Summary
Nanoparticle tracking analysis (NTA) is een veelgebruikte methode om extracellulaire blaasjes te karakteriseren. Dit artikel belicht NTA experimentele parameters en controles plus een uniforme methode voor analyse en karakterisering van monsters en verdunningsmiddelen die nodig zijn om de richtlijnen van MISEV2018 en EV-TRACK voor reproduceerbaarheid tussen laboratoria aan te vullen.
Abstract
Nanoparticle tracking analysis (NTA) is sinds 2006 een van de vele karakteriseringsmethoden die worden gebruikt voor onderzoek naar extracellulaire blaasjes (EV). Velen zijn van mening dat NTA-instrumenten en hun softwarepakketten gemakkelijk kunnen worden gebruikt na minimale training en dat kalibratie van de grootte intern haalbaar is. Aangezien zowel NTA-acquisitie als software-analyse EV-karakterisering vormen, worden ze behandeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Bovendien zijn ze gemonitord door Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) om de robuustheid van EV-experimenten te verbeteren (bijvoorbeeld experimentele variatie als gevolg van ongecontroleerde factoren minimaliseren).
Ondanks inspanningen om de rapportage van methoden en controles aan te moedigen, rapporteren veel gepubliceerde onderzoeksdocumenten geen kritieke instellingen die nodig zijn om de oorspronkelijke NTA-waarnemingen te reproduceren. Weinig artikelen melden de NTA-karakterisering van negatieve controles of verdunningsmiddelen, kennelijk ervan uitgaande dat commercieel verkrijgbare producten, zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing of ultrapuur gedestilleerd water, deeltjesvrij zijn. Evenzo worden positieve controles of groottenormen zelden gerapporteerd door onderzoekers om de deeltjesgrootte te verifiëren. De Stokes-Einstein-vergelijking bevat monsterviscositeit en temperatuurvariabelen om deeltjesverplaatsing te bepalen. Het rapporteren van de stabiele temperatuur van de laserkamer tijdens de gehele monstervideoverzameling is daarom een essentiële controlemaatregel voor nauwkeurige replicatie. De filtratie van monsters of verdunningsmiddelen wordt ook niet routinematig gerapporteerd, en als dat zo is, worden de specifieke kenmerken van het filter (fabrikant, membraanmateriaal, poriegrootte) en opslagomstandigheden zelden opgenomen. De minimale normen van de International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) voor acceptabele experimentele details moeten een goed gedocumenteerd NTA-protocol bevatten voor de karakterisering van EV's. Het volgende experiment levert bewijs dat een NTA-analyseprotocol moet worden vastgesteld door de individuele onderzoeker en moet worden opgenomen in de methoden van publicaties die NTA-karakterisering gebruiken als een van de opties om te voldoen aan de MISEV2018-vereisten voor karakterisering van één blaasje.
Introduction
Nauwkeurige en herhaalbare analyse van EV's en andere deeltjes op nanometerschaal brengt tal van uitdagingen met zich mee in onderzoek en industrie. Replicatie van EV-onderzoek is moeilijk geweest, deels vanwege het gebrek aan uniformiteit in het rapporteren van noodzakelijke parameters in verband met gegevensverzameling. Om deze tekortkomingen aan te pakken, stelde de ISEV industrierichtlijnen voor als een minimale set biochemische, biofysische en functionele normen voor EV-onderzoekers en publiceerde deze als een positieverklaring, gewoonlijk MISEV20141 genoemd. Het versnellende tempo van EV-onderzoek vereiste een bijgewerkte richtlijn en de "MISEV2018: een positieverklaring van de ISEV" breidde de MISEV2014-richtlijnenuit 2. Het MISEV2018-document bevatte tabellen, schetsen van voorgestelde protocollen en stappen die moeten worden gevolgd om specifieke EV-geassocieerde karakterisering te documenteren. Als een verdere maatregel om de interpretatie en replicatie van experimenten te vergemakkelijken, werd EV-TRACK ontwikkeld als een crowd-sourcing kennisbank (http://evtrack.org) om transparantere rapportage van EV-biologie en de methodologie die wordt gebruikt voor gepubliceerde resultatenmogelijk te maken 3. Ondanks deze aanbevelingen voor gestandaardiseerde rapportage van methoden, blijft het veld lijden met betrekking tot het repliceren en bevestigen van gepubliceerde resultaten.
Passend bij de inspanningen van de National Institutes of Health en de National Science Foundation voor kwaliteitsbeoordelingsinstrumenten, suggereert dit artikel dat ISEV gestandaardiseerde rapportage van methoden en details vereist, zodat hulpmiddelen voor gegevensbeoordeling kunnen worden toegepast met als doel resultaten tussen laboratoria te repliceren. Het rapporteren van celbronnen, celkweekprocedures en EV-isolatiemethoden zijn belangrijke factoren om de kwaliteiten van de EV-populatie te definiëren. Onder NTA-instrumenten maken factoren zoals detectie-instellingen, de brekingsindex van dragervloeistof, heterogene deeltjespopulaties die bijdragen aan polydispersiteit, gebrek aan gestandaardiseerde rapportagevereisten en afwezige intra- en interwaarnemer meetresultaten NTA-vergelijking tussen laboratoria moeilijk of onmogelijk.
NTA is sinds 2006 in gebruik en is een populaire methode voor het bepalen van de grootte en concentratie van nanodeeltjes die momenteel door ongeveer 80% van de EV-onderzoekers wordt gebruikt4. De MISEV2018-richtlijnen vereisen twee vormen van analyse van één blaasje, waarvan NTA een van de populaire opties is. NTA wordt nog steeds algemeen gebruikt voor EV-karakterisering vanwege de brede toegankelijkheid, lage kosten per monster en de eenvoudige basistheorie (de Stokes-Einstein-vergelijking). EV-beoordeling door NTA genereert een deeltjesgrootteverdeling en concentratieschatting met behulp van laserlichtverstrooiing en Brownse bewegingsanalyse, waarbij de ondergrens van detectie wordt bepaald door de brekingsindex van de EV. Bij gebruik van een vloeistofmonster met bekende viscositeit en temperatuur worden de trajecten van de EV's gevolgd om hun gemiddelde vierkante verplaatsing in twee dimensies te bepalen. Hierdoor kan de deeltjesdiffusiecoëfficiënt worden berekend en omgezet in een bolequivalente hydrodynamische diameter door een gemodificeerde Stokes-Einsteinvergelijking 5,6,7. NTA's deeltjes-naar-deeltjesanalyse heeft minder interferentie door agglomeraten of grotere deeltjes in een heterogene populatie van EV's dan andere methoden van karakterisering7. Hoewel een paar grotere deeltjes een minimale impact hebben op de nauwkeurigheid van de maatvoering, resulteert de aanwezigheid van zelfs minieme hoeveelheden grote, hoge lichtverstrooiende deeltjes in een opmerkelijke vermindering van de detectie van kleinere deeltjes als gevolg van verminderde software EV-detectie en tracking8. Als meettechniek wordt NTA over het algemeen beschouwd als niet bevooroordeeld naar grotere deeltjes of aggregaten van deeltjes, maar kan het populaties van meerdere grootte oplossen door middel van individuele deeltjesanalyse9. Vanwege het gebruik van lichtverstrooiing door deeltjes, is een van de beperkingen van NTA-analyse dat deeltjes zoals stof, plastic of poeder met vergelijkbare brekings- en groottekenmerken in vergelijking met EV's niet kunnen worden onderscheiden van werkelijke EV's door deze methode van karakterisering.
De NanoSight LM10 (nanoparticle size analyzer) en LM14 (lasermodule) worden sinds 2006 verkocht, en hoewel er nieuwere modellen van dit instrument zijn ontwikkeld, is dit specifieke model te vinden in veel kernfaciliteiten en wordt het beschouwd als een betrouwbaar werkpaard. Training is nodig om de NTA-instellingen goed te optimaliseren voor metingen van grootte en concentratie met hoge resolutie. De twee belangrijke instellingen die nodig zijn voor optimale video-opnames zijn (1) het cameraniveau en (2) de detectiedrempel. Deze moeten door de exploitant worden ingesteld op basis van de kenmerken van het monster. Een van de belangrijkste beperkingen van de NTA-analyse is de aanbeveling van monsterconcentraties tussen 107 en 109 deeltjes / ml, om deze monsterverdunning te bereiken, kan10 nodig zijn. Oplossingen die worden gebruikt voor verdunning, zoals fosfaatbufferde zoutoplossing, zoutoplossing van 0,15 M of ultrapuur water, zijn zelden vrij van deeltjes kleiner dan 220 μm, wat van invloed kan zijn op de NTA-metingen. NTA-karakterisering van de oplossingen die worden gebruikt voor verdunning moet worden uitgevoerd op hetzelfde cameraniveau en dezelfde detectiedrempel als de nanodeeltjesmonsters die worden geanalyseerd. De grootte en concentratie van nanodeeltjes die aanwezig zijn in verdunningsmiddelen die worden gebruikt voor ev-monsterverdunningen worden zelden opgenomen in publicaties met betrekking tot NTA-analyse van EV's.
Dit protocol maakt gebruik van NTA-analyse van synthetische EV-achtige liposomen geëvalueerd met behulp van geselecteerde cameraniveaus, detectiedrempels en mechanische filtering van de monsters om de systematische effecten van cameraniveau, detectiedrempel of monsterfiltratie op de NTA-dataset te analyseren. Liposomen werden gesynthetiseerd zoals beschreven in Supplemental File S1. Synthetische liposomen werden in dit experiment gebruikt vanwege hun grootte-uniformiteit, fysieke kenmerken en stabiliteit bij opslag bij 4 °C. Hoewel er gebruik had kunnen worden gemaakt van daadwerkelijke monsters van EV's, kan de heterogeniciteit en stabiliteit van EV's tijdens opslag deze studie en de interpretatie ervan hebben bemoeilijkt. Overeenkomsten in de NTA-rapporten van (A) liposomen en (B) EV's geven aan dat de systematische effecten die in dit artikel voor liposomen worden onthuld, waarschijnlijk ook van toepassing zullen zijn op EV-karakterisering (figuur 1). Samen ondersteunen deze bevindingen het idee dat volledige rapportage van kritieke software-instellingen en de beschrijving van monsterverwerking, zoals verdunningsmiddel, verdunning en filtratie, van invloed zijn op de reproduceerbaarheid van NTA-gegevens.
Het doel van dit artikel is om aan te tonen dat het variëren van de NTA-instellingen (temperatuur, cameraniveau en detectiedrempel) en monstervoorbereiding de verzamelde resultaten verandert: systematische, significante verschillen in grootte en concentratie werden verkregen. Aangezien NTA een van de populaire opties is om te voldoen aan de MISEV2018-karakteriseringsspecificatie, tonen deze resultaten het belang aan van het rapporteren van monstervoorbereiding en NTA-instellingen om reproduceerbaarheid te garanderen.
Figuur 1: Representatieve NTA-rapporten om liposomen te vergelijken met EV's. (A) Liposomen: ongefilterd monster gekarakteriseerd op NTA op 12 maart 2020. (B) EV's: ongefilterd monster gekarakteriseerd op NTA op 26 augustus 2021. Afkortingen: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EV's = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene protocolrichtlijnen
- Houd de microscoop op een luchttafel of op zijn minst op een trillingsvrije tafel. Zorg ervoor dat externe trillingen (bijv. voettikken op de vloer, aanraken van de tafel, deursluitingen, laboratoriumverkeer) tot een minimum worden beperkt.
- Stel de temperatuur van de lasermodule in en houd deze op een constante temperatuur voor alle video-opnames.
OPMERKING: De gekozen temperatuur was 25 °C omdat de nanodeeltjesgrootteanalysator bij die temperatuur was gekalibreerd. Daarom is het belangrijk dat alle gebruikers van het instrument de gekalibreerde temperatuur kennen en gebruiken. Kamertemperatuur is geen acceptabele instelling omdat deze kan variëren. - Zorg ervoor dat alle verdunningsmiddelen, ook wel negatieve controles genoemd (bijv. Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS), ultrapure distilled water [DW]), allemaal NTA-gekarakteriseerd zijn met behulp van hetzelfde cameraniveau en dezelfde detectiedrempel als de nanodeeltjesmonsters die worden gemeten. Gebruik gekarakteriseerde DPBS voor het spoelen van de lasermodule en het verdunnen van monsters. Factor verontreinigingen in de negatieve controle DPBS in de monsterresultaten als hun niveaus significant zijn.
- Bewaar monsters bij 4 °C voorafgaand aan de evaluatie en vries ze nooit in, omdat dit het liposoommonster zou afbreken. Verwarm monsters/normen/verdunningsmiddelen tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten voorafgaand aan de analyse.
OPMERKING: De monsterbehandeling was specifiek voor het onderzochte materiaal. - Evalueer monster en normen met behulp van snelle meting om een geschikte verdunning vast te stellen om 107 tot 109 deeltjes / ml (ongeveer 50 tot 100 deeltjes / NTA-videoscherm) te verkrijgen die optimaal is voor NTA-analyses.
OPMERKING: De auteurs hebben ontdekt dat deeltjesconcentraties aan de bovenkant van dit bereik consistentere en reproduceerbarere resultaten opleveren. - Vul alle toepasselijke velden in het vak Vastleggen van het tabblad SOP in voor zowel snelle als standaardmetingen , inclusief de gebruikte verdunning en verdunningsmiddel.
2. Voorbereiding van kalibratienormen voor 50 nm en 100 nm
OPMERKING: Zie de tabel met materialen.
- 50 nm grootte Transfer Standaarden verdund 1:5.000
- Voeg 2 μL van de 50 nm-normen toe aan 9.998 μL van 0,22 μm gefilterd 10 mM kaliumchloride (KCl)/0,03% Tween 20 in ultrapuur DW in een tweemaal gespoelde conische buis van 15 ml. Bewaar de verdunde 50 nm-norm bij 4 °C gedurende maximaal een jaar.
- 100 nm grootte Transfer Standards verdund 1:333
- Voeg 30 μL van de 100 nm-normen toe aan 9.970 μL van 0,22 μm-gefilterde 10 mM KCl/0,03% Tween 20 in ultrapuur DW in een tweemaal gespoelde conische buis van 15 ml. Bewaar de verdunde 100 nm-norm bij 4 °C gedurende maximaal een jaar.
3. Reiniging en montage van de lasermodule
- Inspecteer de lasermodule en de vloeicelafdekkingsvensters visueel op krassen of onvolkomenheden.
OPMERKING: Als een van beide glazen oppervlakken bekrast is, kan de beeldvorming worden beïnvloed. - Reinig beide glasoppervlakken voorzichtig met een lenzenreiniger van goede kwaliteit en lenspapier. Gebruik geen doekjes of papieren handdoekjes op glazen oppervlakken.
- Zorg ervoor dat de O-ringafdichting goed in de groef van de flow-cell cover zit voordat deze wordt gemonteerd.
- Plaats het deksel van de stroomcel op de lasermodule en zorg ervoor dat de elektrische contacten in de juiste richting staan. Plaats de 4 veerbelaste duimschroeven door de flow-cell plaat en schakel de draden van de lasermodule in, maar draai ze niet afzonderlijk vast.
- Door gelijkmatige druk uit te oefenen op het deksel van de flowcel, spant u de duimschroeven gelijkmatig aan op een afwisselend diagonale manier totdat ze goed zitten. Draai de duimschroeven alleen aan totdat ze vingervast zijn. Niet te strak aanspannen.
OPMERKING: Ongelijke aanscherping van de duimschroeven kan het oppervlak van de lasermodule scheuren. Nieuwer ontworpen duimschroeven zullen "uitbodemen" bij de juiste druk, waardoor mogelijke overbelasting wordt vermeden.
4. Spoelprocedure voor de lasermodule voorafgaand aan en tussen monsters
- Gebruik een nieuw geopende container met DPBS en aliquot in drievoudig gespoelde 15 ml polypropyleen buizen. Zorg ervoor dat producten die worden gebruikt om monsters te spoelen of te verdunnen vóór gebruik NTA-gekarakteriseerd zijn (zie stap 1.3).
- Spoel twee tuberculinespuiten van 1 ml met sliplockadapters 3 keer door met 1 ml DPBS om eventuele deeltjesresten te verwijderen. Gebruik een van beide poorten als invoer, maar gebruik deze consistent tijdens het experiment. Gebruik geen grotere spuiten vanwege het gevaar van brekende spuitpoorten door het toegenomen gewicht en de grotere grootte van de spuit.
- Verwijder en gooi de zuiger uit de1e tuberculinespuit en plaats deze in de resterende poort om te dienen als een leeggemaakt verdunnings-/monsterreservoir.
OPMERKING: Als u de zuiger niet verwijdert, leidt dit tot verhoogde druk in de monsterkamer en lekkage rond de afdichting. - Vul de2e spuit met 1 ml DPBS en bevestig deze aan de inlaatpoort van het deksel van de stroomcel.
- Houd de lasermodule gekanteld met de poort van de uitlaatspuit omhoog zodat lucht uit de kamer kan worden gespoeld terwijl de DPBS langzaam in de lasermodule wordt geïnjecteerd.
- Spoel de resterende DPBS uit de lasermodule door 1 ml lucht in de inlaatpoort te injecteren. Herhaal het spoelen nog 2 keer.
- Leeg de lasermodule zo volledig mogelijk na de laatste spoeling.
OPMERKING: Grondig, zorgvuldig spoelen is noodzakelijk na NTA-analyse van de 50 nm-standaard, omdat deze deeltjes in de lasermodule blijven bestaan. De lasermodule is nu klaar voor gebruik.
5. Plaatsing van de lasermodule op het microscooppodium
- Zoek de focusuitlijningsgeleiders van de lasermodule op de arm van de microscoop (figuur 2) en lijn ze uit met de focusknop.
Figuur 2: Lasermodule focus uitlijningsgids. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Plaats de lasermodule in het gegroefde stadium en schuif deze voorzichtig zo ver mogelijk naar rechts.
OPMERKING: Als het zorgvuldig wordt gedaan, zijn de uitlijning en de brandpuntsvlek gemakkelijker te vinden tussen de monsters. - Schakel de tuimelschakelaar op de laserbesturingskast in.
6. Scherpstellen en positioneren van de lasermodule
OPMERKING: Dit moet worden uitgevoerd met vloeistof in de kamer.
- Laad de NTA-software (zie de tabel met materialen) vanaf het bureaublad.
OPMERKING: Er kan een fout optreden: "Temperatuur H /W niet gevonden op COM3." Sluit en open de software gewoon opnieuw om het te repareren. - Klik op Camera starten onder het tabblad Vastleggen in het vak in de linkerbovenhoek. Als de camera na 5 minuten automatisch wordt uitgeschakeld, klikt u op Camera opnieuw starten om de camera opnieuw op te starten.
- Pas op hetzelfde tabblad het cameraniveau aan op 14 tot 16 om de laserlijn helderder te maken en de identificatie en focus van deeltjes te vereenvoudigen.
- Leid het beeld van de camera naar de oculairs door de bovenste schuifregelaar aan de linkerkant van het hoofddeksel naar binnen of naar buiten te bewegen.
- Zoek het gebied met verhoogde dichtheid, gewoonlijk de vingerafdruk genoemd. Centreer en focus de vingerafdruk verticaal in het gezichtsveld.
OPMERKING: De laserlijn bevindt zich links van de vingerafdruk. Het verduisteren van de kamer kan helpen bij het lokaliseren van de vingerafdruk en het focussen op de laserlijn. - Centreer de laserlijn in het gezichtsveld; verplaats de bovenste schuifregelaar om het licht naar de camera te leiden zoals waargenomen op het computerscherm.
OPMERKING: De laserlijn die nu zichtbaar is op het scherm is een spiegelbeeld van het oculairzicht; links in de oculairs zal recht op het computerscherm. - Pas de scherpstelling aan om het beeld van individuele bewegende deeltjes op het scherm te verscherpen met de scherpstelknop.
OPMERKING: Vanwege de diepte van de focus zullen niet alle deeltjes scherp zijn, wat acceptabel is. Zelfs deeltjes die enigszins onscherp zijn, worden door de camera vastgelegd en door de software geanalyseerd.
7. Het laden van normen/monsters/verdunningsmiddel in de lasermodule voor NTA-analyse
- Zuig 1 ml standaard/monster/verdunningsmiddel op in een gespoelde tuberculinespuit van 1 ml en bevestig deze aan de inlaatpoort van het deksel van de stroomcel. Vervroeg de zuiger totdat er vloeistof zichtbaar is in de open spuit die aan de uitlaatpoort is bevestigd.
- Ga in de cameraweergave naar rechts van de laserlijn naar een gebied met een uniform aantal deeltjes. Pas indien nodig de verticale oriëntatie aan om de horizontale lichtbanden te centreren. Stel opnieuw scherp totdat het grootste aantal deeltjes in zicht is. Zorg ervoor dat voor alle volgende maatregelen deze positie zo goed mogelijk wordt gehandhaafd.
- Pas het cameraniveau aan op het punt dat het donkere informatiesymbool met tussenpozen in- en uitschakelt in de rechterbovenhoek van de cameraweergave.
OPMERKING: Dit helpt ervoor te zorgen dat een consistente selectie op cameraniveau wordt gemaakt op het minimale gevoeligheidsniveau voor elke reeks gegevensverzameling.
OPMERKING: Het cameraniveau kan niet worden gewijzigd tijdens het vastleggen.
8. Validatie van kalibratie
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de kalibratie van de module te valideren met behulp van groottenormen (zie rubriek 2) voorafgaand aan de monsteranalyse. Routinematige validatie is noodzakelijk om nauwkeurige metingen te garanderen. In een laboratorium met meerdere gebruikers kunnen individuele gebruikersaanpassingen van softwareconfiguratie-instellingen onbedoeld onnauwkeurige gegevensverzameling veroorzaken. Voor het verzamelen van kritieke gegevens is dagelijkse validatie een kwestie van goede laboratoriumpraktijken. De dagelijkse reproduceerbaarheid van validatie moet worden opgenomen in de gerapporteerde resultaten. De kalibratie wordt doorgaans ingesteld door de technicus en kan niet worden aangepast door de individuele gebruiker, tenzij de gebruiker beheerderstoegang heeft. Dit voorkomt ongeautoriseerde herconfiguratie door individuele gebruikers.
- Warm verdunde normen (zie rubriek 2) op tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Draai de normen kort om en laad vervolgens zoals beschreven in sectie 7.
- Voer monster-NTA uit zoals beschreven in sectie 10 en noteer waarden voor de latere berekening van de variatiecoëfficiënt, die minder dan 2% moeten zijn indien correct gekalibreerd.
9. Optimaliseren van de monsterconcentratie voor NTA
OPMERKING: Het scherm moet tussen de 50 en 100 meetbare deeltjes bevatten wanneer het cameraniveau en de monsterconcentratie correct zijn afgesteld. Als er enige twijfel bestaat over de vraag of een monster een geschikt deeltjesaantal heeft, kan op dit punt een snelle meting op het monster worden uitgevoerd (zie stappen 9.1 tot en met 9.7). Het wordt gebruikt om de kenmerken van het monster snel te beoordelen voorafgaand aan langere video-opnamen. Het tabblad Snelle meting bevindt zich op het tabblad SOP in het middelste vak onderaan.
- Stel de opnameduur in op 30 s.
- Accepteer de bestaande basisbestandsnaam of voer een nieuwe bestandsnaam in door op het tabblad ... voor een nieuwe opslagsite voor gegenereerde gegevens te klikken.
- Vink het vakje aan voor Doeltemperatuur en voer de gewenste temperatuur in.
- Laad het voorbeeld zoals eerder beschreven (stap 7.1) en klik op Script maken en uitvoeren.
- Wacht tot het aantal deeltjes per frame rechtsonder in het videoscherm wordt weergegeven na het voltooien van de 30 s-video. Als het aantal deeltjes groter is dan 100, spoelt u de lasermodule 3 keer door (zoals eerder beschreven in stap 4.6).
- Verdun het monster tot het gewenste concentratiebereik met behulp van het gekarakteriseerde verdunningsmiddel.
- Laad het correct verdunde monster in de gespoelde lasermodule en voer de snelle meting uit om te controleren of het monster binnen het acceptabele bereik ligt.
10. Voorbeeld NTA
OPMERKING: Het tabblad Standaardmeting bevindt zich op het tabblad SOP in het middelste vak onderaan en wordt gebruikt voor routinematige monsteranalyse (zie stappen 10.1 tot en met 10.12).
- Stel de duur in op 30 of 60 s en het aantal video's op 5.
- Accepteer de bestaande basisbestandsnaam of voer een nieuwe bestandsnaam in door op het tabblad ... voor een nieuwe opslagsite voor gegenereerde gegevens te klikken.
- Vink het vakje aan voor Doeltemperatuur en voer de gewenste temperatuur in.
- Klik op Script maken om deze standaardmeting opnieuw te gebruiken.
- Zodra het voorbeeld is geladen zoals beschreven in sectie 7 en het experiment klaar is om te worden uitgevoerd, klikt u op Script maken en uitvoeren.
- Vul de velden in het pop-upvenster Rapportdetails instellen in met informatie over de operator, voorbeeldbeschrijving, verdunning van het monster en gebruikt verdunningsmiddel.
OPMERKING: Deze informatie wordt vastgelegd en afgedrukt op het experimentele eindrapport. - Wanneer alle gewenste velden zijn ingevuld, klikt u op OK om het script te starten.
OPMERKING: Als doeltemperatuur is geselecteerd, stabiliseert de kachel het monster in de lasermodule tot de gewenste temperatuur gedurende 5 s voordat het script doorgaat met de meting. Het diagnosepaneel in de linkerbenedenhoek van het scherm leest HEATER ON en geeft de temperatuur van het monster weer. - Zoek voorafgaand aan elke video-opname naar een prompt om de zuiger handmatig vooruit te helpen. Injecteer ~ 0,05 ml van het monster in de laserkamer en laat de deeltjes tot rust komen (d.w.z. niet stromen) en klik vervolgens op OK.
- Wacht tot er een bevestigingsvak voor instellingen verschijnt na het voltooien van de5e video-opname en totdat het vak Proces knippert. Stel de detectiedrempel voor de verwerking van het monster in door het aantal blauwe kruisen op te merken dat deeltjes op het scherm markeert terwijl de frames handmatig vanaf de onderkant van het videoscherm worden gevorderd. Als er meer dan 3-4 blauwe kruisen zijn die deeltjes op elk scherm markeren naarmate frames verder gevorderd zijn, verhoogt u de detectiedrempel.
OPMERKING: De blauwe kruisingen op de afzonderlijke deeltjes zijn analoog aan het "zwerm" -effect in flowcytometrie en moeten worden geminimaliseerd voor optimale nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van gegevensverzameling. - Klik op Instellingen OK wanneer de detectiedrempel acceptabel is.
- Wacht tot de video's automatisch zijn verwerkt en een histogram met resultaten en een melding van voltooiing in het dialoogvenster worden weergegeven voordat u op OK klikt.
- Zodra het vak Exportinstellingen wordt weergegeven, slaat u de resultaten op door op Exporteren te klikken.
OPMERKING: Alle resultaten van video's en analyses worden opgeslagen in het doelbestand dat is gedefinieerd in stap 10.2. Dit vereist een grote hoeveelheid opslag. Controleer en breng indien nodig over naar een secundair opslagapparaat.
11. Heranalyse van het huidige monster bij verschillende detectiedrempels
OPMERKING: Onmiddellijk na de NTA-analyse (stap 10) kunnen de gegevens opnieuw worden geanalyseerd met behulp van verschillende detectiedrempelinstellingen. Het cameraniveau kan echter niet worden gewijzigd na de opname.
- Markeer alle 5 van de opnamevideo's die worden vermeld in het huidige experiment.
- Klik op Geselecteerde bestanden verwerken en wacht tot het vak Bevestiging instellen wordt weergegeven en het vak Proces knippert om de detectiedrempel te wijzigen.
- Pas de detectiedrempel aan op het gewenste niveau en klik op OK instellen.
- Wacht tot de video's automatisch zijn verwerkt en een histogram met resultaten en een melding van voltooiing in het dialoogvenster worden weergegeven voordat u op OK klikt.
- Klik op Exportinstellingen. Wanneer aanvullende evaluaties worden uitgevoerd op het meest recente voorbeeld, moet u op het vak Resultaten exporteren in het huidige experiment klikken, aangezien het pop-upvenster Resultaten exporteren niet wordt weergegeven na de heranalyse van het voorbeeld.
OPMERKING: Omdat er geen herinneringen zijn om dit te doen, kan het gemakkelijk over het hoofd worden gezien en gaat de analyse verloren. De onderliggende gegevens blijven echter bestaan en kunnen later opnieuw worden geanalyseerd.
12. Analyse van gearchiveerde bestanden
OPMERKING: Als eerder geanalyseerde experimenten niet zijn opgeslagen of als er aanvullende analyses op deze monsters moeten worden uitgevoerd, kunnen de afzonderlijke bestanden opnieuw worden geladen in de NTA-software voor aanvullende evaluaties van de detectiedrempel . Wijzigingen in het cameraniveau kunnen niet worden gewijzigd na opname.
- Laad de NTA-software vanaf het bureaublad.
- Klik op het tabblad Analyse in het onderste middelste deelvenster.
- Klik op Experiment openen en navigeer naar het gewenste NANO-bestand.
OPMERKING: De videobestanden die aan het geselecteerde NANO-experiment zijn gekoppeld, moeten zich in dezelfde map bevinden als het hoofdexperimentbestand. anders verschijnt er een fout bij het verwerken van de bestanden. De eerste 6 cijfers van de bestandsnaam zijn de datum waarop het experiment is uitgevoerd (xx-xx-xx). De laatste 6 cijfers van de bestandsnaam zijn de tijd waarop de video is opgenomen (xx-xx-xx) en de individuele video-id. Het PDF-bestand van elk gecombineerd experiment bevat de meegeleverde .nano-bestanden voor die analyse. - Klik op Geselecteerde bestanden verwerken om de analyse uit te voeren.
- Zodra het vak Proces knippert om wijzigingen in detectiedrempel toe te staan, stelt u de drempel in op het gewenste niveau en klikt u op OK.
- Wacht tot de video's automatisch zijn verwerkt en een histogram met resultaten en een melding van voltooiing in het dialoogvenster worden weergegeven voordat u op OK klikt.
- Klik op Resultaten exporteren. Zorg ervoor dat u op het vak Resultaten exporteren in het huidige experiment klikt, omdat het pop-upvenster Resultaten exporteren niet wordt weergegeven na de heranalyse.
OPMERKING: Omdat er geen herinneringen zijn om dit te doen, kan het gemakkelijk over het hoofd worden gezien en gaat de analyse verloren.
13. Reiniging en demontage van de lasermodule
- Schakel de laserbesturingsbox uit.
- Spoel het volledige monster van de lasermodule en gooi het op de juiste manier weg.
- Houd de lasermodule gekanteld met de open spuitpoort verhoogd om lucht uit de kamer te kunnen spoelen terwijl de DPBS langzaam in de lasermodule wordt geïnjecteerd en uit de spuitpoort van de uitlaat wordt gespoeld.
- Spoel de resterende DPBS uit de lasermodule en gooi deze weg.
- Herhaal het spoelen nog 2 keer en leeg de lasermodule zo volledig mogelijk na de laatste spoeling.
- Zet een gelijkmatige druk op het deksel van de stroomcel, maak de duimschroeven gelijkmatig los op een afwisselend diagonale manier totdat deze loskomt van de draden, verwijder de duimschroeven en bewaar ze in de behuizing van de lasermodule.
- Verwijder het deksel van de stroomcel uit de lasermodule.
- Reinig beide glasoppervlakken voorzichtig met een lenzenreiniger van goede kwaliteit en lenspapier. Gebruik geen tissuepapier of papieren handdoeken op glazen oppervlakken.
- Inspecteer de lasermodule en flow-cell cover "vensters" visueel op krassen of onvolkomenheden na gebruik en rapporteer aan de supervisor.
- Vervang de lasermodule en het afdeksel van de flowcel in hun geval om schade aan glazen oppervlakken tijdens opslag te voorkomen.
14. Voorbeeldanalyseprotocol
- Ongefilterde monsters
- Vortex het monster voorafgaand aan het laden en neem video's van 5 x 60 s op cameraniveau 12 en detectiedrempelniveau 3 op zoals hierboven beschreven. Analyseer deze video's opnieuw met detectiedrempels 2 en 5.
- Herhaal videocollecties van hetzelfde voorbeeld op cameraniveau 13 en 14 en detectiedrempelniveau 3. Analyseer deze 2 extra video's opnieuw met detectiedrempels 2 en 5. Herhaal het hele proces met behulp van video's van 5 x 30 s in de SOP-instelling .
- Gefilterde monsters
- Vortex het monster en laad en filter het vervolgens tegelijkertijd (0,22 μm spuitfilter) rechtstreeks in de lasermodule.
OPMERKING: Het spuitfilter werd vóór gebruik gespoeld met 2 keer het volume van de dode ruimte van het filter om eventuele deeltjes te verwijderen. De spuitfilters (zie de tabel met materialen) hadden een gemeten dode ruimte van 0,5 ml en werden voorafgaand aan de metingen gespoeld met 1,0 ml van het monster. Let op het filtertype in de SOP-gegevensvelden . Het gefilterde monster werd precies verwerkt zoals beschreven voor ongefilterde monsters in stap 14.1.
- Vortex het monster en laad en filter het vervolgens tegelijkertijd (0,22 μm spuitfilter) rechtstreeks in de lasermodule.
15. Statistische analyse van NTA-resultaten
- Voor de analyse van de belangrijkste effecten of interacties, voer een variantieanalyse uit na een controle van ANOVA-aannames (normaliteit, unimodaal, homogeniteit van variantie). Gebruik Kruskal-Wallis eenrichtings-ANOVA op rangen in gevallen van falen van ANOVA-aannames.
- Na de terugkeer van significante hoofdeffecten, gebruikt u de methode van Dunn om middelentests uit te voeren voor vooraf geplande vergelijkingen. Beschouw een p-waarde van 0,05 als significant bij tweezijdig testen.
OPMERKING: Gegevensbestanden die hier worden gegenereerd, zijn beschikbaar bij de auteurs na het voltooien van een overeenkomst voor materiaaloverdracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabel 1 bevat de resultaten van de NTA-video's voor de liposoommonsters (18 gefilterd en 18 ongefilterd) en een representatief DPBS-verdunningsmiddel. Vergelijkingen tussen de twee groepen werden voltooid, ongeacht het cameraniveau of de detectiedrempel in dit artikel. Gefilterde monsters hadden een gemiddelde deeltjesdiameter van 108,5 nm, een deeltjesmodus van 86,2 nm en een concentratie van 7,4 × 108 deeltjes/ml. Ongefilterde monsters hadden daarentegen een gemiddelde deeltjesdiameter van 159,1 nm, een deeltjesmodus van 105,7 nm en een concentratie van 7,6 × 108 deeltjes/ml. De gemiddelde en moduswaarden voor de gefilterde en ongefilterde monsters, ongeacht het cameraniveau of de detectiedrempel, waren statistisch significant (p < 0,05). Verschillen in concentratie tussen de gefilterde en ongefilterde monsters, ongeacht het cameraniveau of de detectiedrempel, waren niet significant (p = 0,86).
| Vergelijkingen van gefilterde versus ongefilterde monsters | ||||||||||||
| Monster | Cam Lev | Det Thr | Bedoelen | Gemiddelde %CV | St. Dev. | Conc. × 108 | St. Dev. × 107 | |||||
| Gefilterde | Ongefilterde | Gefilterde | Ongefilterde | Gefilterde | Ongefilterde | Gefilterde | Ongefilterde | Gefilterde | Ongefilterde | |||
| Liposoom | 12 | 3 | 138.3 | 162.1 | 55.5 | 47.5 | 76.7 | 77 | 3.2 | 6.48 | 1.74 | 3.16 |
| Liposoom | 12 | 2 | 126.3 | 153.7 | 58.7 | 49.8 | 74.2 | 76.5 | 4.94 | 8.23 | 2.74 | 3.5 |
| Liposoom | 12 | 5 | 155 | 172.2 | 51.8 | 45.6 | 80.3 | 78.6 | 1.91 | 5.05 | 1.02 | 2.9 |
| Liposoom | 13 | 3 | 102.7 | 169 | 43.5 | 51.3 | 44.7 | 86.7 | 6.72 | 7.75 | 1.91 | 1.17 |
| Liposoom | 13 | 2 | 95.8 | 161.4 | 43.3 | 52.7 | 41.5 | 85 | 10.3 | 9.7 | 1.61 | 1.83 |
| Liposoom | 13 | 5 | 110.7 | 176.1 | 42.5 | 47.1 | 47 | 83 | 4.16 | 6.28 | 1.83 | 1.07 |
| Liposoom | 14 | 3 | 98 | 147.6 | 42.4 | 43.8 | 41.6 | 64.6 | 10.6 | 8.56 | 2.4 | 1.66 |
| Liposoom | 14 | 2 | 92.9 | 142.1 | 42.6 | 45.2 | 39.6 | 64.3 | 14.9 | 10.7 | 2.54 | 1.83 |
| Liposoom | 14 | 5 | 103.8 | 153.8 | 41.1 | 42.6 | 42.7 | 65.5 | 7.42 | 7.02 | 2.37 | 1.51 |
| Liposoom | 12 | 3 | 105.6 | 179.4 | 22.2 | 46.7 | 23.4 | 83.7 | 5.2 | 5.81 | 1.06 | 4.28 |
| Liposoom | 12 | 2 | 100.3 | 170.8 | 24.3 | 49.1 | 24.4 | 83.8 | 7.76 | 7.39 | 1.61 | 4.41 |
| Liposoom | 12 | 5 | 112 | 187.2 | 20.4 | 42.9 | 22.8 | 80.4 | 3.27 | 4.68 | 0.815 | 3.93 |
| Liposoom | 13 | 3 | 99.8 | 153.3 | 23.4 | 52.1 | 23.4 | 79.8 | 7.19 | 7.34 | 3.37 | 1.5 |
| Liposoom | 13 | 2 | 94.3 | 143.6 | 25.8 | 53.2 | 24.3 | 76.4 | 10.8 | 9.53 | 4.3 | 2.46 |
| Liposoom | 13 | 5 | 106.8 | 162 | 21.3 | 49.4 | 22.7 | 80 | 4.64 | 5.76 | 2.63 | 1.01 |
| Liposoom | 14 | 3 | 103.4 | 142.3 | 31.7 | 49.6 | 32.8 | 70.6 | 9.91 | 8.66 | 3.29 | 12.5 |
| Liposoom | 14 | 2 | 97.8 | 136 | 33.3 | 51.4 | 32.6 | 69.9 | 13.8 | 11.5 | 2.98 | 15.7 |
| Liposoom | 14 | 5 | 109.5 | 151.4 | 31.1 | 49.5 | 34 | 74.9 | 7.27 | 6.76 | 3.42 | 10.1 |
| Gemiddeld | 108.5 | 159.1 | 36.4 | 48.3 | 40.5 | 76.7 | 7.4 | 7.6 | 2.3 | 4.1 | ||
Tabel 1: Gegevenstabel met verzamelde waarden, standaardafwijking en variatiecoëfficiënt voor gefilterde en ongefilterde monsters. Afkortingen: Cam Lev = cameraniveau; Det Thr = detectiedrempel; CV = variatiecoëfficiënt; St. Dev. = standaarddeviatie; Conc. = concentratie.
Wanneer de liposoommonsterresultaten werden ontleed op detectiedrempel (2, 3, 5) en cameraniveau (12, 13, 14), waren de resultaten niet significant (figuur 3). Opgemerkt moet worden dat er slechts 3 evaluaties (n = 3) waren op elk van deze individuele niveaus. Deze kleine steekproefomvang op elk cameraniveau en detectiedrempel hebben er waarschijnlijk toe bijgedragen dat het gebrek aan individuele vergelijkingen significant was. Wanneer echter detectiedrempelmonsters (2, 3, 5) werden geëvalueerd, ongeacht het cameraniveau over de gefilterde en ongefilterde monsters (n = 3), waren zowel de gemiddelde grootte (figuur 3A) als de modusgrootte (figuur 3B) significant (p < 0,05) verschillend. Daarentegen waren de verschillen tussen gefilterde en ongefilterde monsterconcentraties (figuur 3C) niet significant verschillend.
Figuur 3: Effecten van cameraniveau en detectiedrempel op gemeten deeltjesgrootte en concentratie van gefilterde en ongefilterde monsters. Gemiddelde (A) en modus (B) deeltjesgrootte bij gecombineerde cameraniveaus 12, 13, 14 toen de detectiedrempel werd verhoogd van 2 naar 3 naar 5 (n = 3), wat een significante afname van de deeltjesgrootte van de gefilterde monsters liet zien. Deeltjesconcentraties (C) op gecombineerde cameraniveaus 12, 13, 14 omdat de detectiedrempel werd verhoogd van 2 naar 3 naar 5) (n = 3), wat een concentratiedaling liet zien naarmate de detectiedrempel toenam zonder significant verschil tussen gefilterde en ongefilterde monsters. Gemiddelde (D) en modus (E) deeltjesgrootte bij gecombineerde detectiedrempels naarmate het cameraniveau steeg van 12 naar 14 (n = 3), wat een afname van de deeltjesgrootte van de gefilterde monsters laat zien. Deeltjesconcentraties (F) bij gecombineerde detectiedrempels naarmate de cameraniveaus stegen van 12 naar 14 (n = 3), wat een concentratiestijging laat zien naarmate het cameraniveau toeneemt zonder significante verschillen tussen gefilterde en ongefilterde monsters. Afkorting: DT = detectiedrempel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Wanneer de 3 cameraniveaus (12, 13, 14) werden geëvalueerd, ongeacht het detectiedrempelniveau (n = 3), namen zowel de gemiddelde grootte (figuur 3D) als de modusgrootte (figuur 3E) toe in de gefilterde monsters. De monsterconcentraties vertoonden de neiging om toe te nemen naarmate het cameraniveau steeg van 12 naar 14 (figuur 3F). De verschillen tussen gefilterde en ongefilterde monsterconcentraties die op verschillende cameraniveaus werden geëvalueerd, waren niet significant verschillend.
Aanvullend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de grootte en concentratie van nanodeeltjes te schatten11. Deze omvatten ensemblemethoden die een schatting van de grootte van een populatie genereren, waaronder dynamische lichtverstrooiing (DLS), centrifugale sedimentatie en analyse-elektronenmicroscopie op één deeltjesniveau, NTA, atoomkrachtmicroscopie en instelbare resistieve pulsdetectie. Hiervan zijn DLS en NTA veel gebruikte, niet-destructieve maat- en concentratiemeetmethoden, gebaseerd op Brownse beweging in een ideaal medium. DLS is afhankelijk van de verstrooiing van licht en de intensiteit is evenredig met het kwadraat van het deeltjesvolume. DLS is dus gevoeliger dan NTA voor de aanwezigheid van grote deeltjes, aggregaten of polydisperse populaties.
NTA berekent de diffusiecoëfficiënt op basis van de padlengte van individuele deeltjes gemeten in opeenvolgende videoframes. De belangrijkste beperking van NTA is het smalle bereik van deeltjesconcentratie dat het kan evalueren in vergelijking met DLS en andere meetmethoden, zodat individuele deeltjespadlengten binnen de diffractielimiet van de microscoop en de mogelijkheden van de trackingsoftware moeten vallen. Aangezien DLS en NTA afhankelijk zijn van de Brownse beweging, kan worden verwacht dat beide een goede mate van overeenstemming vertonen in monodispersed populaties; ze verschillen bij het evalueren van polydisperse populaties en die met aggregaten. Dit laatste maakt DLS nutteloos en verhoogt de schatting van de NTA-deeltjesgrootte aanzienlijkmet 12. De bekendste beperking van NTA is dat het een veel lagere deeltjesconcentratie (of grotere verdunning) vereist dan andere meetmethoden. Desondanks is NTA-karakterisering populair in nanomateriaalonderzoek. Omdat NTA-grootte- en concentratieschattingen afhankelijk zijn van een meer verdunde populatie, met gedefinieerde temperatuur, video-opname-instellingen, inclusief opnamelengte, cameraniveau, detectiedrempel en monsterverdunning om zeer reproduceerbaar te zijn, richt dit artikel zich op de noodzaak om deze te rapporteren om reproduceerbare resultaten te genereren.
Dit artikel laat zien dat het gebruik van een gestandaardiseerd protocol replicatie van resultaten mogelijk maakt en dat het gebruik van positieve controles, zoals groottestandaarden, informatie biedt over de kalibratie van de machine. Bovendien gaven deze resultaten het belang aan van het rapporteren van de kamertemperatuur van de lasermodule, cameraniveaus, detectiedrempel en filtratie (filtertype en -grootte). Daarentegen zijn de kamertemperatuur van de lasermodule, het verdunningsmiddel en de verdunningsfactor even belangrijk voor nauwkeurige en reproduceerbare resultaten. Hoewel noch MISEV2018 noch EV-TRACK specifiek de opname van deze informatie aanbeveelt, stellen we voor dat het opnemen van deze details onafhankelijke bevestiging van gepubliceerde resultaten mogelijk maakt en robuustheid toevoegt aan het experimentele ontwerp.
Beperkingen van het gebruik van latexgroottekalibratiestandaarden voor NTA-kalibratie in EV-analyse worden erkend en omvatten de bekende brekingsindexverschillen in vergelijking met lipide bi-layer nanodeeltjes van vergelijkbare grootte. In dit artikel werden latexparels gebruikt om de machinekalibratie voorafgaand aan metingen te bevestigen en niet om de detectiegrenzen te bepalen. De liposomen hebben een membraan dat vergelijkbaar is met dat van natuurlijk voorkomende EV's, en de brekingsindex zal ook representatief zijn voor EV's. De groottenormen, evenals de liposoommonsters, zijn monodispersed populaties; daarom zal hun grootteverdeling een Gaussische of log-normale verdeling volgen. Natuurlijke EV's zijn polydisperse en hun grootteverdeling volgt een machtswetfunctie13.
Historisch gezien rapporteren publicaties die NTA-karakterisering gebruiken inconsistent de nodige details om de onderzoeksresultaten te dupliceren. De mogelijkheid om NTA-gegevens te reproduceren is afhankelijk van de mogelijkheid om de instellingen te dupliceren die worden gebruikt om de oorspronkelijke gegevens vast te leggen. Zonder deze informatie zal de reproductie van experimentele resultaten met behulp van NTA uiterst moeilijk zijn. Met strikte naleving van een vast protocol en publicatie van de instellingsparameters die met de NTA worden gebruikt, kan een nauwkeurige replicatie van de resultaten worden bereikt. De volgende aanbevelingen worden gedaan om de consistentie van nanodeeltjeskarakterisering van grootte, concentratie, samenstelling en zuiverheid te verbeteren met behulp van een nanodeeltjesgrootteanalysator.
Controleer eerst altijd de kalibratie van de nanodeeltjesgrootteanalysator met behulp van de juiste maatnormen, zoals latexgroottenormen. Dit moet regelmatig gebeuren en worden vastgelegd in het instrumentlogboek en voorafgaand aan de analyse van kritische monsters. Ten tweede moeten alle instelbare parameters, zoals de kamertemperatuur van de lasermodule, cameraniveaus en detectiedrempels, voor elk monster in het monsterlogboekbestand worden geregistreerd, evenals de gebruikte verdunningen en verdunningsmiddelen. Deze parameters moeten worden gerapporteerd omdat ze afhankelijk zijn van de operator en van invloed zijn op NTA-metingen. Ten derde moeten verdunningsmiddelen die worden gebruikt voor monsterverdunning worden gekarakteriseerd op nanodeeltjesgehalte en worden gerapporteerd. De verdunningsmiddelen die voor afzonderlijke nanodeeltjesmonsters worden gebruikt, moeten worden geëvalueerd met behulp van dezelfde cameraniveau- en detectiedrempelinstellingen als die welke voor het verdunde monster worden gebruikt. Ten vierde moeten spuitfilters worden gespoeld met twee keer het dode ruimtevolume voorafgaand aan gegevensverzameling of monstervoorbereidingsstappen om de talrijke deeltjes die overblijven van het productieproces te spoelen. Ten vijfde moet de concentratie van de nanodeeltjes in het monster worden aangepast tot binnen de voorgestelde optimale 1,0 × 107 tot 1,0 × 109 per ml.
Door de hierboven beschreven beperkingen in deze studie te erkennen, laten we zien dat zowel de grootte als de concentratiewaarden verkregen door NTA kunnen worden beïnvloed door NTA-parameters, zoals cameraniveaus en detectiedrempels, en dat de grootte, maar niet de concentratie, kan worden beïnvloed door monstervoorbereiding. Dit onderstreept het cruciale belang van het rapporteren van deze parameters in nanomateriaal- en EV-literatuur, waardoor de productie van robuuste, reproduceerbare literatuur mogelijk wordt, zodat we systematisch de impact van EV-bron, isolatie en andere experimentele variabelen kunnen onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen van de auteurs heeft belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door de staat Kansas aan het Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), het Johnson Cancer Research Center aan MLW en NIH R21AG066488 aan LKC. OLS kreeg GRA-ondersteuning van de MICSCB. De auteurs bedanken Dr. Santosh Aryal voor het verstrekken van de liposomen die in dit project worden gebruikt en de leden van de Weiss- en Christenson-laboratoria voor nuttige gesprekken en feedback. Dr. Hong Hij wordt bedankt voor de technische ondersteuning. MLW bedankt Betti Goren Weiss voor haar steun en raad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic Pipetter | |||
| Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL | Thermo Sci. | 339650 | |
| Kimwipes | |||
| Lens Cleaner | |||
| Lens Paper | |||
| NanoSight LM-10 | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight LM-14 Laser Module | Malvern Panalytical | ||
| Nanosight NTA Software Ver. 3.2 | Malvern Panalytical | ||
| Paper Towels | |||
| Pipette Tips, 1-200 µL, Filtered, Sterile, Low Binding | BioExpress | P -3243-200X | |
| Pipette Tips, 50-1,000 µL, Filtered, Sterile | BioExpress | P-3243-1250 | |
| Saline, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca or Mg) | Gibco | 14190-144 | |
| Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL) | Malvern | NTA4088 | |
| Standards, Latex Transfer- 50 nm (3 mL) | Malvern | NTA4087 | |
| Syringe Filter, 33 mm, .22 µm, MCE, Sterile | Fisher brand | 09-720-004 | |
| Syringe, TB, 1 mL, slip tip | Becton Dickinson | 309659 | |
| Waste fluid container |
References
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Consortium, E. -T., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Danaei, M., et al. Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems. Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).
- Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles. Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Hole, P., et al. Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA). Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).
- Malvern analytical Ltd. NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).
- Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly. Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).
- Gollwitzer, C., et al. A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium. Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).
- vander Pol, E., et al. Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).
