Summary
Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.
Abstract
Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire botkanker bij kinderen en adolescenten, met longen als de meest voorkomende gemetastaseerde plaats. De vijfjaarsoverleving van osteosarcoompatiënten met pulmonale metastase is minder dan 30%. Daarom is het gebruik van muismodellen die de ontwikkeling van osteosarcoom bij mensen nabootsen van groot belang voor het begrijpen van het fundamentele mechanisme van osteosarcoomcarcinogenese en pulmonale metastase om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Hier worden gedetailleerde procedures gerapporteerd om de primaire osteosarcoom- en pulmonale metastasemuismodellen te genereren via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen. In combinatie met het bioluminescentie- of röntgensysteem voor live beeldvorming, worden deze levende muismodellen gebruikt om de groei en metastase van osteosarcoom te monitoren en te kwantificeren. Om dit model vast te stellen, werd een keldermembraanmatrix met osteosarcoomcellen geladen in een microvolumespuit en geïnjecteerd in één scheenbeen van elke athymische muis na te zijn verdoofd. De muizen werden opgeofferd toen het primaire osteosarcoom de groottebeperking in het door de IACUC goedgekeurde protocol bereikte. De benen met osteosarcoom en de longen met uitzaaiingen werden gescheiden. Deze modellen worden gekenmerkt door een korte incubatietijd, snelle groei, ernstige laesies en gevoeligheid bij het monitoren van de ontwikkeling van primaire en pulmonale gemetastaseerde laesies. Daarom zijn dit ideale modellen voor het verkennen van de functies en mechanismen van specifieke factoren in osteosarcoom carcinogenese en pulmonale metastase, de tumormicro-omgeving en het evalueren van de therapeutische werkzaamheid in vivo.
Introduction
Osteosarcoom is de meest voorkomende primaire botkanker bij kinderen en adolescenten 1,2, die voornamelijk het omliggende weefsel infiltreert en zelfs uitzaait naar de longen wanneer de patiënten worden gediagnosticeerd. Pulmonale metastase is de belangrijkste uitdaging voor osteosarcoomtherapie en de vijfjaarsoverleving van osteosarcoompatiënten met pulmonale metastase blijft zo laag als 20% -30% 3,4,5. De vijfjaarsoverleving van primair osteosarcoom is echter sinds de jaren 1970 verhoogd tot ongeveer 70% als gevolg van de introductie van chemotherapie6. Daarom is het dringend nodig om het fundamentele mechanisme van osteosarcoomcarcinogenese en pulmonale metastase te begrijpen om nieuwe therapieën te ontwikkelen. De toepassing van muismodellen die de progressie van osteosarcoom bij mensen het beste nabootsen, is van groot belang7.
De osteosarcoom diermodellen worden gegenereerd door spontane, geïnduceerde genetische manipulatie, transplantatie en andere technieken. Het spontane osteosarcoommodel wordt zelden gebruikt vanwege de lange tumorvormingstijd, inconsistente tumorvoorval, lage morbiditeit en slechte stabiliteit 8,9. Hoewel het geïnduceerde osteosarcoommodel toegankelijker is om te verkrijgen dan het spontane osteosarcoom, is de toepassing van het geïnduceerde osteosarcoommodel beperkt omdat de inducerende factor de micro-omgeving, de pathogenese en pathologische kenmerken van osteosarcoom zal beïnvloeden10. Transgene modellen helpen de pathogenese van kankers te begrijpen, omdat ze de menselijke fysiologische en pathologische omgevingen beter kunnen simuleren; de transgene diermodellen hebben echter ook hun beperkingen vanwege de moeilijkheid, lange termijn en hoge kosten van transgene modificatie. Bovendien, zelfs in de meest algemeen aanvaarde transgene diermodellen gegenereerd door p53- en Rb-genmodificatie, kwam slechts 13,6% van het sarcoom voor in de botten van de vier ledematen11,12.
Transplantatie is een van de meest gebruikte primaire en verre gemetastaseerde kankermodelproductiemethoden in de afgelopen jaren vanwege de eenvoudige manoeuvre, stabiele tumorvormingssnelheid en betere homogeniteit13. Transplantatie omvat heterotope transplantatie en orthotopische transplantatie volgens de transplantatieplaatsen. Bij osteosarcoom heterotope transplantatie worden de osteosarcoomcellen geïnjecteerd buiten de primaire osteosarcoomplaatsen (bot) van de dieren, meestal onder de huid, subcutaan14. Hoewel de heterotope transplantatie eenvoudig is zonder de noodzaak om een operatie bij dieren uit te voeren, vertegenwoordigen de plaatsen waar de osteosarcoomcellen worden geïnjecteerd niet de werkelijke menselijke osteosarcoommicro-omgeving. Osteosarcoom orthotopische transplantatie is wanneer de osteosarcoomcellen worden geïnjecteerd in de botten van dieren, zoals tibia15,16. In vergelijking met de heterotope grafts worden orthotopische osteosarcoomtransplantaten gekenmerkt door een korte incubatietijd, snelle groei en een sterke erosieve aard; daarom zijn het ideale diermodellen voor osteosarcoom-gerelateerde studies17.
De meest gebruikte dieren zijn muizen, honden en zebravissen18,19. Het spontane model van osteosarcoom wordt meestal gebruikt bij honden omdat osteosarcoom een van de meest voorkomende tumoren bij honden is. De toepassing van dit model is echter beperkt vanwege de lange tumorvormingstijd, de lage tumorigenesesnelheid, slechte homogeniteit en stabiliteit. Zebravissen worden vaak gebruikt om transgene of knock-out tumormodellen te construeren vanwege hun snelle reproductie20. Maar zebravisgenen verschillen van menselijke genen, dus hun toepassingen zijn beperkt.
Dit werk beschrijft de gedetailleerde procedures, voorzorgsmaatregelen en representatieve beelden voor het produceren van het primaire osteosarcoom in het scheenbeen met pulmonale metastase via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen in athymische muizen. Deze methode werd toegepast om het primaire osteosarcoom in het tibia van muizen te creëren voor therapeutische werkzaamheidsevaluatie, die een hoge reproduceerbaarheid vertoonde21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de dierenwelzijnscommissie van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. Vier weken oude mannelijke BALB / c athymische muizen werden geacclimatiseerd gedurende een week vóór de operatie voor orthotopische injectie van osteosarcoomcellen. Muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde muizenkooien met vijf muizen per kooi in een licht/ donkercyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot SPF-voer en steriel water.
1. Bereiding van cellen
- Op de dag van osteosarcoomcel (143B-Luciferase) injectie, was 80% -90% confluent cellen gekweekt in een 10 cm celkweekschaal tweemaal met PBS (pH 7,4) en trypsinize met 1,5 ml van 0,25% trypsine gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens 6 ml 10% serumbevattende MEM-media toe om het trypsine te doven en verzamel de cellen in een centrifugebuis van 15 ml.
OPMERKING: 143B-Luciferase cellijn wordt verkregen uit 143B cellijntransfect met pLV-luciferase vector23. - Zuig 20 μL celsuspensie op in de kamer van de celtelplaat en bereken de celconcentratie met behulp van een automatische celteller (zie Materialentabel).
- Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het supernatant op met een pipet en resuspend de celkorrel in een keldermembraanmatrix van 8,5 mg/ml (zie materiaaltabel) tot een eindconcentratie van 2 x 107 cellen/ml.
- Houd de cellen op ijs, breng ze naar de operatiekamer. De cellen moeten binnen 2 uur worden gebruikt.
OPMERKING: Om onnauwkeurige injectiedoses te voorkomen (bijvoorbeeld vanwege de dode ruimte in spuiten), wordt een extra celsuspensie bereid (meestal twee keer het vereiste volume celsuspensie). De keldermembraanmatrix wordt de hele tijd op ijs gehouden omdat deze een coagulatie-eigenschap heeft boven kamertemperatuur24.
2. Chirurgie voor orthotopische injectie van de osteosarcoomcellen
OPMERKING: De chirurgische hulpmiddelen zijn weergegeven in figuur 1.
- Muizen werden grootgebracht in specifieke pathogeenvrije omstandigheden. Alle procedures werden uitgevoerd in een aseptische kast met steriel gereedschap.
- Verdoof de muizen door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan en 98% zuurstof (zuurstofstroomsnelheid, 2 l / min).
- Breng een kleine hoeveelheid oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
OPMERKING: Voer de hele procedure uit in een goed geventileerde ruimte. Vóór osteosarcoomcelinjectie, zorg ervoor dat elke muis onder diepe anesthesie is door een teenknelpunt; als de muis nog steeds reacties heeft, zoals trillen of schokken, wacht dan lang totdat de bovenstaande reacties verdwijnen. - Houd elke muis in rugligging. Houd de enkel van de muis vast met de duim en wijsvinger en desinfecteer de injectieplaats van het scheenbeen met een 70% ethanol wattenstaafje.
OPMERKING: Om de enkel van de muis stevig vast te houden, zijn zowel de duim als de wijsvingers van groot belang voor de daaropvolgende procedures. - Draai het enkelgewricht van elke muis naar buiten om het scheenbeen en kuitbeen te bewegen en buig het kniegewricht naar een geschikte positie totdat het proximale tibiaplateau (de bovenkant van het scheenbeen) duidelijk zichtbaar is door de huid (figuur 2A).
- Bevestig de naald aan een spuit van 1 ml en richt de punt van de naald in de richting van de injectieplaats. Zorg ervoor dat de naald van de spuit evenwijdig is aan de lange as van het scheenbeen.
- Breng de naald percutaan door of naast de patellapees in terwijl deze door de huid / gewrichtskapsel gaat; draai de spuit (1/2 tot 3/4-cirkel) om een gat door het tibiaplatform te boren naar het distale uiteinde van het scheenbeen (medullaire holte) voor osteosarcoomcelinjectie met een spuit met microvolume (figuur 2B, C).
OPMERKING: Gelijktijdige rotatie van het scheenbeen kan worden gevoeld tijdens het boren als de naaldpunt nauwkeurig is. Zorg ervoor dat de needling naar voren beweegt met de rotatie van de spuit in plaats van direct naar voren te worden geduwd totdat ongeveer de helft van de naald zich in het scheenbeen bevindt.
- Breng de naald percutaan door of naast de patellapees in terwijl deze door de huid / gewrichtskapsel gaat; draai de spuit (1/2 tot 3/4-cirkel) om een gat door het tibiaplatform te boren naar het distale uiteinde van het scheenbeen (medullaire holte) voor osteosarcoomcelinjectie met een spuit met microvolume (figuur 2B, C).
- Controleer of de naald van de spuit een prominente beweging in het medullaire kanaal heeft gemaakt om succesvol te boren.
OPMERKING: Voer een röntgenonderzoek uit (zie Materiaaltabel) om de juiste positie van de naald te bevestigen en de beelden te verzamelen. - Laad 143B osteosarcoomcelsuspensie (vanaf stap 1.5) in een microvolumespuit en vervang de spuit van 1 ml in het scheenbeen door de 143B celbelaste microvolumespuit (figuur 2D). Injecteer langzaam ~ 10 μL (negeer reeds bestaande oplossing in de naald) van 143B celsuspensie in het scheenbeen van elke athymische muis (ongeveer 2 x 105 cellen) zonder hoge druk uit te oefenen.
- Druk met een wattenstaafje gedurende 20-30 s op de injectieplaats wanneer de spuit met microvolume wordt verwijderd.
- Plaats elke muis terug in een schone kooi en houd nauwlettend in de gaten totdat de muis volledig is hersteld van de anesthesie (ongeveer 10 minuten).
- Monitor de tumorgroei in vivo met behulp van een röntgenbeeldvormingssysteem. Meet wekelijks de langere diameter (a) en de korte diameter (b) van de kankermassa met een remklauw voor tumorvolume (V) berekening: V = 1/2 x a x b2.
OPMERKING: Verdoof de muizen door ze bloot te stellen aan 2% isofluraan en 98% zuurstof. De muizen werden verdoofd voor röntgenfoto's. Intratibia-injectie van luciferase of fluorescerend eiwit gelabelde osteosarcoomcellen maakt het mogelijk om primaire en gemetastaseerde osteosarcoomlaesies te volgen.
OPMERKING: Humane eindpunten van de muizen met osteosarcoom als gevolg van tumorgroei van de knie en longmetastase waren gebaseerd op de volgende criteria: (1) Body Condition Score, (2) gewichtsverliesdrempel van 20%, (3) gemiddelde maximale diameter van tumoren van 2 cm, of (4) ernstig beperkt diergedrag.
3. Pathologisch onderzoek (verzamelen van primaire en pulmonale gemetastaseerde osteosarcoommonsters voor analyse)
- Zes weken na osteosarcoomcelinjectie offert u de muizen op door cervicale dislocatie na blootstelling aan CO 2-inhalatie.
- Houd de muis in rugligging en strek beide achterpoten uit.
- Scheid de hele benen met osteosarcoom van het liesgebied.
OPMERKING: Zorg ervoor dat alle benen gescheiden zijn van dezelfde anatomische plaats. - Bereid het histologische monster van benen met osteosarcoom voor door de huid, spieren en voeten te verwijderen en fixeer vervolgens het monster van elke muis in een buis van 50 ml met 20 ml formaline-oplossing (10%) gedurende 24 uur, gevolgd door ontkalking in 10% EDTA-oplossing gedurende 14 dagen met af en toe een bufferwissel.
- Integreer het monster in paraffine en bereid secties voor voor histologisch onderzoek na eerder gepubliceerd werk25.
- Scheid de longen voorzichtig en doe ze in een buis van 50 ml gevuld met 20 ml formaline-oplossing (10%). Breng na 24 uur de longen van elke muis over in een buis van 15 ml met 70% ethanol. Embed de longen in paraffine voor Hematoxyline en Eosine (H & E) kleuring en immunohistochemie assay25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle orthotopische (primaire) osteosarcoom en gemetastaseerde longmodellen zijn afhankelijk van de nauwkeurige orthotopische injectie van osteosarcoomcellen. Hier werd met succes een orthotopisch (primair) osteosarcoommodel via intratibiale osteosarcoomcelinjectie ontwikkeld. Figuur 3A toont een representatieve muis met orthotopisch (primair) osteosarcoom en figuur 3B toont een representatief geïsoleerd orthotopisch (primair) osteosarcoom. Het tumorvolume werd eenmaal per week gemeten met een remklauw en berekend zoals beschreven in stap 2.11 (figuur 3C). De orthotopische (primaire) osteosarcoomgroei in vivo werd gevolgd door zowel de röntgenfoto als de bioluminescentie (wanneer de geïnjecteerde cellen werden gelabeld met luciferase) live beeldvormingssysteem. De röntgenbeelden werden verkregen van de eerste week tot de zesde week na 143B osteosarcoomcelinjectie (figuur 3D). Bovendien werd het beeld van orthotopische (primaire) osteosarcoomgroei in vivo verkregen nadat luciferase gelabeld 143B-cellen in het tibia van de muis werden geïnjecteerd (figuur 3E).
De pulmonale metastase veroorzaakt door de intratibiale injectie van luciferase gelabelde osteosarcoomcellen werd met succes in vivo gevolgd door een bioluminescentie live imaging systeem (Figuur 4A). De gemetastaseerde kolonies in de geïsoleerde longweefsels werden ook gevisualiseerd onder de stereomicroscoop (figuur 4B). De gemetastaseerde laesies werden verder bevestigd door H&E-kleuring op paraffine-ingebedde longweefsels (figuur 4C).
Figuur 1: Operatiegereedschap. (A) Spuit op schaal van 1 ml. (B) Spuit met microvolume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatie van de intratibiale injectiechirurgie. (A) De intratibiale injectieplaats van een athymische muis. (B) Een steriele spuit van 1 ml met een begeleidende naald werd percutaan ingebracht in het scheenbeen in de richting van het distale uiteinde via het proximale tibiaplateau (de bovenkant van het scheenbeen). (C) Een zijdelingse weergave van het boorproces. De naald van de spuit liep evenwijdig aan de lange tibia-as (ononderbroken lijn). (D) Intratibiale injectie met osteosarcoomcelbelaste injectiespuit met microvolume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Visualisatie van de osteosarcoomgroei bij muizen. (A) Succesvol orthotopisch osteosarcoommodel bij muizen. (B) Geïsoleerd orthotopisch osteosarcoom. (C) Tumorvolume werd gemeten met een remklauw en berekend met behulp van de volgende formule: tumorvolume = 0,5 x langere diameter x korte diameter x korte diameter. Foutbalken staan voor standaarddeviatie (n = 8). (D) Röntgenfoto's werden verkregen van dezelfde muis op een ander tijdstip (van 1-6 weken). (E) Beeld verkregen op de28e dag nadat luciferase gelabeld 143B cellen werden geïnjecteerd in het tibia van de muis. De rode pijlen gaven de luminescentie-intensiteit van het orthotopische (primaire) osteosarcoom aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Pulmonale metastase van osteosarcoom. (A) Beeld verkregen op de28e dag nadat luciferase gelabeld 143B cellen werden geïnjecteerd in de muis tibia. De rode pijlen gaven de luminescentie-intensiteit van de pulmonale metastase aan. (B) De geïsoleerde longen met osteosarcoommetastasen. De rode pijlen gaven de gemetastaseerde kolonies aan (x20). (C) H&E-kleuring toonde gemetastaseerde laesies in longweefsels (schaalbalk = 200 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orthotopische injectie van osteosarcoomcellen is een ideaal model om de functie en het mechanisme van specifieke factoren in osteosarcoomcarcinogenese en ontwikkeling te bestuderen om de therapeutische werkzaamheid te evalueren. Om verschillen in tumorgroei te voorkomen, worden de meeste actieve osteosarcoomcellen bij 80% -90% confluent met hetzelfde aantal zorgvuldig geïnjecteerd in het scheenbeen van elke muis en wordt de cel trypsinisatietijd strikt gecontroleerd zonder de levensvatbaarheid van de cel te beïnvloeden. Omdat celklompen het tellen van cellen beïnvloeden, wat leidt tot onnauwkeurige celnummers die in het scheenbeen van elke muis worden geïnjecteerd, moet de celsuspensie op de juiste manier worden gemengd met een pipet om de vorming van celklonten te voorkomen.
Een ander kritisch aspect waarmee rekening moet worden gehouden, is de geresuspendeerde oplossing voor osteosarcoomcellen. De geïnjecteerde cellen worden geresuspendeerd in een keldermembraanmatrix in plaats van in PBS of kweekmedium. Bovendien is een hoge concentratie keldermembraanmatrix een uitdaging om te worden gepipetteerd en beïnvloedt het nauwkeurige volume; daarom is een geschikte concentratie van keldermembraanmatrix vereist26. Om een gat door het tibiaplatform te boren voor osteosarcoomcelinjectie, beweegt de needling naar voren met de rotatie van de spuit in plaats van direct naar voren te worden geduwd totdat ongeveer de helft van de naald zich in het scheenbeen bevindt. Meer in het bijzonder worden immunodeficiënte muizen toegepast om een orthotopisch osteosarcoommodel vast te stellen met behulp van menselijke osteosarcoomcellen27. Ondertussen wordt de injectieprocedure uitgevoerd in een biologische veiligheidskast met behulp van steriele chirurgische hulpmiddelen. Omdat muizen onbehagen kunnen ervaren na anesthesie en chirurgie, moeten de muizen nauwlettend worden gecontroleerd op de eerste week na de operatie.
Intratibia-injectie van osteosarcoomcellen gelabeld met fluorescerend eiwit of luciferase maakt het mogelijk om primaire en gemetastaseerde laesies te volgen met behulp van optische beeldvorming28. Osteosarcoom is nooit toegestaan boven de groottelimiet zoals in het IACUC-goedgekeurde protocol; ondertussen kunnen ulceraties optreden in enorme tumormassa, wat kan leiden tot mislukte immunohistochemische analyses. Hoewel de primaire bottumoren en botmetastasen onlangs zijn gemeld te worden bereikt door implantatie van solide tumortransplantaat in bot, en de dieren reproduceerbaar groei ontwikkelden, evenals longmetastase uiteindelijk29; de auteurs implanteerden echter direct verse of gecryopreserveerde tumorfragmenten in het proximale scheenbeen, wat het nadeel van open chirurgie aantoonde, veroorzaakte potentiële infectie en falen van het ontwikkelen van tumortransplantatie. Bovendien zal het volume van geïmplanteerde tumorfragmenten zonder strikte controle resulteren in een significant verschil in geproduceerd tumorvolume, wat moeilijk is bij volgende toepassing, zoals het evalueren van de therapeutische werkzaamheid in vivo. Hier wordt gemeld dat een eenvoudige en reproduceerbare techniek het intratibia primaire osteosarcoom vaststelt met latere pulmonale metastasemuismodellen via intratibia-injectie van osteosarcoomcellen. Dit toonde de voordelen van het beste nabootsen van de klinische ontwikkelingskenmerken van osteosarcoom bij mensen; nauwkeurige aantallen osteosarcoomcellen die rechtstreeks in het scheenbeen worden geïnjecteerd met behulp van een microvolumespuit die een identieke tumorvormingssnelheid (100%) en tumorvolume mogelijk maakt. De methode zorgt ervoor dat de mogelijkheden van infectie of zelfs de dood worden vermeden met behulp van open operatietechnieken en maakt levendige monitoring en kwantificering van osteosarcoomgroei en metastase mogelijk met behulp van het bioluminescentie live beeldvormingssysteem nadat de geïnjecteerde osteosarcoomcellen zijn gelabeld met bioluminescentie. Dit voorkomt dat de geïnjecteerde osteosarcoomcellen direct de bloedbaan bereiken en in de longen koloniseren om longembolie en / of vals-positieve pulmonale metastase te vormen door de geïnjecteerde osteosarcoomcellen opnieuw op te suspenderen in de juiste concentratie van keldermembraanmatrix, omdat de keldermembraanmatrix de eigenschap heeft van coagulatie boven kamertemperatuur. De onmiddellijke stolling ondersteunt en beperkt osteosarcoomcellen in de keldermembraanmatrix nadat ze in het scheenbeen van de muis zijn geïnjecteerd.
Een andere literatuur heeft de botmetastase model vestiging door intracardiale inenting of intratibiale inenting van borstkankercellengemeld 30; cellen die in deze literatuur worden gebruikt, zijn echter borstkankercellen, die verschillende biologische en klinische kenmerken hebben met osteosarcoomcellen; bovendien worden zowel de intracardiale als de intramurale inenting gevestigde kankermodellen in bot gevormd door kankercelkolonisatie direct of reikend door de bloedbaan in plaats van metastaselaesies gevormd door verspreiding van kankercellen uit de primaire kankerlaesies.
Er zijn verschillende beperkingen van het huidige protocol. Muizen die in dit protocol worden gebruikt, zijn genetische immuunsysteemdefect naakte muizen zonder thymus die voorkomen dat ze immunologisch menselijke cellen afwijzen en worden veel gebruikt in preklinische onderzoeken, die niet van toepassing zijn op immuunfunctioneel onderzoek. Bovendien vonden we dat niet alle osteosarcoomcellijnen identiek relevant zijn in deze modellen, en de tumorigenesecapaciteiten van 143B-, MNNG-, MG-63- en U-2 OS-cellen zijn hoger dan de Saos-2-cellen.
Kortom, de huidige primaire en pulmonale gemetastaseerde osteosarcoommodellen gegenereerd door orthotopische osteosarcoomcelinjectie zijn handige hulpmiddelen om de tumormicro-omgeving, werkzaamheid van therapeutica op osteosarcoomgroei en / of metastase te bestuderen. Bovendien, door intratibia-injectie van de genetisch gemodificeerde osteosarcoomcellen die specifiek gericht zijn op een gen, zijn de modellen nuttig om de belangrijkste oncogenen en tumoronderdrukkers in osteosarcoomgroei en pulmonale metastase te verkennen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door subsidies van (1) National Key R & D Program of China (2018YFC1704300 en 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 en 82174408).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
References
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
- Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
- Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
- Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
- Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
- Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
- Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
- Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
- Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
- Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
- Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
- Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
- Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
- Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
