Summary
Nanopartikelspårningsanalys (NTA) är en allmänt använd metod för att karakterisera extracellulära vesiklar. Detta dokument belyser NTA-experimentella parametrar och kontroller plus en enhetlig metod för analys och karakterisering av prover och utspädningsmedel som är nödvändiga för att komplettera de riktlinjer som föreslås av MISEV2018 och EV-TRACK för reproducerbarhet mellan laboratorier.
Abstract
Nanopartikelspårningsanalys (NTA) har varit en av flera karakteriseringsmetoder som används för forskning om extracellulär vesikel (EV) sedan 2006. Många anser att NTA-instrument och deras mjukvarupaket enkelt kan användas efter minimal utbildning och att storlekskalibrering är möjlig internt. Eftersom både NTA-förvärv och mjukvaruanalys utgör EV-karakterisering behandlas de i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Dessutom har de övervakats av Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) för att förbättra robustheten hos EV-experiment (t.ex. minimera experimentell variation på grund av okontrollerade faktorer).
Trots ansträngningar för att uppmuntra rapportering av metoder och kontroller misslyckas många publicerade forskningsartiklar med att rapportera kritiska inställningar som behövs för att reproducera de ursprungliga NTA-observationerna. Få artiklar rapporterar NTA-karakteriseringen av negativa kontroller eller utspädningsmedel, uppenbarligen förutsatt att kommersiellt tillgängliga produkter, såsom fosfatbuffrad saltlösning eller ultrarent destillerat vatten, är partikelfria. På samma sätt rapporteras positiva kontroller eller storleksstandarder sällan av forskare för att verifiera partikelstorlek. Stokes-Einstein-ekvationen innehåller provviskositet och temperaturvariabler för att bestämma partikelförskjutning. Att rapportera den stabila laserkammartemperaturen under hela provvideoinsamlingen är därför en viktig kontrollåtgärd för korrekt replikering. Filtrering av prover eller utspädningsmedel rapporteras inte heller rutinmässigt, och i så fall ingår sällan filtrets detaljer (tillverkare, membranmaterial, porstorlek) och lagringsförhållanden. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) minimala standarder för acceptabla experimentella detaljer bör innehålla ett väldokumenterat NTA-protokoll för karakterisering av elbilar. Följande experiment ger bevis för att ett NTA-analysprotokoll måste upprättas av den enskilda forskaren och inkluderas i metoderna för publikationer som använder NTA-karakterisering som ett av alternativen för att uppfylla MISEV2018-kraven för enstaka vesiklarakterisering.
Introduction
Noggrann och repeterbar analys av elbilar och andra partiklar i nanometerskala utgör många utmaningar inom forskning och industri. Replikering av EV-forskning har varit svårt, delvis på grund av bristen på enhetlighet i rapporteringen av nödvändiga parametrar i samband med datainsamling. För att ta itu med dessa brister föreslog ISEV branschriktlinjer som en minimal uppsättning biokemiska, biofysiska och funktionella standarder för EV-forskare och publicerade dem som ett ställningstagande, vanligen kallat MISEV20141. Den accelererande takten i EV-forskningen krävde en uppdaterad riktlinje, och "MISEV2018: a position statement of the ISEV" utvidgade MISEV2014-riktlinjerna2. MISEV2018-papperet innehöll tabeller, konturer av föreslagna protokoll och steg att följa för att dokumentera specifik EV-associerad karakterisering. Som en ytterligare åtgärd för att underlätta tolkning och replikering av experiment utvecklades EV-TRACK som en crowdsourcing-kunskapsbas (http://evtrack.org) för att möjliggöra en mer transparent rapportering av EV-biologi och den metod som används för publicerade resultat3. Trots dessa rekommendationer för standardiserad rapportering av metoder fortsätter fältet att lida när det gäller replikering och bekräftelse av publicerade resultat.
I överensstämmelse med National Institutes of Healths och National Science Foundations ansträngningar för kvalitetsbedömningsverktyg, föreslår detta dokument att ISEV kräver standardiserad rapportering av metoder och detaljer så att databedömningsverktyg kan tillämpas med målet att replikera resultat mellan laboratorier. Rapportering av cellkällor, cellodlingsförfaranden och EV-isoleringsmetoder är viktiga faktorer för att definiera EV-populationens egenskaper. Bland NTA-instrument gör faktorer som detektionsinställningar, brytningsindex för bärarvätska, heterogena partikelpopulationer som bidrar till polydispersitet, brist på standardiserade rapporteringskrav och frånvarande mätresultat inom och mellan observatörer NTA-jämförelse mellan laboratorier svår eller omöjlig.
NTA har använts sedan 2006 och är en populär metod för nanopartikelstorlek och koncentrationsbestämning som för närvarande används av cirka 80% av EV-forskarna4. MISEV2018-riktlinjerna kräver två former av en-vesiklaranalys, varav NTA är ett av de populära alternativen. NTA fortsätter att vara i allmänt bruk för EV-karakterisering på grund av dess breda tillgänglighet, låga kostnad per prov och dess enkla grundteori (Stokes-Einstein-ekvationen). EV-bedömning av NTA genererar en partikelstorleksfördelning och koncentrationsuppskattning med hjälp av laserljusspridning och brunisk rörelseanalys, med den nedre detektionsgränsen bestämd av EV: s brytningsindex. Vid användning av ett vätskeprov med känd viskositet och temperatur spåras EV: s banor för att bestämma deras genomsnittliga kvadratiska förskjutning i två dimensioner. Detta gör att partikeldiffusionskoefficienten kan beräknas och omvandlas till en sfärekvivalent hydrodynamisk diameter med en modifierad Stokes-Einstein-ekvation 5,6,7. NTA:s partikel-till-partikelanalys har mindre interferens av agglomerat eller större partiklar i en heterogen population av elbilar än andra karakteriseringsmetoder7. Medan några större partiklar har minimal inverkan på storleksnoggrannheten, resulterar närvaron av jämna små mängder stora, höga ljusspridningspartiklar i en anmärkningsvärd minskning av detekteringen av mindre partiklar på grund av minskad programvara EV-detektering och spårning8. Som mätteknik anses NTA i allmänhet inte vara partisk mot större partiklar eller aggregat av partiklar utan kan lösa populationer av flera storlekar genom individuell partikelanalys9. På grund av användningen av ljusspridning av partiklar är en av begränsningarna med NTA-analys att alla partiklar som damm, plast eller pulver med liknande brytnings- och storleksattribut jämfört med elbilar inte kan särskiljas från faktiska elbilar med denna karakteriseringsmetod.
NanoSight LM10 (nanopartikelstorleksanalysator) och LM14 (lasermodul) har sålts sedan 2006, och även om nyare modeller av detta instrument har utvecklats, finns just denna modell i många kärnanläggningar och anses vara en pålitlig arbetshäst. Utbildning behövs för att korrekt optimera NTA-inställningarna för högupplösta mätningar av storlek och koncentration. De två viktiga inställningar som behövs för optimala videoinspelningar är (1) kameranivån och (2) detekteringströskeln. Dessa måste fastställas av operatören på grundval av provets egenskaper. En av de största begränsningarna med NTA-analys är rekommendationen av provkoncentrationer mellan 107 och 109 partiklar/ml, för att uppnå detta kan provutspädning krävas10. Lösningar som används för utspädning, såsom fosfatbuffrad saltlösning, 0,15 M saltlösning eller ultrarent vatten, är sällan fria från partiklar som är mindre än 220 μm stora, vilket kan påverka NTA-mätningarna. NTA-karakterisering av de lösningar som används för utspädning bör utföras på samma kameranivå och detektionströskel som de nanopartikelprover som analyseras. Storleken och koncentrationen av nanopartiklar som finns i utspädningsmedel som används för ev-provutspädningar ingår sällan i publikationer som involverar NTA-analys av elfordon.
Detta protokoll använder NTA-analys av syntetiska EV-liknande liposomer utvärderade med hjälp av utvalda kameranivåer, detektionströsklar och mekanisk filtrering av proverna för att analysera de systematiska effekterna av kameranivå, detektionströskel eller provfiltrering på NTA-datasetet. Liposomer syntetiserades enligt beskrivningen i tilläggsfil S1. Syntetiska liposomer användes i detta experiment på grund av deras storleksenhetlighet, fysiska egenskaper och stabilitet vid lagring vid 4 ° C. Även om faktiska prover av elbilar kunde ha använts, kan heterogeniteten och stabiliteten hos elbilar under lagring ha komplicerat denna studie och dess tolkning. Likheter i NTA-rapporterna från (A) liposomer och (B) EVs indikerar att de systematiska effekterna som avslöjas för liposomer i detta papper sannolikt också kommer att gälla för EV-karakterisering (Figur 1). Tillsammans stöder dessa resultat uppfattningen att fullständig rapportering av kritiska programvaruinställningar och beskrivningen av provbehandling, såsom utspädningsmedel, utspädning och filtrering, påverkar reproducerbarheten av NTA-data.
Syftet med detta dokument är att visa att varierande NTA-inställningar (temperatur, kameranivå och detektionströskel) och provberedning förändrar de insamlade resultaten: systematiska, signifikanta skillnader i storlek och koncentration erhölls. Eftersom NTA är ett av de populära alternativen för att uppfylla MISEV2018-karakteriseringsspecifikationen, visar dessa resultat vikten av att rapportera provberedning och NTA-inställningar för att säkerställa reproducerbarhet.
Figur 1: Representativa NTA-rapporter för att jämföra liposomer med elbilar. A) Liposomer: ofiltrerat prov som karakteriseras på NTA den 12 mars 2020. (B) Elfordon: ofiltrerat prov som karakteriserades på NTA den 26 augusti 2021. Förkortningar: NTA = Nanopartikelspårningsanalys; EVs = extracellulära vesiklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmänna riktlinjer för protokollet
- Håll mikroskopet på ett luftbord eller åtminstone på ett vibrationsfritt bord. Se till att externa vibrationer (t.ex. fotknackning på golvet, beröring av bordet, dörrstängningar, laboratorietrafik) hålls till ett minimum.
- Ställ in och behåll lasermodulens temperatur vid en konstant temperatur för alla videoinspelningar.
OBS: Den valda temperaturen var 25 ° C eftersom nanopartikelstorleksanalysatorn kalibrerades vid den temperaturen. Därför är det viktigt att alla användare av instrumentet känner till och använder den kalibrerade temperaturen. Rumstemperatur är inte en acceptabel inställning eftersom den kan variera. - Se till att alla utspädningsmedel, även kallade negativa kontroller (t.ex. Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS), ultrarent destillerat vatten [DW]), alla är NTA-karakteriserade med samma kameranivå och detektionströskel som nanopartikelproverna som mäts. Använd karakteriserad DPBS för spolning av lasermodulen och utspädning av prover. Faktorföroreningar i den negativa kontrollen DPBS i provresultat om deras nivåer är signifikanta.
- Förvara prover vid 4 ° C före utvärdering och frys aldrig dem eftersom detta skulle försämra liposomprovet. Varma prover/standarder/utspädningsmedel till rumstemperatur i 30 min före analys.
OBS: Provhanteringen var specifik för det material som undersöktes. - Utvärdera prov och standarder med hjälp av snabbmätning för att fastställa en lämplig utspädning för att erhålla 107 till 109 partiklar / ml (cirka 50 till 100 partiklar / NTA-videoskärm) som fastställts vara optimal för NTA-analyser.
OBS: Författarna har funnit att partikelkoncentrationer i den högre änden av detta intervall ger mer konsekventa och reproducerbara resultat. - Fyll i alla tillämpliga fält i rutan Capture på fliken SOP för både snabb- och standardmätningar , inklusive den utspädning och utspädningsmedel som används.
2. Förberedelse av kalibreringsstandarder för 50 nm och 100 nm
OBS: Se materialförteckningen.
- 50 nm storlek Överföringsstandarder utspädda 1: 5,000 XNUMX
- Tillsätt 2 μL av 50 nm-standarderna till 9 998 μL 0,22 μm-filtrerad 10 mM kaliumklorid (KCl)/0,03% Tween 20 i ultraren DW i ett två gånger sköljt 15 ml koniskt rör. Förvara den utspädda 50 nm-standarden vid 4 °C i upp till ett år.
- 100 nm storlek Överföringsstandarder utspädda 1:333
- Tillsätt 30 μL av 100 nm-standarderna till 9 970 μL 0,22 μm-filtrerad 10 mM KCl/0,03% Tween 20 i ultrarent DW i ett två gånger sköljt 15 ml koniskt rör. Förvara den utspädda 100 nm-standarden vid 4 °C i upp till ett år.
3. Rengöring och montering av lasermodulen
- Inspektera lasermodulen och flödescellens lockfönster visuellt för repor eller brister.
OBS: Om någon av glasytorna är repad kan avbildningen påverkas. - Rengör båda glasytorna försiktigt med en linsrengörare av god kvalitet och linspapper. Använd inte mjukpappersservetter eller pappershanddukar på glasytor.
- Se till att O-ringtätningen sitter ordentligt i spåret på flödescellkåpan före montering.
- Placera flödescellkåpan på lasermodulen, så att de elektriska kontakterna är i rätt riktning. Placera de 4 fjäderbelastade tumskruvarna genom flödescellplattan och koppla in lasermodulens trådar men dra inte åt individuellt.
- Sätt jämnt tryck ner på flödescellkåpan, dra åt tumskruvarna jämnt på ett alternerande diagonalt sätt tills de sitter tätt. Dra bara åt tumskruvarna tills de är fingertäta. Försörta inte.
OBS: Ojämn åtdragning av tumskruvarna kan spricka lasermodulens yta. Nydesignade tumskruvar kommer att "bottna ut" vid rätt tryck, vilket undviker eventuell övertätning.
4. Spolningsförfarande för lasermodulen före och mellan proverna
- Använd en nyöppnad behållare med DPBS och alikvot i trippelsköljade 15 ml polypropenrör. Se till att produkter som används för att spola eller späda prover är NTA-karakteriserade före användning (se steg 1.3).
- Spola två 1 ml tuberkulinsprutor med glidlåsadaptrar 3 gånger med 1 ml DPBS för att avlägsna eventuella partikelrester. Använd endera porten som indata men använd den konsekvent under experimentet. Använd inte större sprutor på grund av risken att bryta sprutportar från sprutans ökade vikt och storlek.
- Ta bort och kasta kolven från denförsta tuberkulinsprutan och sätt in den i den återstående porten för att fungera som en tömd utspädningsmedel / provbehållare.
OBS: Underlåtenhet att ta bort kolven kommer att orsaka ökat tryck i provkammaren och läckage runt tätningen. - Fyll denandra sprutan med 1 ml DPBS och fäst den på inloppsporten på flödescellkåpan.
- Håll lasermodulen lutad med utloppssprutan förhöjd så att luft kan rensas från kammaren när DPBS injiceras långsamt i lasermodulen.
- Spola återstående DPBS från lasermodulen genom att injicera 1 ml luft i inloppsporten. Upprepa spolningen ytterligare 2 gånger.
- Töm lasermodulen så fullständigt som möjligt efter den sista spolningen.
OBS: Noggrann, noggrann spolning är nödvändig efter NTA-analys av 50 nm-standarden, eftersom dessa partiklar kvarstår i lasermodulen. Lasermodulen är nu redo att användas.
5. Placering av lasermodulen på mikroskopsteget
- Leta reda på lasermodulens fokusjusteringsguider på mikroskopets arm (figur 2) och rikta in dem med fokusratten.
Figur 2: Fokusjusteringsguide för lasermodul. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Vänd mot mikroskopet, placera lasermodulen i det räfflade steget och skjut den försiktigt så långt som möjligt till höger.
OBS: Om det görs noggrant blir justeringen och fokuspunkten lättare att hitta mellan proverna. - Slå på vippomkopplaren på laserkontrollboxen.
6. Fokusering och positionering av lasermodulen
OBS: Detta måste utföras med vätska i kammaren.
- Ladda NTA-programvaran (se materialförteckningen) från skrivbordet.
OBS: Ett fel kan visas, "Temperatur H / W hittades inte på COM3." Stäng bara och öppna programvaran igen för att fixa den. - Klicka på Starta kamera under fliken Capture i den övre vänstra hörnrutan. Om kameran stängs av automatiskt efter 5 minuter klickar du bara på Starta kameran igen för att starta om den.
- På samma flik justerar du kameranivån till 14 till 16 för att lysa upp laserlinjen och förenkla partikelidentifiering och fokus.
- Avled bilden från kameran till okularen genom att flytta den övre skjutreglaget på vänster sida av huvudstycket in eller ut.
- Hitta området med ökad densitet, vanligtvis kallad tumavtrycket. Centrera och fokusera tumavtrycket vertikalt i synfältet.
OBS: Laserlinjen kommer att vara till vänster om tumavtrycket. Mörkare rum kan hjälpa till att underlätta lokalisering av tumavtrycket och fokusering på laserlinjen. - Centrera laserlinjen i synfältet; flytta det övre skjutreglaget för att avleda ljus till kameran som observerats på datorskärmen.
OBS: Laserlinjen som nu syns på skärmen är en spegelbild av okularvyn; vänster i okularen kommer att vara rätt på datorskärmen. - Justera fokus för att skärpa bilden av enskilda rörliga partiklar på skärmen med fokusratten.
OBS: På grund av fokusdjupet kommer alla partiklar inte att vara i fokus, vilket är acceptabelt. Även partiklar som är något ur fokus kommer att fångas av kameran och analyseras av programvaran.
7. Lastning av standarder/prover/utspädningsmedel i lasermodulen för NTA-analys
- Rita upp 1 ml standard/prov/utspädningsmedel i en sköljd 1 ml tuberkulinspruta och fäst den i inloppsporten på flödescellkåpan. För kolven framåt tills vätska är uppenbar i den öppna sprutan som är fäst vid utloppsporten.
- I kameravyn flyttar du till höger om laserlinjen till ett område med ett enhetligt antal partiklar. Justera vid behov den vertikala orienteringen för att centrera de horisontella ljusbanden. Fokusera om tills det högsta antalet partiklar är i sikte. Se till att denna position upprätthålls så nära som möjligt för alla efterföljande åtgärder.
- Justera kameranivån så att symbolen Mörk information blinkar med jämna mellanrum på och av längst upp till höger i kameravyn.
OBS: Detta hjälper till att säkerställa att ett konsekvent val av kameranivå görs vid den lägsta känslighetsnivån för varje datainsamlingsserie.
OBS: Kameranivån kan inte ändras under inspelningen.
8. Validering av kalibrering
OBS: Det rekommenderas att validera modulkalibreringen med hjälp av storleksstandarder (se avsnitt 2) före provanalys. Rutinmässig validering är nödvändig för att säkerställa noggranna mätningar. I ett fleranvändarlaboratorium kan enskilda användarjusteringar av programvarukonfigurationsinställningar oavsiktligt orsaka felaktig datainsamling. För kritisk datainsamling är daglig validering en fråga om god laboratoriesed. Valideringens dagliga reproducerbarhet måste inkluderas i de rapporterade resultaten. Vanligtvis ställs kalibreringen in av teknikern och kan inte justeras av den enskilda användaren om inte användaren har administratörsåtkomst. Detta förhindrar obehörig omkonfiguration av enskilda användare.
- Varma utspädda standarder (se avsnitt 2) till rumstemperatur i 30 min.
- Kortfattat virvla standarderna och ladda sedan enligt beskrivningen i avsnitt 7.
- Utför prov NTA enligt beskrivningen i avsnitt 10 och registrera värden för efterföljande beräkning av variationskoefficienten, som bör vara mindre än 2% om den är korrekt kalibrerad.
9. Optimera provkoncentrationen för NTA
OBS: Skärmen bör innehålla mellan 50 och 100 mätbara partiklar när kameranivån och provkoncentrationen justeras ordentligt. Om det finns någon fråga om huruvida ett prov har ett lämpligt partikelnummer kan en snabbmätning köras på provet vid denna tidpunkt (se steg 9.1 till 9.7). Den används för att snabbt bedöma provegenskaperna före längre videoinspelningar. Fliken Snabbmätning finns på fliken SOP i den nedre mittrutan.
- Ange Inspelningstid till 30 s.
- Godkänn det befintliga basfilnamnet eller ange ett nytt filnamn genom att klicka på fliken ... för en ny lagringsplats för genererade data.
- Markera rutan för Måltemperatur och ange önskad temperatur.
- Läs in exemplet enligt beskrivningen ovan (steg 7.1) och klicka på Skapa och kör skript.
- Vänta tills antalet partiklar per bildruta visas längst ned till höger på videoskärmen efter att 30-s-videon har slutförts. Om antalet partiklar är större än 100, spola lasermodulen 3 gånger (som tidigare beskrivits i steg 4.6).
- Späd provet till önskat koncentrationsområde med användning av det karakteriserade utspädningsdet.
- Ladda det korrekt utspädda provet i den spolade lasermodulen och kör snabbmätningen för att verifiera att provet ligger inom det acceptabla intervallet.
10. Exempel på NTA
OBS: Fliken Standardmätning finns på fliken SOP i den nedre mittrutan och används för rutinmässig provanalys (se steg 10.1 till 10.12).
- Ställ in varaktigheten på 30 eller 60 s och antalet videor till 5.
- Godkänn det befintliga basfilnamnet eller ange ett nytt filnamn genom att klicka på fliken ... för en ny lagringsplats för genererade data.
- Markera rutan för Måltemperatur och ange önskad temperatur.
- Klicka på Skapa skript för att återanvända standardmätningen.
- När exemplet har lästs in enligt beskrivningen i avsnitt 7 och experimentet är klart att köras klickar du på Skapa och kör skript.
- Fyll i fälten på popup-skärmen Ange rapportinformation med information om operatorn, provbeskrivningen, utspädningen av provet och utspädningsmedel som används.
OBS: Denna information kommer att registreras och skrivas ut på den slutliga experimentella rapporten. - När alla önskade fält har fyllts i klickar du på OK för att initiera skriptet.
OBS: Om måltemperatur valdes kommer värmaren att stabilisera provet i lasermodulen till önskad temperatur i 5 s innan skriptet kan fortsätta med mätningen. Diagnospanelen i det nedre vänstra hörnet av skärmen läser HEATER ON och visar provets temperatur. - Innan varje videoinspelning letar du efter en uppmaning om att avancera kolven manuellt. Injicera ~ 0,05 ml av provet i laserkammaren och låt partiklarna komma till "vila" (dvs inte flyta) och klicka sedan på OK.
- Vänta tills en inställningsbekräftelseruta visas när den 5: e videoinspelningen är klar och tills processrutan blinkar. Ställ in detekteringströskeln för bearbetning av provet genom att notera antalet blå kors som markerar partiklar på skärmen när ramarna avanceras manuellt från botten av videoskärmen. Om det finns fler än 3–4 blå kors som markerar partiklar på varje skärm när bildrutorna är avancerade ökar du detekteringströskeln.
OBS: De blå korsen på de enskilda partiklarna är analoga med "svärm" -effekten i flödescytometri och bör minimeras för optimal noggrannhet och reproducerbarhet av datainsamling. - Klicka på Inställningar OK när tröskelvärdet för identifiering är acceptabelt.
- Vänta tills videorna har bearbetats automatiskt och ett histogram med resultat och ett meddelande om slutförande visas innan du klickar på OK.
- När rutan Exportera inställningar visas sparar du resultaten genom att klicka på Exportera.
Alla resultat från videor och analyser lagras i målfilen som definieras i steg 10.2. Detta kräver en stor mängd lagring. Övervaka och överför till en sekundär lagringsenhet efter behov.
11. Omanalys av det aktuella urvalet vid olika detektionströsklar
Omedelbart efter NTA-analys (steg 10) kan data analyseras på nya sätt med olika inställningar för detektionströskeln. Kameranivån kan dock inte ändras efter inspelning.
- Markera alla fem av inspelningsvideorna som listas i det aktuella experimentet.
- Klicka på Bearbeta valda filer och vänta tills rutan Inställningsbekräftelse visas och rutan Process blinkar för att ändra detekteringströskeln.
- Justera detekteringströskeln till önskad nivå och klicka på Inställning OK.
- Vänta tills videorna har bearbetats automatiskt och ett histogram med resultat och ett meddelande om slutförande visas innan du klickar på OK.
- Klicka på Exportera inställningar. När ytterligare utvärderingar utförs på det senaste exemplet måste du klicka på rutan Exportera resultat i det aktuella experimentet eftersom popup-rutan Exportera resultat inte visas efter omanalysen av exemplet.
OBS: Eftersom det inte finns några påminnelser om att göra detta kan det lätt förbises, och analysen kommer att gå förlorad. Underliggande data kommer dock att finnas kvar och kan omanalyseras senare.
12. Analys av arkiverade filer
OBS: Om tidigare analyserade experiment inte har sparats eller ytterligare analys behöver göras på dessa prover, kan de enskilda filerna laddas om i NTA-programvaran för ytterligare utvärderingar av detektionströskeln . Ändringar på kameranivå kan inte ändras efter inspelning.
- Ladda NTA-programvaran från skrivbordet.
- Klicka på fliken Analys i den nedre mittpanelen.
- Klicka på Öppna experiment och navigera till önskad .nano-fil.
Obs!: Videofilerna som är associerade med det valda .nano-experimentet måste finnas i samma mapp som huvudexperimentfilen. annars visas ett fel när du försöker bearbeta filerna. De första 6 siffrorna i filnamnet är det datum då experimentet kördes (xx-xx-xx). De sista 6 siffrorna i filnamnet är den tid då videon spelades in (xx-xx-xx) och den enskilda videoidentifieraren. PDF-filen för varje kombinerat experiment listar de medföljande .nano-filerna för den analysen. - Klicka på Bearbeta valda filer för att köra analysen.
- När rutan Process blinkar för att tillåta ändringar i detekteringströskeln ställer du in tröskelvärdet på önskad nivå och klickar på OK.
- Vänta tills videorna har bearbetats automatiskt och ett histogram med resultat och ett meddelande om slutförande visas innan du klickar på OK.
- Klicka på Exportera resultat. Se till att klicka på rutan Exportera resultat i det aktuella experimentet, eftersom popup-rutan Exportera resultat inte visas efter omanalysen.
OBS: Eftersom det inte finns några påminnelser om att göra detta kan det lätt förbises, och analysen kommer att gå förlorad.
13. Rengöring och demontering av lasermodulen
- Stäng av laserkontrollboxen.
- Spola hela provet från lasermodulen och kassera det ordentligt.
- Håll lasermodulen lutad med den öppna sprutporten upphöjd så att luft kan rensas från kammaren när DPBS injiceras långsamt i lasermodulen och spolas från utloppssprutan.
- Spola resterande DPBS från lasermodulen och kassera.
- Upprepa spolningen ytterligare 2 gånger och töm lasermodulen så fullständigt som möjligt efter den sista spolningen.
- Sätt jämnt tryck ner på flödescellkåpan, lossa tumskruvarna jämnt på ett alternerande diagonalt sätt tills de är urkopplade från gängor, ta bort tumskruvarna och förvara i lasermodulhöljet.
- Ta bort flödescellkåpan från lasermodulen.
- Rengör båda glasytorna försiktigt med en linsrengörare av god kvalitet och linspapper. Använd inte silkespapper eller pappershanddukar på glasytor.
- Inspektera lasermodulen och flödescellkåpan "fönster" visuellt för repor eller brister efter användning och rapportera till handledaren.
- Byt ut lasermodulen och flödescellkåpan i sina fall för att förhindra skador på glasytor under lagring.
14. Provanalysprotokoll
- Ofiltrerade prover
- Vortex provet innan du laddar och spela in 5 x 60 s videor på kameranivå 12 och detekteringströskelnivå 3 enligt beskrivningen ovan. Omanalysera dessa videor med detekteringströsklar 2 och 5.
- Upprepa videosamlingar av samma prov på kameranivåerna 13 och 14 och detekteringströskelnivå 3. Omanalysera dessa två ytterligare videor med detekteringströsklar 2 och 5. Upprepa hela processen med 5 x 30 s videor i SOP-inställningen .
- Filtrerade prover
- Virvla provet och ladda och filtrera det samtidigt (0,22 μm sprutfilter) direkt i lasermodulen.
OBS: Sprutfiltret spolades med 2 gånger volymen av filterdödutrymmet före användning för att avlägsna eventuella bosatta partiklar. Sprutfiltren (se materialförteckningen) hade ett uppmätt dödutrymme på 0,5 ml och spolades med 1,0 ml av provet före mätningar. Observera filtertypen i SOP-datafälten . Det filtrerade provet bearbetades exakt enligt beskrivningen för ofiltrerade prover i steg 14.1.
- Virvla provet och ladda och filtrera det samtidigt (0,22 μm sprutfilter) direkt i lasermodulen.
15. Statistisk analys av NTA-resultat
- För analys av huvudeffekter eller interaktioner, utföra analys av varians efter en kontroll av ANOVA-antaganden (normalitet, unimodal, variansens homogenitet). Använd Kruskal-Wallis envägs ANOVA på rangordningar i fall av misslyckande av ANOVA-antaganden.
- Efter återkomsten av signifikanta huvudeffekter, använd Dunns metod för att utföra behovstestning för förplanerade jämförelser. Betrakta ett p-värde på 0,05 som signifikant i två-tailed testning.
OBS: Datafiler som genereras här är tillgängliga från författarna efter slutförandet av ett materialöverföringsavtal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 innehåller resultaten från NTA-videorna för liposomproverna (18 filtrerade och 18 ofiltrerade) och ett representativt DPBS-utspädningsmedel. Jämförelser mellan de två grupperna slutfördes oavsett kameranivå eller detekteringströskel i detta papper. Filtrerade prover hade en genomsnittlig partikeldiameter på 108,5 nm, ett partikelläge på 86,2 nm och en koncentration på 7,4 × 108 partiklar/ml. Däremot hade ofiltrerade prover en genomsnittlig partikeldiameter på 159,1 nm, ett partikelläge på 105,7 nm och en koncentration på 7,6 × 108 partiklar /ml. Medelvärden och lägesvärden för de filtrerade och ofiltrerade proverna, oavsett kameranivå eller detektionströskel, var statistiskt signifikanta (p < 0,05). Skillnader i koncentration mellan de filtrerade och ofiltrerade proverna, oavsett kameranivå eller detektionströskel, var icke-signifikanta (p = 0,86).
| Jämförelser av filtrerade kontra ofiltrerade prover | ||||||||||||
| Prov | Cam Lev | Det Thr | Betyda | Medelvärde % CV | St. Dev. | × 108 | × 107 | |||||
| Filtrerad | Ofiltrerad | Filtrerad | Ofiltrerad | Filtrerad | Ofiltrerad | Filtrerad | Ofiltrerad | Filtrerad | Ofiltrerad | |||
| Liposom | 12 | 3 | 138.3 | 162.1 | 55.5 | 47.5 | 76.7 | 77 | 3.2 | 6.48 | 1.74 | 3.16 |
| Liposom | 12 | 2 | 126.3 | 153.7 | 58.7 | 49.8 | 74.2 | 76.5 | 4.94 | 8.23 | 2.74 | 3.5 |
| Liposom | 12 | 5 | 155 | 172.2 | 51.8 | 45.6 | 80.3 | 78.6 | 1.91 | 5.05 | 1.02 | 2.9 |
| Liposom | 13 | 3 | 102.7 | 169 | 43.5 | 51.3 | 44.7 | 86.7 | 6.72 | 7.75 | 1.91 | 1.17 |
| Liposom | 13 | 2 | 95.8 | 161.4 | 43.3 | 52.7 | 41.5 | 85 | 10.3 | 9.7 | 1.61 | 1.83 |
| Liposom | 13 | 5 | 110.7 | 176.1 | 42.5 | 47.1 | 47 | 83 | 4.16 | 6.28 | 1.83 | 1.07 |
| Liposom | 14 | 3 | 98 | 147.6 | 42.4 | 43.8 | 41.6 | 64.6 | 10.6 | 8.56 | 2.4 | 1.66 |
| Liposom | 14 | 2 | 92.9 | 142.1 | 42.6 | 45.2 | 39.6 | 64.3 | 14.9 | 10.7 | 2.54 | 1.83 |
| Liposom | 14 | 5 | 103.8 | 153.8 | 41.1 | 42.6 | 42.7 | 65.5 | 7.42 | 7.02 | 2.37 | 1.51 |
| Liposom | 12 | 3 | 105.6 | 179.4 | 22.2 | 46.7 | 23.4 | 83.7 | 5.2 | 5.81 | 1.06 | 4.28 |
| Liposom | 12 | 2 | 100.3 | 170.8 | 24.3 | 49.1 | 24.4 | 83.8 | 7.76 | 7.39 | 1.61 | 4.41 |
| Liposom | 12 | 5 | 112 | 187.2 | 20.4 | 42.9 | 22.8 | 80.4 | 3.27 | 4.68 | 0.815 | 3.93 |
| Liposom | 13 | 3 | 99.8 | 153.3 | 23.4 | 52.1 | 23.4 | 79.8 | 7.19 | 7.34 | 3.37 | 1.5 |
| Liposom | 13 | 2 | 94.3 | 143.6 | 25.8 | 53.2 | 24.3 | 76.4 | 10.8 | 9.53 | 4.3 | 2.46 |
| Liposom | 13 | 5 | 106.8 | 162 | 21.3 | 49.4 | 22.7 | 80 | 4.64 | 5.76 | 2.63 | 1.01 |
| Liposom | 14 | 3 | 103.4 | 142.3 | 31.7 | 49.6 | 32.8 | 70.6 | 9.91 | 8.66 | 3.29 | 12.5 |
| Liposom | 14 | 2 | 97.8 | 136 | 33.3 | 51.4 | 32.6 | 69.9 | 13.8 | 11.5 | 2.98 | 15.7 |
| Liposom | 14 | 5 | 109.5 | 151.4 | 31.1 | 49.5 | 34 | 74.9 | 7.27 | 6.76 | 3.42 | 10.1 |
| Genomsnitt | 108.5 | 159.1 | 36.4 | 48.3 | 40.5 | 76.7 | 7.4 | 7.6 | 2.3 | 4.1 | ||
Tabell 1: Datatabell över insamlade värden, standardavvikelse och procentuell variationskoefficient för filtrerade och ofiltrerade prover. Förkortningar: Cam Lev = kameranivå; Det Thr = detektionströskel; CV = variationskoefficient; = standardavvikelse; = koncentration.
När liposomprovresultaten analyserades efter detektionströskel (2, 3, 5) och kameranivå (12, 13, 14) var resultaten inte signifikanta (figur 3). Det bör noteras att det endast fanns 3 utvärderingar (n = 3) på var och en av dessa enskilda nivåer. Denna lilla urvalsstorlek på varje kameranivå och detekteringströskel bidrog sannolikt till att bristen på individuella jämförelser var betydande. Men när detektionströskeln (2, 3, 5) prover utvärderades oavsett kameranivå över de filtrerade och ofiltrerade proverna (n = 3) var både medelstorleken (figur 3A) och lägesstorleken (figur 3B) signifikant (p < 0,05) olika. Däremot var skillnaderna mellan filtrerade och ofiltrerade provkoncentrationer (figur 3C) inte signifikant olika.
Figur 3: Effekter av kameranivå och detektionströskel på uppmätt partikelstorlek och koncentration av filtrerade och ofiltrerade prover. Genomsnittlig (A) och läge (B) partikelstorlek vid kombinerade kameranivåer 12, 13, 14 när detektionströskeln ökades från 2 till 3 till 5 (n = 3), vilket visar en signifikant minskning av partikelstorlekarna hos de filtrerade proverna. Partikelkoncentrationer (C) vid kombinerade kameranivåer 12, 13, 14 när detektionströskeln höjdes från 2 till 3 till 5) (n = 3), vilket visar en koncentrationsminskning när detektionströskeln ökade utan någon signifikant skillnad mellan filtrerade och ofiltrerade prover. Genomsnittlig (D) och läge (E) partikelstorlek vid kombinerade detektionströsklar när kameranivån ökade från 12 till 14 (n = 3), vilket visar en minskning av partikelstorleken hos de filtrerade proverna. Partikelkoncentrationer (F) vid kombinerade detektionströsklar när kameranivåerna ökade från 12 till 14 (n = 3), vilket visar en koncentrationsökning när kameranivån ökar utan signifikanta skillnader mellan filtrerade och ofiltrerade prover. Förkortning: DT = detekteringströskel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
När de tre kameranivåerna (12, 13, 14) utvärderades oavsett detektionströskelnivå (n = 3) ökade både medelstorleken (figur 3D) och lägesstorleken (figur 3E) i de filtrerade proverna. Provkoncentrationerna visade en tendens att öka när kameranivån ökade från 12 till 14 (figur 3F). Skillnaderna mellan filtrerade och ofiltrerade provkoncentrationer utvärderade vid olika kameranivåer var inte signifikant olika.
Kompletterande fil 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera metoder tillgängliga för att uppskatta storleken och koncentrationen av nanopartiklar11. Dessa inkluderar ensemblemetoder som genererar en storleksuppskattning från en population, inklusive dynamisk ljusspridning (DLS), centrifugalsedimentering och enpartikelnivåanalys-elektronmikroskopi, NTA, atomkraftsmikroskopi och avstämbar resistiv pulsavkänning. Av dessa används DLS och NTA i stor utsträckning, icke-destruktiva storleks- och koncentrationsmätningsmetoder, baserade på brunisk rörelse i ett idealiskt medium. DLS förlitar sig på spridning av ljus och intensiteten är proportionell mot kvadraten av partikelvolymen. Således är DLS känsligare än NTA för närvaron av stora partiklar, aggregat eller polydispersa populationer.
NTA beräknar diffusionskoefficienten från banlängden för enskilda partiklar mätt i på varandra följande videoramar. Huvudbegränsningen för NTA är det smala intervallet av partikelkoncentration som den kan utvärdera jämfört med DLS och andra mätmetoder, så att enskilda partikelbanor måste falla inom mikroskopets diffraktionsgräns och spårningsprogramvarans kapacitet. Eftersom DLS och NTA är beroende av brunisk rörelse kan båda förväntas visa god storleksöverenskommelse i monodispersed populationer; de avviker vid utvärdering av polydisperspopulationer och de med aggregat. Det senare gör DLS värdelöst och ökar uppskattningen av NTA-partikelstorleken avsevärt12. NTA:s mest kända begränsning är att det kräver mycket lägre partikelkoncentration (eller större utspädning) än andra mätmetoder. Trots detta är NTA-karakterisering populär inom nanomaterialforskning. Eftersom NTA-storlek och koncentrationsuppskattningar beror på en mer utspädd population, med definierad temperatur, videoinspelningsinställningar, inklusive inspelningslängd, kameranivå, detektionströskel och provutspädning för att vara mycket reproducerbar, fokuserar detta dokument på behovet av att rapportera dessa för att generera reproducerbara resultat.
Det här dokumentet visar att användning av ett standardiserat protokoll möjliggjorde replikering av resultat och att användning av positiva kontroller, till exempel storleksstandarder, ger information om maskinens kalibrering. Dessutom indikerade dessa resultat vikten av att rapportera lasermodulens kammartemperatur, kameranivåer, detekteringströskel och filtrering (filtertyp och storlek). Däremot är lasermodulens kammartemperatur, utspädningsmedel och utspädningsfaktor lika viktiga för exakta och reproducerbara resultat. Även om varken MISEV2018 eller EV-TRACK specifikt rekommenderar att denna information inkluderas, föreslår vi att införandet av dessa uppgifter möjliggör oberoende bekräftelse av publicerade resultat och ger robusthet till den experimentella designen.
Begränsningar med att använda latexstorlekskalibreringsstandarder för NTA-kalibrering i EV-analys erkänns och inkluderar de kända brytningsindexskillnaderna jämfört med lipid-tvåskiktsnanopartiklar av liknande storlek. I detta dokument användes latexp pärlor för att bekräfta maskinkalibrering före mätningar och inte för att bestämma detektionsgränserna. Liposomerna har ett membran som liknar dem hos naturligt förekommande elbilar, och brytningsindexet kommer också att vara representativt för elbilar. Storleksstandarderna, liksom liposomproverna, är monodispersed populationer; därför kommer deras storleksfördelning att följa en Gaussisk eller log-normalfördelning. Naturliga elbilar är polydispersa, och deras storleksfördelning kommer att följa en kraftlagsfunktion13.
Historiskt sett rapporterar publikationer som använder NTA-karakterisering inkonsekvent nödvändiga detaljer för att duplicera forskningsresultaten. Möjligheten att reproducera NTA-data är beroende av möjligheten att duplicera de inställningar som används för att fånga originaldata. Utan denna information kommer reproduktionen av experimentella resultat med NTA att vara extremt svår. Med strikt efterlevnad av ett fastställt protokoll och publicering av de inställningsparametrar som används med NTA kan korrekt replikering av resultat uppnås. Följande rekommendationer görs för att förbättra konsistensen av nanopartikelkarakterisering av storlek, koncentration, sammansättning och renhet med hjälp av en nanopartikelstorleksanalysator.
Kontrollera först alltid kalibreringen av nanopartikelstorleksanalysatorn med hjälp av lämpliga storleksstandarder, såsom latexstorleksstandarder. Detta bör göras regelbundet och registreras i instrumentloggen och före analysen av kritiska prover. För det andra bör alla justerbara parametrar, såsom lasermodulens kammartemperatur, kameranivåer och detektionströsklar, registreras för varje prov i provloggfilen , liksom de utspädningar och utspädningsmedel som används. Dessa parametrar bör rapporteras eftersom de är operatörsberoende och påverkar NTA-mätningar. För det tredje måste utspädningsmedel som används för provutspädning karakteriseras för nanopartikelinnehåll och rapporteras. De utspädningsmedel som används för enskilda nanopartikelprover måste utvärderas med samma inställningar för kameranivå och detektionströskel som de som används för det utspädda provet. För det fjärde bör sprutfilter spolas med två gånger dödutrymmesvolymen före datainsamling eller provberedningssteg för att spola de många partiklar som återstår från tillverkningsprocessen. För det femte bör koncentrationen av nanopartiklarna i provet justeras till inom det föreslagna optimala 1,0 × 107 till 1,0 × 109 per ml.
Genom att erkänna de ovan beskrivna begränsningarna i denna studie visar vi att både storleks- och koncentrationsvärdena som erhålls av NTA kan påverkas av NTA-parametrar, såsom kameranivåer och detektionströsklar, och att storleken, men inte koncentrationen, kan påverkas av provberedning. Detta driver hem den kritiska betydelsen av att rapportera dessa parametrar i nanomaterial och EV-litteratur, vilket möjliggör produktion av robust, reproducerbar litteratur så att vi systematiskt kan undersöka effekterna av EV-källa, isolering och andra experimentella variabler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Arbetet stöddes av delstaten Kansas till Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center till MLW och NIH R21AG066488 till LKC. OLS fick GRA-stöd från MICSCB. Författarna tackar Dr. Santosh Aryal för att ha tillhandahållit liposomerna som används i detta projekt och medlemmarna i Weiss och Christenson-laboratorierna för hjälpsamma samtal och feedback. Dr. Hong Han tackas för teknisk support. MLW tackar Betti Goren Weiss för hennes stöd och råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
References
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
- Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
- Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
- Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
- vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
