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Bioengineering

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण में बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं 2018 दिशानिर्देशों के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी को पूरा करने के लिए पुनरुत्पादन में सुधार

Published: November 17, 2021 doi: 10.3791/63059
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Anatomy and Physiology, Kansas State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Kansas Medical Center

Summary

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है जो बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को चिह्नित करता है। यह पेपर एनटीए प्रयोगात्मक मापदंडों और नियंत्रणों के साथ-साथ प्रयोगशालाओं के बीच पुनरुत्पादन के लिए MISEV2018 और EV-TRACK द्वारा प्रस्तावित दिशानिर्देशों के पूरक के लिए आवश्यक नमूनों और डिलुएंट्स के विश्लेषण और लक्षण वर्णन की एक समान विधि पर प्रकाश डालता है।

Abstract

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) 2006 के बाद से extracellular vesicle (EV) अनुसंधान के लिए उपयोग किए जाने वाले कई लक्षण वर्णन विधियों में से एक रहा है। कई लोग मानते हैं कि एनटीए उपकरणों और उनके सॉफ़्टवेयर पैकेजों को न्यूनतम प्रशिक्षण के बाद आसानी से उपयोग किया जा सकता है और यह आकार अंशांकन इन-हाउस संभव है। जैसा कि एनटीए अधिग्रहण और सॉफ्टवेयर विश्लेषण दोनों ईवी लक्षण वर्णन का गठन करते हैं, उन्हें बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी 2018 (MISEV2018) में संबोधित किया जाता है। इसके अलावा, उन्हें पारदर्शी रिपोर्टिंग और बाह्य कोशिकीय पुटिका अनुसंधान (ईवी-ट्रैक) में ज्ञान को केंद्रीकृत करने द्वारा निगरानी की गई है ताकि ईवी प्रयोगों की मजबूती में सुधार किया जा सके (उदाहरण के लिए, अनियंत्रित कारकों के कारण प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करें)।

विधियों और नियंत्रणों की रिपोर्टिंग को प्रोत्साहित करने के प्रयासों के बावजूद, कई प्रकाशित शोध पत्र मूल एनटीए टिप्पणियों को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण सेटिंग्स की रिपोर्ट करने में विफल रहते हैं। कुछ कागजात नकारात्मक नियंत्रण या डिलुएंट्स के एनटीए लक्षण वर्णन की रिपोर्ट करते हैं, स्पष्ट रूप से यह मानते हुए कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद, जैसे कि फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा या अल्ट्राप्योर आसुत पानी, कण-मुक्त हैं। इसी तरह, सकारात्मक नियंत्रण या आकार मानकों को शायद ही कभी शोधकर्ताओं द्वारा कण आकार को सत्यापित करने के लिए रिपोर्ट किया जाता है। स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण में कण विस्थापन को निर्धारित करने के लिए नमूना चिपचिपाहट और तापमान चर शामिल हैं। पूरे नमूना वीडियो संग्रह के दौरान स्थिर लेजर कक्ष तापमान की रिपोर्टिंग, इसलिए, सटीक प्रतिकृति के लिए एक आवश्यक नियंत्रण उपाय है। नमूनों या डिलुएंट्स के निस्पंदन को भी नियमित रूप से रिपोर्ट नहीं किया जाता है, और यदि हां, तो फ़िल्टर की बारीकियों (निर्माता, झिल्ली सामग्री, छिद्र आकार) और भंडारण की स्थिति शायद ही कभी शामिल होती है। इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ISEV) के स्वीकार्य प्रयोगात्मक विवरण के न्यूनतम मानकों में ईवी के लक्षण वर्णन के लिए एक अच्छी तरह से प्रलेखित एनटीए प्रोटोकॉल शामिल होना चाहिए। निम्नलिखित प्रयोग इस बात का सबूत प्रदान करता है कि एक एनटीए विश्लेषण प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत शोधकर्ता द्वारा स्थापित करने की आवश्यकता है और प्रकाशनों के तरीकों में शामिल किया जाना चाहिए जो एकल पुटिका लक्षण वर्णन के लिए MISEV2018 आवश्यकताओं को पूरा करने के विकल्पों में से एक के रूप में एनटीए लक्षण वर्णन का उपयोग करते हैं।

Introduction

ईवी और अन्य नैनोमीटर-स्केल किए गए कणों का सटीक और दोहराने योग्य विश्लेषण अनुसंधान और उद्योग में कई चुनौतियों को प्रस्तुत करता है। ईवी अनुसंधान की प्रतिकृति मुश्किल रही है, भाग में, डेटा संग्रह से जुड़े आवश्यक मापदंडों की रिपोर्टिंग में एकरूपता की कमी के कारण। इन कमियों को दूर करने के लिए, ISEV ने ईवी शोधकर्ताओं के लिए जैव रासायनिक, बायोफिजिकल और कार्यात्मक मानकों के न्यूनतम सेट के रूप में उद्योग दिशानिर्देशों का प्रस्ताव दिया और उन्हें एक स्थिति बयान के रूप में प्रकाशित किया, जिसे आमतौर पर MISEV20141 के रूप में जाना जाता है। ईवी अनुसंधान की तेज गति के लिए एक अद्यतन दिशानिर्देश की आवश्यकता थी, और "MISEV2018: ISEV का एक स्थिति कथन" ने MISEV2014 दिशानिर्देशों2 का विस्तार किया। MISEV2018 पेपर में टेबल, सुझाए गए प्रोटोकॉल की रूपरेखा, और विशिष्ट ईवी-संबद्ध लक्षण वर्णन को दस्तावेज़ करने के लिए पालन करने के लिए चरण शामिल थे। प्रयोगों की व्याख्या और प्रतिकृति को सुविधाजनक बनाने के लिए एक और उपाय के रूप में, EV-TRACK को एक भीड़-सोर्सिंग नॉलेजबेस (http://evtrack.org) के रूप में विकसित किया गया था ताकि EV जीव विज्ञान की अधिक पारदर्शी रिपोर्टिंग और प्रकाशितपरिणामों के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को सक्षम किया जा सके। विधियों की मानकीकृत रिपोर्टिंग के लिए इन सिफारिशों के बावजूद, फ़ील्ड प्रकाशित परिणामों की प्रतिकृति और पुष्टि करने के बारे में पीड़ित है।

गुणवत्ता मूल्यांकन उपकरणों के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्रयास के साथ फिटिंग, इस पेपर से पता चलता है कि ISEV को तरीकों और विवरणों की मानकीकृत रिपोर्टिंग की आवश्यकता होती है ताकि प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की प्रतिकृति के लक्ष्य के साथ डेटा मूल्यांकन उपकरण लागू किए जा सकें। ईवी आबादी के गुणों को परिभाषित करने के लिए सेल स्रोतों, सेल संस्कृति प्रक्रियाओं और ईवी अलगाव विधियों की रिपोर्टिंग महत्वपूर्ण कारक हैं। एनटीए उपकरणों के बीच, पता लगाने की सेटिंग्स, वाहक तरल पदार्थ का अपवर्तक सूचकांक, पॉलीडिस्पर्सिटी में योगदान देने वाली विषम कण आबादी, मानकीकृत रिपोर्टिंग आवश्यकताओं की कमी, और अनुपस्थित इंट्रा- और इंटर-ऑब्जर्वर माप परिणामों जैसे कारकों ने प्रयोगशालाओं के बीच एनटीए की तुलना को मुश्किल या असंभव बना दिया है।

2006 के बाद से उपयोग में, एनटीए नैनोपार्टिकल आकार और एकाग्रता निर्धारण के लिए एक लोकप्रिय विधि है जो वर्तमान में लगभग 80% ईवीशोधकर्ताओं द्वारा उपयोग की जाती है। MISEV2018 दिशानिर्देशों के लिए एकल-पुटिका विश्लेषण के दो रूपों की आवश्यकता होती है, जिनमें से एनटीए लोकप्रिय विकल्पों में से एक है। एनटीए अपनी व्यापक पहुंच, प्रति नमूना कम लागत, और इसके सीधे संस्थापक सिद्धांत (स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण) के कारण ईवी लक्षण वर्णन के लिए आम उपयोग में बना हुआ है। एनटीए द्वारा ईवी मूल्यांकन लेजर प्रकाश प्रकीर्णन और ब्राउनियन गति विश्लेषण का उपयोग करके एक कण आकार वितरण और एकाग्रता अनुमान उत्पन्न करता है, जिसमें ईवी के अपवर्तक सूचकांक द्वारा निर्धारित पहचान की निचली सीमा होती है। ज्ञात चिपचिपाहट और तापमान के तरल पदार्थ के नमूने का उपयोग करते समय, ईवी के प्रक्षेपवक्रों को दो आयामों में उनके माध्य-वर्ग विस्थापन को निर्धारित करने के लिए ट्रैक किया जाता है। यह कण प्रसार गुणांक की गणना करने और एक संशोधित स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण 5,6,7 द्वारा एक गोले-समतुल्य हाइड्रोडायनामिक व्यास में परिवर्तित करने की अनुमति देता है। एनटीए के कण-से-कण विश्लेषण में लक्षण वर्णन के अन्य तरीकों की तुलना में ईवी की विषम आबादी में agglomerates या बड़े कणों द्वारा कम हस्तक्षेपहोता है। जबकि कुछ बड़े कणों का आकार सटीकता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है, बड़े, उच्च प्रकाश-प्रकीर्णन कणों की भी मिनट की मात्रा की उपस्थिति के परिणामस्वरूप कम सॉफ़्टवेयर ईवी का पता लगाने और ट्रैकिंग 8 के कारण छोटे कणों का पता लगाने में उल्लेखनीय कमी आतीहै। एक माप तकनीक के रूप में, एनटीए को आम तौर पर बड़े कणों या कणों के समुच्चय की ओर पक्षपाती नहीं माना जाता है, लेकिन व्यक्तिगत कण विश्लेषण9 के माध्यम से कई आकार की आबादी को हल कर सकता है। कणों द्वारा प्रकाश-प्रकीर्णन के उपयोग के कारण, एनटीए विश्लेषण की सीमाओं में से एक यह है कि ईवी की तुलना में समान अपवर्तन और आकार विशेषताओं के साथ धूल, प्लास्टिक या पाउडर जैसे किसी भी कण को लक्षण वर्णन की इस विधि द्वारा वास्तविक ईवी से अलग नहीं किया जा सकता है।

NanoSight LM10 (nanoparticle आकार विश्लेषक) और LM14 (लेजर मॉड्यूल) 2006 के बाद से बेचा गया है, और हालांकि इस उपकरण के नए मॉडल विकसित किए गए हैं, यह विशेष मॉडल कई मुख्य सुविधाओं में पाया जाता है और इसे एक विश्वसनीय वर्कहॉर्स माना जाता है। आकार और एकाग्रता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन माप के लिए एनटीए सेटिंग्स को ठीक से अनुकूलित करने के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इष्टतम वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक दो महत्वपूर्ण सेटिंग्स (1) कैमरा स्तर और (2) पहचान सीमा हैं। इन्हें नमूने की विशेषताओं के आधार पर ऑपरेटर द्वारा सेट किया जाना चाहिए। एनटीए विश्लेषण की प्रमुख बाधाओं में से एक 107 और 109 कणों / एमएल के बीच नमूना सांद्रता की सिफारिश है, इस नमूने को प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकतीहै। कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान, जैसे कि फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा, 0.15 एम खारा, या अल्ट्राप्योर पानी, शायद ही कभी आकार में 220 μm से कम कणों से मुक्त होते हैं, जो एनटीए माप को प्रभावित कर सकते हैं। कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों के एनटीए लक्षण वर्णन को उसी कैमरा स्तर पर किया जाना चाहिए और नैनोपार्टिकल नमूनों के रूप में पता लगाने की सीमा का विश्लेषण किया जाना चाहिए। ईवी नमूना कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिलुएंट्स में मौजूद नैनोकणों के आकार और एकाग्रता को शायद ही कभी ईवी के एनटीए विश्लेषण से जुड़े प्रकाशनों में शामिल किया जाता है।

यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक ईवी-जैसे लिपोसोम के एनटीए विश्लेषण का उपयोग करता है, जिसका मूल्यांकन चयनित कैमरा स्तरों, डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड और नमूनों के यांत्रिक फ़िल्टरिंग का उपयोग करके किया जाता है ताकि एनटीए डेटासेट पर कैमरा स्तर, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड या नमूना निस्पंदन के व्यवस्थित प्रभावों का विश्लेषण किया जा सके। Liposomes के रूप में पूरक फ़ाइल S1 में वर्णित संश्लेषित किए गए थे. सिंथेटिक लिपोसोम का उपयोग इस प्रयोग में उनके आकार की एकरूपता, भौतिक विशेषताओं और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण में स्थिरता के कारण किया गया था। यद्यपि ईवी के वास्तविक नमूनों का उपयोग किया जा सकता था, भंडारण के दौरान ईवी की विषमता और स्थिरता ने इस अध्ययन और इसकी व्याख्या को जटिल बना दिया हो सकता है। (ए) लिपोसोम और (बी) ईवी से एनटीए रिपोर्टों में समानताएं इंगित करती हैं कि इस पेपर में लिपोसोम के लिए प्रकट किए गए व्यवस्थित प्रभाव संभवतः ईवी लक्षण वर्णन (चित्रा 1) पर भी लागू होंगे। साथ में, ये निष्कर्ष इस धारणा का समर्थन करते हैं कि महत्वपूर्ण सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स की पूरी रिपोर्टिंग और नमूना प्रसंस्करण का विवरण, जैसे कि डिल्यूएंट, कमजोर पड़ने और निस्पंदन, एनटीए डेटा की पुनरुत्पादकता को प्रभावित करते हैं।

इस पेपर का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि एनटीए सेटिंग्स (तापमान, कैमरा स्तर, और पता लगाने की सीमा) और नमूना तैयारी में बदलाव के परिणामों को बदलना है: आकार और एकाग्रता में व्यवस्थित, महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त किए गए थे। जैसा कि एनटीए MISEV2018 लक्षण वर्णन विनिर्देश को पूरा करने के लिए लोकप्रिय विकल्पों में से एक है, ये परिणाम पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए नमूना तैयारी और एनटीए सेटिंग्स की रिपोर्टिंग के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिनिधि एनटीए रिपोर्ट करने के लिए लिपोसोम की तुलना करने के लिए EVs. (ए) लिपोसोम्स: 12 मार्च 2020 को एनटीए पर अनफ़िल्टर्ड नमूना की विशेषता है। (बी) ईवी: 26 अगस्त 2021 को एनटीए पर अनफ़िल्टर्ड नमूना विशेषता है। संक्षेप: NTA = Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण; EVs = extracellular vesicles. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Protocol

1. सामान्य प्रोटोकॉल दिशानिर्देश

  1. एक हवा की मेज पर या एक कंपन मुक्त मेज पर एक न्यूनतम पर माइक्रोस्कोप बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि बाहरी कंपन (उदाहरण के लिए, फर्श पर पैर दोहन, मेज को छूना, दरवाजा बंद करना, प्रयोगशाला यातायात) को कम से कम रखा जाता है।
  2. सेट करें और सभी वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए एक स्थिर तापमान पर लेजर मॉड्यूल के तापमान को बनाए रखने।
    नोट: चुना गया तापमान 25 डिग्री सेल्सियस था क्योंकि नैनोपार्टिकल आकार विश्लेषक उस तापमान पर कैलिब्रेट किया गया था। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि उपकरण के सभी उपयोगकर्ता कैलिब्रेटेड तापमान को जानते हैं और उपयोग करते हैं। कमरे का तापमान एक स्वीकार्य सेटिंग नहीं है क्योंकि यह अलग-अलग हो सकता है।
  3. सुनिश्चित करें कि सभी diluents, भी नकारात्मक नियंत्रण कहा जाता है (उदाहरण के लिए, Dulbecco के फॉस्फेट-buffered खारा (DPBS), ultrapure आसुत पानी [DW]), सभी NTA-नैनोपार्टिकल नमूनों को मापा जा रहा है के रूप में एक ही कैमरा स्तर और पता लगाने की दहलीज का उपयोग कर विशेषता कर रहे हैं। लेजर मॉड्यूल की निस्तब्धता और नमूनों के कमजोर पड़ने के लिए विशेषता DPBS का उपयोग करें। नकारात्मक नियंत्रण DPBS में कारक contaminants नमूना परिणामों में यदि उनके स्तर महत्वपूर्ण हैं.
  4. मूल्यांकन से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें और उन्हें कभी फ्रीज न करें क्योंकि यह लिपोसोम नमूने को नीचा दिखाएगा। विश्लेषण से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए गर्म नमूने / मानक / डिलुएंट्स।
    नोट:: नमूना हैंडलिंग सामग्री की जांच की जा रही के लिए विशिष्ट था।
  5. एनटीए विश्लेषण के लिए इष्टतम होने के लिए निर्धारित 107 से 109 कणों / एमएल (लगभग 50 से 100 कणों / एनटीए वीडियो स्क्रीन) को प्राप्त करने के लिए एक उपयुक्त कमजोर पड़ने की स्थापना करने के लिए त्वरित माप का उपयोग करके नमूना और मानकों का मूल्यांकन करें।
    नोट: लेखकों ने पाया है कि इस सीमा के उच्च अंत में कण सांद्रता अधिक सुसंगत और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करती है।
  6. त्वरित और मानक माप दोनों के लिए एसओपी टैब के कैप्चर बॉक्स में सभी लागू फ़ील्ड भरें, जिसमें कमजोर पड़ने और उपयोग किए गए डिलुएंट शामिल हैं।

2. 50 एनएम और 100 एनएम आकार अंशांकन मानकों की तैयारी

नोट: सामग्री की तालिका देखें।

  1. 50 एनएम आकार स्थानांतरण मानक पतला 1:5,000
    1. 50 nm मानकों के 2 μL को 9,998 μL 0.22 μm-फ़िल्टर किए गए 10 mM पोटेशियम क्लोराइड (KCl)/0.03% Tween 20 में अल्ट्राप्योर DW में दो बार कुल्ला 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। पतला 50 एनएम मानक को एक वर्ष तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. 100 एनएम आकार स्थानांतरण मानक पतला 1:333
    1. 9,970 μL के लिए 9,970 μL करने के लिए 100 nm मानकों के 30 μL जोड़ें 0.22 μm-फ़िल्टर 10 mM KCl / पतला 100 एनएम मानक को एक वर्ष तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. सफाई और लेजर मॉड्यूल की विधानसभा

  1. नेत्रहीन खरोंच या खामियों के लिए लेजर मॉड्यूल और प्रवाह सेल कवर खिड़कियों का निरीक्षण करें।
    नोट: यदि या तो कांच की सतह खरोंच है, तो इमेजिंग प्रभावित हो सकता है।
  2. एक अच्छी गुणवत्ता वाले लेंस क्लीनर और लेंस पेपर के साथ दोनों कांच की सतहों को धीरे से साफ करें। कांच की सतहों पर टिश्यू वाइप्स या पेपर टॉवल का उपयोग न करें।
  3. सुनिश्चित करें कि ओ-रिंग सील असेंबली से पहले प्रवाह-सेल कवर के नाली में ठीक से बैठी है।
  4. लेजर मॉड्यूल पर प्रवाह-सेल कवर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि विद्युत संपर्क उचित अभिविन्यास में हैं। प्रवाह-सेल प्लेट के माध्यम से 4 वसंत-भारित थंबस्क्रू रखें और लेजर मॉड्यूल के धागे को संलग्न करें लेकिन व्यक्तिगत रूप से कस न करें।
  5. प्रवाह-सेल कवर पर समान दबाव डालते हुए, समान रूप से अंगूठे को एक वैकल्पिक विकर्ण तरीके से स्नग तक कसते हैं। केवल अंगूठे को उंगली-तंग होने तक कसें। overtighten मत करो।
    नोट: थंबस्क्रू के असमान कसने लेजर मॉड्यूल सतह दरार कर सकते हैं. नए डिजाइन किए गए थंबस्क्रू उचित दबाव पर "नीचे बाहर" होंगे, संभावित ओवरटाइटनिंग से बचेंगे।

4. से पहले और नमूनों के बीच लेजर मॉड्यूल के लिए फ्लशिंग प्रक्रिया

  1. DPBS और एलीकोट के एक नए खुले कंटेनर का उपयोग ट्रिपल-कुल्ला 15 mL पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में करें। सुनिश्चित करें कि नमूनों को फ्लश या पतला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले उत्पादों को उपयोग करने से पहले NTA-विशेषता है (चरण 1.3 देखें)।
  2. किसी भी कण अवशेष को हटाने के लिए डीपीबीएस के 1 एमएल के साथ 3 बार स्लिप लॉक एडाप्टर के साथ दो 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज फ्लश करें। इनपुट के रूप में या तो पोर्ट का उपयोग करें लेकिन प्रयोग के दौरान लगातार इसका उपयोग करें। सिरिंज के बढ़े हुए वजन और आकार से सिरिंज बंदरगाहों को तोड़ने के खतरे के कारण बड़े सिरिंज का उपयोग न करें।
  3. निकालें और 1st tuberculin सिरिंज से प्लंजर को त्याग दें और इसे शेष बंदरगाह में डालने के लिए एक voided diluent / नमूना जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए।
    नोट:: प्लंजर को निकालने में विफलता नमूना कक्ष में बढ़े हुए दबाव और सील के चारों ओर रिसाव का कारण बनेगी।
  4. DPBS के 1 mL के साथ 2nd सिरिंज भरें और इसे प्रवाह-सेल कवर के इनलेट पोर्ट से संलग्न करें।
  5. आउटलेट सिरिंज पोर्ट के साथ झुका हुआ लेजर मॉड्यूल पकड़ो हवा को कक्ष से शुद्ध करने की अनुमति देने के लिए ऊंचा क्योंकि DPBS को लेजर मॉड्यूल में धीरे-धीरे इंजेक्ट किया जाता है।
  6. इनलेट पोर्ट में 1 मिलीलीटर हवा इंजेक्ट करके लेजर मॉड्यूल से शेष DPBS फ्लश करें। फ्लशिंग को 2 बार और दोहराएं।
  7. पिछले फ्लश के बाद लेजर मॉड्यूल को पूरी तरह से जितना संभव हो उतना खाली करें।
    नोट: पूरी तरह से, सावधानीपूर्वक फ्लशिंग 50 एनएम मानक के एनटीए विश्लेषण के बाद आवश्यक है, क्योंकि ये कण लेजर मॉड्यूल में बने रहते हैं। लेजर मॉड्यूल अब उपयोग करने के लिए तैयार है।

5. माइक्रोस्कोप चरण पर लेजर मॉड्यूल के प्लेसमेंट

  1. लेजर मॉड्यूल फोकस संरेखण मार्गदर्शिकाओं को माइक्रोस्कोप (चित्रा 2) की बांह पर खोजें और फोकस घुंडी का उपयोग करके उन्हें संरेखित करें।

Figure 2
चित्रा 2: लेजर मॉड्यूल फोकस संरेखण गाइड. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. माइक्रोस्कोप का सामना करते हुए, लेजर मॉड्यूल को नालीदार चरण में रखें और धीरे से इसे दाईं ओर जहां तक संभव हो उतना स्लाइड करें।
    नोट: यदि ध्यान से किया जाता है, तो संरेखण और फोकल स्पॉट नमूनों के बीच पता लगाना आसान होगा।
  2. लेजर नियंत्रण बॉक्स पर रॉकर स्विच चालू करें।

6. ध्यान केंद्रित और लेजर मॉड्यूल की स्थिति

नोट: यह कक्ष में तरल पदार्थ के साथ किया जाना चाहिए।

  1. डेस्कटॉप से NTA सॉफ़्टवेयर लोड करें ( सामग्री की तालिका देखें).
    नोट:: एक त्रुटि प्रकट हो सकती है, "तापमान H/W COM3 पर नहीं मिला." बस इसे ठीक करने के लिए सॉफ़्टवेयर को बंद करें और फिर से खोलें।
  2. ऊपरी बाएँ कोने बॉक्स में कैप्चर टैब के अंतर्गत कैमरा प्रारंभ करें क्लिक करें. यदि कैमरा 5 मिनट के बाद स्वचालित रूप से बंद हो जाता है, तो बस इसे पुनरारंभ करने के लिए फिर से स्टार्ट कैमरा क्लिक करें।
  3. एक ही टैब में, लेजर लाइन को उज्ज्वल करने और कण पहचान और फोकस को सरल बनाने के लिए कैमरा स्तर को 14 से 16 तक समायोजित करें।
  4. कैमरे से आईपीस के लिए शीर्ष स्लाइडर को हेडपीस के बाईं ओर ले जाकर या बाहर ले जाकर छवि को डायवर्ट करें।
  5. बढ़े हुए घनत्व का क्षेत्रफल ज्ञात कीजिये, जिसे आमतौर पर थंबप्रिंट के रूप में जाना जाता है। दृश्य के क्षेत्र में थंबप्रिंट को अनुलंब रूप से केंद्र में और फ़ोकस करें.
    नोट: लेजर लाइन थंबप्रिंट के बाईं ओर होगी। कमरे को अंधेरा करने से थंबप्रिंट का पता लगाने और लेजर लाइन पर ध्यान केंद्रित करने में मदद मिल सकती है।
  6. दृश्य के क्षेत्र में लेजर लाइन को केंद्र में रखें; कंप्यूटर स्क्रीन पर देखे गए कैमरे के रूप में प्रकाश को मोड़ने के लिए शीर्ष स्लाइडर को स्थानांतरित करें।
    नोट: लेजर लाइन अब स्क्रीन पर दिखाई दे रही है आईपीस दृश्य की एक दर्पण छवि है; आईपीस में छोड़ दिया कंप्यूटर स्क्रीन पर सही हो जाएगा.
  7. फोकस घुंडी के साथ स्क्रीन पर व्यक्तिगत चलती कणों की छवि को तेज करने के लिए फोकस समायोजित करें।
    नोट: फोकस की गहराई के कारण, सभी कण फोकस में नहीं होंगे, जो स्वीकार्य है। यहां तक कि कण जो फोकस से थोड़ा बाहर हैं, उन्हें कैमरे द्वारा कैप्चर किया जाएगा और सॉफ्टवेयर द्वारा विश्लेषण किया जाएगा।

7. लोड हो रहा है मानकों /

  1. एक कुल्ला 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज में मानक / नमूना / डिलुएंट के 1 एमएल को ड्रा करें और इसे प्रवाह-सेल कवर के इनलेट पोर्ट से जोड़ें। प्लंजर को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि आउटलेट पोर्ट से जुड़े खुले सिरिंज में तरल पदार्थ स्पष्ट न हो जाए।
  2. कैमरा दृश्य में, लेजर लाइन के दाईं ओर कणों की एक समान संख्या के क्षेत्र में ले जाएँ। यदि आवश्यक हो, तो प्रकाश के क्षैतिज बैंड को केंद्र में रखने के लिए ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास को समायोजित करें। जब तक कणों की उच्चतम संख्या दृश्य में नहीं होती है तब तक पुन: ध्यान केंद्रित करें। सुनिश्चित करें कि बाद के सभी उपायों के लिए, इस स्थिति को यथासंभव बारीकी से बनाए रखा जाता है।
  3. कैमरा स्तर को उस बिंदु पर समायोजित करें कि डार्क जानकारी प्रतीक कैमरा दृश्य के शीर्ष दाईं ओर आवर्तक रूप से चालू और बंद चमकता है।
    नोट:: यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि एक संगत कैमरा स्तर चयन प्रत्येक डेटा संग्रह श्रृंखला के लिए न्यूनतम संवेदनशीलता स्तर पर किया जाता है।
    नोट:: कैमरा स्तर कैप्चर के दौरान परिवर्तित नहीं किया जा सकता।

8. अंशांकन का सत्यापन

नोट:: यह नमूना विश्लेषण से पहले आकार मानकों (अनुभाग 2 देखें) का उपयोग कर मॉड्यूल अंशांकन को मान्य करने के लिए अनुशंसित है। सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए नियमित सत्यापन आवश्यक है। एक multiuser प्रयोगशाला में, सॉफ़्टवेयर कॉन्फ़िगरेशन सेटिंग्स के अलग-अलग उपयोगकर्ता समायोजन अनजाने में गलत डेटा संग्रह का कारण बन सकते हैं। महत्वपूर्ण डेटा संग्रह के लिए, दैनिक सत्यापन अच्छे प्रयोगशाला अभ्यास का मामला है। सत्यापन की दिन-प्रतिदिन की पुनरुत्पादकता को रिपोर्ट किए गए परिणामों में शामिल करने की आवश्यकता है। आमतौर पर, अंशांकन तकनीशियन द्वारा सेट किया गया है और जब तक उपयोगकर्ता व्यवस्थापक पहुँच है, तब तक अलग-अलग उपयोगकर्ता द्वारा समायोज्य नहीं है। यह अलग-अलग उपयोगकर्ताओं द्वारा अनधिकृत पुनर्संरचना को रोकता है।

  1. गर्म पतला मानक (अनुभाग 2 देखें) 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान के लिए।
  2. संक्षेप में मानकों भंवर और फिर लोड के रूप में खंड 7 में वर्णित है.
  3. अनुभाग 10 में वर्णित के रूप में नमूना NTA निष्पादित करें और भिन्नता के गुणांक की बाद की गणना के लिए रिकॉर्ड मान, जो सही ढंग से कैलिब्रेट किए जाने पर 2% से कम होना चाहिए।

9. एनटीए के लिए नमूना एकाग्रता का अनुकूलन

नोट:: स्क्रीन 50 और 100 औसत दर्जे का कणों के बीच होना चाहिए जब कैमरा स्तर और नमूना एकाग्रता ठीक से समायोजित कर रहे हैं। यदि इस बारे में कोई प्रश्न है कि क्या किसी नमूने में एक उपयुक्त कण संख्या है, तो इस बिंदु पर नमूने पर एक त्वरित माप चलाया जा सकता है (चरण 9.1 से 9.7 देखें)। इसका उपयोग लंबे समय तक वीडियो कैप्चर से पहले नमूना विशेषताओं का तेजी से आकलन करने के लिए किया जाता है। त्वरित मापन टैब नीचे मध्य बॉक्स में SOP टैब के भीतर पाया जाता है।

  1. कैप्चर अवधि को 30 सेकंड पर सेट करें.
  2. मौजूदा आधार फ़ाइल नाम स्वीकार करें या जनरेट किए गए डेटा के लिए एक नई संग्रहण साइट के लिए ... टैब पर क्लिक करके एक नया फ़ाइल नाम दर्ज करें।
  3. लक्ष्य तापमान के लिए बॉक्स की जाँच करें और वांछित तापमान इनपुट करें।
  4. नमूना पहले वर्णित (चरण 7.1) के रूप में लोड करें, और स्क्रिप्ट बनाएँ और चलाएँक्लिक करें।
  5. 30 s वीडियो के पूरा होने के बाद वीडियो स्क्रीन के नीचे दाईं ओर प्रदर्शित होने के लिए प्रति फ्रेम कणों की संख्या के लिए प्रतीक्षा करें। यदि कणों की संख्या 100 से अधिक है, तो लेजर मॉड्यूल को 3 बार फ्लश करें (जैसा कि पहले चरण 4.6 में वर्णित है)।
  6. विशेषता diluent का उपयोग कर वांछित एकाग्रता सीमा के लिए नमूने को पतला.
  7. flushed लेजर मॉड्यूल में ठीक से पतला नमूना लोड करें और सत्यापित करने के लिए त्वरित माप चलाने के लिए नमूना स्वीकार्य सीमा के भीतर है।

10. नमूना NTA

नोट:: मानक माप टैब नीचे मध्य बॉक्स में SOP टैब के भीतर है और नियमित नमूना विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है (चरण 10.1 से 10.12 देखें)।

  1. अवधि को 30 या 60 सेकंड और वीडियो की संख्या को 5 पर सेट करें।
  2. मौजूदा आधार फ़ाइल नाम स्वीकार करें या जनरेट किए गए डेटा के लिए एक नई संग्रहण साइट के लिए ... टैब पर क्लिक करके एक नया फ़ाइल नाम दर्ज करें।
  3. लक्ष्य तापमान के लिए बॉक्स की जाँच करें और वांछित तापमान इनपुट करें।
  4. इस मानक मापन का पुन: उपयोग करने के लिए स्क्रिप्ट बनाएँ क्लिक करें.
  5. एक बार नमूना अनुभाग 7 में वर्णित के रूप में लोड किया गया है और प्रयोग चलाने के लिए तैयार है, स्क्रिप्ट बनाएँ और चलाएँक्लिक करें।
  6. ऑपरेटर, नमूना विवरण, नमूना विवरण, नमूने के कमजोर पड़ने, और उपयोग किए गए डिलुएंट पर जानकारी के साथ रिपोर्ट विवरण सेट करें पॉपअप स्क्रीन में फ़ील्ड भरें.
    नोट:: यह जानकारी रिकॉर्ड किया जाएगा और अंतिम प्रयोगात्मक रिपोर्ट पर मुद्रित किया जाएगा।
  7. जब सभी इच्छित फ़ील्ड भर गए हैं, तो स्क्रिप्ट प्रारंभ करने के लिए ठीक क्लिक करें.
    नोट:: यदि लक्ष्य तापमान का चयन किया गया था, तो हीटर लेजर मॉड्यूल में नमूने को माप के साथ आगे बढ़ने के लिए स्क्रिप्ट की अनुमति देने से पहले 5 s के लिए वांछित तापमान पर स्थिर कर देगा। स्क्रीन के निचले-बाएं कोने में नैदानिक पैनल हीटर को पढ़ेगा और नमूने के तापमान को प्रदर्शित करेगा।
  8. प्रत्येक वीडियो कैप्चर से पहले, प्लंजर को मैन्युअल रूप से आगे बढ़ाने के लिए एक प्रॉम्प्ट की तलाश करें। लेजर कक्ष में नमूने के ~ 0.05 मिलीलीटर इंजेक्ट करें और कणों को "आराम" (यानी, बहने नहीं) पर आने की अनुमति दें, और फिर ठीक क्लिक करें।
  9. 5वीडियो कैप्चर के पूरा होने पर और प्रक्रिया बॉक्स को फ़्लैश करने के लिए प्रकट होने के लिए सेटिंग्स पुष्टिकरण बॉक्स की प्रतीक्षा करें. स्क्रीन पर कणों को चिह्नित करने वाले नीले क्रॉस की संख्या को नोट करके नमूने के प्रसंस्करण के लिए डिटेक्शन थ्रेशोल्ड सेट करें क्योंकि फ्रेम वीडियो स्क्रीन के नीचे से मैन्युअल रूप से उन्नत होते हैं। यदि फ़्रेम उन्नत होने के रूप में प्रत्येक स्क्रीन पर कणों को चिह्नित करने वाले 3-4 से अधिक नीले क्रॉस हैं, तो डिटेक्शन थ्रेशोल्ड बढ़ाएँ.
    नोट: अलग-अलग कणों पर नीले क्रॉस प्रवाह साइटोमेट्री में "झुंड" प्रभाव के अनुरूप हैं और डेटा संग्रह की इष्टतम सटीकता और पुनरुत्पादन के लिए कम से कम किया जाना चाहिए।
  10. क्लिक करें,सेटिंग्स ठीकजब डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्वीकार्य है।
  11. वीडियो को स्वचालित रूप से संसाधित करने और परिणामों का हिस्टोग्राम और ठीक पर क्लिक करने से पहले प्रदर्शित होने की एक संवाद बॉक्स अधिसूचना के लिए प्रतीक्षा करें.
  12. एक बार निर्यात सेटिंग्स बॉक्स प्रकट होने के बाद, निर्यात करें क्लिक करके परिणाम सहेजें.
    नोट:: वीडियो और विश्लेषण से सभी परिणाम चरण 10.2 में परिभाषित गंतव्य फ़ाइल में संग्रहीत किया जाएगा। इसके लिए बड़ी मात्रा में भंडारण की आवश्यकता होती है। मॉनिटर और आवश्यक के रूप में एक द्वितीयक भंडारण डिवाइस के लिए स्थानांतरण.

11. विभिन्न पता लगाने थ्रेसहोल्ड पर वर्तमान नमूने का पुन: विश्लेषण

नोट:: तुरंत NTA विश्लेषण (चरण 10) के बाद, डेटा विभिन्न डिटेक्शन थ्रेशोल्ड सेटिंग्स का उपयोग कर पुन: विश्लेषण किया जा सकता है। हालाँकि, कैमरा स्तर कैप्चर के बाद संशोधित नहीं किया जा सकता।

  1. वर्तमान प्रयोग में सूचीबद्ध कैप्चर वीडियो के सभी 5 हाइलाइट करें.
  2. चयनित फ़ाइलों को संसाधित करें क्लिक करें, और प्रकट होने के लिए सेटिंग पुष्टिकरण बॉक्स और डिटेक्शन थ्रेशोल्ड को बदलने के लिए फ़्लैश करने के लिए प्रक्रिया बॉक्स की प्रतीक्षा करें.
  3. डिटेक्शन थ्रेशोल्ड को इच्छित स्तर पर समायोजित करें और ठीक सेटिंग क्लिक करें.
  4. वीडियो को स्वचालित रूप से संसाधित करने और परिणामों का हिस्टोग्राम और ठीक पर क्लिक करने से पहले प्रदर्शित होने की एक संवाद बॉक्स अधिसूचना के लिए प्रतीक्षा करें.
  5. सेटिंग्स निर्यात करेंक्लिक करें। जब नवीनतम नमूने पर अतिरिक्त मूल्यांकन किए जाते हैं, तो वर्तमान प्रयोग में परिणाम निर्यात करें बॉक्स को क्लिक करना सुनिश्चित करें क्योंकि निर्यात परिणाम पॉपअप बॉक्स नमूना पुन: विश्लेषण के बाद प्रदर्शित नहीं किया जाएगा.
    नोट: जैसा कि ऐसा करने के लिए कोई अनुस्मारक नहीं हैं, इसे आसानी से अनदेखा किया जा सकता है, और विश्लेषण खो जाएगा। हालांकि, अंतर्निहित डेटा बना रहेगा और बाद में पुन: विश्लेषण किया जा सकता है।

12. संग्रहीत फ़ाइलों का विश्लेषण

नोट:: यदि पहले से विश्लेषण किए गए प्रयोगों को सहेजा नहीं गया है या इन नमूनों पर अतिरिक्त विश्लेषण करने की आवश्यकता है, तो अलग-अलग फ़ाइलों को अतिरिक्त डिटेक्शन थ्रेशोल्ड मूल्यांकन के लिए NTA सॉफ़्टवेयर में पुन: लोड किया जा सकता है। कैमरा स्तर परिवर्तन कैप्चर के बाद संशोधित नहीं किया जा सकता.

  1. डेस्कटॉप से NTA सॉफ़्टवेयर लोड करें।
  2. निम्न मध्य पैनल में विश्लेषण टैब क्लिक करें.
  3. प्रयोग खोलें क्लिक करें और इच्छित .nano फ़ाइल पर नेविगेट करें.
    नोट:: चयनित .nano प्रयोग के साथ संबद्ध वीडियो फ़ाइलें मुख्य प्रयोग फ़ाइल के रूप में एक ही फ़ोल्डर में होना आवश्यक है; अन्यथा, फ़ाइलों को संसाधित करने का प्रयास करते समय एक त्रुटि दिखाई देगी। फ़ाइल नाम के पहले 6 अंक वह तिथि है जब प्रयोग चलाया गया था (xx-xx-xx)। फ़ाइल नाम के अंतिम 6 अंक वह समय है जब वीडियो रिकॉर्ड किया गया था (xx-xx-xx) और व्यक्तिगत वीडियो पहचानकर्ता। प्रत्येक संयुक्त प्रयोग की पीडीएफ फाइल उस विश्लेषण के लिए शामिल .nano फाइलों को सूचीबद्ध करती है।
  4. विश्लेषण चलाने के लिए चयनित फ़ाइलों को संसाधित करें क्लिक करें.
  5. एक बार प्रक्रिया बॉक्स डिटेक्शन थ्रेशोल्ड में परिवर्तन की अनुमति देने के लिए चमकता है, तो थ्रेशोल्ड को वांछित स्तर पर सेट करें और ठीक क्लिक करें।
  6. वीडियो को स्वचालित रूप से संसाधित करने और परिणामों का हिस्टोग्राम और ठीक पर क्लिक करने से पहले प्रदर्शित होने की एक संवाद बॉक्स अधिसूचना के लिए प्रतीक्षा करें.
  7. परिणाम निर्यात करें क्लिक करें. वर्तमान प्रयोग में परिणाम निर्यात करें बॉक्स को क्लिक करना सुनिश्चित करें, क्योंकि निर्यात परिणाम पॉपअप बॉक्स पुन: विश्लेषण के बाद प्रदर्शित नहीं किया जाएगा.
    नोट: जैसा कि ऐसा करने के लिए कोई अनुस्मारक नहीं हैं, इसे आसानी से अनदेखा किया जा सकता है, और विश्लेषण खो जाएगा।

13. सफाई और लेजर मॉड्यूल के disassembly

  1. लेजर नियंत्रण बॉक्स बंद करें।
  2. लेजर मॉड्यूल से पूरे नमूने फ्लश और इसे ठीक से छोड़ दें।
  3. खुले सिरिंज बंदरगाह के साथ झुका हुआ लेजर मॉड्यूल पकड़ो हवा को कक्ष से शुद्ध करने की अनुमति देने के लिए ऊंचा किया गया है क्योंकि DPBS को लेजर मॉड्यूल में धीरे-धीरे इंजेक्ट किया जाता है और आउटलेट सिरिंज बंदरगाह से फ्लश किया जाता है।
  4. लेजर मॉड्यूल से शेष DPBS फ्लश और त्याग.
  5. 2 और अधिक बार फ्लशिंग को दोहराएं और अंतिम फ्लश के बाद लेजर मॉड्यूल को पूरी तरह से जितना संभव हो सके खाली करें।
  6. प्रवाह-सेल कवर पर समान दबाव डालना, समान रूप से थंबस्क्रू को बारी-बारी से विकर्ण तरीके से ढीला करना जब तक कि धागे से अलग नहीं हो जाता, अंगूठे को हटा दें, और लेजर मॉड्यूल मामले में स्टोर करें।
  7. लेजर मॉड्यूल से प्रवाह-सेल कवर निकालें।
  8. एक अच्छी गुणवत्ता वाले लेंस क्लीनर और लेंस पेपर के साथ दोनों कांच की सतहों को धीरे से साफ करें। कांच की सतहों पर टिश्यू पेपर या पेपर तौलिए का उपयोग न करें।
  9. नेत्रहीन लेजर मॉड्यूल और प्रवाह-सेल कवर "खिड़कियों" का निरीक्षण खरोंच या खामियों के लिए उपयोग के बाद और पर्यवेक्षक को रिपोर्ट करने के बाद।
  10. भंडारण के दौरान कांच की सतहों को नुकसान को रोकने के लिए उनके मामलों में लेजर मॉड्यूल और फ्लो-सेल कवर को बदलें।

14. नमूना विश्लेषण प्रोटोकॉल

  1. अनफ़िल्टर किए गए नमूने
    1. लोड करने से पहले नमूना भंवर और कैमरा स्तर 12 और पता लगाने थ्रेशोल्ड स्तर 3 पर 5 x 60 s वीडियो रिकॉर्ड के रूप में ऊपर वर्णित है. डिटेक्शन थ्रेशोल्ड 2 और 5 का उपयोग करके इन वीडियो का पुन: विश्लेषण करें।
    2. कैमरा स्तर 13 और 14 और डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्तर 3 पर एक ही नमूने के वीडियो संग्रह को दोहराएँ। डिटेक्शन थ्रेशोल्ड 2 और 5 का उपयोग करके इन 2 अतिरिक्त वीडियो का पुन: विश्लेषण करें। एसओपी सेटिंग में 5 x 30 s वीडियो का उपयोग करके पूरी प्रक्रिया को दोहराएँ।
  2. फ़िल्टर किए गए नमूने
    1. भंवर नमूना और फिर एक साथ लोड और इसे फ़िल्टर (0.22 μm सिरिंज फिल्टर) सीधे लेजर मॉड्यूल में.
      नोट:: सिरिंज फ़िल्टर 2 बार फ़िल्टर मृत स्थान की मात्रा के साथ flushed किया गया था किसी भी निवासी कण को निकालने के लिए उपयोग करने से पहले। सिरिंज फिल्टर ( सामग्री की तालिका देखें) में 0.5 मिलीलीटर का मापा गया मृत स्थान था और माप से पहले नमूने के 1.0 मिलीलीटर के साथ फ्लश किया गया था। SOP डेटा फ़ील्ड में फ़िल्टर प्रकार नोट करें। फ़िल्टर किए गए नमूने को चरण 14.1 में अनफ़िल्टर किए गए नमूनों के लिए वर्णित के रूप में ठीक से संसाधित किया गया था।

15. NTA परिणामों का सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. मुख्य प्रभावों या इंटरैक्शन के विश्लेषण के लिए, एनोवा मान्यताओं (सामान्यता, यूनिमोडल, विचरण की समरूपता) की जांच के बाद विचरण का विश्लेषण करें। एनोवा मान्यताओं की विफलता के मामलों में रैंकों पर Kruskal-Wallis एक तरफा एनोवा का उपयोग करें।
  2. महत्वपूर्ण मुख्य प्रभावों की वापसी के बाद, पूर्वनियोजित तुलनाओं के लिए परीक्षण करने के लिए डन की विधि का उपयोग करें। दो-पूंछ परीक्षण में महत्वपूर्ण होने के लिए 0.05 के पी-मान पर विचार करें।
    नोट:: यहाँ जनरेट की गई डेटा फ़ाइलें सामग्री स्थानांतरण समझौते के पूरा होने के बाद लेखकों से उपलब्ध हैं।

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Representative Results

तालिका 1 लिपोसोम नमूनों (18 फ़िल्टर और 18 unfiltered) और एक प्रतिनिधि DPBS diluent के लिए NTA वीडियो के परिणाम शामिल हैं। इस पेपर में कैमरा स्तर या डिटेक्शन थ्रेशोल्ड की परवाह किए बिना दो समूहों में तुलना पूरी हो गई थी। फ़िल्टर किए गए नमूनों में 108.5 एनएम का औसत कण व्यास, 86.2 एनएम का कण मोड और 7.4 × 108 कणों / एमएल की एकाग्रता थी। इसके विपरीत, अनफ़िल्टर्ड नमूनों में 159.1 एनएम का औसत कण व्यास, 105.7 एनएम का कण मोड और 7.6 × 108 कणों / एमएल की एकाग्रता थी। फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के लिए माध्य और मोड मान, कैमरा स्तर या डिटेक्शन थ्रेशोल्ड की परवाह किए बिना, सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण थे (पी < 0.05)। फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के बीच एकाग्रता में अंतर, कैमरा स्तर या पहचान सीमा की परवाह किए बिना, गैर-महत्वपूर्ण थे (पी = 0.86)।

फ़िल्टर किए गए बनाम अनफ़िल्टर्ड नमूनों की तुलना
नमूना कैम लेव Det Thr औसत माध्य %CV सेंट देव। Conc. × 108 सेंट देव × 107
फ़िल्टर अनफ़िल्टर्ड फ़िल्टर अनफ़िल्टर्ड फ़िल्टर अनफ़िल्टर्ड फ़िल्टर अनफ़िल्टर्ड फ़िल्टर अनफ़िल्टर्ड
लिपोसोम 12 3 138.3 162.1 55.5 47.5 76.7 77 3.2 6.48 1.74 3.16
लिपोसोम 12 2 126.3 153.7 58.7 49.8 74.2 76.5 4.94 8.23 2.74 3.5
लिपोसोम 12 5 155 172.2 51.8 45.6 80.3 78.6 1.91 5.05 1.02 2.9
लिपोसोम 13 3 102.7 169 43.5 51.3 44.7 86.7 6.72 7.75 1.91 1.17
लिपोसोम 13 2 95.8 161.4 43.3 52.7 41.5 85 10.3 9.7 1.61 1.83
लिपोसोम 13 5 110.7 176.1 42.5 47.1 47 83 4.16 6.28 1.83 1.07
लिपोसोम 14 3 98 147.6 42.4 43.8 41.6 64.6 10.6 8.56 2.4 1.66
लिपोसोम 14 2 92.9 142.1 42.6 45.2 39.6 64.3 14.9 10.7 2.54 1.83
लिपोसोम 14 5 103.8 153.8 41.1 42.6 42.7 65.5 7.42 7.02 2.37 1.51
लिपोसोम 12 3 105.6 179.4 22.2 46.7 23.4 83.7 5.2 5.81 1.06 4.28
लिपोसोम 12 2 100.3 170.8 24.3 49.1 24.4 83.8 7.76 7.39 1.61 4.41
लिपोसोम 12 5 112 187.2 20.4 42.9 22.8 80.4 3.27 4.68 0.815 3.93
लिपोसोम 13 3 99.8 153.3 23.4 52.1 23.4 79.8 7.19 7.34 3.37 1.5
लिपोसोम 13 2 94.3 143.6 25.8 53.2 24.3 76.4 10.8 9.53 4.3 2.46
लिपोसोम 13 5 106.8 162 21.3 49.4 22.7 80 4.64 5.76 2.63 1.01
लिपोसोम 14 3 103.4 142.3 31.7 49.6 32.8 70.6 9.91 8.66 3.29 12.5
लिपोसोम 14 2 97.8 136 33.3 51.4 32.6 69.9 13.8 11.5 2.98 15.7
लिपोसोम 14 5 109.5 151.4 31.1 49.5 34 74.9 7.27 6.76 3.42 10.1
औसत 108.5 159.1 36.4 48.3 40.5 76.7 7.4 7.6 2.3 4.1

तालिका 1: एकत्रित मानों की डेटा तालिका, मानक विचलन, और फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के लिए भिन्नता का प्रतिशत गुणांक। संक्षिप्त रूप: कैम लेव = कैमरा स्तर; Det Thr = पता लगाने की दहलीज; CV = भिन्नता का गुणांक; सेंट देव = मानक विचलन; Conc. = एकाग्रता।

जब लिपोसोम नमूना परिणामों को डिटेक्शन थ्रेशोल्ड (2, 3, 5) और कैमरा स्तर (12, 13, 14) द्वारा पार्स किया गया था, तो परिणाम महत्वपूर्ण नहीं थे (चित्रा 3)। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन व्यक्तिगत स्तरों में से प्रत्येक पर केवल 3 मूल्यांकन (एन = 3) थे। प्रत्येक कैमरा स्तर पर इस छोटे से नमूना आकार और पहचान सीमा ने संभवतः व्यक्तिगत तुलनाओं की कमी में योगदान दिया। हालांकि, जब पता लगाने की सीमा (2, 3, 5) नमूनों को फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों (n = 3) में कैमरे के स्तर की परवाह किए बिना मूल्यांकन किया गया था, तो औसत आकार (चित्रा 3A) और मोड आकार (चित्रा 3B) दोनों काफी (पी < 0.05) अलग थे। इसके विपरीत, फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूना सांद्रता (चित्रा 3 C) के बीच अंतर काफी अलग नहीं थे।

Figure 3
चित्रा 3: कैमरा स्तर और मापा कण आकार और फ़िल्टर और unfiltered नमूनों की एकाग्रता पर पता लगाने की दहलीज के प्रभाव. माध्य (ए) और मोड (बी) कण आकार संयुक्त कैमरा स्तरों पर 12, 13, 14 के रूप में पता लगाने की सीमा को 2 से 3 से 5 (एन = 3) तक बढ़ा दिया गया था, जो फ़िल्टर किए गए नमूनों के कण आकार में महत्वपूर्ण कमी दिखाता है। संयुक्त कैमरा स्तर 12, 13, 14 पर कण सांद्रता (सी) के रूप में पता लगाने की सीमा को 2 से 3 से 5 तक बढ़ा दिया गया था) (एन = 3), एक एकाग्रता में कमी दिखा रहा है क्योंकि पता लगाने की सीमा फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। माध्य (डी) और मोड (ई) कण आकार संयुक्त पता लगाने थ्रेसहोल्ड पर के रूप में कैमरा स्तर 12 से 14 (एन = 3) तक बढ़ गया, फ़िल्टर किए गए नमूनों के कण आकार में कमी दिखा रहा है। संयुक्त डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड पर कण सांद्रता (एफ) के रूप में कैमरे का स्तर 12 से 14 (एन = 3) तक बढ़ गया, जो एक एकाग्रता वृद्धि दिखा रहा है क्योंकि कैमरा स्तर फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है। संक्षिप्त नाम: DT = पता लगाने की दहलीज. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

जब 3 कैमरा स्तर (12, 13, 14) का मूल्यांकन डिटेक्शन थ्रेशोल्ड स्तर (n = 3) की परवाह किए बिना किया गया था, तो फ़िल्टर किए गए नमूनों में माध्य आकार (चित्रा 3डी) और मोड आकार (चित्रा 3ई) दोनों में वृद्धि हुई थी। नमूना सांद्रता में वृद्धि की प्रवृत्ति दिखाई दी क्योंकि कैमरा स्तर 12 से 14 तक बढ़ गया (चित्रा 3 एफ)। विभिन्न कैमरा स्तरों पर मूल्यांकन किए गए फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूना सांद्रता के बीच के अंतर काफी अलग नहीं थे।

पूरक फ़ाइल 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

नैनोकणों के आकार और एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। इनमें पहनावा विधियां शामिल हैं जो एक आबादी से आकार का अनुमान उत्पन्न करती हैं, जिसमें गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस), केन्द्रापसारक अवसादन, और एकल-कण स्तर विश्लेषण-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एनटीए, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और ट्यूनेबल प्रतिरोधी नाड़ी संवेदन शामिल हैं। इनमें से, डीएलएस और एनटीए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं, एक आदर्श माध्यम में ब्राउनियन आंदोलन के आधार पर गैर-विनाशकारी आकार और एकाग्रता माप विधियां। डीएलएस प्रकाश के प्रकीर्णन पर निर्भर करता है और तीव्रता कण आयतन के वर्ग के लिए आनुपातिक है। इस प्रकार, डीएलएस बड़े कणों, समुच्चय, या पॉलीडिस्पर्स आबादी की उपस्थिति के लिए एनटीए की तुलना में अधिक संवेदनशील है।

एनटीए क्रमिक वीडियो फ्रेम में मापा व्यक्तिगत कणों के पथ की लंबाई से प्रसार गुणांक की गणना करता है। एनटीए की मुख्य सीमा कण एकाग्रता की संकीर्ण सीमा है जिसे यह डीएलएस और अन्य माप विधियों की तुलना में मूल्यांकन कर सकता है, जैसे कि व्यक्तिगत कण पथलंबन को माइक्रोस्कोप की विवर्तन सीमा और ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर की क्षमताओं के भीतर आना चाहिए। जैसा कि डीएलएस और एनटीए ब्राउनियन आंदोलन पर निर्भर करते हैं, दोनों को मोनोडिस्पर्स्ड आबादी में अच्छे आकार के समझौते को दिखाने की उम्मीद की जा सकती है; वे जब polydispersed आबादी और समुच्चय के साथ उन लोगों का मूल्यांकन करते हैं अलग-अलग. उत्तरार्द्ध डीएलएस को बेकार कर देता है और एनटीए कण आकार अनुमान को काफीबढ़ाता है 12। एनटीए की सबसे अच्छी ज्ञात सीमा यह है कि इसे अन्य माप विधियों की तुलना में बहुत कम कण एकाग्रता (या अधिक कमजोर पड़ने) की आवश्यकता होती है। इसके बावजूद, एनटीए लक्षण वर्णन नैनोमटेरियल्स अनुसंधान में लोकप्रिय है। क्योंकि एनटीए आकार और एकाग्रता अनुमान एक अधिक पतला आबादी पर निर्भर करते हैं, परिभाषित तापमान, वीडियो कैप्चर सेटिंग्स के साथ, जिसमें रिकॉर्डिंग लंबाई, कैमरा स्तर, पता लगाने की सीमा और नमूना कमजोर पड़ने की लंबाई अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य होने के लिए शामिल है, यह पेपर पुनरुत्पादक परिणाम उत्पन्न करने के लिए इन्हें रिपोर्ट करने की आवश्यकता पर केंद्रित है।

इस पेपर से पता चलता है कि एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग करके परिणामों की प्रतिकृति सक्षम की गई है और सकारात्मक नियंत्रणों का उपयोग, जैसे आकार मानक, मशीन के अंशांकन के बारे में जानकारी प्रदान करता है। इसके अलावा, इन परिणामों ने लेजर मॉड्यूल चैंबर तापमान, कैमरा स्तर, पहचान सीमा, और निस्पंदन (फ़िल्टर प्रकार और आकार) की रिपोर्टिंग के महत्व का संकेत दिया। इसके विपरीत, लेजर मॉड्यूल चैंबर तापमान, डिल्यूएंट, और कमजोर पड़ने वाला कारक सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण हैं। हालांकि न तो MISEV2018 और न ही EV-TRACK विशेष रूप से इस जानकारी को शामिल करने की सिफारिश करता है, हम सुझाव देते हैं कि इन विवरणों को शामिल करने से प्रकाशित परिणामों की स्वतंत्र पुष्टि सक्षम होती है और प्रयोगात्मक डिजाइन में मजबूती जोड़ती है।

ईवी विश्लेषण में एनटीए अंशांकन के लिए लेटेक्स आकार अंशांकन मानकों का उपयोग करने की सीमाओं को स्वीकार किया जाता है और समान आकार के लिपिड द्वि-परत नैनोकणों की तुलना में ज्ञात अपवर्तक सूचकांक अंतर शामिल हैं। इस पेपर में, लेटेक्स मोतियों का उपयोग माप से पहले मशीन अंशांकन की पुष्टि करने के लिए किया गया था और पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए नहीं। लिपोसोम में स्वाभाविक रूप से होने वाले ईवी के समान झिल्ली होती है, और अपवर्तक सूचकांक भी ईवी का प्रतिनिधि होगा। आकार मानकों, साथ ही लिपोसोम नमूने, monodispersed आबादी हैं; इसलिए, उनके आकार वितरण एक गाऊसी या लॉग-सामान्य वितरण का पालन करेंगे। प्राकृतिक ईवी पॉलीडिस्पर्स हैं, और उनका आकार वितरण एक पावर-लॉ फ़ंक्शन13 का पालन करेगा।

ऐतिहासिक रूप से, एनटीए लक्षण वर्णन का उपयोग करने वाले प्रकाशन असंगत रूप से अनुसंधान परिणामों को डुप्लिकेट करने के लिए आवश्यक विवरणों की रिपोर्ट करते हैं। एनटीए डेटा को पुन: उत्पन्न करने की क्षमता मूल डेटा को कैप्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली सेटिंग्स को डुप्लिकेट करने की क्षमता पर निर्भर करती है। इस जानकारी के बिना, एनटीए का उपयोग करके प्रयोगात्मक परिणामों का प्रजनन बेहद मुश्किल होगा। एक सेट प्रोटोकॉल के कठोर पालन और एनटीए के साथ उपयोग किए जाने वाले सेटिंग पैरामीटर के प्रकाशन के साथ, परिणामों की सटीक प्रतिकृति प्राप्त की जा सकती है। निम्नलिखित सिफारिशें एक नैनोपार्टिकल आकार विश्लेषक का उपयोग करके आकार, एकाग्रता, संरचना और शुद्धता के नैनोपार्टिकल लक्षण वर्णन की स्थिरता में सुधार करने के लिए की जाती हैं।

सबसे पहले, हमेशा उचित आकार मानकों का उपयोग करके नैनोपार्टिकल आकार विश्लेषक के अंशांकन की जांच करें, जैसे कि लेटेक्स आकार मानक। यह एक नियमित आधार पर किया जाना चाहिए और उपकरण लॉग में दर्ज किया जाना चाहिए और महत्वपूर्ण नमूनों के विश्लेषण से पहले। दूसरा, सभी समायोज्य पैरामीटर, जैसे कि लेजर मॉड्यूल चैंबर तापमान, कैमरा स्तर, और डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड, नमूना लॉग फ़ाइल में प्रत्येक नमूने के लिए रिकॉर्ड किया जाना चाहिए, जैसा कि उपयोग किए जाने वाले dilutions और diluents होना चाहिए। इन मापदंडों को रिपोर्ट किया जाना चाहिए क्योंकि वे ऑपरेटर-निर्भर हैं और एनटीए माप को प्रभावित करते हैं। तीसरा, नमूना कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिलुएंट्स को नैनोपार्टिकल सामग्री के लिए विशेषता और रिपोर्ट करने की आवश्यकता होती है। अलग-अलग नैनोपार्टिकल नमूनों के लिए उपयोग किए जाने वाले डिलुएंट्स को पतले नमूने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान कैमरा स्तर और पहचान थ्रेशोल्ड सेटिंग्स का उपयोग करके मूल्यांकन करने की आवश्यकता होगी। चौथा, सिरिंज फिल्टर को विनिर्माण प्रक्रिया से शेष कई कणों को फ्लश करने के लिए डेटा संग्रह या नमूना तैयारी चरणों से पहले मृत स्थान की मात्रा के दो गुना के साथ फ्लश किया जाना चाहिए। पांचवां, नमूने के भीतर नैनोकणों की एकाग्रता को सुझाए गए इष्टतम 1.0 × 107 से 1.0 × 109 प्रति एमएल के भीतर समायोजित किया जाना चाहिए।

इस अध्ययन में उपर्युक्त वर्णित सीमाओं को स्वीकार करते हुए, हम दिखाते हैं कि एनटीए द्वारा प्राप्त आकार और एकाग्रता दोनों मूल्यों को एनटीए पैरामीटर से प्रभावित किया जा सकता है, जैसे कि कैमरा स्तर और पता लगाने की थ्रेसहोल्ड, और यह कि आकार, लेकिन एकाग्रता नहीं, नमूना तैयारी से प्रभावित हो सकता है। यह नैनोमटेरियल और ईवी साहित्य में इन मापदंडों की रिपोर्ट करने के महत्वपूर्ण महत्व को घर चलाता है, जिससे मजबूत, पुन: प्रस्तुत करने योग्य साहित्य के उत्पादन को सक्षम किया जा सके ताकि हम व्यवस्थित रूप से ईवी स्रोत, अलगाव और अन्य प्रयोगात्मक चर के प्रभाव की जांच कर सकें।

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Disclosures

लेखकों में से किसी के पास हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को तुलनात्मक स्टेम सेल जीवविज्ञान (MICSCB) के लिए मिडवेस्ट इंस्टीट्यूट, जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर को तुलनात्मक स्टेम सेल जीवविज्ञान (MICSCB) के लिए कंसास राज्य द्वारा समर्थित किया गया था, जो MLW और एनआईएच R21AG066488 को LKC के लिए था। OLS को MICSCB से GRA समर्थन प्राप्त हुआ। लेखकइस परियोजना में उपयोग किए जाने वाले लिपोसोम और सहायक वार्तालापों और प्रतिक्रिया के लिए वीस और क्रिस्टनसन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को प्रदान करने के लिए डॉ संतोष आर्यल को धन्यवाद देते हैं। डॉ हांग वह तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है। MLW उसके समर्थन और वकील के लिए Betti Goren Weiss धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Automatic Pipetter
Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL Thermo Sci. 339650
Kimwipes
Lens Cleaner
Lens Paper
NanoSight LM-10 Malvern Panalytical
NanoSight LM-14 Laser Module Malvern Panalytical
Nanosight NTA Software Ver. 3.2 Malvern Panalytical
Paper Towels
Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding BioExpress P -3243-200X
Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile BioExpress P-3243-1250
Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) Gibco 14190-144
Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) Malvern NTA4088
Standards, Latex Transfer- 50 nm  (3 mL) Malvern NTA4087
Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile Fisher brand 09-720-004
Syringe, TB, 1 mL, slip tip Becton Dickinson 309659
Waste fluid container

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References

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Bioengineering अंक 177
Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण में बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं 2018 दिशानिर्देशों के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी को पूरा करने के लिए पुनरुत्पादन में सुधार
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Snyder, O. L., Campbell, A. W.,… More

Snyder, O. L., Campbell, A. W., Christenson, L. K., Weiss, M. L. Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis. J. Vis. Exp. (177), e63059, doi:10.3791/63059 (2021).

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