Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול כדי לקבוע הבדלים במצב redox בזאלי ו redox תגובות perturbations חריפה בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח באמצעות מיקרוסקופיה חיה קונפוצלית. ניתן להחיל את הפרוטוקול על סוגי תאים ומיקרוסקופים אחרים עם שינויים מינימליים.

Abstract

הומיאוסטזיס מיטוכונדריאלי redox חשוב עבור הכדאיות העצבית ותפקוד. למרות המיטוכונדריה מכילים מספר מערכות redox, תיול-דיסולפיד חוצץ גלוטתיון נחשב לשחקן מרכזי בהגנות נוגדות חמצון. לכן, מדידת פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי מספק מידע שימושי על מצב תיקון מיטוכונדריאלי ומתח חמצוני. גלוטרדוקסין1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) הוא אינדיקטור יחסמטרי מבוסס חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המקודד גנטית (GFP) של פוטנציאל הגלוטתיון מחדש בעל שתי פסגות עירור רגישות למצב אדום ב-400 ננומטר ו-490 ננומטר עם שיא פליטה יחיד של 510 ננומטר. מאמר זה מתאר כיצד לבצע מיקרוסקופיה חיה קונפוקלית של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח. הוא מתאר כיצד להעריך גלוטתיון מיטוכונדריאלי במצב יציב מחדש את הפוטנציאל (למשל, להשוות מצבי מחלה או טיפולים ארוכי טווח) וכיצד למדוד שינויים redox על טיפולים חריפים (באמצעות התרופה excitotoxic N-מתיל-D-אספרטט (NMDA) כדוגמה). בנוסף, המאמר מציג הדמיה משותפת של Grx1-roGFP2 ואת אינדיקטור פוטנציאל המילוכונדריה, tetramethylrhodamine, אתיל אסתר (TMRE), כדי להדגים כיצד Grx1-roGPF2 יכול להיות multiplexed עם אינדיקטורים נוספים עבור ניתוחים multiparametric. פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוצלי, (ii) להחיל תרופות לגירוי ואחריו כיול חיישנים עם דימיד ודית'רייטול, ו- (iii) לנתח נתונים עם ImageJ / FIJI.

Introduction

מספר אנזימים מיטוכונדריאליים חשובים ומולקולות איתות כפופים לוויסות תיול redox1. יתר על כן, המיטוכונדריה הם מקור תאי מרכזי של מינים חמצן תגובתי והם פגיעים באופן סלקטיבי לנזק חמצוני2. בהתאם לכך, פוטנציאל ההשמטה המיטוכונדריאלי משפיע ישירות על הביו-אנרגטיקה, איתות התא, תפקוד המיטוכונדריה, ובסופו של דבר על כדאיות התא3,4. המטריצה המיטוכונדריאלית מכילה כמויות גבוהות (1-15 מ"מ) של הגלוטתיון של מאגר התיול-דיסולפיד (GSH) לשמירה על הומיאוסטזיס ולהגנות נוגדות חמצון להרה5,6. GSH יכול להיות מחובר covalenting חלבונים היעד (S-גלוטתיוניליציה) כדי לשלוט במצבם מחדש ופעילותם והוא משמש על ידי מגוון של אנזימים detoxifying להפחית חלבונים מחומצנים. לכן, פוטנציאל גלוטתיון גלוטתיון המיטוכונדריאלי הוא פרמטר אינפורמטיבי מאוד בעת לימוד תפקוד מיטוכונדריאלי ופתופיזיולוגיה.

roGFP2 היא גרסה של GFP שנעשתה רגישה ל-redox על ידי תוספת של שני צייסטנים חשופים פני השטח היוצרים זוג dithiol-disulfide מלאכותי7,8. יש לו שיא פליטה יחיד ב ~ 510 ננומטר ושתי פסגות עירור ב ~ 400 ננומטר ו 490 ננומטר. חשוב לציין, המשרעת היחסית של שתי פסגות העירור תלויות במצב ההוקסר מחדש של roGFP2 (איור 1), מה שהופך את החלבון הזה לחיישן רצימטרי. בחיישן Grx1-roGFP2, גלוטרוקסין-1 אנושי הותך לטרמינל N של roGFP29,10. התקשרות קוולנטית של האנזים Grx1 ל- roGFP2 מעניקה שני שיפורים עיקריים של החיישן: היא הופכת את תגובת החיישן לספציפית עבור זוג הגלוטתיון GSH/GSSG (איור 1), והוא מאיץ את השיוויון בין GSSG ל- roGFP2 בגורם של לפחות 100,0009. לכן, Grx1-roGFP2 מאפשר הדמיה ספציפית ודינמית של פוטנציאל הגלוטתיון התאי מחדש.

הדמיית Grx1-roGFP2 יכולה להתבצע במגוון רחב של מיקרוסקופים, כולל מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רחבים, מיקרוסקופים קונפוקליים מסתובבים של דיסקים ומיקרוסקופים קונפוקליים לסריקת לייזר. ביטוי החיישן בתאי העצב העיקריים יכול להתבצע בשיטות שונות הכוללות ליפופקטיון11, COPRECIPitation DNA/סידן-פוספט12, העברת גנים בתיווך וירוסים או שימוש בבעלי חיים מהונדסים כמקור התא (איור 2). וירוסים רקומביננטיים מדומים (rAAV) המכילים יחס של 1:1 של חלבונים קבסידיים AAV1 ו- AAV2 13,14 שימשו לניסויים במאמר זה. עם וקטור זה, ביטוי חיישן מקסימלי הוא הגיע בדרך כלל 4-5 ימים לאחר ההדבקה ונשאר יציב לפחות שבועיים. השתמשנו בהצלחה Grx1-roGFP2 בהיפוקמפוס ראשוני נוירונים קליפת המוח מעכברים וחולדות.

במאמר זה, ביטוי בתיווך rAAV של מיטוכונדריה ממוקד Grx1-roGFP2 בהיפוקמפול חולדה ראשוני נוירונים קליפת המוח משמש להערכת מצב גלוטתיון מיטוכונדריאלי בזאלי ואת ההפרעה החריפה שלה. פרוטוקול מסופק עבור הדמיה חיה confocal עם הוראות מפורטות כיצד (i) למטב את הגדרות מיקרוסקופ קונפוקליות סריקת לייזר, (ii) להפעיל ניסוי הדמיה חיה, ו -(iii) לנתח נתונים עם FIJI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים התאימו להנחיות הלאומיות והמוסדיות, כולל הוראת המועצה 2010/63/האיחוד האירופי של הפרלמנט האירופי, והיה להם אישור אתי מלא של משרד הפנים (המשרד לרווחת בעלי החיים של אוניברסיטת היידלברג ו- Regierungspraesidium Karlsruhe, רישיונות T14/21 ו- T13/21). נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס ובקליפת המוח הוכנו מעכבר או גורי חולדות שזה עתה נולדו על פי הנהלים הסטנדרטיים ונשמרו במשך 12-14 ימים כפי שתואר קודם לכן13.

1. הכנת פתרונות

  1. פתרונות מלאי עבור מאגר הדמיה
    1. הכן כל פתרון מלאי לפי טבלה 1 ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F). לאחסון לטווח ארוך (>3 חודשים), שמור על עליקוטים ב-20 °C (70 °F).
רכיב MW ריכוז (ז) סכום (ז) עוצמת קול (מ"ל)
NaCl 58.44 5 14.61 50
KCl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
גליצין 75.07 0.1 0.375 50
סוכרוז 342.3 1.5 25.67 50
נתרן פירובט 110.04 0.1 0.55 50
HEPES 238.3 1 11.9 50
גלוקוז 180.15 2.5 45 100

טבלה 1: פתרונות מלאי עבור מאגר הדמיה.

  1. פתרונות מלאי של תרופות וצבעים
    1. להמיס דימיד (DA; משמש לכיול יחס מרבי של 405:488) במים כדי להשיג תמיסת מלאי של 0.5 M (למשל, 1 גרם ב-11.615 מ"ל של מים). Aliquot ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
    2. להמיס dithiothreitol (DTT; משמש לכיול של יחס מינימלי 405:488) במים כדי לקבל פתרון מלאי 1 M (למשל, 5 גרם ב 32.425 מ"ל של מים). Aliquot ולאחסן ב -20 °C (50 °F) לכל היותר 3 חודשים.
    3. להמיס N-מתיל-D-אספרטט (NMDA; משמש כדי לגרום excitotoxicity חמצון מיטוכונדריאלי) במים כדי לקבל פתרון מלאי 10 mM (למשל, 25 מ"ג ב 16.991 מ"ל של מים). לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F). לאחסון לטווח ארוך (>6 חודשים), שמור את ה- aliquots ב - -80 °C (70 °F).
    4. טטרמתילרודמין אתיל אסטר פרכלוארט (TMRE; אינדיקטור למולקולה קטנה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית)
      1. להמיס אבקת TMRE מתנול כדי להשיג מלאי 20 mM (למשל, 25 מ"ג ב 2.427 מ"ל של מתנול).
      2. לדלל את מניית 20 mM 1:1,000 במתנול כדי להשיג מניית 20 מיקרומטר.
      3. Aliquot פתרונות מלאי 20 mM ו 20 מיקרומטר, לאטום עם parafilm, ולאחסן מוגן מפני אור ב -20 °C (50 °F).
        הערה: שני פתרונות המניות יציבים במשך מספר שנים. השתמש בפתרון המלאי 1,000x (20 מיקרומטר) לניסויים.
  2. מאגר הדמיה
    1. הכן 100 מ"ל של מאגר הדמיה על ידי הוספת כל הרכיבים משולחן 2 עד 80 מ"ל של מים סטריליים בגליל מדידה. להביא את הנפח עד 100 מ"ל עם מים סטריליים. מערבבים על ידי ניעור זהיר של גליל המדידה עד שהתמיסה נראית הומוגנית.
      הערה: מומלץ להשתמש osmometer כדי לבדוק את osmolarity של המאגר. זה צריך להיות קרוב ככל האפשר למדיום הצמיחה של התאים. כאן, זה 315 mOsmol / L. להגדיל או להקטין את ריכוז סוכרוז לפי הצורך כדי להתאים את osmolarity של חיץ הדמיה ומדיום צמיחה.
    2. כוונן את ה-pH ל-7.4. הפוך aliquots ולשמור אותם ב 4 °C (70 °F) עד שבועיים. לאחסון לטווח ארוך, שמור על עליקוטים ב -20 °C (70 °F). אפשרו למאגר ההדמיה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
רכיב פתרון מלאי (ז) ריכוז סופי (mM) עוצמת קול (מ"ל)
NaCl 5 114 2.3
KCl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
גליצין 0.1 0.005 0.005
סוכרוז 1.5 52 3.5
נתרן פירובט 0.1 0.5 0.5
HEPES 1 10 1
גלוקוז 2.5 5 0.2

טבלה 2: הרכב מאגר הדמיה. אמצעי האחסון שצוינו משמשים להכנת 100 מ"ל של מאגר הדמיה.

  1. פתרונות לגירוי וכיול
    הערה: תמיד להכין פתרונות גירוי טרי על ידי הוספת פתרונות מלאי של תרופות שצוינו למאגר ההדמיה ממש לפני הניסוי. פתרונות לגירוי וכיול יותוספו לתא ההדמיה ברצף במהלך ניסוי (ראו סעיפים 3-5). בהתאם לסוג הניסוי, פתרונות שונים נדרשים כדי להגיע לאותו ריכוז קצה בנפח הסופי המתאים בתא ההדמיה.
    1. הכן פתרון 3x NMDA (90 מיקרומטר; ריכוז סופי בתא: 30 מיקרומטר) על ידי הוספת 63 μL של מלאי NMDA 10 מ"מ ל 6.937 מ"ל של מאגר הדמיה. הוסף 500 μL של הפתרון המתקבל לתא (נפח סופי: 1.5 מ"ל).
    2. הכן פתרון DA 2x לשלבים 3 ו- 4 (1 מ"מ; ריכוז סופי בתא: 0.5 מ"מ) על-ידי הוספת 14 μL של מלאי DA של 0.5 M ל- 6.986 מ"ל של מאגר הדמיה. הוסף 1 מ"ל לתא (נפח סופי: 2 מ"ל).
    3. הכן פתרון DA 4x לשלב 5 (2 מ"מ; ריכוז סופי בתא: 0.5 מ"מ) על-ידי הוספת 28 μL של מלאי DA של 0.5 M ל- 6.972 מ"ל של מאגר הדמיה. הוסף 500 μL לתא (נפח סופי: 2 מ"ל).
    4. הכן פתרון DTT 1x (5 מ"מ; ריכוז סופי בתא: 5 מ"מ) על ידי הוספת 45 μL של 1 M DTT מלאי 8955 μL של מאגר הדמיה. הוסף 1 מ"ל של פתרון זה לתא לאחר שאיפת מאגר ההדמיה (נפח סופי: 1 מ"ל).

2. טעינת תאים עם TMRE

הערה: בפרוטוקול זה, TMRE משמש במצב שאינו מרווה15 בריכוז סופי של 20 ננומטר. באופן כללי, הריכוז הנמוך ביותר האפשרי של TMRE שעדיין מספק עוצמת אות מספקת על המיקרוסקופ של בחירה יש להשתמש. בשל אידוי לא אחיד, נפח המדיום בבארות שונות יכול להיות שונה בתרבויות ראשוניות ארוכות טווח. כדי להבטיח ריכוז TMRE עקבי בכל בארות, אין להוסיף TMRE ישירות לבארות. במקום זאת, החלף את המדיום בכל באר באותה כמות של מדיום המכיל TMRE. הפרוטוקול שלהלן מיועד נוירונים ראשוניים 24-well לוחות המכילים ~ 1 מ"ל של בינוני לבאר.

  1. עבודה במכסה המנוע זרימה למינאר תרבות רקמה, לאסוף 500 μL של בינוני מכל באר לתוך צינור חרוט אחד.
  2. לבאר, להוסיף 0.5 μL של 20 μM TMRE מלאי לתוך הצינור חרוט (למשל, 12 μL עבור 24 בארות).
  3. שאפו בזהירות את המדיום הנותר מהבאר הראשונה והחליפו אותו ב-500 מיקרו-אל של מדיום המכיל TMRE. המשך, היטב, עם בארות הנותרות.
    הערה: יש להקפיד לא לתת לתאים להתייבש ולא להפריע לתאים.
  4. להחזיר את התאים לאינקובטור ולחכות לפחות 60 דקות עבור שיווי משקל צבע.
    הערה: ניתן להאריך את זמן הטעינה למספר שעות ללא תופעות לוואי.
  5. כדי להבטיח ריכוזי TMRE עקביים ושיווי משקל לאורך ניסוי ההדמיה, הקפד לכלול ריכוז סופי של 20 nM TMRE במאגר ההדמיה וכל פתרונות הגירוי.

3. אופטימיזציה של הגדרות מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה

הערה: שלב זה נועד למצוא את הפשרה הטובה ביותר בין איכות התמונה לבין הכדאיות של התא במהלך הדמיה חיה. סעיף זה מתאר את המיטוב של הגדרות עבור הדמיית roGFP. אם מתבצעת הדמיה רב-פרמטרית, יש לבצע אופטימיזציה דומה, כולל בדיקת קו בסיס יציב ללא סימנים להלבנה או פוטוטוקסיה, עבור האינדיקטורים הנוספים.

  1. הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת הגדרות תקן הטעינה עבור הדמיית GFP (עירור של 488 ננומטר, פליטה של 505 - 550 ננומטר).
  2. הגדר את הגלאי ל- 12 סיביות או 16 סיביות.
    הערה: בדרך כלל, 8 סיביות אינן מספיקות להדמיה כמותית.
  3. הפעל את מצב הסריקה הרציף והוסף רצף /רצועה שניים (עירור של 405 ננומטר, פליטה של 505 - 550 ננומטר).
  4. עבור שני הערוצים, בחר טבלת בדיקת מידע מדומה המציינת פיקסלים חשופים יתר על המידה ומתחת (לדוגמה, GLOW OU).
  5. בחר מטרה המתאימה למושא העניין.
    הערה: 10x-40x מתאימים לניתוח תא יחיד, 63x-100x מתאימים לניתוח מיטוכונדריון יחיד.
  6. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, להוסיף 1 מ"ל של מאגר הדמיה, ולהניח את התא על המיקרוסקופ.
  7. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
    הערה: אין להשתמש באור אפיפלואורסצנטיות כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
  8. הקלט תמונות בתבניות פיקסל שונות. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את מספר הפיקסל הנמוך ביותר המעניק רזולוציה מקובלת של מבנה העניין.
    הערה: בדרך כלל, 512 x 512 פיקסלים פועלים היטב עבור הדמיה של תא בודד עם מטרות של פי 20 ו- 40x, ו- 1024 x 1024 או 2048 x2048 פיקסלים בדרך כלל פועלים היטב עבור הדמיית מיטוכונדריון יחיד עם מטרה של 63x.
  9. הקלט תמונות בגדלים שונים של חורי סיכה. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את גודל חור הסיכה הגדול ביותר המעניק רזולוציה מקובלת של מבנה העניין.
    הערה: בדרך כלל, 3-7 יחידות אווריין לעבוד טוב.
  10. הקלט תמונות בעוצמות לייזר שונות.
    1. התאם את הרווח והסף של הגלאי בהתאם. בהתבסס על תמונות אלה, בחר את עוצמת הלייזר הנמוכה ביותר המעניקה עוצמת אות מקובלת ויחס אות לרקע.
      1. כדי לקבוע את יחס האות לרקע, מדוד את עוצמת האות באזור עניין (ROI) המכיל תאים או מיטוכונדריה (ROI1) וב-ROI ללא תאים או מיטוכונדריה (ROI2). לאחר מכן, לחלק את עוצמת ROI1 על ידי עוצמת ROI2.
        הערה: כוון ליחס אות לרקע של >3 ועוצמות אותות של ROIs בודדים של 200-1,000 עבור עירור של 405 ננומטר עם כוח לייזר של 1-3% ועוצמות של ROIs בודדים של 300-1,500 עבור עירור של 488 ננומטר עם כוח לייזר של 1%.
  11. הקלט תמונות עם מהירויות סריקה שונות ומספר ממוצעי מסגרות. הקלט 4-5 תמונות עבור כל שילוב של הגדרות. בהתבסס על סדרות תמונות אלה, בחרו במהירות הגבוהה ביותר ובהגדרות הממוצעות הנמוכות ביותר המעניקות רעש תמונה מקובל ושונות תמונה לתמונה.
    הערה: מהירות סריקה של 600 מסגרות הרץ ו- 1-2 לממוצע פועלת היטב ברוב המקרים.
  12. באמצעות כיסוי חדש, הקלט סידרה של זמן לשגות עם ההגדרות הממוטבות.
    הערה: משך הזמן ומרווח התמונה של הסדרה צריכים להידמות לאלה של הניסויים המתוכננים.
  13. בסוף סדרת הזמן-לשגות, הוסף 1 מ"ל של פתרון DA 2x לתא ההקלטה. תמונה למשך 2 דקות נוספות.
  14. שאפו את מאגר ההדמיה באמצעות משאבה פרייסטלית או פיפטה כף יד. הוסף 1 מ"ל של פתרון DTT 1x. תמונה למשך 5 דקות נוספות.
  15. נתח את ניסוי זמן-לשגות (ראה סעיף 5).
    1. ודא שאף אחד משני הערוצים לא נחשף יתר על המידה או לא נחשף במהלך טיפול DA ו- DTT עם ההגדרות הממוטבות.
    2. ודא שאף אחד משני הערוצים לא מראה להלבנה ניכרת במהלך ההקלטה בזמן ההפסקה; שואפים לאובדן אינטנסיביות של <2% בין התמונות הראשונות והאחרונות.
    3. ודא שיחס 405:488 אינו משתנה במידה ניכרת במהלך ההדמיה.
  16. חזור על ההליך כולו באופן איטרטיבי, תוך שימוש במספר כיסויים, עד שהוגדרו הגדרות המספקות תוצאות מקובלות באופן עקבי.

4. הערכת מצב ההוקסם מחדש של הבזל

  1. הפעל את המיקרוסקופ וטען את ההגדרות הממוטבות מסעיף 3.
  2. הגדר את ממוצע המסגרת ל - 3-5.
  3. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, להוסיף 1 מ"ל של מאגר הדמיה, ולהניח את התא על המיקרוסקופ.
  4. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
    הערה: אין להשתמש באור אפיפלואורסצנטיות כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
  5. עבור למצב סריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה חיה כדי להתמקד ולאתר תאים להדמיה.
  6. השתמש בפונקציה multipoint כדי לבחור 3-5 שדות תצוגה בכיסוי.
  7. הקלט תמונת בסיס.
  8. הוסף 1 מ"ל של פתרון DA 2x לחדר.
  9. לאחר 1, 2 ו- 3 דקות, השתמש בתצוגה חיה כדי לאשר/להתאים את המוקד ולאחר מכן להקליט תמונה.
    הערה: התאים בדרך כלל מחומצנים לחלוטין לאחר 2 דקות.
  10. החלף את המאגר בתא ההדמיה בפתרון DTT 1 מ"ל אחד.
  11. לאחר 3 ו- 5 דקות, השתמש בתצוגה חיה כדי לאשר/להתאים את המוקד ולאחר מכן להקליט תמונה.
    הערה: התאים בדרך כלל מופחתים באופן מלא לאחר 4-5 דקות.

5. הדמיה חיה של טיפולים חריפים

הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר הדמיה של תגובת redox המיטוכונדריאלי לטיפול NMDA. ייתכן שיהיה צורך להתאים מרווחי תמונה ומשך הניסוי לטיפולים אחרים.

  1. הפעל את המיקרוסקופ וטען את ההגדרות הממוטבות מסעיף 3.
  2. הגדר את מרווח הזמן ל- 30 שניות ומשך הזמן ל- 25 דקות.
  3. הר כיסוי עם תאים לתוך תא ההדמיה, להוסיף 1 מ"ל של מאגר הדמיה, ולהניח את התא על המיקרוסקופ.
    הערה: כדי למנוע סחיפה מיקוד תרמית, להשאיר את התאים על שלב המיקרוסקופ במשך 10-15 דקות לפני תחילת הדמיה זמן לשגות.
  4. השתמש בעין ובאור המועבר כדי למקד את התאים.
    הערה: אין להשתמש באור אפיפלואורסצנטיות כדי לאתר ולמקד תאים. אפילו בהספק נמוך, זה ישפיע לרעה על התאים.
  5. עבור למצב הסריקה והשתמש בערוץ 488 ננומטר בתצוגה חיה כדי להתמקד ולאתר תאים להדמיה.
  6. אופציונלי: כדי להגדיל את מספר התאים המוקלטים בכל ריצה, השתמש בפונקציה multipoint כדי לדמיין 2-3 שדות תצוגה לכל כיסוי.
  7. התחל את רכישת הזמן-לשגות והקלט 5 תמונות כהקלטה בסיסית של 2 דקות.
  8. הוסף 500 μL של פתרון 3x NMDA לתא (ריכוז סופי 30 מיקרומטר) ולרשום 20 תמונות נוספות כתגובת NMDA של 10 דקות.
    הערה: נוירונים רגישים מאוד לשינויים באוסמולריות. לכן, הקפד למזער את האידוי של מאגר ההדמיה. לטיפולים ארוכים יותר, תא ההדמיה צריך להיות מכוסה במכסה.
  9. הוסף 500 μL של פתרון DA 4x לתא והקלט 6 תמונות נוספות (כיול מרבי של 3 דקות).
  10. שאף את המאגר מתא ההדמיה והחלף אותו ב- 1 מ"ל של פתרון DTT 1x. הקלט 10 תמונות נוספות (כיול מינימלי של 5 דקות).
  11. סיים את ההקלטה ושמור את סידרת התמונות.

6. ניתוח נתונים

  1. ייבוא נתונים וקדם עיבוד תמונה ב- FIJI
    1. השתמש ביבואן Bio-Formats כדי לפתוח קבוצת תמונות מהשלב 4 או מקובץ תמונה מהשלב 5. לחץ על תוספים | ביו-פורמטים | יבואן ביו-פורמטים. בתיבת הדו-שיח , השתמש בערימה הצג עם: ערכת יתר, הגדר מצב צבע: ברירת מחדל, בחר שינוי קנה מידה אוטומטי ואל תתפצל לחלונות נפרדים.
      הערה: שינוי קנה מידה אוטומטי ממטב את תצוגת הנתונים על מסך המחשב. זה לא משנה את עוצמות הפיקסלים.
    2. אם נפתחו תמונות בודדות מהשלב 4, לחץ על תמונה | ערימות | כלים | יש למזג אותם לערימה של תמונה אחת.
    3. אם יש XY-להיסחף במהלך סדרת התמונות, לחץ על תוספים | StackReg כדי לרשום את התמונות. בתיבת הדו-שיח , בחר גוף קשיח או תרגום.
    4. שנה את תבנית התמונה ל- 32 סיביות על-ידי לחיצה על תמונה | הקלד | 32 סיביות.
    5. פצל את ערוצי הצבע לחלונות נפרדים על-ידי לחיצה על תמונה | | צבע ערוצים מפוצלים.
    6. בחר ערוץ 1 (405 ננומטר) והתאם את הסף לבחירת המיטוכונדריה לניתוח על-ידי לחיצה על תמונה | כוונון | סף. בתיבת הדו-שיח , בחרו 'ברירת מחדל', 'אדום', 'רקע כהה' ו'הערימה היסטוגרמה' והמתינו עד שהפיקסלים שנבחרו ייראו אדומים. לחץ על החל. בחרו 'הגדר פיקסלי רקע' ל-NaN ועבדו את כל התמונות.
      הערה: כדי להימנע מהטיית משקיפים פוטנציאלית, יש להשתמש בה קביעת סף אוטומטית. FIJI מציעה מספר שיטות אוטומטיות (כגון ברירת מחדל, הואנג, Intermodes, Otsu) שניתן לבחור מתפריט נפתח בתיבת הדו-שיח סף. בדרך כלל, שיטת ברירת המחדל מעניקה תוצאה טובה. מומלץ להשוות מספר שיטות במהלך הניתוח הראשון כדי למצוא את שיטת הסף הטובה ביותר עבור ערכת התמונות הנתונה. לאחר בחירת שיטה, יש להחיל אותה על כל התמונות.
    7. חזור על שלב 6.1.6 עבור ערוץ 2 (488 ננומטר).
    8. צור תמונת יחס כדי להציג באופן חזותי את יחס 405:488 ננומטר על-ידי לחיצה על תהליך | מחשבון תמונה. בתיבת הדו-שיח , בחר תמונה 1: ערוץ 1, פעולה: הפרדה, תמונה 2: ערוץ 2, צור חלון חדש, עבד את כל התמונות.
    9. שנה את טבלת בדיקת המידע של תמונת היחס ל - פסאודוקולור. לדוגמה, כדי לעבור לאש, לחץ על תמונה | | טבלאות בדיקת מידע אש.
  2. ניתוח תמונה
    1. בתמונת היחס, צייר ROIs סביב תאים בודדים או מיטוכונדריה. לאחר ציור כל ROI, הוסף אותו למנהל ההבחות. ניתוח | כלים | מנהל | של | הוסף. (קיצור מקשים: 'T') בחר הצג הכל.
      הערה: מכיוון שהפקסלים ברקע הוגדרו כ'לא מספר' (NaN) בשלבים 6.1.6 ו- 6.1.7, הם לא ישפיעו על תוצאת המדידה. לכן, מקובל לכלול כמה פיקסלי רקע ב- ROI.
    2. מדוד את היחסים של 405:488 של תאים בודדים על-ידי לחיצה על מנהל ההשערה | ctrl+A כדי לבחור את כל ההשערות | עוד | ריבוי מידה. בתיבת הדו-שיח , בחרו 'מדוד את כל הפרוסות' ואת 'שורה אחת' לפרוסה.
    3. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
    4. בחר את התמונה של 405 ננומטר. מדוד את האינטנסיביות של כל ההנסים עלה על המידה כמו בשלב 6.2.2. באמצעות ROIs המאוחסנים במנהל ההחזר על מכירות.
    5. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
    6. בחר את התמונה של 488 ננומטר. מדוד עוצמות של כל ההנסרות כמו בשלב 6.2.2. באמצעות ROIs המאוחסנים במנהל ההחזר על מכירות.
    7. יצא את המידות לתוכנת גיליון אלקטרוני.
    8. שמור ROIs לעיון עתידי על-ידי לחיצה על מנהל ההפרשה על | ctrl+A כדי לבחור את כל ההבהלה | עוד | שמור.
    9. מומלץ: צור עוצמה לעומת חלקות זמן של עקבות 405 ו- 488 ננומטר. ודא כי אין להלבנה מסומנת באף אחד מהערוצים (עוצמת האות בסוף סדרת ההדמיה צריכה להיות ≥98% מהתמונה הראשונה) וכי שני העקבות עוברים לכיוונים מנוגדים במהלך תגובות החיישנים (למשל, מעקב 405 ננומטר צריך לגדול במהלך חמצון בעוד מעקב 488 ננומטר צריך לרדת).
  3. נרמול נתונים
    1. עבור כל ההחזר על השקעה מתמונת היחס, קבע את הערך המרבי במהלך טיפול DA (Rmax) ואת הערך המינימלי במהלך טיפול DTT (Rmin).
    2. חשב את היחס המנורמל באופן הבא:
      Equation 1
      הערה: פעולה זו תגדיר את היחס המרבי ל- 1.0 ואת היחס המינימלי ל- 0.
  4. ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית
    1. כדי להשיג מדידות של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במקביל לעוצמות roGFP בשלב 6.2.6, עבור אל ניתוח | קבע מדידות ובדוק את מתארי הצורה והתאים אליפסה.
      הערה: בנוסף לעוצמה ממוצעת, המדידות בחלון התוצאות יכללו את אורך הציר הראשי (מייג'ור), אורך הציר המשני (מינור), יחס הגובה-רוחב (AR; ציר ראשי חלקי ציר משני; למיטוכונדריה עגולה יש AR ~ 1, למיטוכונדריה מוארכת יש AR גדול יותר), כמו גם מדידות של מעגליות (Circ.) ועגולות (עגול).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כימות הבדלים במצב מיטוכונדריאלי יציב לאחר נסיגת גורם גדילה
כדי להדגים את הכימות של הבדלים במצב יציב במצב redox מיטוכונדריאלי, נוירונים ראשוניים גדלו במדיום סטנדרטי הושוו נוירונים בתרבית ללא גורמי גדילה עבור 48 שעות לפני הדמיה. נסיגה גורם גדילה תוצאות מוות תאי עצביים אפופטוטי לאחר 72 h16. תאים צולמו לאחר 48 שעות כדי לבדוק אם זה קדם לשינויים במצב ילוקס מיטוכונדריאלי. נוירונים קליפת המוח חולדה ראשוני גדל על כיסויים מצופים poly-L-ornithine נדבקו rAAV-mito-Grx1-roGFP2 בימים במבחנה 6 (DIV6) וצוו על DIV12. הדמיה חיה בוצעה בטמפרטורת החדר על פי סעיף 4 של פרוטוקול זה על מיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר הפוך המצויד במטרה טבילת מים 40x/ 1.10. הגדרות הקונפוקליות היו חור סיכה 7 יחידות אוורירית, גודל פיקסל 568.7 ננומטר (512 x 512 פיקסלים), מהירות סריקה 600 הרץ, כוח לייזר 405 ננומטר 3%, כוח לייזר 488 ננומטר 1%, רוחב פס פליטה 505-550 ננומטר וממוצע מסגרת 4. לא היה הבדל משמעותי בין היחס הגולמי של 405:488 ננומטר של שני התנאים (איור 3B). לאחר נורמליזציה של נתונים, ניתן היה לזהות קבוצת משנה של תאים עם יחס מוגבר של 405:488 ננומטר בקבוצת הגמילה מגורם הצמיחה (איור 3C). הדבר מצביע על כך ששינויי צביעה מחדש מיטוכונדריאליים עשויים להקדים מוות תאי עצבי, והוא מדגיש את הרלוונטיות של נורמליזציה של נתונים מרביים/דקה להשוואה בין מצבי redox הבסיסיים בין קבוצות.

שינויים דינמיים במצב קסיד מיטוכונדריאלי עם טיפול בנוירונים עם NMDA
קולטן גלוטמט מסוג NMDA (NMDAR) ממלא תפקיד מרכזי בפלסטיות העצבית, אך יכול גם לתווך נזק עצבי ומוות תאים. הפעלה פתולוגית של NMDAR מובילה למספר השפעות שליליות על המיטוכונדריה הכוללות עומס יתר של סידן מטריצה, חמצון ופיצול מיטוכונדריאלי, ומעבר חדורות מיטוכונדריאלי. במחקר קודם, הפרוטוקול המתואר לעיל שימש כדי לחקור קשר סיבתי בין עומס יתר של סידן מיטוכונדריאלי המושרה NMDA וחמצון מיטוכונדריאלי13. נוירונים ראשוניים בהיפוקמפוס חולדה גדלו על כיסויים מצופים פולי-D-ליצין/למינין נדבקו rAAV-mito-Grx1-roGFP2 על DIV4 ותמונה על DIV12. הדמיה חיה בוצעה ב 37 °C (50 °F) על מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב הפוך מצויד 20x/ 0.75 יעד טבילה מרובה (טבילת מים שימש) ומערכת דגירה על הבמה. Mito-Grx1-roGFP2 התרגש ברצף כל 20 s באמצעות קווי לייזר 405 ננומטר ו 488 ננומטר, ופליטה נאספה עם מסנן פליטה 527/55 ננומטר עבור שני אורכי גל עירור. טיפול בנוירונים עם 30 מיקרומטר NMDA גרם חמצון של המיטוכונדריה בתוך כמה דקות (איור 4A,B). ראוי לציין, חמצת מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי NMDA גרמה להרוות משמעותית של פלואורסצנטיות roGFP2, בהתאם לרגישות ה- pH הידועה שלה8. כדי לאשר כי מרווה תלוי pH זה לא השפיע על יחס 405:4889, המיטוכונדריה היו מחומצנים לחלוטין על ידי DA לפני הוספת NMDA בניסוי בקרה. טיפול מקדים עם DA מונע כל חמצון נוסף של המיטוכונדריה על ידי NMDA, ובהתאם לכך, יחס 405:488 לא השתנה בניסוי זה למרות מרווה ניכר של עוצמת פלואורסצנטיות roGFP2 (איור 4C).

ניתוח רב-פרמטרי של שינויים הנגרמים על ידי NMDA של מיטוכונדריה דנדריטית
כדי להעריך את הרצף הזמני של שינויים הנגרמים על-ידי NMDA במורפולוגיה מיטוכונדריאלית, פוטנציאל הממברנה ומצב redox, הדמיה מקבילה של פלואורסצנטיות TMRE- ו- mito-Grx1-roGFP2 בוצעה ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. נוירונים קליפת המוח חולדה ראשוני גדל על כיסויים מצופים poly-L-ornithine נדבקו rAAV-mito-Grx1-roGFP2 על DIV6 ותמונה על DIV12. הדמיה חיה בוצעה בטמפרטורת החדר על מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך באמצעות יעד טבילת שמן 63x/1.40, מהירות סריקה של 600 הרץ, גודל פיקסל של 90.2 ננומטר (1024 x 1024 פיקסלים בזום סריקה 2x), גודל חור סיכה של 3 יחידות אוורירית וממוצע מסגרת של 2. כל 30 s, שלוש תמונות נרשמו במצב רציף: 405 ננומטר עירור/ 505-550 ננומטר פליטה; 488 ננומטר עירור/505-550 ננומטר פליטה; 552 ננומטר עירור/פליטה של 560-600 ננומטר. טיפול בנוירונים עם 60 μM NMDA הביא לאובדן אות TMRE ולעלייה ביחס roGFP של 405:488 ננומטר, ואחריו כמה עיגול מאוחר של המיטוכונדריה (איור 5).

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של פונקציית Grx1-roGFP2 וספקטרום עירור roGFP2. (A) מתח חמצוני ופעולת מערכות הגנה נוגדות חמצון מחמצנים את מאגר הגלוטתיון התאי. Grx1 בחלבון ההיתוך Grx1-roGPF2 מקדם את שיווי משקל מהיר של מצב ה-roGFP2 עם מצב ההדבקה מחדש של בריכת הגלוטתיון. ניתן להעריך את מצב ה-redox של מאגר roGFP2 על ידי ניטור היחס בין פליטת GFP-פלואורסצנטיות ב-510 ננומטר לאחר עירור ב-405 ננומטר ו-488 ננומטר. מינים מופחתים מוצגים בכחול; מינים מחומצנים מוצגים באדום. (B) ספקטרום עירור של roGFP2 מופחת לחלוטין (כחול) מחומצן (אדום). לאחר חמצון של roGFP2, פליטת פלואורסצנטיות ב 400 ננומטר עירור עולה, בעוד פליטה ב 490 ננומטר עירור פוחתת. נתון זה השתנה מפרסום קודם13. ספקטרום עירור ב - B צויר על בסיס איור 1B מ - 8. קווים מנוקדים ב - B מציינים את אורכי הגל של קווי לייזר נפוצים של 405 ננומטר ו- 488 ננומטר. קיצורים: GSH = גלוטתיון; GSSG = גלוטתיון מחומצן; Grx = גלוטרוקסין; roGFP = וריאנט חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לאדום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: זרימת עבודה של השיטה. ביטוי של חלבון פלורסנט רגיש להתרגשות roGFP2 בתאי עצב ניתן להשיג באמצעות מספר שיטות הכוללות טרנספוזיה, ליפופקטיון, העברת גנים ויראליים ובעלי חיים מהונדסים. החיישן יכול לשמש כדי לחקור את מצב redox העצבי נוירונים ראשוניים בתרבית, explants רקמת ex vivo , ובעלי חיים שלמים. הדמיית roGFP2 יכולה להתבצע על מגוון מיקרוסקופים הכוללים מיקרוסקופים פלואורסצנטיים רחבים, מיקרוסקופים קונפוקליים ומיקרוסקופים של 2 פוטונים. ניתוח נתוני הדמיה roGFP2 יכול להתבצע עם התוכנה הזמינה באופן חופשי ImageJ / FIJI. קיצור: roGFP = וריאנט חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לאקסוקס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: גמילה מגורם גדילה גורמת חמצון של המיטוכונדריה העצבית. (A) נציג 405:488 nm יחס תמונות של נוירונים בתרבית בנוכחות (+ GF) או היעדר (- GF) של גורמי גדילה עבור 48 שעות לפני הדמיה. סולמות מקודדים בצבע מייצגים יחסי 405:488 ננומטר לא מנורמלים (יחס נמוך יותר תואם למצב מופחת; יחסים גבוהים יותר תואמים למצב מחומצן). מוטות קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) כימות יחס 405:488 ננומטר בתאי עצב בודדים. (C) יחס מרבי/דקה של 405:488 ננומטר של נוירונים בודדים. סמלים עגולים מייצגים תאים בודדים; מייצג ממוצע. N = 40-44 תאים מ 3 כיסויים מהכנה אחת. קיצור: GF = גורם גדילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חמצון המושרה על ידי NMDA של מיטוכונדריה עצבית. (A) נציג 405:488 תמונות יחס ננומטר לפני ואחרי טיפול עם 30 μM NMDA ולאחר כיול מקסימום / דקה עם DA ו- DTT. בהגדלה זו, אות roGFP מזוהה בעיקר בדנדריטים סומה פרוקסימלית. קנה המידה המקודד בצבע מייצג יחסי 405:488 ננומטר שאינם מנורמלים (יחסים נמוכים יותר תואמים למצב מופחת; יחסים גבוהים יותר תואמים למצב מחומצן). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B) כימות של הפעלת ההדמיה המוצגת ב - A. NMDA תחולל חמצון מיטוכונדריאלי מהיר ומתמשך שניתן לכייל באמצעות DA ו- DTT. (C) חמצת מיטוכונדריאלית הנגרמת על ידי NMDA גורמת לירידה של פלואורסצנטיות GFP הן על 405 ננומטר והן על 488 ננומטר עירור (פאנל עליון). כדי לבודד את האפקט מונחה ה- pH ולאשר כי יחס 405:488 ננומטר הוא pH-חסר רגישות, נוירונים היו תחילה חמצון מקסימלי באמצעות DA ולאחר מכן מאותגר עם NMDA בנוכחות DA (פאנל נמוך). בתנאים אלה, NMDA עדיין גורם חמצת מיטוכונדריאלית אבל לא חמצון מיטוכונדריאלי נוסף. בהתאם, למרות הן מעקב 405 nm ו 488 ננומטר להראות ירידה מונעת pH בעוצמת פלואורסצנטיות, היחס 405:488 ננומטר נשאר יציב. נתון זה משתנה מ- 13. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; roGFP = וריאנט חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לאדומים; NMDA = N-מתיל-D-אספרטט; DA = דימיד; DTT = dithiothreitol. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: שינויים הנגרמים על-ידי NMDA בפוטנציאל הממברנה, במצב redox ובמורפולוגיה של המיטוכונדריה הדנדריטית. (A) שלוש תמונות בהגדלה גבוהה מניסוי של זמן לשגות, שנרכשו ב- t = 1, 4 ו - 9 דקות, המציגות מיטוכונדריה דנדריטית ואקסונית. צביעה מייצגת את עוצמת TMRE (ראה פס כיול). (B) 405:488 nm roGFP יחס תמונות מאותו ניסוי זמן לשגות כמו ב (A) ב t = 1, 4 ו 9 דקות. שים לב כי בשל יעילות זיהום AAV מוגבלת, רק תת קבוצה של נוירונים מבטא מיטו-Grx1-roGFP2, ולכן, לא כל המיטוכונדריה חיובי TMRE הם roGFP חיובי. סרגל הכיול המקודד בצבע מייצג יחסי 405:488 ננומטר שאינם מנורמלים (יחסים נמוכים יותר תואמים למצב מופחת; יחסים גבוהים יותר תואמים למצב מחומצן). (ג) כימות עוצמת TMRE, יחס roGFP 405:488 ננומטר ועגולות של מיטוכונדריון יחיד (המצוין על-ידי חצים ב - A, B). לאחר דקה אחת של הקלטה בסיסית, 60 μM NMDA נוספה לפתרון האמבטיה. סרגלי קנה מידה = 5 מיקרומטר. ציר ה- y ב - C מתאר את יחס roGFP של 405:488 ננומטר ביחס ל- T0 הבסיסי (קו מקווקו ירוק), את עוצמת הפלואורסצנטיות של TMRE ביחס ל- T0 הבסיסית (קו מקווקו אדום) ואת מתאר הצורה FIJI / ImageJ "עגולות" (קו מוצק שחור). קיצורים: GFP = roGFP = וריאנט חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש לרדוקס; mito-Grx1-roGFP2 = גלוטרוקסין-1 התמזג ל- N-terminus של roGFP; AAV = וירוס הקשורים אדנו; TMRE = tetramethylrhodamine, אתיל אסתר; NMDA = N-מתיל-D-אספרטט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מדידות כמותיות ודינמיות של מצב ההוקסיד המיטוכונדריאלי מספקות מידע חשוב על פיזיולוגיה מיטוכונדריאלית ופיזיולוגיה תאית. מספר בדיקות כימיות פלואורוגניות זמינות המזהות מינים של חמצן תגובתי, "לחץ אדום", או "עקה חמצונית". עם זאת, המונחים האחרונים אינם מוגדרים היטב ולעתים קרובות חסרים ספציפיות9,17,18. בהשוואה לצבעים כימיים, Grx1-roGFP2 מציע מספר יתרונות9,19: (i) כחיישן עירור-יחס, הוא מספק נורמליזציה אינהרנטית לרמת ביטוי החיישן, עוצמת פלואורסצנטיות מוחלטת, וצפיפות תאים או אברונים; (ii) כגשוש מקודד גנטית, ניתן לכוון אותו לאברונים או לתאים תת-תאיים ספציפיים כגון מסופים פרזינפטיים או קוצים דנדריטיים פוסט-סינפטיים; (iii) ביטוי גנטי של החיישן מטשטש את הצורך בטעינת צבע, אשר במקרה של צבעים כימיים יכול להיות מלחיץ עבור נוירונים ראשוניים; (iv) בניגוד לצבעים כימיים כלליים הרגישים לרדוקס, Grx1-roGFP2 הוא ספציפי מאוד לפוטנציאל הגלוטתיון מחדש; (v) חמצון והפחתת החיישן הפיכים, ומאפשרים מדידה של שינויים ארעיים; (vi) בניגוד צבעים כימיים המאפשרים זיהוי של שינויים יחסיים בלבד, יחס פלואורסצנטי Grx1-roGPF2 ניתן לכייל כדי לקבוע פוטנציאל redox מוחלט ב- mV9.

פרוטוקול זה מתאר מדידות דינמיות של פוטנציאל גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים. ניתוח של המיטוכונדריה בתוך תאים שלמים יש כמה יתרונות15. בהשוואה לחקר המיטוכונדריה המבודדת, המיטוכונדריה בתוך התאים שומרת על קשרים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית עם אברונים אחרים (למשל, מגעים של רטיקולום-מיטוכונדריה אנדופלסמיים, מגעים מיטוכונדריה-ליזוזום) ונחשפים לריכוזים תאיים של מולקולות איתות ומטבוליטים. בהשוואה לחקר בעלי חיים שלמים, נוירונים ראשוניים מספקים נגישות טובה יותר למניפולציות גנטיות ופרמקולוגיות ומיקרוסקופיה. עם זאת, עבור שאלות מסוימות, ניתוח של מיטוכונדריה מבודדת יהיה מתאים יותר כמו זה מאפשר שליטה מדויקת על מצעים ומעכבים נמסר. יש לציין, מיטו-Grx1-roGFP2 יכול לשמש גם במיטוכונדריה מבודדת20. כדי לחקור מיטוכונדריה עצבית בתוך רקמות שלמות או בעלי חיים, קווי זבוב ועכבר מהונדסים זמינים המביעים מיטו-Grx1-roGFP2 במערכת העצבים21,22,23. ראוי לציין, ספקטרום העירור של roGFP2 הוא נוח עירור שני פוטון, המאפשר ex vivo ו in vivo הדמיה דו פוטון ב explants רקמות ובעלי חיים שלמים, בהתאמה 23,24. גרסאות ספקטרליות של חלבונים פלואורסצנטיים רגישים לתיול זמינים גם כגון rxYFP-Grx1p25 ו- Grx1-roCherry26 אדום. אלה מספקים גמישות נוספת עבור מולטיפלקסינג, ובאופן עקרוני, מאפשרים מדידה סימולטנית של תגובות redox בסוגי תאים שונים או תאים סלולריים.

כפי שמתואר בפרוטוקול, ניתן לכייל את יחס 405:488 ננומטר על-ידי מדידת יחסי פלואורסצנטיות מקסימליים ומינימליים לאחר היישום של DA ו- DTT, בהתאמה. נורמליזציה זו אינה חיונית מכיוון שחיישן מספק מידה מסוימת של נורמליזציה אינהרנטית בשל אופיו היחסי. עם זאת, אנו ממליצים לבצע כיול מרבי/דקה לאחר כל הרצת הדמיה, בעיקר משתי סיבות. ראשית, הוא מבטיח כי תגובות החיישנים לא היו רוויות במהלך הניסוי. שנית, היחס המוחלט של 405:488 ננומטר הוא מספר שרירותי התלוי בהגדרות המיקרוסקופ של שני הערוצים. גם כאשר שומרים על אותן הגדרות, אי אפשר להיות בטוחים שכוח הלייזר וביצועי הגלאי יישארו זהים בין הניסויים, במיוחד כאשר אלה הם בהפרש של כמה שבועות. דרך אחת לעקיפת הבעיה תהיה להגדיר את יחס הבסיס הממוצע של תאי בקרה ל- 1.0 בתוך כל ניסוי. זה מאפשר כימות יחסי של טיפול המושרה מחדש perturbations בניסוי נתון אבל מגביל את ההשוואה של ניסויים שונים. במיוחד כאשר משווים את מצב ההשמצה מחדש של התאים מניסויים שונים או סוגי תאים שונים, חשוב להשיג כימות מוחלט מכויל מקסימום/דקה. מדי פעם, יחס 405:488 ננומטר אינו נופל מתחת ליחס הבסיסי לאחר טיפול DTT, במיוחד אם המיטוכונדריה כבר היו במצב מופחת יחסית בבסיס. זה בדרך כלל סימן להלבנה חיישן במהלך ניסויים ממושכים בזמן לשגות. במקרה זה, חזור על הניסוי עם הגדרות מיקרוסקופ הגורמות פחות חשיפה לאור.

חשוב ביותר להשתמש בהגדרות מיקרוסקופ שאינן גורמות להלבנה של החיישן או חמצון המושרה פוטוטוקסיות של המיטוכונדריה. הקפד לקחת מספיק זמן למיטוב פרוטוקול לפני תחילת ניסויים בפועל. לאחר הגדרת הגדרות מקובלות, ניתן להשתמש בהן בניסויים הבאים עם התאמות מינימליות. הדמיית mito-Grx1-roGFP2 יכולה להתבצע בטמפרטורת החדר או 35-37 מעלות צלזיוס על במה מחוממת. החיישן יפעל בשני המקרים; עם זאת, הקינטיקה של מפלי איתות ותגובות אנזימים בתוך התאים תהיה שונה באופן טבעי בהתבסס על הטמפרטורה. לכן, קינטיקה ומשרעת של תגובות חיישנים עשוי להשתנות בהתאם לטמפרטורה שנבחרה. בחירת הטמפרטורה תלויה במשתמש, בהתאם לצרכים הספציפיים של הניסוי.

לבסוף, ברצוננו להצביע על שתי מגבלות של החיישן. ראשית, עוצמת האור הנפלט נמוכה בהרבה עם עירור ב 405 ננומטר מאשר עם עירור ב 488 ננומטר, לעתים קרובות וכתוצאה מכך תמונות רועשות למדי 405 ננומטר. כוח לייזר גבוה יותר נדרש כדי לשפר את האות לרעש בערוץ 405 ננומטר. עם זאת, עירור ב 405 ננומטר הוא בדרך כלל פוטוטוקסי יותר ומייצר יותר autofluorescence מאשר עירור ב 488 ננומטר, הגבלת עוצמת לייזר 405 ננומטר המותרת. לדוגמה, במחקר זה, פלואורסצנטיות roGFP חלש בשילוב עם autofluorescence רקמות 405 ננומטר נרגש ניכר מנע רכישת נתונים חזקים מתאי גנגליון mito-Grx1-roGFP2 מבטאים שטוחים רשתית חיה (דפ ו Bas-Orth, תצפית שלא פורסם). שנית, למרות שיחס 405:488 ננומטר אינו רגיש לשינויי pH בטווח פיזיולוגי סביב pH 5.5 ל- pH 8.5 (איור 4)9, מרווה תלוי pH של פליטת roGFP2 עלול לגרום לאות החלש בדרך כלל של 405 ננומטר לרדת מתחת למגבלת הזיהוי של המיקרוסקופ, ולמנוע רכישה של תמונות יחס הניתנות לכימות. לדוגמה, זה היה המקרה במהלך חמצת הנגרמת על ידי NMDA בציטוסול העצבי13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (BA 3679/5-1; עבור 2289: BA 3679/4-2). A.K. נתמך על ידי מלגת ERASMUS + . אנו מודים לאיריס בנזלי-ארט, ריטה רוזנר ואנדראה שליקסופ על הכנת תאי העצב העיקריים. אנו מודים לד"ר טוביאס דיק על שסיפק pLPCX-מיטו-Grx1-roGFP2. ניסויים שהוצגו באיור 4 בוצעו במרכז הדמיה ניקון, אוניברסיטת היידלברג. איור 2 הוכן עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Tags

מדעי המוח גיליון 176 Grx1-roGFP2 מיקרוסקופיה קונפוקלית עקה חמצונית נוירונים בהיפוקמפוס אקסיטוקסיות פוטנציאל ממברנה מיטוכונדריאלית
הדמיה חיה של מצב גלוטתיון גלוטתיון מיטוכונדריאלי בנוירונים ראשוניים באמצעות מחוון רצומטרי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsalifis, A., Casaril, A. M.,… More

Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter