Summary
ナノ粒子追跡分析(NTA)は、細胞外小胞を特徴付けるために広く使用されている方法です。この論文では、NTAの実験パラメータと対照に加えて、実験室間の再現性のためにMISEV2018とEV-TRACKによって提案されたガイドラインを補完するために必要なサンプルと希釈剤の均一な分析と特性評価方法に焦点を当てます。
Abstract
ナノ粒子追跡解析(NTA)は、2006年以来、細胞外小胞(EV)研究に使用されているいくつかの特性評価方法の1つです。多くの人は、NTA機器とそのソフトウェアパッケージは最小限のトレーニングで簡単に利用でき、サイズ校正は社内で実現可能であると考えています。NTA取得とソフトウェア解析の両方がEV特性評価を構成するため、それらは細胞外小胞の研究のための最小情報2018(MISEV2018)で扱われています。さらに、EV実験の堅牢性を向上させるために、細胞外小胞研究における透明な報告および集中化知識(EV-TRACK)によって監視されています(例えば、制御されていない要因による実験変動を最小限に抑えます)。
方法と対照の報告を奨励する努力にもかかわらず、多くの出版された研究論文は、元のNTA観測を再現するために必要な重要な設定を報告していない。ネガティブコントロールまたは希釈剤のNTA特性評価を報告する論文はほとんどなく、明らかにリン酸緩衝生理食塩水や超純粋な蒸留水などの市販品が粒子を含まないと仮定しています。同様に、陽性対照またはサイズ基準は、粒子サイズを検証するために研究者によって報告されることはめったにありません。ストークス-アインシュタイン方程式には、サンプルの粘度と温度変数が組み込まれており、粒子の変位が決定されます。したがって、サンプルビデオ収集全体を通して安定したレーザーチャンバー温度を報告することは、正確な複製に不可欠な制御手段です。サンプルまたは希釈剤のろ過も日常的に報告されておらず、そうであれば、フィルターの詳細(製造業者、膜材料、孔径)および保管条件はほとんど含まれない。国際細胞外小胞学会(ISEV)の許容可能な実験詳細の最小基準には、EVの特性評価のための十分に文書化されたNTAプロトコルを含めるべきである。次の実験は、NTA分析プロトコルを個々の研究者によって確立し、単一小胞特性評価のためのMISEV2018要件を満たすためのオプションの1つとしてNTA特性評価を使用する出版物の方法に含める必要があるという証拠を提供する。
Introduction
EVやその他のナノメートルスケールの粒子の正確で再現性のある分析は、研究や業界全体で多くの課題を提示しています。EV研究の再現は、データ収集に関連する必要なパラメータの報告に統一性がないために、部分的には困難であった。これらの欠陥に対処するために、ISEVは、EV研究者のための生化学的、生物物理学的、および機能的基準の最小セットとして業界ガイドラインを提案し、一般にMISEV20141と呼ばれるポジションステートメントとして公開しました。EV研究の加速に伴い、ガイドラインの更新が必要となり、「MISEV2018:ISEVの立場表明」はMISEV2014ガイドライン2を拡張した。MISEV2018の論文には、表、推奨されるプロトコルの概要、および特定のEV関連の特性評価を文書化するための手順が含まれていました。実験の解釈と複製を容易にするためのさらなる措置として、EV-TRACKは、EV生物学および公表された結果に使用される方法論のより透明な報告を可能にするクラウドソーシングナレッジベース(http://evtrack.org)として開発されました3。方法の標準化された報告のためのこれらの勧告にもかかわらず、この分野は公表された結果の複製および確認に関して引き続き苦しんでいる。
この論文は、米国国立衛生研究所と米国国立科学財団の品質評価ツールに対する取り組みに合致して、ISEVが、実験室間で結果を複製する目的でデータ評価ツールを適用できるように、方法と詳細の標準化された報告を必要とすることを示唆している。細胞源、細胞培養手順、およびEV単離方法の報告は、EV集団の品質を定義する重要な要素です。NTA機器の中では、検出設定、キャリア流体の屈折率、多分散性に寄与する不均一な粒子集団、標準化された報告要件の欠如、および観察者間および観察者間の測定結果の欠如などの要因により、ラボ間のNTA比較は困難または不可能になります。
2006年以来使用されているNTAは、現在EV研究者の約80%によって使用されているナノ粒子サイズと濃度測定のための一般的な方法です4。MISEV2018ガイドラインでは、2つの形式の単一小胞分析が必要であり、そのうちNTAは一般的な選択肢の1つです。NTAは、その広いアクセシビリティ、サンプルあたりの低コスト、およびその簡単な創設理論(ストークス - アインシュタイン方程式)のために、EV特性評価に引き続き一般的に使用されています。NTAによるEV評価は、レーザー光散乱とブラウン運動解析を用いて粒度分布と濃度推定値を生成し、検出の下限はEVの屈折率によって決定される。既知の粘度と温度の流体サンプルを使用する場合、EVの軌道を追跡して、2次元で平均二乗変位を決定します。これにより、粒子拡散係数を計算し、修正されたストークス・アインシュタイン式5,6,7によって球相当流体力学的直径に変換することができる。NTAの粒子間分析は、他の特性評価方法よりも、EVの不均一な集団における凝集体またはより大きな粒子による干渉が少ない7。いくつかの大きな粒子はサイジング精度への影響を最小限に抑えますが、たとえ微量の大きくて高い光散乱粒子が存在すると、ソフトウェアEV検出と追跡の減少により、より小さな粒子の検出が著しく減少します8。測定技術として、NTAは一般に、より大きな粒子または粒子の凝集体に偏っていないと考えられているが、個々の粒子分析9を通じて複数のサイズの集団を解決できる。NTA解析の限界の1つは、粒子による光散乱を使用するため、粉塵、プラスチック、粉末などの屈折率やサイズ属性がEVと比較して類似している粒子は、この特性評価方法では実際のEVと区別できないことです。
NanoSight LM10(ナノ粒子サイズアナライザー)とLM14(レーザーモジュール)は2006年から販売されており、この装置の新しいモデルが開発されていますが、この特定のモデルは多くのコア施設で見つかっており、信頼性の高い主力製品と考えられています。サイズと濃度の高解像度測定のためにNTA設定を適切に最適化するには、トレーニングが必要です。最適なビデオ録画に必要な2つの重要な設定は、(1)カメラレベルと(2)検出しきい値です。これらは、サンプルの特性に基づいてオペレータが設定する必要があります。NTA分析の主な制約の1つは、107 〜109 粒子/ mLの間のサンプル濃度の推奨であり、このサンプル希釈を達成するためには10が必要であり得る。リン酸緩衝生理食塩水、0.15 M 生理食塩水、超純水などの希釈に使用される溶液には、サイズが 220 μm 未満の粒子が含まれていないことはめったになく、NTA 測定に影響を与える可能性があります。希釈に使用される溶液のNTA特性評価は、分析中のナノ粒子サンプルと同じカメラレベルおよび検出閾値で実施されるべきである。EVサンプル希釈に使用される希釈剤中に存在するナノ粒子のサイズおよび濃度は、EVのNTA分析を含む出版物にはほとんど含まれていない。
このプロトコルは、選択されたカメラレベル、検出閾値、およびサンプルの機械的フィルタリングを使用して評価された合成EV様リポソームのNTA分析を使用して、NTAデータセットに対するカメラレベル、検出閾値、またはサンプル濾過の体系的な影響を分析する。リポソームは、 補足ファイルS1に記載されるように合成した。合成リポソームは、そのサイズ均一性、物理的特性、および4°Cでの保存における安定性のために、この実験で使用された。 EVの実際のサンプルを使用する可能性があったが、貯蔵中のEVの異質性と安定性は、この研究とその解釈を複雑にした可能性がある。(A)リポソームと(B)EVからのNTA報告の類似性は、本論文でリポソームについて明らかにされた系統的効果がEV特性評価にも適用される可能性が高いことを示している(図1)。これらの知見は、重要なソフトウェア設定の完全なレポートと、希釈剤、希釈液、ろ過などのサンプル処理の説明がNTAデータの再現性に影響を与えるという考えを支持している。
この論文の目的は、NTA設定(温度、カメラレベル、および検出閾値)およびサンプル調製を変更すると、収集された結果(体系的で、サイズおよび濃度の有意な差)が得られたことを実証することである。NTAはMISEV2018特性評価仕様を満たすための一般的なオプションの1つであるため、これらの結果は、再現性を確保するためにサンプル調製とNTA設定を報告することの重要性を示しています。
図1:代表的なNTAは、リポソームをEVと比較すると報告している。 (A)リポソーム:2020年3月12日にNTAを特徴とする未濾過サンプル。(B)EV:2021年8月26日に国税庁で特徴付けられた未濾過サンプル。略語: NTA = ナノ粒子追跡分析;EVs=細胞外小胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. 一般的なプロトコルガイドライン
- 顕微鏡はエアテーブルの上、または少なくとも振動のないテーブルで維持してください。無関係な振動(足で床を叩く、テーブルに触れる、ドアの閉まる、実験室の交通量など)を最小限に抑えるようにします。
- すべてのビデオ録画でレーザーモジュールの温度を一定温度に設定し、維持します。
注:ナノ粒子サイズアナライザーがその温度で較正されたため、選択された温度は25°Cでした。したがって、機器のすべてのユーザーが校正された温度を知っていて使用することが重要です。室温は変動する可能性があるため、許容できる設定ではありません。 - ネガティブコントロールとも呼ばれるすべての希釈剤(例えば、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、超純粋な蒸留水[DW])が、測定対象のナノ粒子サンプルと同じカメラレベルおよび検出閾値を使用して、すべてNTA特性評価されていることを確認してください。レーザーモジュールのフラッシングとサンプルの希釈に特性化されたDPBSを使用してください。ネガティブコントロールDPBS中の因子汚染物質は、そのレベルが有意であればサンプル結果に。
- 評価前にサンプルを4°Cで保存し、リポソームサンプルを分解するため、凍結しないでください。分析前に、サンプル/標準/希釈剤を室温に30分間温めます。
注:サンプルの取り扱いは、調査対象の材料に固有のものでした。 - クイック測定を使用してサンプルと標準を評価し、適切な希釈を確立して、NTA分析に最適と判断された107~109粒子/mL(約50~100粒子/NTAビデオスクリーン)を取得します。
注:著者らは、この範囲のより高い方の粒子濃度が、より一貫性があり再現性のある結果をもたらすことを見出した。 - [SOP]タブの[キャプチャ]ボックス内に、クイック測定と標準測定の両方に適用可能なすべてのフィールドに、使用する希釈液と希釈液を含めて入力します。
2. 50nmおよび100nmサイズの校正標準品の調製
メモ: 材料表を参照してください。
- 50nmサイズ転写基準希釈1:5,000
- 9,998 μL の 0.22 μm ろ過 10 mM 塩化カリウム (KCl)/0.03% Tween 20 in 超高純度 DW に 2 μL の 50 nm 標準品を 2 回すすぎ洗いした 15 mL 円錐形チューブに加えます。希釈した50 nm標準物質を4°Cで最大1年間保存する。
- 100 nm サイズ 転写基準 希釈 1:333
- 9,970 μL の 0.22 μm ろ過 10 mM KCl/0.03% Tween 20 in 超高純度 DW に 30 μL の 100 nm 標準物質を 2 回すすぎ洗いした 15 mL 円錐形チューブに加えます。希釈した100 nm標準物質を4°Cで最大1年間保存する。
3. レーザーモジュールの洗浄と組み立て
- レーザーモジュールとフローセルカバーウィンドウに傷や欠陥がないか目視で検査します。
メモ: いずれかのガラス表面に傷が付いている場合、画像が影響を受ける可能性があります。 - ガラスの両面を良質のレンズクリーナーとレンズ用紙で優しく拭き取ってください。ティッシュワイプやペーパータオルをガラス表面に使用しないでください。
- 組み立てる前に、Oリングシールがフローセルカバーの溝に正しく取り付けられていることを確認してください。
- フローセルカバーをレーザーモジュールの上に置き、電気接点が正しい向きになっていることを確認します。4本のバネ式蝶ネジをフローセルプレートに通し、レーザーモジュールのネジを噛み合わせますが、個別に締め付けないでください。
- フローセルカバーに均一な圧力をかけ、蝶ネジをぴったりと収まるまで交互の対角線で均一に締めます。指がきつくまで蝶ネジを締めてください。締めすぎないでください。
メモ: 蝶ネジの締め付けが不均一になると、レーザーモジュール表面に亀裂が入るおそれがあります。新しく設計された蝶ネジは、適切な圧力で「ボトムアウト」し、締め過ぎの可能性を回避します。
4. サンプルの前およびサンプル間のレーザーモジュールのフラッシング手順
- DPBSとアリコートの新しく開いた容器を使用して、トリプルリンスした15mLポリプロピレンチューブに入れます。サンプルのフラッシュまたは希釈に使用する製品が、使用前に NTA 特性であることを確認してください (ステップ 1.3 を参照)。
- スリップロックアダプター付きのツベルクリン注射器2本を1mLのDPBSで3回流し、粒子状の残留物を除去します。いずれかのポートを入力として使用しますが、実験中は一貫して使用します。シリンジの重量とサイズの増加からシリンジポートを壊す危険性があるため、より大きなシリンジを使用しないでください。
- プランジャーを1番目の ツベルクリンシリンジから取り外して廃棄し、残りのポートに挿入して、ボイド希釈剤/サンプルリザーバとして機能します。
メモ:プランジャーを取り外しないと、サンプルチャンバ内の圧力が上昇し、シールの周囲に漏れが生じます。 - 2番目の シリンジに 1 mL の DPBS を充填し、フローセルカバーの入口ポートに取り付けます。
- DPBSがレーザーモジュールにゆっくりと注入されるときに、チャンバーから空気がパージされるように、出口シリンジポートを高くしてレーザーモジュールを傾けたままにします。
- 残りのDPBSをレーザーモジュールから流し、1 mLの空気を入口ポートに注入します。フラッシングをさらに2回繰り返します。
- 最後のフラッシュの後、レーザーモジュールをできるだけ完全に空にします。
メモ:これらの粒子はレーザーモジュール内に残留するため、50nm規格のNTA分析後に徹底的かつ慎重なフラッシングが必要です。これで、レーザーモジュールを使用する準備ができました。
5. 顕微鏡ステージへのレーザーモジュールの配置
- 顕微鏡のアームにあるレーザーモジュールのフォーカスアライメントガイド(図2)の位置を確認し、フォーカスノブを使用して位置合わせします。
図2:レーザーモジュールのフォーカスアライメントガイド この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 顕微鏡に面して、溝のあるステージにレーザーモジュールを置き、できるだけ右に静かにスライドさせます。
メモ:慎重に行うと、サンプル間の位置合わせと焦点を見つけやすくなります。 - レーザーコントロールボックスのロッカースイッチをオンにします。
6. レーザーモジュールの集束と位置決め
注:これはチャンバー内の液体で実行する必要があります。
- NTAソフトウェア(資料 表を参照)をデスクトップからロードします。
メモ:「COM3 に温度 H/W が見つかりません」というエラーが表示されることがあります。ソフトウェアを閉じてから再度開くだけで修正できます。 - 左上隅のボックスの[キャプチャ]タブの下にある[カメラの開始]をクリックします。5分後にカメラが自動的にシャットダウンした場合は、[カメラの開始]をもう一度クリックして再起動します。
- 同じタブで、[ カメラ レベル] を 14 ~ 16 に 調整して、レーザー ラインを明るくし、パーティクルの識別とフォーカスを簡素化します。
- カメラから接眼レンズに画像をそらすには、ヘッドピースの左側にある上部のスライダを内外に動かします。
- 一般に 拇印と呼ばれる密度が増加した領域を見つけます。拇印を視野内で垂直方向に中央揃えして焦点を合わせます。
メモ: レーザーの線は拇印の左側にあります。部屋を暗くすると、拇印の位置を特定し、レーザーラインに焦点を合わせやすくなります。 - レーザーラインを視野の中央に配置します。上部のスライダーを動かして、コンピュータ画面で観察されているようにカメラに光をそらします。
注:画面に表示されるレーザーラインは、接眼レンズビューの鏡像です。接眼レンズの左は、コンピュータ画面上で右になります。 - フォーカスノブで画面上の個々の移動粒子の画像をシャープにするためにフォーカスを調整します。
注: 焦点深度により、すべてのパーティクルにピントが合っているわけではありませんが、これは許容範囲です。わずかに焦点が合っていない粒子でも、カメラでキャプチャされ、ソフトウェアによって分析されます。
7. NTA分析のためのレーザーモジュールへの標準/サンプル/希釈液のロード
- すすぎた1 mLツベルクリンシリンジに1 mLの標準/サンプル/希釈剤を引き出し、フローセルカバーの入口ポートに取り付けます。出口ポートに取り付けられたオープンシリンジに液体が見えるまでプランジャーを進めます。
- カメラビューで、レーザーラインの右に移動して、パーティクル数の均一な領域に移動します。必要に応じて、垂直方向を調整して、ライトの水平バンドを中央に配置します。最大数のパーティクルが表示されるまでフォーカスを再配置します。後続のすべてのメジャーで、この位置ができるだけ厳密に維持されるようにします。
- カメラ ビューの右上で、暗い情報シンボルが断続的にオン/オフに点滅するようにカメラ レベルを調整します。
メモ: これにより、各データ収集系列の最小感度レベルで一貫したカメラレベルの選択が確実に行われるようになります。
メモ : カメラレベル はキャプチャ中に変更できません。
8. キャリブレーションの検証
メモ: サンプル分析の前に、サイズ標準(セクション2を参照)を使用してモジュールキャリブレーションを検証することをお勧めします。正確な測定を保証するには、定期的な検証が必要です。マルチユーザー ラボでは、ソフトウェア構成設定をユーザーが個別に調整すると、不注意で不正確なデータ収集が発生する可能性があります。重要なデータ収集では、毎日の検証は実験室での優れた実践の問題です。検証の日々の再現性は、報告された結果に含める必要があります。通常、キャリブレーションは技術者によって設定され、ユーザーが管理者アクセス権を持っていない限り、個々のユーザーが調整することはできません。これにより、個々のユーザーによる不正な再構成が防止されます。
- 希釈した標準物質(セクション2を参照)を室温に30分間温める。
- 規格を簡単に渦巻き、セクション7の説明に従ってロードします。
- セクション 10 で説明されているようにサンプル NTA を実行し、その後の変動係数の計算のために値を記録します (正しく較正されていれば 2% 未満になるはずです)。
9. NTAのサンプル濃度の最適化
メモ:カメラレベルとサンプル濃度が適切に調整されている場合、画面には50〜100個の測定可能な粒子が含まれている必要があります。サンプルに適切な粒子番号があるかどうかについて疑問がある場合は、この時点でサンプルに対して クイック測定 を実行できます(ステップ9.1~9.7を参照)。これは、より長いビデオキャプチャの前にサンプル特性を迅速に評価するために使用されます。 クイック測定 タブは、中央下部のボックスの SOP タブ内にあります。
- [キャプチャ期間] を 30 秒に設定します。
- 既存のベース ファイル名を受け入れるか、生成されたデータの新しいストレージ サイトの [...] タブ をクリックして新しいファイル名を入力します。
- [目標温度]のチェックボックスをオンにして、希望の温度を入力します。
- 前述のようにサンプルをロードし (ステップ 7.1)、 スクリプトの作成と実行をクリックします。
- 30秒のビデオの完了後、フレームあたりのパーティクル数がビデオ画面の右下に表示されるのを待ちます。パーティクルの数が 100 を超える場合は、レーザー モジュールを 3 回フラッシュします (前述の手順 4.6 で説明したとおり)。
- 特徴付けられた希釈剤を用いて試料を所望の濃度範囲に希釈する。
- 適切に希釈されたサンプルをフラッシュされたレーザーモジュールにロードし、 クイック測定 を実行してサンプルが許容範囲内にあることを確認します。
10. NTA のサンプル
メモ: 「標準測定 」タブは、中央下部のボックスの「 SOP 」タブ内にあり、日常的なサンプル分析に使用されます(ステップ 10.1 ~ 10.12 を参照)。
- 再生時間を 30 秒または 60 秒 に設定し、ビデオの数を 5 に設定します。
- 既存のベース ファイル名を受け入れるか、生成されたデータの新しいストレージ サイトの [...] タブ をクリックして新しいファイル名を入力します。
- [目標温度]のチェックボックスをオンにして、希望の温度を入力します。
- 「 スクリプトの作成 」をクリックして、この 標準測定値を再利用します。
- セクション 7 の説明に従ってサンプルが読み込まれ、実験を実行する準備ができたら、[ スクリプトの作成と実行] をクリックします。
- [ レポートの詳細の設定] ポップアップ画面のフィールドに、オペレータ、サンプルの説明、サンプルの希釈、および使用した希釈液に関する情報を入力します。
注:この情報は記録され、最終実験報告書に印刷されます。 - 必要なフィールドがすべて入力されたら、「 OK」 をクリックしてスクリプトを開始します。
メモ :目標 温度が選択されている場合、ヒーターはレーザーモジュール内のサンプルを所望の温度に5秒間安定させてから、スクリプトが測定を続行できるようにします。画面の左下隅にある診断パネルにHEATER ONと表示され、サンプルの温度が表示されます。 - 各ビデオキャプチャの前に、プランジャーを手動で 進め るプロンプトを探します。約0.05mLのサンプルをレーザーチャンバーに注入し、粒子が「静止」(すなわち、流れていない)になるのを許し、「 OK」をクリックします。
- 5番目のビデオキャプチャの完了時に設定確認ボックスが表示され、プロセスボックスが点滅するのを待ちます。ビデオ画面の下部からフレームが手動で進められるときに、画面上の青い十字マーク粒子の数に注目して、サンプルの処理のための検出しきい値を設定します。フレームが進むにつれて各画面に粒子を示す青い十字が 3 ~ 4 個以上ある場合は、[検出しきい値] を増やします。
注:個々の粒子の青い十字は、フローサイトメトリーの「群れ」効果に類似しており、データ収集の最適な精度と再現性のために最小限に抑える必要があります。 - 検出しきい値が許容できる場合は 、[設定 OK ] をクリックします。
- ビデオが自動的に処理され、結果のヒストグラムと完了のダイアログボックスの通知が表示されるのを待ってから、[ OK]をクリックします。
- [エクスポート設定] ボックスが表示されたら、[エクスポート] をクリックして結果を保存します。
注: ビデオおよび分析からのすべての結果は、ステップ 10.2 で定義された宛先ファイルに保存されます。これには大量のストレージが必要です。必要に応じて、セカンダリ・ストレージ・デバイスを監視して転送します。
11. 異なる検出閾値での現在のサンプルの再分析
メモ: NTA 分析の直後 (ステップ 10)、異なる検出しきい値設定を使用してデータを再分析できます。ただし、 キャプチャ後にカメラレベル を変更することはできません。
- 現在の実験にリストされている 5 つのキャプチャ ビデオをすべて強調表示します。
- 「 選択したファイルを処理」をクリックし、「 設定の確認 」ボックスが表示され、「 プロセス」ボックス が点滅して 「検出しきい値」が変更されるのを待ちます。
- 検出しきい値を目的のレベルに調整し、「設定OK」をクリックします。
- ビデオが自動的に処理され、結果のヒストグラムと完了のダイアログボックスの通知が表示されるのを待ってから、[ OK]をクリックします。
- 「設定のエクスポート」をクリックします。最新のサンプルに対して追加の評価が実行される場合は、サンプルの再分析後に [結果のエクスポート] ポップアップ ボックスが表示されないため、現在の実験の [結果のエクスポート] ボックスを必ずクリックしてください。
注:これを行うためのリマインダーがないため、簡単に見落とされ、分析が失われます。ただし、基になるデータは残り、後で再分析できます。
12. アーカイブファイルの分析
注: 以前に分析した実験が保存されていない場合、またはこれらのサンプルに対して追加の分析を行う必要がある場合は、個々のファイルを NTA ソフトウェアに再ロードして、追加の 検出しきい値 評価を行うことができます。 カメラレベルの 変更は、キャプチャ後に変更することはできません。
- デスクトップからNTAソフトウェアをロードします。
- 中央パネル下部の[ 解析 ]タブをクリックします。
- [ 実験を開く] をクリックし、目的の .nano ファイルに移動します。
注: 選択した .nano 実験に関連付けられているビデオ ファイルは、メインの実験ファイルと同じフォルダーにある必要があります。そうしないと、ファイルを処理しようとするとエラーが表示されます。ファイル名の最初の 6 桁は、実験が実行された日付 (xx-xx-xx) です。ファイル名の最後の 6 桁は、ビデオが録画された時刻 (xx-xx-xx) と個々のビデオ識別子です。結合された各実験の PDF ファイルには、その分析に含まれる .nano ファイルが一覧表示されます。 - 「 選択したファイルの処理 」をクリックして、分析を実行します。
- [プロセス] ボックスが点滅して検出しきい値の変更が可能になったら、しきい値を目的のレベルに設定し、[OK] をクリックします。
- ビデオが自動的に処理され、結果のヒストグラムと完了のダイアログボックスの通知が表示されるのを待ってから、[ OK]をクリックします。
- 「結果のエクスポート」をクリックします。再分析後に [結果のエクスポート] ポップアップ ボックスが表示されないため、[現在の実験] の [結果のエクスポート] ボックスを必ずクリックしてください。
注:これを行うためのリマインダーがないため、簡単に見落とされ、分析が失われます。
13. レーザーモジュールの清掃・分解
- レーザーコントロールボックスの電源を切ります。
- レーザーモジュールからサンプル全体を洗い流し、適切に廃棄します。
- DPBSがレーザーモジュールにゆっくりと注入され、出口シリンジポートからフラッシュされるときに、チャンバから空気がパージされるように、開いたシリンジポートを高くしてレーザーモジュールを傾けたままにします。
- 残りのDPBをレーザーモジュールからフラッシュし、廃棄します。
- フラッシングをさらに2回繰り返し、最後のフラッシュ後にレーザーモジュールをできるだけ完全に空にします。
- フローセルカバーに均一な圧力をかけ、ねじから外れるまで蝶ネジを交互に斜めに均一に緩め、蝶ネジを取り外してレーザーモジュールケースに保管します。
- レーザーモジュールからフローセルカバーを取り外します。
- ガラスの両面を良質のレンズクリーナーとレンズ用紙で優しく拭き取ってください。ガラス面にティッシュペーパーやペーパータオルを使用しないでください。
- レーザーモジュールとフローセルカバーの「窓」に使用後の傷や欠陥がないか目視で検査し、スーパーバイザーに報告してください。
- レーザーモジュールとフローセルカバーをケースに取り付けて、保管中のガラス表面の損傷を防ぎます。
14. サンプル分析プロトコル
- フィルター処理されていないサンプル
- ロードする前にサンプルを渦巻き、上記のようにカメラレベル12と検出しきい値レベル3で5 x 60秒のビデオを録画します。検出しきい値 2 と 5 を使用して、これらのビデオを再分析します。
- 同じサンプルのビデオコレクションをカメラレベル13と14、検出しきい値レベル3で繰り返します。検出しきい値 2 と 5 を使用して、これらの 2 つの追加ビデオを再分析します。SOP設定で5 x 30秒のビデオを使用してプロセス全体を繰り返します。
- フィルター処理されたサンプル
- サンプルを渦巻き、同時にレーザーモジュールに直接ロードしてろ過します(0.22μmシリンジフィルター)。
注:シリンジフィルターは、常駐微粒子を除去するために使用する前に、フィルターデッドスペースの2倍の体積でフラッシュしました。シリンジフィルター( 材料表を参照)は、0.5mLの測定デッドスペースを有し、測定前に1.0mLのサンプルでフラッシュされた。 SOP データ・フィールドのフィルター・タイプに注意してください。濾過されたサンプルは、ステップ14.1でフィルタリングされていないサンプルについて説明したとおりに正確に処理された。
- サンプルを渦巻き、同時にレーザーモジュールに直接ロードしてろ過します(0.22μmシリンジフィルター)。
15. 国税庁の調査結果の統計分析
- 主効果または交互作用の分析では、分散分析(正規性、単峰性、分散の均質性)のチェックに続いて分散分析を実行します。クラスカル・ウォリス一方向分散分析は、ANOVA仮定が失敗した場合にランクで使用します。
- 有意な主効果が返されたら、Dunn の方法を使用して、事前に計画された比較の平均検定を実行します。p値0.05は両側検定で有意であると考えてください。
注:ここで生成されたデータファイルは、材料移転契約の完了後に著者から入手できます。
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Representative Results
表1 は、リポソームサンプル(18個の濾過済みおよび18個の未濾過)および代表的なDPBS希釈剤についてのNTAビデオの結果を含む。このホワイトペーパーでは、カメラレベルまたは検出しきい値に関係なく、2つのグループ間の比較が完了しました。濾過されたサンプルは、平均粒子径108.5nm、粒子モード86.2nm、および濃度7.4×108 粒子/mLであった。対照的に、濾過されていないサンプルは、平均粒子径が159.1nm、粒子モードが105.7nm、濃度が7.6×108 粒子/mLであった。フィルタリングされたサンプルおよびフィルタリングされていないサンプルの平均値およびモード値は、カメラレベルまたは検出閾値にかかわらず、統計的に有意であった(p<0.05)。フィルターをかけたサンプルとろ過されていないサンプルの間の濃度の差は、カメラレベルまたは検出閾値に関係なく、有意ではありませんでした(p = 0.86)。
| フィルター処理されたサンプルとフィルター処理されていないサンプルの比較 | ||||||||||||
| 見本 | カムレフ | デット Thr | 意味する | 平均 %CV | セントデブ | × 108 | セントデベ× 107 | |||||
| フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | フィルター | |||
| リポソーム | 12 | 3 | 138.3 | 162.1 | 55.5 | 47.5 | 76.7 | 77 | 3.2 | 6.48 | 1.74 | 3.16 |
| リポソーム | 12 | 2 | 126.3 | 153.7 | 58.7 | 49.8 | 74.2 | 76.5 | 4.94 | 8.23 | 2.74 | 3.5 |
| リポソーム | 12 | 5 | 155 | 172.2 | 51.8 | 45.6 | 80.3 | 78.6 | 1.91 | 5.05 | 1.02 | 2.9 |
| リポソーム | 13 | 3 | 102.7 | 169 | 43.5 | 51.3 | 44.7 | 86.7 | 6.72 | 7.75 | 1.91 | 1.17 |
| リポソーム | 13 | 2 | 95.8 | 161.4 | 43.3 | 52.7 | 41.5 | 85 | 10.3 | 9.7 | 1.61 | 1.83 |
| リポソーム | 13 | 5 | 110.7 | 176.1 | 42.5 | 47.1 | 47 | 83 | 4.16 | 6.28 | 1.83 | 1.07 |
| リポソーム | 14 | 3 | 98 | 147.6 | 42.4 | 43.8 | 41.6 | 64.6 | 10.6 | 8.56 | 2.4 | 1.66 |
| リポソーム | 14 | 2 | 92.9 | 142.1 | 42.6 | 45.2 | 39.6 | 64.3 | 14.9 | 10.7 | 2.54 | 1.83 |
| リポソーム | 14 | 5 | 103.8 | 153.8 | 41.1 | 42.6 | 42.7 | 65.5 | 7.42 | 7.02 | 2.37 | 1.51 |
| リポソーム | 12 | 3 | 105.6 | 179.4 | 22.2 | 46.7 | 23.4 | 83.7 | 5.2 | 5.81 | 1.06 | 4.28 |
| リポソーム | 12 | 2 | 100.3 | 170.8 | 24.3 | 49.1 | 24.4 | 83.8 | 7.76 | 7.39 | 1.61 | 4.41 |
| リポソーム | 12 | 5 | 112 | 187.2 | 20.4 | 42.9 | 22.8 | 80.4 | 3.27 | 4.68 | 0.815 | 3.93 |
| リポソーム | 13 | 3 | 99.8 | 153.3 | 23.4 | 52.1 | 23.4 | 79.8 | 7.19 | 7.34 | 3.37 | 1.5 |
| リポソーム | 13 | 2 | 94.3 | 143.6 | 25.8 | 53.2 | 24.3 | 76.4 | 10.8 | 9.53 | 4.3 | 2.46 |
| リポソーム | 13 | 5 | 106.8 | 162 | 21.3 | 49.4 | 22.7 | 80 | 4.64 | 5.76 | 2.63 | 1.01 |
| リポソーム | 14 | 3 | 103.4 | 142.3 | 31.7 | 49.6 | 32.8 | 70.6 | 9.91 | 8.66 | 3.29 | 12.5 |
| リポソーム | 14 | 2 | 97.8 | 136 | 33.3 | 51.4 | 32.6 | 69.9 | 13.8 | 11.5 | 2.98 | 15.7 |
| リポソーム | 14 | 5 | 109.5 | 151.4 | 31.1 | 49.5 | 34 | 74.9 | 7.27 | 6.76 | 3.42 | 10.1 |
| 平均 | 108.5 | 159.1 | 36.4 | 48.3 | 40.5 | 76.7 | 7.4 | 7.6 | 2.3 | 4.1 | ||
表 1: フィルター処理されたサンプルとフィルター処理されていないサンプルについて収集された値、標準偏差、および変動係数のパーセントのデータ テーブル。 略語: Cam Lev = カメラレベル;Det Thr = 検出しきい値;CV = 変動係数;セントデブ = 標準偏差;濃度=濃度。
リポソームサンプルの結果を検出閾値(2、3、5)およびカメラレベル(12、13、14)によって解析したところ、結果は有意ではなかった(図3)。これらの個々のレベルのそれぞれで3つの評価(n = 3)しかなかったことに留意すべきである。各カメラレベルと検出しきい値でのこの小さなサンプルサイズは、個々の比較が有意ではないことに寄与している可能性があります。しかし、検出閾値(2、3、5)サンプルを、フィルターサンプルと非フィルターサンプル(n = 3)のカメラレベルに関係なく評価した場合、平均サイズ(図3A)とモードサイズ(図3B)の両方が有意に異なっていた(p<0.05)。対照的に、濾過されたサンプル濃度と濾過されていないサンプル濃度の差(図3C)は有意差はなかった。
図3:フィルターサンプルとフィルターなしサンプルの測定粒子サイズと濃度に対するカメラレベルと検出しきい値の影響。平均(A)およびモード(B)は、検出閾値が2から3から5(n=3)に増加したように、カメラレベル12、13、14を合わせた粒子サイズで、濾過されたサンプルの粒子サイズの有意な減少を示した。検出閾値として組み合わせたカメラレベル12、13、14における粒子濃度(C)は、2から3から5に増加した)(n = 3)が、濾過されたサンプルと濾過されていないサンプルとの間に有意差なく検出閾値が増加するにつれて濃度減少を示した。カメラレベルが12から14(n = 3)に増加するにつれて、複合検出閾値における平均(D)およびモード(E)粒径は、濾過されたサンプルの粒径の減少を示す。カメラレベルが12から14(n = 3)に増加したときの複合検出閾値での粒子濃度(F)は、フィルタリングされたサンプルとフィルタリングされていないサンプルの間に有意差なくカメラレベルが増加するにつれて濃度の増加を示す。省略形: DT = 検出しきい値。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
検出閾値レベル(n = 3)に関係なく、3つのカメラレベル(12、13、14)を評価したところ、フィルタ処理されたサンプルでは平均サイズ(図3D)とモードサイズ(図3E)の両方が増加しました。サンプル濃度は、カメラレベルが12から14に増加するにつれて増加する傾向を示した(図3F)。異なるカメラレベルで評価されたフィルターサンプル濃度と非ろ過サンプル濃度の違いは有意差はなかった。
補足ファイル1:このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ナノ粒子11のサイズおよび濃度を推定するために利用可能ないくつかの方法がある。これらには、動的光散乱(DLS)、遠心沈降、および単一粒子レベルの分析 - 電子顕微鏡、NTA、原子間力顕微鏡、および調整可能な抵抗パルスセンシングを含む、集団からサイズ推定値を生成するアンサンブル法が含まれる。これらのうち、DLSおよびNTAは、理想的な媒体中でのブラウン運動に基づく、非破壊的なサイズおよび濃度測定方法として広く使用されている。DLSは光の散乱に依存し、強度は粒子体積の2乗に比例する。したがって、DLSは、大きな粒子、凝集体、または多分散集団の存在に対してNTAよりも敏感である。
NTA は、連続するビデオ フレームで測定された個々の粒子のパス長から拡散係数を計算します。NTAの主な制限は、DLSやその他の測定方法と比較して評価できる粒子濃度の範囲が狭いため、個々の粒子経路長が顕微鏡の回折限界とトラッキングソフトウェアの能力内に収まらなければならないことです。DLSとNTAはブラウン運動に依存しているため、どちらも単分散集団で良好なサイズ一致を示すことが期待できます。多分散集団と凝集体を持つ集団を評価するときに発散します。後者はDLSを役に立たなくし、NTAの粒径推定値を大幅に増加させる12。NTAの最もよく知られている限界は、他の測定方法よりもはるかに低い粒子濃度(またはより大きな希釈)を必要とすることです。それにもかかわらず、NTAの特性評価はナノ材料研究において一般的である。NTAのサイズと濃度の推定値は、記録長、カメラレベル、検出閾値、サンプル希釈などの定義された温度、ビデオキャプチャ設定が再現性が高いため、このホワイトペーパーでは、再現性の高い結果を生成するためにこれらを報告する必要性に焦点を当てます。
このホワイトペーパーでは、標準化されたプロトコルを使用することで結果の複製が可能になり、サイズ標準などのポジティブコントロールを利用することで、マシンのキャリブレーションに関する情報が得られることを示しています。さらに、これらの結果は、レーザーモジュールチャンバー温度、カメラレベル、検出しきい値、およびろ過(フィルターの種類とサイズ)を報告することの重要性を示しました。対照的に、レーザーモジュールチャンバーの温度、希釈剤、および希釈係数は、正確で再現性のある結果を得るためにも同様に重要です。MISEV2018もEV-TRACKも、この情報を含めることを特に推奨していませんが、これらの詳細を含めることで、公表された結果の独立した確認が可能になり、実験計画に堅牢性が加わることを示唆しています。
EV分析におけるNTA較正にラテックスサイズ較正標準を使用することの限界は認められており、同様のサイズの脂質二重層ナノ粒子と比較して既知の屈折率差が含まれる。この論文では、ラテックスビーズを使用して、測定前に機械校正を確認し、検出限界を決定するために使用しませんでした。リポソームは、天然に存在するEVの膜と同様の膜を有し、屈折率も同様にEVの代表となる。サイズ標準およびリポソームサンプルは、単分散集団である。したがって、それらのサイズ分布はガウス分布または対数正規分布に従います。天然EVは多分散であり、そのサイズ分布はべき乗則関数13に従う。
歴史的に、NTAの特性評価を使用する出版物は、研究成果を複製するために必要な詳細を一貫して報告していません。NTA データを再現する機能は、元のデータのキャプチャに使用された設定を複製する機能に依存します。この情報がなければ、NTAを用いた実験結果の再現は極めて困難になります。設定されたプロトコルを厳格に遵守し、NTAで使用される設定パラメータを公開することで、結果の正確な複製を達成することができます。ナノ粒子サイズ分析器を使用して、サイズ、濃度、組成、および純度のナノ粒子特性評価の一貫性を向上させるために、以下の推奨事項が推奨されます。
まず、ラテックスサイズ標準などの適切なサイズ標準を使用してナノ粒子サイズ分析装置の校正を常に確認してください。これは定期的に行い、重要なサンプルの分析前に機器ログに記録する必要があります。次に、レーザーモジュールチャンバー温度、カメラレベル、検出しきい値などの調整可能なすべてのパラメータは、使用する希釈液や希釈剤と同様に、サンプルログファイルに各サンプルについて記録する必要があります。これらのパラメータはオペレータに依存し、NTA測定に影響を与えるため、報告する必要があります。第三に、サンプル希釈に使用される希釈剤は、ナノ粒子含有量について特徴付けられ、報告される必要がある。個々のナノ粒子サンプルに使用される希釈剤は、希釈サンプルに使用されるものと同じカメラレベルおよび検出閾値設定を使用して評価する必要があります。第四に、シリンジフィルターは、データ収集またはサンプル調製ステップの前にデッドスペース容量の2倍でフラッシュして、製造プロセスから残っている多数の微粒子をフラッシュする必要があります。第5に、サンプル内のナノ粒子の濃度は、mL当たり1.0〜1.0×1.0〜109の提案された最適×内に調整されるべきである。
本研究における上述の限界を認識して、我々は、NTAによって得られたサイズおよび濃度値の両方が、カメラレベルおよび検出閾値などのNTAパラメータによって影響され得ること、およびサイズが、濃度ではなく、サンプル調製によって影響され得ることを示す。これにより、ナノ材料およびEV文献でこれらのパラメータを報告し、EVソース、単離、およびその他の実験変数の影響を体系的に調査できるように、堅牢で再現可能な文献の作成を可能にすることが決定的に重要になります。
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Disclosures
いずれの著者も利益相反を負わない。
Acknowledgments
この研究は、カンザス州から中西部比較幹細胞生物学研究所(MICSCB)、ジョンソンがん研究センターからMLW、NIH R21AG066488からLKCに支援されました。OLSはMICSCBからGRA支援を受けた。著者らは、このプロジェクトで使用されたリポソームを提供してくれたSantosh Aryal博士と、WeissとChristensonの研究室のメンバーに有益な会話とフィードバックに感謝している。ホン・ヘ博士は技術サポートに感謝しています。MLWはベッティ・ゴレン・ワイスのサポートと助言に感謝する。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
References
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- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
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