Summary
本稿では、共焦点ライブ顕微鏡を用いた一次海馬および皮質ニューロンにおける急性摂動に対する基底レドックス状態と酸化還元反応の違いを判断するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、他の細胞タイプや顕微鏡に最小限の変更で適用できます。
Abstract
ミトコンドリアレドックスホメオスタシスは、神経の生存率と機能のために重要です.ミトコンドリアには複数のレドックス系が含まれていますが、豊富なチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオンは抗酸化防御の中心的なプレーヤーと考えられています。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位を測定すると、ミトコンドリア酸化還元状態および酸化ストレスに関する有用な情報が得られます。グルタレドキシン1-roGFP2(Grx1-roGFP2)は、510nmで1つの放出ピークを有する400nmおよび490nmの2つの酸化還元状態感受性励起ピークを有するグルタチオン酸化還元電位の遺伝的にコードされた緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの比比指標である。本稿では、一次海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2の共焦点ライブ顕微鏡を行う方法について説明する。これは、定常性ミトコンドリア・グルタチオン・レドキ酸価(例えば、疾患状態または長期治療を比較する)を評価する方法と、急性治療時の酸化還元性の変化を測定する方法(興奮性薬物 N-メチル-D-アスパルテート(NMDA)を例として使用する)を説明する。さらに、この記事では、Grx1-roGFP2とミトコンドリア膜電位指標であるテトラメチルrhodamine、エチルエステル(TMRE)の共イメージングを紹介し、Grx1-roGPF2がマルチパラメトリック分析のための追加の指標でどのように多重化できるかを示します。このプロトコルは、(i)共焦点レーザー走査顕微鏡の設定を最適化する方法の詳細な説明を提供し、(ii)刺激のための薬物を適用し、その後、ジアミドとジチオトライトールによるセンサーキャリブレーション、および(iii)ImageJ / FIJIを用いてデータを分析する。
Introduction
いくつかの重要なミトコンドリア酵素およびシグナル伝達分子は、チオール酸化還元調節1の対象となります。さらに、ミトコンドリアは活性酸素種の主要な細胞源であり、酸化的損傷に対して選択的に脆弱である2。したがって、ミトコンドリア酸化還元電位は、バイオエネルギー、細胞シグナル伝達、ミトコンドリア機能、および最終的に細胞生存率3,4に直接影響を及ぼす。ミトコンドリアマトリックスには、酸化還元恒常性を維持し、抗酸化防御剤を搭載するチオールジスルフィドレドックスバッファーグルタチオン(GSH)の量(1-15 mM)が多く含まれています。GSHは、標的タンパク質に共有結合(S-グルタチオン化)を使用して酸化還元の状態と活性を制御し、酸化タンパク質を減少させる解毒酵素の範囲で使用されます。したがって、ミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位は、ミトコンドリア機能および病態生理学を研究する際の非常に有益なパラメータである。
roGFP2は、人工ジチオールジスルフィドペア7,8を形成する2つの表面露出システインを添加することによって酸化還元感受性にされたGFPの変異体である。それは〜510 nmで1つの放出ピークを有し、〜400 nmおよび490 nmで2つの励起ピークを有する。重要なことに、2つの励起ピークの相対振幅はroGFP2の酸化還元状態に依存し(図1)、このタンパク質をレシオメトリックセンサーにします。Grx1-roGFP2センサーでは、ヒトグルタレドキシン-1(Grx1)がroGFP29,10のN末語に融合されています。RoGFP2へのGrx1酵素の共有結合は、センサーの2つの大きな改善を提供する:それはGSH / GSSGグルタチオンレドックス対(図1)に特異的なセンサー応答を作り、少なくとも100,0009の倍によってGSSGとroGFP2の間の平衡化を加速する。従って、Grx1-roGFP2は細胞グルタチオン酸化還元電位の特異的かつ動的なイメージングを可能にする。
Grx1-roGFP2イメージングは、広視野蛍光顕微鏡、回転ディスク共焦点顕微鏡、レーザー走査型共焦点顕微鏡など、幅広い顕微鏡で行うことができます。一次ニューロンにおけるセンサの発現は、リポフェクション11、DNA/リン酸カルシウム共沈12、ウイルス媒介遺伝子導入、または細胞源としてのトランスジェニック動物の使用を含む様々な方法によって達成することができる(図2)。この記事では、AAV1およびAAV2キャプシドタンパク質1:1比を含む擬似型組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)を使用した。このベクターを使用すると、最大センサ発現は、通常、感染後4〜5日に達し、少なくとも2週間安定した状態を保ちます。マウスやラットの一次海馬および皮質ニューロンでGrx1-roGFP2を使用しました。
本稿では、一次ラット海馬および皮質ニューロンにおけるミトコンドリア標的Grx1-roGFP2のrAAV媒介発現を用いて、基底ミトコンドリアグルタチオンレドックスの状態とその急性摂動を評価する。(i)レーザースキャン共焦点顕微鏡の設定を最適化する方法、(ii)ライブイメージング実験を実行し、(iii)FIJIを使用してデータを分析する方法についての詳細な手順を備えた共焦点ライブイメージング用のプロトコルが提供されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は、欧州議会の理事会指令2010/63/EUを含む国家および制度的ガイドラインに準拠し、完全な内務省の倫理的承認を得ました(ハイデルベルク大学動物福祉事務所とレジエルングスプラエシジウム・カールスルーエ校、ライセンスT14/21およびT13/21)。一次海馬および皮質ニューロンは、標準的な手順に従って新生児マウスまたはラットの子犬から調製され、前述の13日に12〜14日間維持された。
1. ソリューションの準備
- イメージングバッファ用ストックソリューション
- 表1に従って各ストック液を準備し、4°Cに保ちます。 長期保存(>3ヶ月)の場合は、アリコートを-20°Cに保ちます。
| コンポーネント | MW | 濃度(M) | 金額 (g) | ボリューム (mL) |
| ナクル | 58.44 | 5 | 14.61 | 50 |
| KCl | 74.55 | 3 | 1.12 | 5 |
| MgCl2·6H2O | 203.3 | 1.9 | 2 | 5 |
| CaCl2·2H2O | 147.01 | 1 | 1.47 | 10 |
| グリシン | 75.07 | 0.1 | 0.375 | 50 |
| 蔗糖 | 342.3 | 1.5 | 25.67 | 50 |
| ピルビン酸ナトリウム | 110.04 | 0.1 | 0.55 | 50 |
| ヘペス | 238.3 | 1 | 11.9 | 50 |
| グルコース | 180.15 | 2.5 | 45 | 100 |
表1:イメージングバッファ用のストックソリューション
- 医薬品および染料のストックソリューション
- 水にジアミド(DA;最大405:488比の較正に使用される)を溶解し、0.5Mストック溶液(例えば、1gの水11.615 mL)を得る。アリコートと-20°Cで保管してください。
- ジチオスレイトール(DTT;最小405:488比の較正に使用)を水に溶解し、1Mストック溶液(例えば、水の5グラム)を得る。アリコートと-20°Cで最大3ヶ月間保管してください。
- N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA;興奮毒性およびミトコンドリア酸化を誘発するために使用される)を水に溶解し、10 mMストック溶液(例えば、水の16.991 mLで25mg)を得る。アリコートは-20°Cで保管してください。 長期保存(>6ヶ月)の場合は、アリコートを-80°Cに保ちます。
- テトラメチルロダミンエチルエステル過塩素酸塩(TMRE、ミトコンドリア膜電位の低分子指標)
- TMRE粉末をメタノールに溶解し、20mMストック(例えば、2.427mLのメタノール中25mg)を得る。
- 20 mM ストックを 1:1,000 メタノールで希釈して 20 μM のストックを得る。
- アリコート 20 mM および 20 μM のストックソリューション、パラフィルムでシール、-20 °C で光から保護された保管。
注:両方のストックソリューションは、数年間安定しています。実験には1,000xストックソリューション(20μM)を使用します。
- イメージングバッファ
- 測定シリンダーに 表2 から80mLの無菌水を全て添加して、100mLのイメージングバッファーを用意します。滅菌水で最大100mLまでボリュームを持って来ます。溶液が均一に見えるまで慎重に測定シリンダーを振って混ぜます。
メモ:バッファーの浸透性を確認するには、オスマメーターを使用することをお勧めします。細胞の成長培地にできるだけ近いはずです。ここで、これは315 mOsmol/L.イメージングバッファーと増殖培地の浸透率に合わせて必要に応じてスクロース濃度を増減する。 - pH を 7.4 に調整します。アリコートを作り、4°Cで2週間保ちます。長期保存の場合は、アリコートを-20°Cに保ちます。 イメージングバッファは使用前に室温に達します。
- 測定シリンダーに 表2 から80mLの無菌水を全て添加して、100mLのイメージングバッファーを用意します。滅菌水で最大100mLまでボリュームを持って来ます。溶液が均一に見えるまで慎重に測定シリンダーを振って混ぜます。
| コンポーネント | ストックソリューション (M) | 最終濃度 (mM) | ボリューム (mL) |
| ナクル | 5 | 114 | 2.3 |
| KCl | 3 | 5.29 | 0.176 |
| MgCl2 | 1.9 | 1 | 0.053 |
| CaCl2 | 1 | 2 | 0.2 |
| グリシン | 0.1 | 0.005 | 0.005 |
| 蔗糖 | 1.5 | 52 | 3.5 |
| ピルビン酸ナトリウム | 0.1 | 0.5 | 0.5 |
| ヘペス | 1 | 10 | 1 |
| グルコース | 2.5 | 5 | 0.2 |
表2:撮像バッファーの組成。 示された容積は、100 mLのイメージングバッファの調製に使用される。
- 刺激およびキャリブレーションのためのソリューション
注:実験の直前に、示された薬剤のストック溶液をイメージングバッファに追加することで、常に新鮮な刺激溶液を準備してください。刺激および較正のための解決は実験の間連続してイメージ投射室に加えられる(セクション3-5を参照)。実験の種類に応じて、異なる溶液がイメージングチャンバー内のそれぞれの最終体積で同じ最終濃度に達するために必要とされる。- 3x NMDA溶液(90 μM、チャンバー内の最終濃度:30 μM)を、63 μLの10 mM NMDAストックをイメージングバッファの6.937 mLに加えて準備します。得られた溶液の500 μLをチャンバに加えます(最終容積:1.5 mL)。
- ステップ3と4(1 mM;チャンバー内の最終濃度:0.5 mM)に対して、0.5 M DAストックの14 μLを6.986 mLのイメージングバッファに加えて、2倍のDA溶液を準備します。チャンバーに1 mLを加えます(最終容積:2 mL)。
- 0.5 M DA ストックの 28 μL をイメージング バッファの 6.972 mL に加えて、ステップ 5(2 mM;最終濃度)の 4x DA 溶液を準備します。チャンバーに500 μLを加えます(最終容積:2 mL)。
- 1 M DTT ストックの 45 μL を 8955 μL のイメージングバッファーに加えて、1x DTT 溶液 (5 mM; チャンバー内の最終濃度: 5 mM) を準備します。この溶液の1 mLを、撮像バッファを吸引した後にチャンバに加えます(最終体積:1 mL)。
2. TMRE を使用したセルのロード
注: このプロトコルでは、TMRE は 20 nM の最終濃度で非クエンチ モード 15 で使用されます。一般に、選択した顕微鏡上で十分な信号強度を提供するTMREの最も低い濃度を使用する必要があります。不均一な蒸発のために、異なる井戸の中の媒体の量は、長期的な一次培養物で異なる場合があります。すべてのウェルで一貫したTMRE濃度を確保するために、TMREを直接ウェルに追加しないでください。代わりに、各ウェルの培地を同量のTMRE含有培地に交換してください。以下のプロトコルは、ウェルあたり培地の〜1 mLを含む24ウェルプレートの一次ニューロンのために設計されています。
- 組織培養層流フードで作業し、各ウェルから500 μLの培地を1本の円錐形チューブに集めます。
- 20 μM TMRE ストックの 0.5 μL を円錐形チューブに加えます(例えば、24 ウェルの場合は 12 μL)。
- 残りの培地を第1ウェルから慎重に吸引し、500μLのTMRE含有培地に交換します。残りの井戸で、よく続けてください。
注:細胞を乾燥させないようにし、細胞を邪魔しないように注意してください。 - 細胞をインキュベーターに戻し、染料平衡のために少なくとも60分待ちます。
注:負荷時間は、悪影響を及ぼすことなく数時間に延長することができます。 - 画像実験全体を通して一貫したTMRE濃度と平衡を確保するために、イメージングバッファおよびすべての刺激溶液に20 nM TMREの最終濃度を含める必要があります。
3. 走査型共焦点顕微鏡設定の最適化
注: このステップは、ライブイメージング中の画質と細胞生存率の間で最良の妥協点を見つけることを目的としています。このセクションでは、roGFP イメージングの設定の最適化について説明します。マルチパラメトリックイメージングが実行される場合、同様の最適化(漂白や光毒性の兆候のない安定したベースラインのチェックを含む)は、追加の指標に対して実行する必要があります。
- GFP イメージング(488 nm 励起、505 ~ 550 nm の放出)の共焦点顕微鏡と負荷標準設定を開始します。
- 検出器を 12ビットまたは16ビットに 設定 します。
注: 通常、定量的なイメージングには 8 ビットでは十分ではありません。 - シーケンシャルスキャンモードを有効にして、2番目のシーケンス/トラック(405 nm励起、505-550 nm放射)を追加します。
- どちらのチャネルでも、露出超過ピクセルと露出不足のピクセルを示す 疑似色のルックアップ テーブル を選択します ( GLOW OU など)。
- 対象のオブジェクトに適した目的を選択します。
注:10x-40xは単細胞分析に適しており、63x-100xは単一ミトコンドリア分析に適しています。 - 細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。
- 接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。
注意:細胞を見つけて焦点を合わせるには、蛍光光を使用しないでください。低電力でも、これは細胞に悪影響を及ぼします。 - 異なるピクセル形式の画像を記録します。これらの画像に基づいて、対象の構造の許容解像度を与える最小ピクセル数を選択します。
注:通常、512 x 512 ピクセルは 20x および 40x の目的を持つ単一セルイメージングに適しており、1024 x 1024 または 2048 x 2048 x 2048 ピクセルは、通常、63x の目的を持つシングルミトコンドリアイメージングに適しています。 - 異なるピンホールサイズの画像を記録します。これらのイメージに基づいて、目的の構造の許容解像度を与える最大のピンホール サイズを選択します。
注:通常、3-7風通しのユニットがうまく機能します。 - 異なるレーザー強度の画像を記録します。
- 検出器のゲインとしきい値を適宜調整します。これらの画像に基づいて、許容可能な信号強度と信号対バックグラウンド比を与える最も低いレーザー強度を選択します。
- シグナル対バックグラウンド比を決定するには、細胞またはミトコンドリア(ROI1)を含む対象領域(ROI)および細胞またはミトコンドリア(ROI2)のないROIでのシグナル強度を測定します。次に、ROI1 の強度を ROI2 の強度で割る。
注:1%レーザーパワーで488 nm励起の300-1,500の個々のROIの強度と1-3%のレーザーパワーと強度を持つ405 nmの励振のための>3と200-1,000の個々のROIの信号強度の信号対バックグラウンド比を目指します。
- シグナル対バックグラウンド比を決定するには、細胞またはミトコンドリア(ROI1)を含む対象領域(ROI)および細胞またはミトコンドリア(ROI2)のないROIでのシグナル強度を測定します。次に、ROI1 の強度を ROI2 の強度で割る。
- 検出器のゲインとしきい値を適宜調整します。これらの画像に基づいて、許容可能な信号強度と信号対バックグラウンド比を与える最も低いレーザー強度を選択します。
- 異なるスキャン速度とフレーム平均の数で画像を記録します。設定の組み合わせごとに4~5枚の画像を記録します。これらの画像シリーズに基づいて、許容可能な画像ノイズと画像から画像への変動性を与える最高速度と最低の平均設定を選択します。
注:平均化のための600 Hzと1-2フレームのスキャン速度は、ほとんどの場合うまく動作します。 - 新しいカバースリップを使用して、最適化された設定でタイムラプスシリーズを記録します。
注: シリーズの期間と画像間隔は、計画された実験の時間と同じでなければなりません。 - タイムラプスシリーズの終わりに、記録チャンバーに2x DA溶液の1 mLを加えます。画像は2分追加。
- 蠕動ポンプまたはハンドヘルドピペットを使用してイメージングバッファーを吸引します。1x DTT溶液を1 mL追加します。さらに5分間の画像。
- タイムラプス実験を解析します(セクション5を参照)。
- 最適化された設定で DA と DTT の処理中に、2 つのチャネルのいずれも過剰または露出が少なくなることを確認します。
- タイムラプス記録中に、2つのチャンネルのどれもかなりの漂白を示さないようにしてください。最初と最後の画像間の強度の<2%の損失を目指します。
- イメージング中に405:488の比率が大幅に変化しないことを確認します。
- 許容可能な結果を一貫して提供する設定が定義されるまで、いくつかのカバーリップを使用して、反復的な方法で手順全体を繰り返します。
4. 基底酸化の状態の評価
- 顕微鏡を起動し、セクション3から最適化された設定をロードします。
- フレーム平均を 3-5 に設定します。
- 細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。
- 接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。
注意:細胞を見つけて焦点を合わせるには、蛍光光を使用しないでください。低電力でも、これは細胞に悪影響を及ぼします。 - スキャンモードに切り替え、488 nmチャネルをライブビューで使用して、イメージング用のセルに焦点を当てて配置します。
- マルチポイント機能を使用して、カバースリップ上の3-5の視野を選択します。
- ベースラインイメージを記録します。
- チャンバーに2x DA溶液1 mLを加えます。
- 1、2、3 分後、 ライブビュー を使用してフォーカスを確認/調整し、画像を記録します。
注:細胞は通常、2分後に完全に酸化されます。 - イメージングチャンバのバッファを1mLの1dTT溶液に交換してください。
- 3 分と 5 分後、 ライブ ビュー を使用してフォーカスを確認/調整し、画像を記録します。
メモ:セルは通常、4〜5分後に完全に減少します。
5. 急性治療の生画像化
注:以下のプロトコルは、NMDA治療に対するミトコンドリア酸化還元応答のイメージングについて説明します。他の治療のために、画像の間隔と実験期間を調整する必要がある場合があります。
- 顕微鏡を起動し、セクション3から最適化された設定をロードします。
- 時間経過間隔を 30 秒、持続時間を 25 分に設定します。
- 細胞を含むカバースリップをイメージングチャンバーに取り付け、1 mLのイメージングバッファを追加し、チャンバーを顕微鏡に置きます。
注:熱的な焦点のドリフトを避けるために、タイムラプスイメージングを開始する前に、顕微鏡ステージに10〜15分間放置してください。 - 接眼レンズと透過光を使用して細胞に焦点を当てます。
注意:細胞を見つけて焦点を合わせるには、蛍光光を使用しないでください。低電力でも、これは細胞に悪影響を及ぼします。 - スキャンモードに切り替え、488 nmチャネルをライブビューで使用して、イメージング用のセルに焦点を当てて配置します。
- オプション: 1 回の実行で記録されるセルの数を増やすには、 マルチポイント関数 を使用して、カバースリップごとに 2 ~ 3 個の視野をイメージします。
- タイムラプス取得を開始し、5枚の画像を2分のベースライン記録として記録します。
- 3x NMDA溶液500 μLをチャンバ(最終濃度30 μM)に加え、追加の20枚の画像を10分のNMDA応答として記録します。
注: ニューロンは、オスモルの変化に非常に敏感です。そのため、イメージングバッファの蒸発を最小限に抑えるようにしてください。長い治療のために、画像の部屋はふたで覆われるべきである。 - チャンバーに4x DA溶液500 μLを加え、さらに6枚の画像(3分最大キャリブレーション)を記録します。
- イメージングチャンバーからバッファーを吸引し、1mLの1dTT溶液に交換してください。さらに10枚の画像を記録します(最小校正5分)。
- 録音を終了し、画像シリーズを保存します。
6. データ分析
- フィジーでのデータインポートと画像前処理
- ステップ 4 の画像のグループまたは手順 5 のイメージ ファイルを開くには、バイオフォーマット インポーターを使用します。プラグイン|をクリックします。バイオフォーマット|バイオフォーマット輸入者。ダイアログ ボックスで、[スタックの表示: ハイパースタック] を使用し、[カラー モード] を設定します。
メモ: 自動スケール は、コンピュータ画面上のデータの表示を最適化します。ピクセルの強度は変更されません。 - 手順 4 の個別の画像が開かれた場合は、[ イメージ] |スタック|ツール|連結 して単一イメージ スタックにマージします。
- 画像シリーズ中にXY-ドリフトがある場合は、プラグインをクリック |イメージを登録 します。ダイアログ ボックスで、[ リジッド ボディ ]または[ 変換]を選択します。
- [イメージ] をクリックして、イメージ形式を 32 ビットに変更 |タイプ|32ビット。
- [イメージ]をクリックしてカラーチャンネルを別々のウィンドウに分割 |カラー|チャンネルを分割します。
- チャンネル1(405 nm)を選択し、画像|をクリックして、分析用ミトコンドリアを選択する閾値を調整します。|を調整するしきい値。ダイアログ ボックスで、[既定]、[赤]、[暗い背景]、[スタック ヒストグラム] を選択し、選択したピクセルが赤く表示されるのを待ちます。[適用] をクリックします。「背景ピクセルを NaN に設定」を選択し、すべての画像を処理します。
注: 観測者の偏りが生じる可能性を避けるため、自動しきい値決定を使用する必要があります。FIJI では、しきい値ダイアログボックスのドロップダウンメニューから選択できる自動化メソッド(デフォルト、黄、インターモード、大津など)を提供しています。通常、Default メソッドは、良い結果を提供します。最初の分析で複数の方法を比較して、指定された画像のセットに最適なしきい値法を見つけることをお勧めします。メソッドを選択したら、すべての画像に適用する必要があります。 - チャンネル 2(488 nm)のステップ 6.1.6 を繰り返します。
- [プロセス] をクリックして 405:488 nm の比率を視覚化する比率イメージを作成| 画像計算機。ダイアログボックスで、 イメージ1:チャンネル1、操作:分割、画像2:チャンネル2、新しいウィンドウの作成、すべての画像を処理を選択します。
- 比率画像の 参照テーブル を 疑似色に変更します。たとえば、 Fire に変更するには、[ イメージ] をクリック|参照テーブルの|火。
- ステップ 4 の画像のグループまたは手順 5 のイメージ ファイルを開くには、バイオフォーマット インポーターを使用します。プラグイン|をクリックします。バイオフォーマット|バイオフォーマット輸入者。ダイアログ ボックスで、[スタックの表示: ハイパースタック] を使用し、[カラー モード] を設定します。
- 画像解析
- 比率画像上で、個々の細胞またはミトコンドリアの周りにROIを描きます。各 ROI を描画した後、 ROI マネージャに追加します。 |を分析するツール|ROI マネージャー |追加します。(キーボード ショートカット: 'T')[ すべて表示] を選択します。
注: ステップ 6.1.6 および 6.1.7 では、背景ピクセルが「数値ではない」(NaN)に設定されているため、測定結果には影響しません。したがって、ROI に背景ピクセルを含めることができます。 - ROI マネージャをクリックして個々のセルの 405:488 の比率 を測定| ctrl+A を押して、すべての ROI を選択|その他の|マルチメジャー。ダイアログ ボックスで、[ すべてのスライスを測定する ] と [スライス ごとに 1 行] を選択します。
- 測定値をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
- 405 nm のイメージを選択します。ステップ 6.2.2 で示したように、すべての ROI の強度を測定します。ROI マネージャに格納されている ROI を使用します。
- 測定値をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
- 488 nm のイメージを選択します。ステップ 6.2.2 のとおりに、すべての ROI の強度を測定します。ROI マネージャに格納されている ROI を使用します。
- 測定値をスプレッドシート ソフトウェアにエクスポートします。
- ROI マネージャをクリックして、後で参照するために ROI を保存| ctrl+A を押して、すべての ROI を選択|その他の|保存します。
- 推奨: 405 および 488 nm トレースの強度と時間のプロットを生成します。どちらのチャンネルにもマークされた漂白が存在しない(イメージングシリーズの最後の信号強度は最初の画像の98%≥)、センサー応答中に2つのトレースが反対方向に移動することを確認します(例えば、48 nm8トレースが減少するはずですが、酸化中に405 nmのトレースが増加するはずです)。
- 比率画像上で、個々の細胞またはミトコンドリアの周りにROIを描きます。各 ROI を描画した後、 ROI マネージャに追加します。 |を分析するツール|ROI マネージャー |追加します。(キーボード ショートカット: 'T')[ すべて表示] を選択します。
- データの正規化
- 比率画像からのROIごとに、DA処理時の最大値(Rmax)とDTT処理中の最小値(Rmin)を決定します。
- 正規化比率を次のように計算します。
注: 最大比率を 1.0 に、最小比率を 0 に設定します。
- ミトコンドリア形態の解析
- ステップ 6.2.6 で roGFP 強度と並行してミトコンドリア形態の測定値を取得するには、分析 |[寸法]を設定し、[シェイプ記述子]および[楕円をフィット]をオンにします。
注: 平均強度に加えて、 結果 ウィンドウの測定値には、長軸の長さ(主軸)、短軸の長さ(Minor)、アスペクト比(AR;長軸を短軸で割った軸)、丸いミトコンドリアはAR〜1、細長いミトコンドリアはARが大きくなり、円形(Circ.)と丸み(ラウンド)の測定が含まれます。
- ステップ 6.2.6 で roGFP 強度と並行してミトコンドリア形態の測定値を取得するには、分析 |[寸法]を設定し、[シェイプ記述子]および[楕円をフィット]をオンにします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
成長因子離脱後の定常ミトコンドリア酸化還元状態の違いの定量化
ミトコンドリア酸化還元状態における定常状態差の定量化を実証するために、標準培地で増殖した一次ニューロンを、イメージング前に48時間の成長因子なしで培養したニューロンと比較した。成長因子離脱は、72 h16後のアポトーシス神経細胞死をもたらす。細胞を48時間後に画像化し、これがミトコンドリア酸化還元状態の変化によって先行しているかどうかを試験した。ポリL-オルニチンコーティングカバーリップ上に成長した原発ラット皮質ニューロンは、 インビトロ 6(DIV6)の日にrAAV-mito-Grx1-roGFP2に感染し、DIV12で画像化された。ライブイメージングは、40x/1.10の水浸し目的を備えた反転レーザー走査共焦点顕微鏡上で、このプロトコルのセクション4に従って室温で行った。コンフォーカル設定は、ピンホール7風通しユニット、ピクセルサイズ568.7 nm(512 x 512ピクセル)、スキャン速度600Hz、レーザーパワー405 nm 3%、レーザーパワー488 nm 1%、放出帯域幅505-550 nm、フレーム平均4でした。2つの条件の生の405:488 nmの比率には大きな違いはなかった(図3B)。データの正規化後、増加した405:488 nm比の細胞のサブセットは、成長因子離脱群で検出可能であった(図3C)。これは、ミトコンドリア酸化還元の変化が神経細胞死に先立つ可能性があることを示し、グループ間の基底レドックス状態の比較のための最大/分データ正規化の関連性を強調する。
NMDAによるニューロンの治療におけるミトコンドリア酸化還元状態の動的変化
NMDA型グルタミン酸受容体(NMDAR)は、神経可塑性において中心的な役割を果たすが、ニューロンの損傷および細胞死を媒介することもできる。NMDARの病理学的活性化は、マトリックスカルシウム過負荷、ミトコンドリア酸化および断片化、およびミトコンドリア透過性遷移を含むミトコンドリアに対するいくつかの悪影響をもたらす。以前の研究では、上記のプロトコルを用いて、NMDA誘導ミトコンドリアカルシウム過負荷とミトコンドリア酸化13との因果関係を調べた。ポリ-D-リジン/ラミニンコーティングされたカバーリップで成長した一次ラット海馬ニューロンは、DIV4でrAAV-mito-Grx1-roGFP2に感染し、DIV12で画像化された。ライブイメージングは、20x/0.75マルチ浸漬目的(水浸漬を使用)およびステージ上のインキュベーションシステムを備えた反転回転ディスク共焦点顕微鏡上で37°Cで行われました。Mito-Grx1-roGFP2は、405 nmおよび488nmレーザーラインを用いて20秒ごとに順次励起され、両方の励起波長に対して527/55 nmの発光フィルタで発光を収集した。30 μM NMDA を用いたニューロンの治療は、ミトコンドリアの酸化を数分以内に引き起こした(図4A,B)。特に、NMDA誘導ミトコンドリアアシドーシスは、そのよく知られたpH感受性8に沿って、roGFP2蛍光の有意な焼入を引き起こした。このpH依存性のクエンチが405:488比9に影響しなかったことを確認するために、ミトコンドリアは、コントロール実験でNMDAを添加する前にDAによって完全に酸化された。DAによる前処理は、NMDAによるミトコンドリアのさらなる酸化を排除し、したがって、405:488比はroGFP2蛍光強度のかなりの急弱にもかかわらず、この実験で変化しなかった(図4C)。
NMDAによる樹状ミトコンドリアの変化の多パラメトリック解析
ミトコンドリア形態、膜電位、およびレドックス状態におけるNMDA誘導変化の時間配列を評価するために、TMRE-およびミト-Grx1-roGFP2蛍光の並列イメージングを高い空間的および時間的分解能で行った。ポリL-オルニチンコーティングカバーリップで成長した原発ラット皮質ニューロンは、DIV6でrAAV-mito-Grx1-roGFP2に感染し、DIV12で画像化された。ライブイメージングは、63x/1.40の油浸漬目的、600 Hzのスキャン速度、90.2 nmのピクセルサイズ(2xスキャンズームで1024 x 1024ピクセル)、3気通単位のピンホールサイズ、および2のフレーム平均を使用して、反転共焦点レーザー走査顕微鏡上で室温で行われました。30 s ごとに、3 つの画像がシーケンシャル モードで記録されました: 405 nm 励起/505-550 nm 放出;488 nm励起/505-550 nmの放出;552 nm励起/560-600 nmの放出。60 μM NMDA を用いたニューロンの治療は、TMRE シグナルの損失と 405:488 nm の roGFP 比の増加をもたらし、続いてミトコンドリアの切り上げが遅れました(図 5)。
図1:Grx1-roGFP2機能とroGFP2励起スペクトルの模式的表現(A)酸化ストレスと抗酸化防御システムの作用は、細胞グルタチオンプールを酸化する。Grx1-roGPF2融合タンパク質中のGrx1は、グルタチオンプールのレドックス状態とroGFP2レドックス状態の迅速な平衡を促進する。roGFP2プールの酸化還元状態は、405 nmおよび488nmでの励起後510nmにおけるGFP蛍光発光の比率を監視することによって評価することができる。減らされた種は青で示される;酸化された種は赤で示されています。(B)完全に減少した(青)および酸化された(赤)roGFP2の励起スペクトル。roGFP2の酸化に際して、400nm励起時の蛍光発光は増加し、一方、490nm励起での発光は減少する。この図は、以前の文書13から変更されています。Bの励起スペクトルは、図1Bを8から基づいて描いた。Bの点線は、一般的に使用される405nmおよび488nmレーザー線の波長を示す。略語: GSH = グルタチオン;GSSG = 酸化グルタチオン;Grx = グルタレドキシン;roGFP = 酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質変異体この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:メソッドのワークフロー。 ニューロンにおける興奮比レドックス感受性蛍光タンパク質roGFP2の発現は、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス遺伝子導入、トランスジェニック動物を含むいくつかの方法を通じて達成することができる。このセンサーは、培養された一次ニューロン、 エクスビボ 組織外植物、および無傷の動物における神経赤新ox状態を研究するために使用することができる。roGFP2イメージングは、広視野蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、2光子顕微鏡を含む様々な顕微鏡で行うことができます。roGFP2イメージングデータの分析は、自由に入手可能なソフトウェアImageJ/ FIJIで行うことができます。略語: roGFP = 酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質変異体 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:成長因子離脱は、ニューロンミトコンドリアの酸化を引き起こす。 (A)代表的な405:488nm比の画像は、イメージング前の48時間の成長因子の存在(+GF)または存在(-GF)の存在下で培養されたニューロンの画像である。色分けされたスケールは、正規化されていない405:488 nmの比率を表します(低い比率は減少状態に対応し、より高い比率は酸化状態に対応します)。スケールバー= 50 μm. (B) 個々のニューロンにおける 405:488 nm 比の定量化。(C) 最大/分は、個々のニューロンの405:488 nmの比率を校正した。丸い記号は単一のセルを表します。バーは平均を表します。N = 1つの調製物から3つのカバーリップから40〜44細胞。略語: GF = 成長因子。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:NMDAによる神経細胞ミトコンドリアの酸化(A)は、30μM NMDAでの治療前後およびDAおよびDTTによる最大/分較正後の405:488nm比の画像を代表する。この倍率では、roGFPシグナルは、主に相腫および近位デンドライトで検出される。色分けされたスケールは、正規化されていない405:488 nmの比率を表します(低い比率は減少状態に対応し、より高い比率は酸化状態に対応します)。スケールバー= 50 μm. (B) Aに示すイメージング実行の定量化。NMDAはDAおよびDTTを使用して校正することができる急速かつ持続的なミトコンドリア酸化を誘発する。(C) NMDA誘導ミトコンドリアアシドーシスは、405 nmおよび488 nmの励起(上部パネル)の両方でGFP蛍光の低下を引き起こす。pH駆動効果を分離し、405:488 nm比がpH感受性であることを確認するために、ニューロンは最初にDAを用いて最大酸化され、その後DA(下部パネル)の存在下でNMDAで挑戦された。これらの条件下では、NMDAは依然としてミトコンドリア酸アシドーシスを引き起こすが、それ以上のミトコンドリア酸化は起こさない。したがって、405nmおよび488nmの両方のトレースは、蛍光強度のpH駆動低下を示すが、405:488nm比は安定したままである。この図は13から変更されます。略語: GFP = 緑色蛍光タンパク質;roGFP = 酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質変異体;NMDA = N-メチル-D-アスパラギンテ;DA = ジアミド;DTT = ジチオトレイトール。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:NMDAによる膜電位、酸化還元状態、樹状ミトコンドリアの形態変化 (A)タイムラプス実験から得られた3つの高倍率画像を、t=1、4、9分で取得し、樹状および軸索ミトコンドリアを示す。着色はTMRE強度を表します(キャリブレーションバーを参照)。(B) 405:488 nmのroGFP比画像は、(A)t= 1、4、および9分で(A)と同じタイムラプス実験から撮影した。AAV感染効率が限られているため、一部のニューロンのみがミト-Grx1-roGFP2を発現するため、TMRE陽性ミトコンドリアのすべてがroGFP陽性であるとは限りません。色分けされたキャリブレーションバーは、正規化されていない405:488 nmの比率を表します(低い比率は減少状態に対応し、より高い比率は酸化状態に対応します)。(C)TMRE強度の定量化、roGFP 405:488 nm比、および単一のミトコンドリアの丸み( A、 Bの矢印で示される)。ベースライン記録の1分後、60 μM NMDAを浴液に加えた。スケールバー= 5 μm C の y 軸は、ベースライン T0 に対する 405:488 nm の roGFP 比 (緑の破線)、TMRE 蛍光強度をベースライン T0 に対して相対的に (赤い点線) 、およびフィジー/ImageJ シェイプ記述子の"丸さ" (黒い実線) を示しています。略語: GFP = roGFP = 酸化還元感受性緑色蛍光タンパク質変異体;ミト-Grx1-roGFP2 = グルタレドキシン-1はroGFPのN末語に融合;AAV = アデノ関連ウイルス;TMRE = テトラメチルロダミン, エチルエステル;NMDA = N-メチル-D-アスパラギンテ. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ミトコンドリアレドックス状態の定量的および動的測定は、ミトコンドリアおよび細胞生理に関する重要な情報を提供する。活性酸素種「酸化ストレス」または「酸化ストレス」を検出するいくつかのフッ素化化学プローブが利用可能です。しかし、後者の用語は明確に定義されておらず、しばしば特異性9,17,18を欠いている。化学色素と比較して、Grx1-roGFP2は、励起比センサーとしていくつかの利点9、19:(i)、センサー発現レベル、絶対蛍光強度、および細胞またはオルガネラ密度に固有の正規化を提供します。(ii)遺伝的にコードされたプローブとして、小器官またはシナプス前末端または心内樹状脊椎などの特定の細胞内区画を標的とすることができる。(iii) センサーの遺伝的発現は、化学染料の場合は一次ニューロンにとってストレスになり得る染料の負荷の必要性を排除する;(iv) 一般的な酸化還元反応性化学染料とは対照的に, Grx1-roGFP2 は、グルタチオン酸化還元力に対して非常に特異的です;(v) センサーの酸化および還元は可逆的であり、一過性の酸化還元変化の測定を可能にする;(vi)相対変化のみの検出を可能にする化学染料とは対照的に、Grx1-roGPF2蛍光比を較正してmV9の絶対酸化還元電位を決定することができる。
このプロトコルは、一次ニューロンにおけるミトコンドリアグルタチオン酸化還元電位の動的測定を記述する。無傷細胞内のミトコンドリアの分析はいくつかの利点を有する15.単離ミトコンドリアの研究と比較して、細胞内のミトコンドリアは、他のオルガネラとの生理学的に関連する接触(例えば、小胞体-ミトコンドリア接触、ミトコンドリア-リソソーム接触)を保持し、シグナル伝達分子および代謝物の細胞濃度にさらされる。無傷の動物の研究と比較して、プライマリニューロンは、遺伝的および薬理学的操作および顕微鏡検査のためのより良いアクセシビリティを提供する。しかし、特定の質問では、孤立したミトコンドリアの分析は、これが配信された基質および阻害剤を正確に制御することができるので、より適している。特に、ミトグルックス1-roGFP2は、単離ミトコンドリア20でも使用できる。無傷の組織または動物の中で神経細胞ミトコンドリアを研究するために、神経系21,22,23でミト-Grx1-roGFP2を発現するトランスジェニックフライおよびマウスラインが利用可能である。特に、roGFP2の励起スペクトルは2光子励起に適しており、組織外植物および無傷の動物におけるex vivoおよびin vivo 2光子イメージングをそれぞれ23,24に可能にする。チオールレドックス感受性蛍光タンパク質のスペクトル変異体は、黄色のrxYFP-Grx1p25および赤Grx1-roCherry26なども利用可能です。これらは多重化のための追加の柔軟性を提供し、そして、原則として、異なる細胞タイプまたは細胞コンパートメントでのレドックス応答の同時測定を可能にする。
プロトコルに記載されているように、405:488 nm比は、DAおよびDTTの適用後の最大蛍光比と最小蛍光比をそれぞれ測定することによって較正することができる。この正規化は、センサがレシオメトリックの性質に起因する特定の程度の固有の正規化を提供するため、必須ではありません。ただし、イメージングの実行ごとに最大/分のキャリブレーションを実行することをお勧めします。まず、実験中にセンサー応答が飽和していないことを確認します。第2に、絶対405:488 nm比は、両方のチャネルの顕微鏡設定に依存する任意の数である。同じ設定を維持する場合でも、レーザーパワーと検出器の性能が実験の間、特に数週間離れている場合は、同じままであることを確信することはできません。1 つの回避策として、各実験でコントロール セルの平均ベースライン比を 1.0 に設定します。これは、与えられた実験における治療誘発レドックス摂動の相対的な定量を可能にするが、異なる実験の比較可能性を制限する。特に異なる実験や細胞タイプの細胞の基底酸化状態を比較する場合、最大/分の校正された絶対定量を得ることが重要です。時折、405:488 nm比は、特にミトコンドリアがベースラインで比較的減少した状態にあった場合、DTT処理後のベースライン比を下回らない。これは通常、長時間のタイムラプス実験中にセンサーが漂白する兆候です。この場合、光の露出が少ない顕微鏡設定で実験を繰り返します。
ミトコンドリアのセンサーの漂白や光毒性による酸化を引き起こさない顕微鏡設定を使用することが最も重要です。実際の実験を開始する前に、プロトコルの最適化に十分な時間を要するようにしてください。許容可能な設定を定義すると、その後の実験で最小限の調整で使用できます。ミト-Grx1-roGFP2イメージングは、加熱されたステージ上で室温または35〜37°Cで行うことができます。センサーはどちらの場合も動作します。しかし、シグナル伝達カスケードの動態と細胞内の酵素反応は、温度によって自然に異なります。したがって、センサー応答の運動および振幅は、選択した温度によって異なる場合があります。温度の選択は、実験の特定のニーズに応じて、ユーザー次第です。
最後に、センサの2つの制限点を指摘します。第1に、放出光の強度は488nmの励起よりも405nmの励起でかなり低く、多くの場合、むしろ騒々しい405 nm画像をもたらす。405 nmチャネルのノイズへの信号を改善するには、より高いレーザーパワーが必要です。しかし、405nmでの励起は、典型的には光毒性が高く、488nmで励起よりも多くの自己蛍光を発生させ、405nmレーザー強度を許容制限する。例えば、この研究では、弱いroGFP蛍光とかなりの405 nm励起組織自己蛍光を組み合わせることで、生きているレティナフラットマウント(DeppおよびBas-Orth、未発表の観察)におけるミト-Grx1-roGFP2発現神経節細胞からの堅牢なデータの取得を妨げました。第2に、405:488nm比はpH5.5~pH8.5(図4)9の生理学的範囲内でのpH変化に対して無感受性であるが、roGFP2発光のpH依存的な急行は、典型的に弱い405nm信号を顕微鏡の検出限界以下に低下させ、定量化可能な比率の取得を妨げる。例えば、これは、神経細胞質13におけるNMDA誘導性アシドーシス中の場合であった。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、利益相反はないと宣言している。
Acknowledgments
この作品はドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(BA 3679/5-1;3679/5-1;)2289の場合:BA 3679/4-2)。A.K.はエラスムス+フェローシップによってサポートされています。アイリス・ブンスリ=エーレット、リタ・ロズナー、アンドレア・シュリックサップの原発ニューロンの調製に感謝します。私たちは、pLPCX-ミト-Grx1-roGFP2を提供してくれたトビアス・ディック博士に感謝します。 図4 に示す実験は、ハイデルベルク大学ニコンイメージングセンターで行われました。 図2 は BioRender.com で調製した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| reagents | |||
| Calcium chloride (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Diamide (DA) | Sigma-Aldrich | D3648 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Carl Roth GmbH | 6908.1 | |
| Glucose (2.5 M stock solution) | Sigma-Aldrich | G8769 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Glycine | neoFroxx GmbH | LC-4522.2 | |
| HEPES (1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | 15630-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| N-methyl-D-aspartate (NMDA) | Sigma-Aldrich | M3262 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Sodium chloride (NaCl) | neoFroxx GmbH | LC-5932.1 | |
| Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.1 | |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) | Sigma-Aldrich | 87917 | |
| equipment | |||
| imaging chamber | Life Imaging Services (Basel, Switzerland) | 10920 | Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips |
| laser scanning confocal microscope, microscope | Leica | DMI6000 | |
| laser scanning confocal microscope, scanning unit | Leica | SP8 | |
| peristaltic pump | VWR | PP1080 181-4001 | |
| spinning disc confocal microscope, camera | Hamamatsu | C9100-02 EMCCD | |
| spinning disc confocal microscope, incubationsystem | TokaiHit | INU-ZILCF-F1 | |
| spinning disc confocal microscope, microscope | Nikon | Ti microscope | |
| spinning disc confocal microscope, scanning unit | Yokagawa | CSU-X1 | |
| software | |||
| FIJI | https://fiji.sc | ||
| StackReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java | ||
| TurboReg plugin | https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java |
References
- Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
- Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
- Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
- Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
- Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
- Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
- Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
- Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
- Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
- Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G.
- Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
- Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
- Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
- Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
- Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
- Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
- Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
- Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
- Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
- Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
- Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).
