse.
4. Klik på Behandl valgte filer for at køre analysen.
5. Når feltet Proces blinker for at tillade ændringer i Registreringstærskelværdi, skal du indstille tærsklen til det ønskede niveau og klikke på OK.
6. Vent på, at videoerne behandles automatisk, og et histogram over resultater og en dialogboksmeddelelse om færdiggørelse vises, før du klikker på OK.
7. Klik på Eksportér resultater. Sørg for at klikke på feltet Eksportér resultater i det aktuelle eksperiment, da pop op-boksen Eksportér resultater ikke vises efter genanalysen.
   BEMÆRK: Da der ikke er nogen påmindelser om at gøre dette, kan det let overses, og analysen vil gå tabt.

13. Rengøring og demontering af lasermodulet

1. Sluk for laserkontrolboksen.
2. Skyl hele prøven ud af lasermodulet, og kassér den korrekt.
3. Hold lasermodulet vippet med den åbne sprøjteport hævet for at gøre det muligt at rense luft fra kammeret, når DPBS injiceres langsomt i lasermodulet og skylles fra udløbssprøjteporten.
4. Skyl de resterende DPBS fra lasermodulet, og kassér det.
5. Gentag skylningen 2 gange mere, og tøm lasermodulet så fuldstændigt som muligt efter den sidste skylning.
6. Læg ensartet tryk ned på flowcelledækslet, løsn tommelfingerskruerne ensartet på en skiftevis diagonal måde, indtil de er frakoblet gevindene, fjern tommelskruerne og opbevar dem i lasermodulhuset.
7. Fjern flowcelledækslet fra lasermodulet.
8. Rengør begge glasoverflader forsigtigt med en linserenser og linsepapir af god kvalitet. Brug ikke silkepapir eller køkkenrulle på glasoverflader.
9. Undersøg visuelt lasermodulet og flowcelledækslet "vinduer" for ridser eller ufuldkommenheder efter brug og rapporter til vejlederen.
10. Udskift lasermodulet og flowcelledækslet i deres tilfælde for at forhindre beskadigelse af glasoverflader under opbevaring.

14. Prøveanalyseprotokol

1. Ufiltrerede prøver
   1. Vortex prøven før indlæsning og optag 5 x 60 s videoer på kameraniveau 12 og detektionstærskelniveau 3 som beskrevet ovenfor. Analysér disse videoer ved hjælp af registreringstærskelværdier 2 og 5.
   2. Gentag videosamlinger af den samme prøve på kameraniveau 13 og 14 og registreringstærskelniveau 3. Analysér disse 2 yderligere videoer ved hjælp af registreringstærskler 2 og 5. Gentag hele processen ved hjælp af 5 x 30 s videoer i SOP-indstillingen.
2. Filtrerede prøver
   1. Hvirvel prøven og derefter samtidig lægge og filtrere den (0,22 μm sprøjtefilter) direkte ind i lasermodulet.
      BEMÆRK: Sprøjtefilteret blev skyllet med 2 gange volumenet af filterets døde rum inden brug for at fjerne eventuelle hjemmehørende partikler. Sprøjtefiltrene (se materialetabellen) havde et målt dødrum på 0,5 ml og blev skyllet med 1,0 ml af prøven inden målingerne. Bemærk filtertypen i SOP-datafelterne . Den filtrerede prøve blev behandlet nøjagtigt som beskrevet for ufiltrerede prøver i trin 14.1.

15. Statistisk analyse af NTA-resultater

1. Til analyse af hovedeffekter eller interaktioner udføres analyse af varians efter en kontrol af ANOVA-antagelser (normalitet, unimodal, homogenitet af varians). Brug Kruskal-Wallis envejs ANOVA på rækker i tilfælde af fejl i ANOVA-antagelser.
2. Efter tilbagevenden af betydelige hovedeffekter skal du bruge Dunns metode til at udføre middeltest for forudplanlagte sammenligninger. Overvej en p-værdi på 0,05 for at være signifikant i to-halet test.
   BEMÆRK: Datafiler, der genereres her, er tilgængelige fra forfatterne efter afslutningen af en materialeoverførselsaftale.

Representative Results

Tabel 1 indeholder resultaterne af NTA-videoerne for liposomprøverne (18 filtrerede og 18 ufiltrerede) og et repræsentativt DPBS-fortyndingsmiddel. Sammenligninger på tværs af de to grupper blev gennemført uanset kameraniveau eller detektionstærskel i dette papir. Filtrerede prøver havde en gennemsnitlig partikeldiameter på 108,5 nm, en partikelmodus på 86,2 nm og en koncentration på 7,4 × 10⁸ partikler / ml. I modsætning hertil havde ufiltrerede prøver en gennemsnitlig partikeldiameter på 159,1 nm, en partikeltilstand på 105,7 nm og en koncentration på 7,6 × 10⁸ partikler / ml. Gennemsnits- og tilstandsværdier for de filtrerede og ufiltrerede prøver, uanset kameraniveau eller detektionstærskel, var statistisk signifikante (p < 0,05). Forskelle i koncentration mellem de filtrerede og ufiltrerede prøver, uanset kameraniveau eller detektionstærskel, var ikke signifikante (p = 0,86).

Sammenligninger af filtrerede vs ufiltrerede prøver
Prøve	Cam Lev	Det Thr	Betyde		Gennemsnit% CV		Skt. Dev.		× 108		Skt. × 107
			Filtreret	Ufiltreret	Filtreret	Ufiltreret	Filtreret	Ufiltreret	Filtreret	Ufiltreret	Filtreret	Ufiltreret
Liposom	12	3	138.3	162.1	55.5	47.5	76.7	77	3.2	6.48	1.74	3.16
Liposom	12	2	126.3	153.7	58.7	49.8	74.2	76.5	4.94	8.23	2.74	3.5
Liposom	12	5	155	172.2	51.8	45.6	80.3	78.6	1.91	5.05	1.02	2.9
Liposom	13	3	102.7	169	43.5	51.3	44.7	86.7	6.72	7.75	1.91	1.17
Liposom	13	2	95.8	161.4	43.3	52.7	41.5	85	10.3	9.7	1.61	1.83
Liposom	13	5	110.7	176.1	42.5	47.1	47	83	4.16	6.28	1.83	1.07
Liposom	14	3	98	147.6	42.4	43.8	41.6	64.6	10.6	8.56	2.4	1.66
Liposom	14	2	92.9	142.1	42.6	45.2	39.6	64.3	14.9	10.7	2.54	1.83
Liposom	14	5	103.8	153.8	41.1	42.6	42.7	65.5	7.42	7.02	2.37	1.51
Liposom	12	3	105.6	179.4	22.2	46.7	23.4	83.7	5.2	5.81	1.06	4.28
Liposom	12	2	100.3	170.8	24.3	49.1	24.4	83.8	7.76	7.39	1.61	4.41
Liposom	12	5	112	187.2	20.4	42.9	22.8	80.4	3.27	4.68	0.815	3.93
Liposom	13	3	99.8	153.3	23.4	52.1	23.4	79.8	7.19	7.34	3.37	1.5
Liposom	13	2	94.3	143.6	25.8	53.2	24.3	76.4	10.8	9.53	4.3	2.46
Liposom	13	5	106.8	162	21.3	49.4	22.7	80	4.64	5.76	2.63	1.01
Liposom	14	3	103.4	142.3	31.7	49.6	32.8	70.6	9.91	8.66	3.29	12.5
Liposom	14	2	97.8	136	33.3	51.4	32.6	69.9	13.8	11.5	2.98	15.7
Liposom	14	5	109.5	151.4	31.1	49.5	34	74.9	7.27	6.76	3.42	10.1
Gennemsnitlig			108.5	159.1	36.4	48.3	40.5	76.7	7.4	7.6	2.3	4.1

Tabel 1: Datatabel over indsamlede værdier, standardafvigelse og procentvis variationskoefficient for filtrerede og ufiltrerede prøver. Forkortelser: Cam Lev = kameraniveau; Det Thr = detektionstærskel; CV = variationskoefficient St. Dev. = standardafvigelse; = koncentration.

Når liposomprøveresultaterne blev analyseret af detektionstærsklen (2, 3, 5) og kameraniveau (12, 13, 14), var resultaterne ikke signifikante (figur 3). Det skal bemærkes, at der kun var 3 evalueringer (n = 3) på hvert af disse individuelle niveauer. Denne lille stikprøvestørrelse på hvert kameraniveau og detektionstærsklen bidrog sandsynligvis til, at manglen på individuelle sammenligninger var signifikant. Når detektionstærsklen (2, 3, 5) prøver blev evalueret uanset kameraniveau på tværs af de filtrerede og ufiltrerede prøver (n = 3), var både gennemsnitsstørrelsen (figur 3A) og tilstandsstørrelsen (figur 3B) signifikant (p < 0,05) forskellige. I modsætning hertil var forskellene mellem filtrerede og ufiltrerede prøvekoncentrationer (figur 3C) ikke signifikant forskellige.

Figur 3: Effekter af kameraniveau og detektionstærskel på målt partikelstørrelse og koncentration af filtrerede og ufiltrerede prøver. Gennemsnitlig (A) og tilstand (B) partikelstørrelse på kombinerede kameraniveauer 12, 13, 14, da detektionstærsklen blev øget fra 2 til 3 til 5 (n = 3), hvilket viser et signifikant fald i partikelstørrelserne af de filtrerede prøver. Partikelkoncentrationer (C) på kombinerede kameraniveauer 12, 13, 14, da detektionstærsklen blev forhøjet fra 2 til 3 til 5) (n = 3), hvilket viser et koncentrationsfald, da detektionstærsklen steg uden signifikant forskel mellem filtrerede og ufiltrerede prøver. Gennemsnitlig (D) og tilstand (E) partikelstørrelse ved kombinerede detektionstærskler, da kameraniveauet steg fra 12 til 14 (n = 3), hvilket viser et fald i partikelstørrelsen af de filtrerede prøver. Partikelkoncentrationer (F) ved kombinerede detektionstærskler, da kameraniveauerne steg fra 12 til 14 (n = 3), hvilket viser en koncentrationsstigning, når kameraniveauet stiger uden signifikante forskelle mellem filtrerede og ufiltrerede prøver. Forkortelse: DT = detektionstærskel. Klik her for at se en større version af denne figur.

Da de 3 kameraniveauer (12, 13, 14) blev evalueret uanset detektionstærskelniveauet (n = 3), steg både gennemsnitsstørrelsen (figur 3D) og tilstandsstørrelsen (figur 3E) i de filtrerede prøver. Prøvekoncentrationer viste en tendens til at stige, da kameraniveauet steg fra 12 til 14 (figur 3F). Forskellene mellem filtrerede og ufiltrerede prøvekoncentrationer, der blev evalueret på forskellige kameraniveauer, var ikke signifikant forskellige.

Supplerende fil 1: Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Der findes flere metoder til at estimere størrelsen og koncentrationen af nanopartikler¹¹. Disse omfatter ensemblemetoder, der genererer et størrelsesestimat fra en population, herunder dynamisk lysspredning (DLS), centrifugalsedimentering og enkeltpartikelniveauanalyse-elektronmikroskopi, NTA, atomkraftmikroskopi og justerbar resistiv pulssensor. Af disse anvendes DLS og NTA i vid udstrækning, ikke-destruktive størrelses- og koncentrationsmålemetoder baseret på brownsk bevægelse i et ideelt medium. DLS er afhængig af spredning af lys, og intensiteten er proportional med kvadratet af partikelvolumenet. DLS er således mere følsom end NTA over for tilstedeværelsen af store partikler, aggregater eller polydisperse populationer.

NTA beregner diffusionskoefficienten ud fra stilængden af individuelle partikler målt i successive videorammer. Hovedbegrænsningen ved NTA er det snævre område af partikelkoncentration, som den kan evaluere sammenlignet med DLS og andre målemetoder, således at individuelle partikelstilængder skal falde inden for diffraktionsgrænsen for mikroskopet og sporingssoftwarens muligheder. Da DLS og NTA er afhængige af brownsk bevægelse, kan begge forventes at vise god størrelsesoverensstemmelse i monodispererede populationer; de afviger, når man vurderer polydisperse populationer og dem med aggregater. Sidstnævnte gør DLS ubrugelig og øger NTA-partikelstørrelsesestimatet betydeligt¹². NTA's mest kendte begrænsning er, at det kræver meget lavere partikelkoncentration (eller større fortynding) end andre målemetoder. På trods af dette er NTA-karakterisering populær inden for nanomaterialeforskning. Da NTA-størrelses- og koncentrationsestimater afhænger af en mere fortyndet population, hvor definerede temperatur-, videooptagelsesindstillinger, herunder optagelseslængde, kameraniveau, detektionstærskel og prøvefortynding er meget reproducerbare, fokuserer dette papir på behovet for at rapportere disse for at generere reproducerbare resultater.

Dette papir viser, at brug af en standardiseret protokol muliggjorde replikering af resultater, og at udnyttelse af positive kontroller, såsom størrelsesstandarder, giver information om maskinens kalibrering. Desuden indikerede disse resultater vigtigheden af at rapportere lasermodulets kammertemperatur, kameraniveauer, detektionstærskel og filtrering (filtertype og -størrelse). I modsætning hertil er lasermodulets kammertemperatur, fortyndings- og fortyndingsfaktor lige så vigtige for nøjagtige og reproducerbare resultater. Selv om hverken MISEV2018 eller EV-TRACK specifikt anbefaler, at disse oplysninger medtages, foreslår vi, at medtagelsen af disse detaljer muliggør uafhængig bekræftelse af offentliggjorte resultater og tilføjer robusthed til det eksperimentelle design.

Begrænsninger ved anvendelse af latexstørrelseskalibreringsstandarder til NTA-kalibrering i EV-analyse anerkendes og omfatter de kendte brydningsindeksforskelle sammenlignet med lipid-tolags nanopartikler af samme størrelse. I dette papir blev latexperler brugt til at bekræfte maskinkalibrering før målinger og ikke til at bestemme grænserne for detektion. Liposomerne har en membran, der ligner dem i naturligt forekommende elbiler, og brydningsindekset vil ligeledes være repræsentativt for elbiler. Størrelsesstandarderne såvel som liposomprøverne er monodispergerede populationer; derfor vil deres størrelsesfordeling følge en gaussisk eller log-normal fordeling. Naturlige elbiler er polydisperse, og deres størrelsesfordeling vil følge en magtlovsfunktion¹³.

Historisk set rapporterer publikationer, der bruger NTA-karakterisering, inkonsekvent nødvendige detaljer for at duplikere forskningsresultaterne. Evnen til at gengive NTA-data afhænger af evnen til at duplikere de indstillinger, der bruges til at fange de originale data. Uden disse oplysninger vil reproduktionen af eksperimentelle resultater ved hjælp af NTA være yderst vanskelig. Med streng overholdelse af en bestemt protokol og offentliggørelse af de indstillingsparametre, der anvendes med NTA, kan der opnås nøjagtig replikering af resultater. Følgende anbefalinger er lavet for at forbedre konsistensen af nanopartikelkarakterisering af størrelse, koncentration, sammensætning og renhed ved hjælp af en nanopartikelstørrelsesanalysator.

Kontroller først altid kalibreringen af nanopartikelstørrelsesanalysatoren ved hjælp af passende størrelsesstandarder, såsom latexstørrelsesstandarder. Dette bør ske regelmæssigt og registreres i instrumentloggen og forud for analysen af kritiske prøver. For det andet skal alle justerbare parametre, såsom lasermodulkammerets kammertemperatur, kameraniveauer og detektionstærskler, registreres for hver prøve i prøvelogfilen , ligesom de anvendte fortyndinger og fortyndingsmidler. Disse parametre bør rapporteres, da de er operatørafhængige og påvirker NTA-målinger. For det tredje skal fortyndingsmidler, der anvendes til prøvefortynding, karakteriseres for nanopartikelindhold og rapporteres. De fortyndingsmidler, der anvendes til individuelle nanopartikelprøver, skal evalueres ved hjælp af de samme indstillinger for kameraniveau og detektionstærskel som dem, der anvendes til den fortyndede prøve. For det fjerde skal sprøjtefiltre skylles med to gange det døde rumvolumen inden dataindsamling eller prøveforberedelsestrin for at skylle de mange partikler, der er tilbage fra fremstillingsprocessen. For det femte bør koncentrationen af nanopartiklerne i prøven justeres til inden for de foreslåede optimale 1,0 × 10⁷ til 1,0 × 10⁹ pr. ml.

I erkendelse af de ovenfor beskrevne begrænsninger i denne undersøgelse viser vi, at både størrelses- og koncentrationsværdierne opnået af NTA kan påvirkes af NTA-parametre, såsom kameraniveauer og detektionstærskler, og at størrelsen, men ikke koncentrationen, kan påvirkes af prøveforberedelse. Dette driver hjem den kritiske betydning af at rapportere disse parametre i nanomateriale og EV litteratur, hvilket muliggør produktion af robust, reproducerbar litteratur, så vi systematisk kan undersøge virkningen af EV kilde, isolering og andre eksperimentelle variabler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL	Thermo Sci.	339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10	Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module	Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2	Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding	BioExpress	P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile	BioExpress	P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg)	Gibco	14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)	Malvern	NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL)	Malvern	NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile	Fisher brand	09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip	Becton Dickinson	309659
Waste fluid container