Summary
Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является широко используемым методом для характеристики внеклеточных везикул. В этой статье освещаются экспериментальные параметры и средства контроля NTA, а также единый метод анализа и характеристики образцов и разбавителей, необходимых для дополнения руководящих принципов, предложенных MISEV2018 и EV-TRACK для воспроизводимости между лабораториями.
Abstract
Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является одним из нескольких методов характеристики, используемых для исследования внеклеточных везикул (EV) с 2006 года. Многие считают, что приборы NTA и их программные пакеты могут быть легко использованы после минимального обучения и что калибровка размера возможна внутри компании. Поскольку как приобретение NTA, так и анализ программного обеспечения представляют собой характеристику EV, они рассматриваются в Минимальной информации для исследований внеклеточных везикул 2018 (MISEV2018). Кроме того, они контролировались с помощью прозрачной отчетности и централизации знаний в исследованиях внеклеточных везикул (EV-TRACK) для повышения надежности экспериментов с электромобилями (например, минимизации экспериментальных вариаций из-за неконтролируемых факторов).
Несмотря на усилия по поощрению отчетности о методах и средствах контроля, во многих опубликованных исследовательских работах не сообщается о критических настройках, необходимых для воспроизведения оригинальных наблюдений NTA. В немногих работах сообщается о характеристике NTA отрицательных контрольных или разбавителей, очевидно, предполагая, что коммерчески доступные продукты, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор или сверхчистая дистиллированная вода, не содержат твердых частиц. Аналогичным образом, исследователи редко сообщают о положительных контрольных показателях или стандартах размера для проверки размера частиц. Уравнение Стокса-Эйнштейна включает в себя переменные вязкости и температуры образца для определения смещения частиц. Таким образом, сообщение о стабильной температуре лазерной камеры в течение всего видеосбора образцов является важной контрольной мерой для точной репликации. Фильтрация образцов или разбавителей также обычно не сообщается, и если это так, то редко включаются особенности фильтра (производитель, мембранный материал, размер пор) и условия хранения. Минимальные стандарты допустимых экспериментальных деталей Международного общества внеклеточных везикул (ISEV) должны включать хорошо документированный протокол NTA для характеристики EV. Следующий эксперимент предоставляет доказательства того, что протокол анализа NTA должен быть установлен отдельным исследователем и включен в методы публикаций, которые используют характеристику NTA в качестве одного из вариантов выполнения требований MISEV2018 для характеристики одного пузырька.
Introduction
Точный и воспроизводимый анализ электромобилей и других нанометровых частиц представляет собой многочисленные проблемы в исследованиях и промышленности. Тиражирование исследований EV было затруднено, в частности, из-за отсутствия единообразия в представлении необходимых параметров, связанных со сбором данных. Чтобы устранить эти недостатки, ISEV предложил отраслевые руководящие принципы в качестве минимального набора биохимических, биофизических и функциональных стандартов для исследователей EV и опубликовал их в виде заявления о позиции, обычно называемого MISEV20141. Ускоряющиеся темпы исследований электромобилей потребовали обновленного руководства, и «MISEV2018: заявление о позиции ISEV» расширило руководящие принципы MISEV20142. Документ MISEV2018 включал таблицы, наброски предлагаемых протоколов и шаги, которые необходимо выполнить для документирования конкретных характеристик, связанных с EV. В качестве дополнительной меры для облегчения интерпретации и тиражирования экспериментов EV-TRACK был разработан в качестве базы знаний краудсорсинга (http://evtrack.org), чтобы обеспечить более прозрачную отчетность о биологии EV и методологии, используемой для опубликованных результатов3. Несмотря на эти рекомендации в отношении стандартизированной отчетности о методах, на местах по-прежнему страдают в том, что касается воспроизведения и подтверждения опубликованных результатов.
В соответствии с усилиями Национальных институтов здравоохранения и Национального научного фонда по инструментам оценки качества, в этом документе предполагается, что ISEV требует стандартизированной отчетности о методах и деталях, чтобы инструменты оценки данных могли применяться с целью воспроизведения результатов между лабораториями. Отчетность об источниках клеток, процедурах культивирования клеток и методах изоляции EV являются важными факторами для определения качеств популяции EV. Среди приборов NTA такие факторы, как настройки обнаружения, показатель преломления жидкости-носителя, гетерогенные популяции частиц, способствующие полидисперсности, отсутствие стандартизированных требований к отчетности и отсутствие результатов измерений внутри и между наблюдателями, затрудняют или делают невозможным сравнение NTA между лабораториями.
Используемый с 2006 года, NTA является популярным методом определения размера наночастиц и концентрации, который в настоящее время используется примерно 80% исследователей EV4. Руководящие принципы MISEV2018 требуют двух форм анализа с одним пузырьком, одним из популярных вариантов которого является NTA. NTA по-прежнему широко используется для характеристики электромобилей из-за его широкой доступности, низкой стоимости за образец и его простой теории основания (уравнение Стокса-Эйнштейна). Оценка EV NTA генерирует оценку распределения и концентрации частиц по размеру с использованием лазерного рассеяния света и броуновского анализа движения, причем нижний предел обнаружения определяется показателем преломления EV. При использовании образца жидкости известной вязкости и температуры траектории электромобилей отслеживаются для определения их среднеквадратичного смещения в двух измерениях. Это позволяет рассчитать коэффициент диффузии частиц и преобразовать его в сферический эквивалентный гидродинамический диаметр по модифицированному уравнению Стокса-Эйнштейна 5,6,7. Анализ NTA от частицы к частице имеет меньшую интерференцию агломератами или более крупными частицами в гетерогенной популяции EV, чем другие методы характеристики7. В то время как несколько более крупных частиц оказывают минимальное влияние на точность определения размеров, присутствие даже незначительных количеств крупных частиц с высоким рассеянием света приводит к заметному снижению обнаружения более мелких частиц из-за снижения программного обнаружения и отслеживания EV8. В качестве метода измерения NTA обычно считается не смещенным в сторону более крупных частиц или агрегатов частиц, но может разрешать множественные популяции с помощью индивидуального анализа частиц9. Из-за использования рассеяния света частицами одним из ограничений анализа NTA является то, что любые частицы, такие как пыль, пластик или порошок с аналогичными преломлениями и размерными характеристиками по сравнению с EV, не могут быть дифференцированы от фактических EV с помощью этого метода характеристики.
NanoSight LM10 (анализатор размера наночастиц) и LM14 (лазерный модуль) продаются с 2006 года, и хотя были разработаны более новые модели этого прибора, эта конкретная модель встречается во многих основных установках и считается надежной рабочей лошадкой. Обучение необходимо для правильной оптимизации настроек NTA для измерений размера и концентрации с высоким разрешением. Двумя важными настройками, необходимыми для оптимальной видеозаписи, являются (1) уровень камеры и (2) порог обнаружения. Они должны быть установлены оператором на основе характеристик образца. Одним из основных ограничений анализа NTA является рекомендация о концентрациях пробы между 107 и 109 частицами/мл, для достижения этого разбавления пробы может потребоваться10. Растворы, используемые для разбавления, такие как фосфатно-буферный физиологический раствор, 0,15 М физиологического раствора или сверхчистая вода, редко свободны от частиц размером менее 220 мкм, что может повлиять на измерения NTA. NTA-характеристика растворов, используемых для разбавления, должна выполняться на том же уровне камеры и пороге обнаружения, что и анализируемые образцы наночастиц. Размер и концентрация наночастиц, присутствующих в разбавителях, используемых для разбавления образцов EV, редко включаются в публикации, связанные с NTA-анализом EV.
Этот протокол использует NTA-анализ синтетических EV-подобных липосом, оцениваемых с использованием выбранных уровней камеры, порогов обнаружения и механической фильтрации образцов для анализа систематических эффектов уровня камеры, порога обнаружения или фильтрации образцов на набор данных NTA. Липосомы были синтезированы, как описано в дополнительном файле S1. Синтетические липосомы были использованы в этом эксперименте из-за их однородности размеров, физических характеристик и стабильности при хранении при 4 °C. Хотя фактические образцы электромобилей могли быть использованы, гетерогенность и стабильность электромобилей во время хранения, возможно, усложнили это исследование и его интерпретацию. Сходство в отчетах NTA с (A) липосомами и (B) EV указывает на то, что систематические эффекты, выявленные для липосом в этой статье, вероятно, также будут применяться к характеристике EV (рисунок 1). В совокупности эти результаты подтверждают представление о том, что полная отчетность о критических настройках программного обеспечения и описание обработки образцов, таких как разбавитель, разбавление и фильтрация, влияют на воспроизводимость данных NTA.
Целью данной работы является демонстрация того, что изменение настроек NTA (температура, уровень камеры и порог обнаружения) и подготовка образцов изменяют собранные результаты: получены систематические, значительные различия в размерах и концентрации. Поскольку NTA является одним из популярных вариантов выполнения спецификации характеристик MISEV2018, эти результаты демонстрируют важность отчетности о подготовке образцов и настройках NTA для обеспечения воспроизводимости.
Рисунок 1: Репрезентативные отчеты NTA сравнивают липосомы с EV. (A) Липосомы: нефильтрованный образец, охарактеризованный на NTA 12 марта 2020 года. (B) EV: нефильтрованная выборка, охарактеризованная на NTA 26 августа 2021 года. Сокращения: NTA = анализ отслеживания наночастиц; EV = внеклеточные везикулы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Общие протокольные рекомендации
- Держите микроскоп на воздушном столе или, как минимум, на столе без вибрации. Убедитесь, что посторонние вибрации (например, постукивание ногами по полу, прикосновение к столу, закрытие дверей, лабораторное движение) сведены к минимуму.
- Установите и поддерживайте температуру лазерного модуля на постоянной температуре для всех видеозаписей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выбранная температура составляла 25 °C, поскольку анализатор размера наночастиц калибровался при этой температуре. Поэтому важно, чтобы все пользователи прибора знали и использовали калиброванную температуру. Комнатная температура не является приемлемой настройкой, потому что она может варьироваться. - Убедитесь, что все разбавители, также называемые отрицательными элементами управления (например, фосфатно-буферный физиологический раствор Dulbecco (DPBS), сверхчистая дистиллированная вода [DW]), характеризуются NTA с использованием того же уровня камеры и порога обнаружения, что и измеряемые образцы наночастиц. Использование характеризуется DPBS для промывки лазерного модуля и разбавления образцов. Учитывайте загрязняющие вещества в отрицательном контроле DPBS в результатах отбора проб, если их уровни значительны.
- Храните образцы при температуре 4 °C до оценки и никогда не замораживайте их, так как это приведет к деградации образца липосомы. Нагревайте образцы/стандарты/разбавители до комнатной температуры в течение 30 мин перед анализом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка образцов была специфичной для исследуемого материала. - Оценить образец и стандарты с помощью быстрых измерений для установления соответствующего разбавления для получения от 107 до 109 частиц / мл (приблизительно от 50 до 100 частиц / видеоэкран NTA), определенных как оптимальные для анализа NTA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы обнаружили, что концентрации частиц в верхнем конце этого диапазона дают более последовательные и воспроизводимые результаты. - Заполните все применимые поля в поле «Захват» вкладки «СОП » для быстрых и стандартных измерений , включая используемое разбавление и разбавитель.
2. Подготовка калибровочных эталонов размером 50 нм и 100 нм
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов.
- 50 нм размер Стандарты передачи разбавленные 1:5,000
- Добавьте 2 мкл из 50 нм стандартов к 9,998 мкл 0,22 мкм-фильтрованного 10 мМ хлористого калия (KCl)/0,03% Tween 20 в сверхчистом DW в дважды промытую коническую трубку объемом 15 мл. Хранить разбавленные 50 нм стандарта при 4 °C в течение года.
- Размер 100 нм Стандарты передачи разбавлены 1:333
- Добавьте 30 мкл стандартов 100 нм к 9,970 мкл 0,22 мкм-фильтрованного 10 мМ KCl/0,03% Tween 20 в сверхчистом DW в дважды промытую коническую трубку объемом 15 мл. Хранить разбавленный стандарт 100 нм при 4 °C в течение года.
3. Очистка и сборка лазерного модуля
- Визуально осмотрите лазерный модуль и окна крышки проточной ячейки на наличие царапин или дефектов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если какая-либо стеклянная поверхность поцарапана, это может повлиять на визуализацию. - Аккуратно очистите обе стеклянные поверхности с помощью высококачественного очистителя линз и бумаги для линз. Не используйте салфетки или бумажные полотенца на стеклянных поверхностях.
- Перед сборкой убедитесь, что уплотнительное кольцо правильно установлено в канавке крышки проточной ячейки.
- Поместите крышку проточной ячейки на лазерный модуль, убедившись, что электрические контакты находятся в правильной ориентации. Поместите 4 подпружиненных винта через пластину проточной ячейки и зацепите резьбу лазерного модуля, но не затягивайте по отдельности.
- Оказывая равномерное давление на крышку проточной ячейки, равномерно затягивайте винты попеременно по диагонали до плотного расположения. Только затягивайте винты большого пальца до тех пор, пока пальцы не затянуты. Не перетягивайте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное затягивание винтов может повредить поверхность лазерного модуля. Винты с более новой конструкцией будут «опускаться» при надлежащем давлении, избегая возможного чрезмерного затягивания.
4. Процедура промывки лазерного модуля до и между образцами
- Используйте недавно открытый контейнер DPBS и аликвоты в трижды промытые полипропиленовые трубки объемом 15 мл. Убедитесь, что продукты, используемые для промывки или разбавления образцов, характеризуются NTA перед использованием (см. шаг 1.3).
- Промывайте два туберкулиновых шприца по 1 мл с адаптерами блокировки скольжения 3 раза с 1 мл DPBS для удаления остатков твердых частиц. Используйте любой порт в качестве входных данных, но используйте его последовательно во время эксперимента. Не используйте шприцы большего размера из-за опасности разрыва шприцевых портов от увеличенного веса и размера шприца.
- Извлеките и выбросьте плунжер из1-го туберкулинового шприца и вставьте его в оставшийся порт, чтобы он служил в качестве пустого резервуара для разбавителя / образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неспособность удалить плунжер приведет к повышению давления в камере для отбора проб и утечке вокруг уплотнения. - Наполните2-й шприц 1 мл DPBS и прикрепите его к входному отверстию крышки проточной ячейки.
- Держите лазерный модуль наклоненным с поднятым портом выходного шприца, чтобы воздух выдувался из камеры при медленном впрыскивании DPBS в лазерный модуль.
- Смывайте оставшуюся DPBS из лазерного модуля, впрыскивая 1 мл воздуха во входной порт. Повторите промывку еще 2 раза.
- Очистите лазерный модуль как можно полнее после последнего смыва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательная, тщательная промывка необходима после NTA-анализа стандарта 50 нм, поскольку эти частицы сохраняются в лазерном модуле. Лазерный модуль готов к использованию.
5. Размещение лазерного модуля на ступени микроскопа
- Найдите направляющие выравнивания фокуса лазерного модуля на руке микроскопа (рисунок 2) и выровняйте их с помощью ручки фокусировки.
Рисунок 2: Руководство по выравниванию фокуса лазерного модуля. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
- Лицом к микроскопу поместите лазерный модуль в рифленую сцену и аккуратно сдвиньте его как можно дальше вправо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если все сделано осторожно, выравнивание и фокусное пятно будет легче найти между образцами. - Включите переключатель коромысла на блоке управления лазером.
6. Фокусировка и позиционирование лазерного модуля
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть выполнено с жидкостью в камере.
- Загрузите программное обеспечение NTA (см. Таблицу материалов) с рабочего стола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может появиться сообщение об ошибке "Температура H/W не найдена на COM3". Просто закройте и снова откройте программное обеспечение, чтобы исправить это. - Нажмите кнопку Запустить камеру на вкладке Захват в левом верхнем углу. Если фотокамера автоматически выключается через 5 минут, просто нажмите кнопку Запустить камеру еще раз, чтобы перезапустить ее.
- На той же вкладке отрегулируйте уровень камеры на 14-16, чтобы осветлить лазерную линию и упростить идентификацию и фокусировку частиц.
- Переведите изображение с камеры на окуляры, переместив верхний ползунок с левой стороны головного убора внутрь или наружу.
- Найдите область повышенной плотности, обычно называемую отпечатком большого пальца. Центрируйте и фокусируйте отпечаток по вертикали в поле зрения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная линия будет слева от отпечатка пальца. Затемнение комнаты может помочь облегчить обнаружение отпечатка большого пальца и фокусировку на лазерной линии. - Центрируйте лазерную линию в поле зрения; переместите верхний ползунок, чтобы направить свет на камеру, как это видно на экране компьютера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лазерная линия, видимая на экране, является зеркальным отражением вида окуляра; слева в окулярах будет прямо на экране компьютера. - Отрегулируйте фокусировку, чтобы повысить резкость изображения отдельных движущихся частиц на экране с помощью ручки фокусировки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за глубины фокусировки все частицы не будут находиться в фокусе, что приемлемо. Даже частицы, которые немного не в фокусе, будут захвачены камерой и проанализированы программным обеспечением.
7. Загрузка стандартов/образцов/разбавителя в лазерный модуль для анализа NTA
- Возьмите 1 мл стандартного/пробного/разбавителя в промытый 1 мл туберкулиновый шприц и прикрепите его к входному отверстию крышки проточной ячейки. Выдвигайте плунжер до тех пор, пока жидкость не появится в открытом шприце, прикрепленном к выходному отверстию.
- В представлении камеры переместитесь вправо от лазерной линии в область равномерного числа частиц. При необходимости отрегулируйте вертикальную ориентацию, чтобы центрировать горизонтальные полосы света. Перефокусируйтесь до тех пор, пока не появится наибольшее количество частиц. Обеспечить, чтобы при всех последующих мерах эта позиция сохранялась как можно ближе.
- Отрегулируйте уровень камеры до такой степени, что символ темной информации периодически вспыхивает и выключается в правом верхнем углу обзора камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это помогает обеспечить последовательный выбор уровня камеры на минимальном уровне чувствительности для каждого ряда сборов данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень камеры не может быть изменен во время захвата.
8. Валидация калибровки
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проверить калибровку модуля с использованием стандартов размера (см. раздел 2) перед анализом образца. Для обеспечения точных измерений необходима регулярная валидация. В многопользовательской лаборатории индивидуальные пользовательские настройки конфигурации программного обеспечения могут непреднамеренно привести к неточному сбору данных. Для сбора критически важных данных ежедневная валидация является вопросом надлежащей лабораторной практики. Повседневная воспроизводимость валидации должна быть включена в сообщаемые результаты. Как правило, калибровка устанавливается техническим специалистом и не регулируется отдельным пользователем, если пользователь не имеет доступа администратора. Это предотвращает несанкционированную перенастройку отдельными пользователями.
- Теплые разбавленные стандарты (см. раздел 2) до комнатной температуры в течение 30 мин.
- Кратко вихрьте стандарты, а затем загрузите, как описано в разделе 7.
- Выполняют пробу NTA, как описано в разделе 10, и записывают значения для последующего расчета коэффициента вариации, который должен быть менее 2% при правильной калибровке.
9. Оптимизация концентрации пробы для NTA
ПРИМЕЧАНИЕ: Экран должен содержать от 50 до 100 измеримых частиц при правильной регулировке уровня камеры и концентрации образца. Если возникает вопрос о том, имеет ли образец соответствующий номер частицы, на этом этапе на образце можно выполнить быстрое измерение (см. шаги 9.1-9.7). Он используется для быстрой оценки характеристик образца перед более длительными видеозахватами. Вкладка Быстрое измерение находится на вкладке СОП в нижнем среднем поле.
- Установите для параметра Длительность захвата значение 30 с.
- Примите существующее базовое имя файла или введите новое имя файла, щелкнув вкладку ... для нового сайта хранения созданных данных.
- Установите флажок Целевая температура и введите желаемую температуру.
- Загрузите образец, как описано выше (шаг 7.1), и нажмите кнопку Создать и запустить сценарий.
- Подождите, пока количество частиц в кадре будет отображаться в правом нижнем углу видеоэкрана после завершения видео 30 секунд. Если количество частиц больше 100, промывайте лазерный модуль 3 раза (как описано ранее в шаге 4.6).
- Разбавляют образец до нужного диапазона концентраций, используя характеризуемый разбавитель.
- Загрузите правильно разбавленный образец в промытый лазерный модуль и запустите quick Measurement , чтобы убедиться, что образец находится в допустимом диапазоне.
10. Образец НТА
ПРИМЕЧАНИЕ: Вкладка Стандартное измерение находится на вкладке СОП в нижнем среднем поле и используется для рутинного анализа образцов (см. шаги 10.1-10.12).
- Установите длительность 30 или 60 с , а количество видео — 5.
- Примите существующее базовое имя файла или введите новое имя файла, щелкнув вкладку ... для нового сайта хранения созданных данных.
- Установите флажок Целевая температура и введите желаемую температуру.
- Нажмите кнопку Создать сценарий , чтобы повторно использовать это стандартное измерение.
- После загрузки образца, как описано в разделе 7, и готовности эксперимента к запуску щелкните Создать и запустить сценарий.
- Заполните поля всплывающего окна «Задать сведения об отчете» информацией об операторе, описанием образца, разбавлением образца и используемым разбавителем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта информация будет записана и напечатана в окончательном экспериментальном отчете. - Когда все необходимые поля будут заполнены, нажмите кнопку ОК , чтобы запустить сценарий.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если выбрана целевая температура , нагреватель стабилизирует образец в лазерном модуле до желаемой температуры в течение 5 с, прежде чем позволить сценарию продолжить измерение. Диагностическая панель в левом нижнем углу экрана будет читать HEATER ON и отображать температуру образца. - Перед каждым захватом видео найдите подсказку для продвижения плунжера вручную. Введите ~0,05 мл образца в лазерную камеру и позвольте частицам «отдохнуть» (т.е. не течь), а затем нажмите кнопку «ОК».
- Подождите, пока по завершении5-й видеозаписи появится окно Подтверждение настроек и начнет мигать окно Обработка. Установите порог обнаружения для обработки образца, отметив количество синих крестиков, отмечающих частицы на экране, когда кадры вручную перемещаются из нижней части видеоэкрана. Если на каждом экране более 3-4 синих крестиков, отмечающих частицы по мере продвижения кадров, увеличьте порог обнаружения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Синие кресты на отдельных частицах аналогичны эффекту "роя" в проточной цитометрии и должны быть сведены к минимуму для обеспечения оптимальной точности и воспроизводимости сбора данных. - Нажмите кнопку Параметры ОК , если пороговое значение обнаружения является приемлемым.
- Дождитесь автоматической обработки видео и отображения гистограммы результатов и уведомления о завершении в диалоговом окне, прежде чем нажимать кнопку ОК.
- После появления поля Параметры экспорта сохраните результаты, нажав кнопку Экспорт.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все результаты видео и анализа будут сохранены в целевом файле, определенном на шаге 10.2. Для этого требуется большой объем хранилища. При необходимости отслеживайте и передавайте на дополнительное запоминающее устройство.
11. Повторный анализ текущего образца при различных порогах обнаружения
ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после анализа NTA (шаг 10) данные могут быть повторно проанализированы с использованием различных настроек порога обнаружения. Однако уровень камеры не может быть изменен после захвата.
- Выделите все 5 видеороликов захвата, перечисленных в текущем эксперименте.
- Щелкните Обработать выбранные файлы и подождите, пока появится поле Подтверждение настройки и поле Процесс начнет мигать, чтобы изменить пороговое значение обнаружения.
- Установите пороговое значение обнаружения на требуемый уровень и нажмите кнопку Настройка ОК.
- Дождитесь автоматической обработки видео и отображения гистограммы результатов и уведомления о завершении в диалоговом окне, прежде чем нажимать кнопку ОК.
- Нажмите кнопку Экспорт настроек. При выполнении дополнительных оценок для самого последнего образца обязательно щелкните поле Экспорт результатов в текущем эксперименте , так как всплывающее окно Экспорт результатов не будет отображаться после повторного анализа образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку нет никаких напоминаний об этом, это может быть легко упущено из виду, и анализ будет потерян. Однако базовые данные останутся и могут быть повторно проанализированы позже.
12. Анализ архивных файлов
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ранее проанализированные эксперименты не были сохранены или на этих образцах необходимо провести дополнительный анализ, отдельные файлы могут быть перезагружены в программное обеспечение NTA для дополнительных оценок порога обнаружения . Изменения уровня камеры не могут быть изменены после захвата.
- Загрузите программное обеспечение NTA с рабочего стола.
- Перейдите на вкладку Анализ на нижней средней панели.
- Нажмите кнопку Открыть эксперимент и перейдите к нужному файлу .nano.
ПРИМЕЧАНИЕ: Видеофайлы, связанные с выбранным экспериментом .nano, должны находиться в той же папке, что и основной файл эксперимента; в противном случае при попытке обработки файлов появится сообщение об ошибке. Первые 6 цифр имени файла — это дата запуска эксперимента (xx-xx-xx). Последние 6 цифр имени файла — это время записи видео (xx-xx-xx) и индивидуальный идентификатор видео. В PDF-файле каждого объединенного эксперимента перечислены включенные файлы .nano для этого анализа. - Щелкните Обработать выбранные файлы , чтобы запустить анализ.
- Как только поле Процесс начнет мигать, чтобы разрешить изменения порогового значения обнаружения, установите пороговое значение на требуемый уровень и нажмите кнопку ОК.
- Дождитесь автоматической обработки видео и отображения гистограммы результатов и уведомления о завершении в диалоговом окне, прежде чем нажимать кнопку ОК.
- Нажмите кнопку Экспорт результатов. Обязательно щелкните поле Экспорт результатов в текущем эксперименте, так как всплывающее окно Экспорт результатов не будет отображаться после повторного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку нет никаких напоминаний об этом, это может быть легко упущено из виду, и анализ будет потерян.
13. Очистка и демонтаж лазерного модуля
- Выключите лазерный блок управления.
- Смывайте весь образец с лазерного модуля и выбрасывайте его должным образом.
- Удерживайте лазерный модуль наклоненным с открытым портом шприца, чтобы воздух мог выдуваться из камеры, когда DPBS медленно впрыскивается в лазерный модуль и смывается из выходного отверстия шприца.
- Смойте оставшиеся DPBS из лазерного модуля и выбросьте.
- Повторите промывку еще 2 раза и опорожните лазерный модуль как можно полнее после последнего смыва.
- При равномерном давлении на крышку проточной ячейки равномерно ослабьте винты большого пальца попеременно по диагонали до тех пор, пока они не отсоединятся от резьбы, удалите винты большого пальца и храните в корпусе лазерного модуля.
- Снимите крышку проточной ячейки с лазерного модуля.
- Аккуратно очистите обе стеклянные поверхности с помощью высококачественного очистителя линз и бумаги для линз. Не используйте папиросную бумагу или бумажные полотенца на стеклянных поверхностях.
- Визуально осмотрите лазерный модуль и проточную ячейку крышки «окон» на наличие царапин или дефектов после использования и сообщите об этом руководителю.
- Замените лазерный модуль и крышку проточной ячейки в их корпусах, чтобы предотвратить повреждение стеклянных поверхностей при хранении.
14. Протокол анализа образцов
- Нефильтрованные образцы
- Вращайте образец перед загрузкой и записывайте видео 5 x 60 с на уровне камеры 12 и пороге обнаружения 3, как описано выше. Повторно проанализируйте эти видео, используя пороговые значения обнаружения 2 и 5.
- Повторите видеоколлекции одного и того же образца на уровнях камеры 13 и 14 и пороговом уровне обнаружения 3. Повторно проанализируйте эти 2 дополнительных видео, используя пороговые значения обнаружения 2 и 5. Повторите весь процесс, используя видео 5 x 30 с в настройках SOP .
- Отфильтрованные образцы
- Вращайте образец, а затем одновременно загружайте и фильтруйте его (шприцевой фильтр 0,22 мкм) непосредственно в лазерный модуль.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием шприцевого фильтра промывали в 2 раза большим объемом мертвого пространства фильтра для удаления любых резидентных частиц. Шприцевые фильтры (см. Таблицу материалов) имели измеренное мертвое пространство 0,5 мл и промывались 1,0 мл образца до начала измерений. Запишите тип фильтра в полях данных SOP . Отфильтрованный образец обрабатывали в точности так, как описано для нефильтрованных образцов на этапе 14.1.
- Вращайте образец, а затем одновременно загружайте и фильтруйте его (шприцевой фильтр 0,22 мкм) непосредственно в лазерный модуль.
15. Статистический анализ результатов НТА
- Для анализа основных эффектов или взаимодействий выполните анализ дисперсии после проверки допущений ANOVA (нормальность, унимодальность, однородность дисперсии). Используйте одностороннюю ANOVA Крускала-Уоллиса на рангах в случаях провала предположений ANOVA.
- После возвращения значительных основных эффектов используйте метод Данна для выполнения тестирования средств для заранее запланированных сравнений. Считайте, что p-значение 0,05 является значительным в двуххвостом тестировании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы данных, созданные здесь, доступны от авторов после завершения соглашения о передаче материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Таблица 1 содержит результаты видео NTA для образцов липосом (18 отфильтрованных и 18 нефильтрованных) и репрезентативного разбавителя DPBS. Сравнения по двум группам были завершены независимо от уровня камеры или порога обнаружения в этой статье. Отфильтрованные образцы имели средний диаметр частиц 108,5 нм, режим частиц 86,2 нм и концентрацию 7,4 × 108 частиц/мл. Напротив, нефильтрованные образцы имели средний диаметр частиц 159,1 нм, режим частиц 105,7 нм и концентрацию 7,6 × 108 частиц/мл. Средние и режимные значения для отфильтрованных и нефильтрованных образцов, независимо от уровня камеры или порога обнаружения, были статистически значимыми (p < 0,05). Различия в концентрации между отфильтрованными и нефильтрованными образцами, независимо от уровня камеры или порога обнаружения, были незначительными (p = 0,86).
| Сравнение отфильтрованных и нефильтрованных образцов | ||||||||||||
| Образец | Кэм Лев | Det Thr | Значить | Среднее %CV | Св. | × 108 | Сент-Дев × 107 | |||||
| Отфильтрованный | Нефильтрованное | Отфильтрованный | Нефильтрованное | Отфильтрованный | Нефильтрованное | Отфильтрованный | Нефильтрованное | Отфильтрованный | Нефильтрованное | |||
| Липосома | 12 | 3 | 138.3 | 162.1 | 55.5 | 47.5 | 76.7 | 77 | 3.2 | 6.48 | 1.74 | 3.16 |
| Липосома | 12 | 2 | 126.3 | 153.7 | 58.7 | 49.8 | 74.2 | 76.5 | 4.94 | 8.23 | 2.74 | 3.5 |
| Липосома | 12 | 5 | 155 | 172.2 | 51.8 | 45.6 | 80.3 | 78.6 | 1.91 | 5.05 | 1.02 | 2.9 |
| Липосома | 13 | 3 | 102.7 | 169 | 43.5 | 51.3 | 44.7 | 86.7 | 6.72 | 7.75 | 1.91 | 1.17 |
| Липосома | 13 | 2 | 95.8 | 161.4 | 43.3 | 52.7 | 41.5 | 85 | 10.3 | 9.7 | 1.61 | 1.83 |
| Липосома | 13 | 5 | 110.7 | 176.1 | 42.5 | 47.1 | 47 | 83 | 4.16 | 6.28 | 1.83 | 1.07 |
| Липосома | 14 | 3 | 98 | 147.6 | 42.4 | 43.8 | 41.6 | 64.6 | 10.6 | 8.56 | 2.4 | 1.66 |
| Липосома | 14 | 2 | 92.9 | 142.1 | 42.6 | 45.2 | 39.6 | 64.3 | 14.9 | 10.7 | 2.54 | 1.83 |
| Липосома | 14 | 5 | 103.8 | 153.8 | 41.1 | 42.6 | 42.7 | 65.5 | 7.42 | 7.02 | 2.37 | 1.51 |
| Липосома | 12 | 3 | 105.6 | 179.4 | 22.2 | 46.7 | 23.4 | 83.7 | 5.2 | 5.81 | 1.06 | 4.28 |
| Липосома | 12 | 2 | 100.3 | 170.8 | 24.3 | 49.1 | 24.4 | 83.8 | 7.76 | 7.39 | 1.61 | 4.41 |
| Липосома | 12 | 5 | 112 | 187.2 | 20.4 | 42.9 | 22.8 | 80.4 | 3.27 | 4.68 | 0.815 | 3.93 |
| Липосома | 13 | 3 | 99.8 | 153.3 | 23.4 | 52.1 | 23.4 | 79.8 | 7.19 | 7.34 | 3.37 | 1.5 |
| Липосома | 13 | 2 | 94.3 | 143.6 | 25.8 | 53.2 | 24.3 | 76.4 | 10.8 | 9.53 | 4.3 | 2.46 |
| Липосома | 13 | 5 | 106.8 | 162 | 21.3 | 49.4 | 22.7 | 80 | 4.64 | 5.76 | 2.63 | 1.01 |
| Липосома | 14 | 3 | 103.4 | 142.3 | 31.7 | 49.6 | 32.8 | 70.6 | 9.91 | 8.66 | 3.29 | 12.5 |
| Липосома | 14 | 2 | 97.8 | 136 | 33.3 | 51.4 | 32.6 | 69.9 | 13.8 | 11.5 | 2.98 | 15.7 |
| Липосома | 14 | 5 | 109.5 | 151.4 | 31.1 | 49.5 | 34 | 74.9 | 7.27 | 6.76 | 3.42 | 10.1 |
| Средний | 108.5 | 159.1 | 36.4 | 48.3 | 40.5 | 76.7 | 7.4 | 7.6 | 2.3 | 4.1 | ||
Таблица 1: Таблица данных собранных значений, стандартного отклонения и процентного коэффициента отклонения для отфильтрованных и нефильтрованных образцов. Сокращения: Cam Lev = уровень камеры; Det Thr = порог обнаружения; CV = коэффициент вариации; St. Dev. = стандартное отклонение; Conc. = концентрация.
Когда результаты выборки липосом анализировались по порогу обнаружения (2, 3, 5) и уровню камеры (12, 13, 14), результаты не были значимыми (рисунок 3). Следует отметить, что на каждом из этих индивидуальных уровней было проведено всего 3 оценки (n = 3). Этот небольшой размер выборки на каждом уровне камеры и порог обнаружения, вероятно, способствовали отсутствию значимых индивидуальных сравнений. Однако, когда порог обнаружения (2, 3, 5) образцов оценивали независимо от уровня камеры в отфильтрованных и нефильтрованных образцах (n = 3), как средний размер (рисунок 3A), так и размер режима (рисунок 3B) были значительно различены (p < 0,05). Напротив, различия между отфильтрованными и нефильтрованными концентрациями проб (рисунок 3С) существенно не отличались.
Рисунок 3: Влияние уровня камеры и порога обнаружения на измеренный размер частиц и концентрацию отфильтрованных и нефильтрованных образцов. Средний (A) и режим (B) размер частиц на комбинированных уровнях камеры 12, 13, 14 по мере увеличения порога обнаружения был увеличен с 2 до 3 до 5 (n = 3), что свидетельствует о значительном уменьшении размеров частиц отфильтрованных образцов. Концентрации частиц (C) на комбинированных уровнях камеры 12, 13, 14 по мере увеличения порога обнаружения с 2 до 3 до 5) (n = 3), что свидетельствует о снижении концентрации по мере увеличения порога обнаружения без существенной разницы между отфильтрованными и нефильтрованными образцами. Средний (D) и размер частиц режима (E) при комбинированных порогах обнаружения, когда уровень камеры увеличился с 12 до 14 (n = 3), что свидетельствует об уменьшении размера частиц отфильтрованных образцов. Концентрации частиц (F) при комбинированных пороговых значениях обнаружения при повышении уровней камеры с 12 до 14 (n = 3), что свидетельствует о повышении концентрации по мере увеличения уровня камеры без существенных различий между отфильтрованными и нефильтрованными образцами. Аббревиатура: DT = порог обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Когда оценивались 3 уровня камеры (12, 13, 14) независимо от порогового уровня обнаружения (n = 3), как средний размер (рисунок 3D), так и размер режима (рисунок 3E) увеличивались в отфильтрованных образцах. Концентрации образцов показали тенденцию к увеличению по мере увеличения уровня камеры с 12 до 14 (рисунок 3F). Различия между отфильтрованными и нефильтрованными концентрациями образцов, оцененными на разных уровнях камеры, существенно не отличались.
Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существует несколько методов оценки размера и концентрации наночастиц11. К ним относятся ансамблевые методы, которые генерируют оценку размера популяции, включая динамическое рассеяние света (DLS), центробежное осаждение и анализ на уровне одной частицы - электронную микроскопию, NTA, атомно-силовую микроскопию и перестраиваемое резистивное импульсное зондирование. Из них широко используются DLS и NTA, неразрушающие методы измерения размеров и концентрации, основанные на броуновском движении в идеальной среде. DLS полагается на рассеяние света, а интенсивность пропорциональна квадрату объема частицы. Таким образом, DLS более чувствителен, чем NTA, к присутствию крупных частиц, агрегатов или полидисперсных популяций.
NTA вычисляет коэффициент диффузии из длины пути отдельных частиц, измеренной в последовательных видеокадровах. Основным ограничением NTA является узкий диапазон концентрации частиц, который он может оценить по сравнению с DLS и другими методами измерения, так что отдельные длины пути частиц должны попадать в дифракционный предел микроскопа и возможности программного обеспечения для отслеживания. Поскольку DLS и NTA зависят от броуновского движения, можно ожидать, что оба они продемонстрируют хорошее согласие по размеру в монодисперсных популяциях; они расходятся при оценке полидисперсных популяций и популяций с агрегатами. Последнее делает DLS бесполезным и значительно увеличивает оценку размера частиц NTAна 12. Наиболее известным ограничением NTA является то, что он требует гораздо более низкой концентрации частиц (или большего разбавления), чем другие методы измерения. Несмотря на это, характеристика NTA популярна в исследованиях наноматериалов. Поскольку оценки размера и концентрации NTA зависят от более разбавленной популяции, с определенной температурой, настройками видеозахвата, включая длину записи, уровень камеры, порог обнаружения и разбавление образцов, чтобы быть высоко воспроизводимыми, в этой статье основное внимание уделяется необходимости их представления для получения воспроизводимых результатов.
В этой статье показано, что использование стандартизированного протокола позволяет воспроизводить результаты и что использование положительных элементов управления, таких как стандарты размеров, предоставляет информацию о калибровке машины. Кроме того, эти результаты показали важность отчетности о температуре камеры лазерного модуля, уровнях камеры, пороге обнаружения и фильтрации (тип и размер фильтра). Напротив, температура камеры лазерного модуля, разбавитель и коэффициент разбавления одинаково важны для точных и воспроизводимых результатов. Хотя ни MISEV2018, ни EV-TRACK специально не рекомендуют включать эту информацию, мы предполагаем, что включение этих деталей позволяет независимо подтвердить опубликованные результаты и добавить надежность экспериментальному дизайну.
Признаны ограничения использования калибровочных стандартов размеров латекса для калибровки NTA в анализе электромобилей и включают известные различия в показателях преломления по сравнению с липидными двухслойными наночастицами аналогичного размера. В этой статье латексные шарики использовались для подтверждения калибровки машины до измерений, а не для определения пределов обнаружения. Липосомы имеют мембрану, аналогичную мембранам естественных EV, и показатель преломления также будет репрезентативным для EV. Стандарты размеров, а также образцы липосом представляют собой монодисперсные популяции; следовательно, их распределение размеров будет следовать гауссовскому или логарифмическому нормальному распределению. Природные электромобили являются полидисперсными, и их распределение по размерам будет следовать функциистепенного закона 13.
Исторически сложилось так, что публикации, использующие характеристику NTA, непоследовательно сообщают необходимые детали для дублирования результатов исследования. Возможность воспроизведения данных NTA зависит от возможности дублирования настроек, используемых для захвата исходных данных. Без этой информации воспроизведение экспериментальных результатов с использованием НТА будет крайне затруднительным. При строгом соблюдении установленного протокола и публикации параметров настройки, используемых с NTA, может быть достигнуто точное воспроизведение результатов. Следующие рекомендации сделаны для улучшения согласованности характеристик наночастиц размера, концентрации, состава и чистоты с использованием анализатора размера наночастиц.
Во-первых, всегда проверяйте калибровку анализатора размера наночастиц, используя соответствующие стандарты размера, такие как стандарты размера латекса. Это должно делаться на регулярной основе и регистрироваться в журнале приборов и до анализа критических образцов. Во-вторых, все регулируемые параметры, такие как температура камеры лазерного модуля, уровни камеры и пороговые значения обнаружения, должны регистрироваться для каждого образца в файле журнала образцов , как и используемые разбавители и разбавители. Эти параметры должны сообщаться, поскольку они зависят от оператора и влияют на измерения NTA. В-третьих, разбавители, используемые для разбавления проб, должны быть охарактеризованы по содержанию наночастиц и сообщены. Разбавители, используемые для отдельных образцов наночастиц, необходимо будет оценивать с использованием тех же настроек уровня камеры и порога обнаружения, что и для разбавленного образца. В-четвертых, шприцевые фильтры должны быть промыты в два раза большим объемом мертвого пространства перед сбором данных или этапами подготовки образцов для промывки многочисленных частиц, оставшихся от производственного процесса. В-пятых, концентрация наночастиц в образце должна быть скорректирована до рекомендуемого оптимального 1,0 × 107 до 1,0 × 109 на мл.
Признавая вышеописанные ограничения в этом исследовании, мы показываем, что как на размер, так и на значения концентрации, полученные NTA, могут влиять параметры NTA, такие как уровни камеры и пороги обнаружения, и что на размер, но не концентрацию, может влиять подготовка образца. Это подчеркивает критическую важность представления этих параметров в литературе по наноматериалам и электромобилям, что позволяет создавать надежную, воспроизводимую литературу, чтобы мы могли систематически исследовать влияние источника EV, изоляции и других экспериментальных переменных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного из авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Работа была поддержана штатом Канзас для Института сравнительной биологии стволовых клеток Среднего Запада (MICSCB), Центром исследований рака Джонсона для MLW и NIH R21AG066488 для LKC. МЖС получил поддержку ГРА от МГМСКБ. Авторы благодарят доктора Сантоша Ариала за предоставление липосом, используемых в этом проекте, и членов лабораторий Вайса и Кристенсона за полезные беседы и обратную связь. Д-р Хонг Хэ благодарит за техническую поддержку. MLW благодарит Бетти Горен Вайс за ее поддержку и советы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
References
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
- Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
- Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
- Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
- vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
