Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Live Imaging af Mitokondrie Glutathione Redox tilstand i primære neuroner ved hjælp af en ratiometrisk indikator

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

Denne artikel beskriver en protokol til at bestemme forskelle i basal redox tilstand og redox svar på akutte forstyrrelser i primære hippocampal og kortikale neuroner ved hjælp af konfokal levende mikroskopi. Protokollen kan anvendes på andre celletyper og mikroskoper med minimale ændringer.

Abstract

Mitokondrie redox homøostase er vigtigt for neuronal levedygtighed og funktion. Selvom mitokondrier indeholder flere redox-systemer, betragtes den meget rigelige thiol-disulfid redox buffer glutathion som en central aktør i antioxidantforsvar. Derfor, måling af mitokondrie glutathion redox potentiale giver nyttige oplysninger om mitokondrie redox status og oxidativ stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) er et genetisk kodet, grønt fluorescerende protein (GFP)-baseret ratiometrisk indikator for glutathion redox-potentialet, der har to redox-state-følsomme excitation toppe ved 400 nm og 490 nm med en enkelt emissionstop ved 510 nm. Denne artikel beskriver, hvordan man udfører konfokal levende mikroskopi af mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primære hippocampal og kortikale neuroner. Den beskriver, hvordan man vurderer steady-state mitokondrie glutathion redox potentiale (f.eks at sammenligne sygdomstilstande eller langsigtede behandlinger) og hvordan man måler redox ændringer på akutte behandlinger (ved hjælp af excitotoksiske stof N-methyl-D-aspartat (NMDA) som et eksempel). Derudover præsenterer artiklen co-imaging af Grx1-roGFP2 og mitokondriemembranpotentialeindikatoren, tetramethylrhodamin, ethyl ester (TMRE), for at demonstrere, hvordan Grx1-roGPF2 kan multiplexes med yderligere indikatorer til multiparametriske analyser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan (i) optimerer confocal laser scanning mikroskop indstillinger, (ii) anvende lægemidler til stimulation efterfulgt af sensor kalibrering med diamid og dithiothreitol, og (iii) analysere data med ImageJ / FIJI.

Introduction

Flere vigtige mitokondrie enzymer og signalmolekyler er underlagt thiol redox regulering1. Desuden er mitokondrier en vigtig cellulær kilde til reaktive iltarter og er selektivt sårbare over for oxidative skader2. Derfor mitokondrie redox potentiale direkte påvirker bioenergetik, celle signalering, mitokondrie funktion, og i sidste ende celle levedygtighed3,4. Mitokondrie matrix indeholder store mængder (1-15 mM) af thiol-disulfid redox buffer glutathion (GSH) for at opretholde redox homøostase og montere antioxidant forsvar5,6. GSH kan være kovalent knyttet til målproteiner (S-glutathionylation) for at kontrollere deres redox-status og aktivitet og bruges af en række afgiftende enzymer, der reducerer oxiderede proteiner. Derfor er mitokondrie glutathion redox potentiale en meget informativ parameter, når man studerer mitokondrie funktion og patofysiologi.

roGFP2 er en variant af GFP, der er blevet gjort redox-følsomme ved tilsætning af to overflade-eksponerede cysteiner, der danner en kunstig dithiol-disulfid par7,8. Det har en enkelt emission peak på ~ 510 nm og to excitation toppe på ~ 400 nm og 490 nm. Det er vigtigt, at de relative amplituder af de to excitationstoppe afhænger af roGFP2's redox-tilstand (figur 1), hvilket gør dette protein til en ratiometrisk sensor. I Grx1-roGFP2 sensoren er human glutaredoxin-1 (Grx1) blevet smeltet til N-endestationen for roGFP29,10. Kovalent fastgørelse af Grx1-enzymet til roGFP2 giver to store forbedringer af sensoren: Det gør sensorresponset specifikt for GSH/GSSG glutathion redox-parret (figur 1), og det fremskynder ækvilibreringen mellem GSSG og roGFP2 med en faktor på mindst 100.0009. Derfor muliggør Grx1-roGFP2 specifik og dynamisk billeddannelse af det cellulære glutathion redox-potentiale.

Grx1-roGFP2 billeddannelse kan udføres på en bred vifte af mikroskoper, herunder widefield fluorescens mikroskoper, spinning disk konfokale mikroskoper, og laser scanning konfokale mikroskoper. Ekspression af sensoren i primære neuroner kan opnås ved forskellige metoder, der omfatter lipofection11, DNA / calcium-fosfat coprecipitation12, virusmedieret genoverførsel eller brug af transgene dyr som cellekilde (figur 2). Pseudotyped rekombinant adeno-associerede vira (rAAV), der indeholder en 1:1 forholdet mellem AAV1 og AAV2 capsid proteiner 13,14 blev brugt til eksperimenter i denne artikel. Med denne vektor, maksimal sensor udtryk er typisk nået 4-5 dage efter infektion og forbliver stabil i mindst to uger. Vi har med succes brugt Grx1-roGFP2 i primære hippocampale og kortikale neuroner fra mus og rotter.

I denne artikel, rAAV-medieret udtryk for mitokondrier-målrettet Grx1-roGFP2 i primær rotte hippocampal og kortikale neuroner bruges til at vurdere basal mitokondrie glutathion redox tilstand og dens akutte forstyrrelser. En protokol er fastsat for confocal live imaging med detaljerede instruktioner om, hvordan (i) optimere laser scanning konfokale mikroskop indstillinger, (ii) køre en levende billedbehandling eksperiment, og (iii) analysere data med FIJI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med nationale og institutionelle retningslinjer, herunder Rådets direktiv 2010/63/EU i Europa-Parlamentet, og havde fuld etisk godkendelse fra indenrigsministeriet (Universitetet i Heidelberg' dyrevelfærdskontor og Regierungspraesidium Karlsruhe, licenserne T14/21 og T13/21). Primære hippocampale og kortikale neuroner blev fremstillet af nyfødte mus- eller rotteunger i henhold til standardprocedurer og blev opretholdt i 12-14 dage som tidligere beskrevet13.

1. Udarbejdelse af løsninger

  1. Lagerløsninger til billedbuffer
    1. Hver lageropløsning i henhold til tabel 1 og hold dem på 4 °C. Ved langtidsopbevaring (>3 måneder) skal aliquots opbevares ved -20 °C.
Komponent MW Koncentration (M) Beløb (g) Lydstyrke (mL)
NaCl 58.44 5 14.61 50
KCl 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
Glycin 75.07 0.1 0.375 50
Saccharose 342.3 1.5 25.67 50
Natrium pyruvat 110.04 0.1 0.55 50
HEPES 238.3 1 11.9 50
Glukose 180.15 2.5 45 100

Tabel 1: Lagerløsninger til billedbuffer.

  1. Stock løsninger af lægemidler og farvestoffer
    1. Diamid (DA; anvendes til kalibrering af maksimalt 405:488-forhold) i vand for at opnå en 0,5 M lageropløsning (f.eks. 1 g i 11,615 mL vand). Aliquot og opbevares ved -20 °C.
    2. Dithiothreitol (DTT), der anvendes til kalibrering af et minimumsforhold på 405:488) i vand for at opnå en 1 M lageropløsning (f.eks. 5 g i 32.425 mL vand). Aliquot og opbevares ved -20 °C i højst 3 måneder.
    3. N-methyl-D-aspartat (NMDA, der anvendes til at fremkalde excitotoxicity og mitokondrieoxidation) i vand for at opnå en 10 mM lageropløsning (f.eks. 25 mg i 16.991 mL vand). Opbevar aliquots ved -20 °C. Ved langtidsopbevaring (>6 måneder) skal aliquoterne opbevares ved -80 °C.
    4. Tetramethylrhodamin ethyl ester perchlorat (TMRE; en indikator for mitokondriemembranpotentialet)
      1. TMRE-pulver opløses i methanol for at opnå en 20 mM-bestand (f.eks. 25 mg i 2,427 mL methanol).
      2. Fortynd 20 mM lager 1:1.000 i methanol for at opnå en 20 μM lager.
      3. Aliquot 20 mM og 20 μM lagerløsninger, tætning med parafilm, og opbevare beskyttet mod lys ved -20 °C.
        BEMÆRK: Begge aktieløsninger er stabile i flere år. Brug 1.000x lageropløsningen (20 μM) til forsøg.
  2. Imaging buffer
    1. Klargør 100 mL billedbuffer ved at tilføje alle komponenter fra tabel 2 til 80 mL sterilt vand i en målecylinder. Bring volumen op til 100 mL med sterilt vand. Bland ved forsigtigt at ryste målecylinderen, indtil opløsningen ser homogen ud.
      BEMÆRK: Det anbefales at bruge et osmometer til at kontrollere bufferens osmolarity. Det skal være så tæt som muligt på cellernes vækstmedium. Her er dette 315 mOsmol / L. Øge eller mindske saccharose koncentration efter behov for at matche osmolarity af billeddannelse buffer og vækst medium.
    2. PH-tallet justeres til 7,4. Lav aliquots og hold dem på 4 °C i op til to uger. For langtidsopbevaring skal aliquoterne opbevares ved -20 °C. Lad billedbufferen nå stuetemperatur før brug.
Komponent Lagerløsning (M) Endelig koncentration (mM) Lydstyrke (mL)
NaCl 5 114 2.3
KCl 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
Glycin 0.1 0.005 0.005
Saccharose 1.5 52 3.5
Natrium pyruvat 0.1 0.5 0.5
HEPES 1 10 1
Glukose 2.5 5 0.2

Tabel 2: Sammensætning af billedbuffer. De angivne diskenheder anvendes til fremstilling af 100 mL billedbuffer.

  1. Løsninger til stimulering og kalibrering
    BEMÆRK: Forbered altid nye stimuleringsløsninger ved at tilføje lageropløsninger af indicerede lægemidler til billedbufferen lige før eksperimentet. Opløsninger til stimulering og kalibrering vil blive tilføjet til billedbehandlingskammeret sekventielt under et forsøg (se afsnit 3-5). Afhængigt af eksperimenttypen kræves der forskellige opløsninger for at nå den samme slutkoncentration i det respektive endelige volumen i billedkammeret.
    1. Der fremstilles 3x NMDA-opløsning (90 μM; endelig koncentration i kammeret: 30 μM) ved at tilsætte 63 μL af en 10 mM NMDA-bestand til 6,937 mL billedbuffer. Kammeret tilsættes 500 μL (sidste volumen: 1,5 mL).
    2. 2x DA-opløsning til trin 3 og 4 (1 mM; endelig koncentration i kammeret: 0,5 mM) ved at tilsætte 14 μL af en 0,5 M DA-bestand til 6,986 mL billedbuffer. Tilsæt 1 mL til kammeret (sidste bind: 2 mL).
    3. 4x DA-opløsning til trin 5 (2 mM; endelig koncentration i kammeret: 0,5 mM) ved at tilsætte 28 μL af en 0,5 M DA-bestand til 6,972 mL billedbuffer. Kammeret tilsættes 500 μL (sidste bind: 2 mL).
    4. 1x DTT-opløsning (5 mM; endelig koncentration i kammeret: 5 mM) ved at tilsætte 45 μL 1 M DTT lager til 8955 μL billedbuffer. 1 mL af denne opløsning til kammeret efter indsugning af billedbufferen (sidste volumen: 1 mL).

2. Indlæsning af celler med TMRE

BEMÆRK: I denne protokol anvendes TMRE i ikke-quench mode15 ved en endelig koncentration på 20 nM. Generelt bør den lavest mulige koncentration af TMRE, der stadig giver tilstrækkelig signalintensitet på det foretrukne mikroskop, anvendes. På grund af ujævn fordampning kan mængden af medium i forskellige brønde variere i langsigtede primære kulturer. For at sikre en ensartet TMRE-koncentration i alle brønde må TMRE ikke tilføjeS direkte til brøndene. I stedet erstatte mediet i hver brønd med den samme mængde TMRE-holdige medium. Protokollen nedenfor er designet til primære neuroner i 24-brønd plader, der indeholder ~ 1 mL medium pr brønd.

  1. Arbejder i en vævskultur laminar flow hætte, indsamle 500 μL medium fra hver brønd i en enkelt koniske rør.
  2. Pr. brønd tilsættes 0,5 μL på 20 μM TMRE-lager i det koniske rør (f.eks. 12 μL til 24 brønde).
  3. Opsigts forsigtigt det resterende medium fra den første brønd, og udskift det med 500 μL TMRE-holdige medier. Fortsæt, godt, godt, med de resterende brønde.
    BEMÆRK: Pas på ikke at lade cellerne tørre ud og ikke forstyrre cellerne.
  4. Returner cellerne til inkubatoren og vent i mindst 60 minutter på farvestofekvilibrering.
    BEMÆRK: Indlæsningstiden kan forlænges til flere timer uden bivirkninger.
  5. For at sikre ensartede TMRE-koncentrationer og ekvilibrering i hele billedeksperimentet skal du sørge for at inkludere en endelig koncentration på 20 nM TMRE i billedbufferen og alle stimuleringsløsninger.

3. Optimering af indstillinger for scanning af konfokale mikroskoper

BEMÆRK: Dette trin har til formål at finde det bedste kompromis mellem billedkvalitet og cellelevedygtighed under live imaging. I dette afsnit beskrives optimeringen af indstillingerne for roGFP-billedbehandling. Hvis multiparametrisk billeddannelse udføres, skal der udføres lignende optimering, herunder kontrol af en stabil baseline uden tegn på blegning eller fototoksicitet, for de yderligere indikatorer.

  1. Start det konfokale mikroskop, og indlæs standardindstillingerne for GFP-billeddannelse (488 nm excitation, 505 - 550 nm emission).
  2. Indstil detektoren til 12 bit eller 16 bit.
    BEMÆRK: Normalt er 8 bit ikke tilstrækkelige til kvantitativ billeddannelse.
  3. Aktiver den sekventielle scanningstilstand , og tilføj anden sekvens/spor (405 nm excitation, 505 - 550 nm emission).
  4. For begge kanaler skal du vælge en pseudofarveopslagstabel, der angiver over- og undereksponerede pixel (f.eks.
  5. Vælg en målsætning, der passer til det objekt, der er af interesse.
    BEMÆRK: 10x-40x er velegnede til enkeltcellet analyse, 63x-100x er velegnede til single-mitokondrie analyse.
  6. Monter en coverlip med celler ind i billedkammeret, tilsæt 1 mL billedbuffer, og placer kammeret på mikroskopet.
  7. Brug okularet og transmitteret lys til at fokusere cellerne.
    BEMÆRK: Brug ikke epifluorescencelys til at finde og fokusere celler. Selv ved lav effekt vil dette påvirke cellerne negativt.
  8. Optag billeder med forskellige pixelformater. Baseret på disse billeder skal du vælge det laveste pixeltal, der giver en acceptabel opløsning af interessestrukturen.
    BEMÆRK: Typisk fungerer 512 x 512 pixels godt til enkeltcellet billeddannelse med 20x og 40x mål og 1024 x 1024 eller 2048 x2048 pixels fungerer typisk godt til single-mitokonddrion billeddannelse med et 63x mål.
  9. Optag billeder med forskellige pinhole størrelser. Baseret på disse billeder skal du vælge den største pinhole størrelse, der giver en acceptabel opløsning af strukturen af interesse.
    BEMÆRK: Typisk fungerer 3-7 luftige enheder godt.
  10. Optag billeder med forskellige laserintensiteter.
    1. Juster detektorforøgelsen og tærsklen i overensstemmelse hermed. Baseret på disse billeder skal du vælge den laveste laserintensitet, der giver acceptabel signalintensitet og signal-til-baggrund-forhold.
      1. For at bestemme signal-til-baggrund-forholdet skal du måle signalintensiteten i et interesseområde (ROI), der indeholder celler eller mitokondrier (ROI1) og i et investeringsafkast uden celler eller mitokondrier (ROI2). Del derefter intensiteten af ROI1 med intensiteten af ROI2.
        BEMÆRK: Sigt efter et signal-til-baggrundsforhold på >3 og signalintensiteter for individuelle ROI'er på 200-1.000 for 405 nm excitation med 1-3% laserkraft og intensiteter af individuelle ROI'er på 300-1.500 for 488 nm excitation med 1% laserkraft.
  11. Optag billeder med forskellige scanningshastigheder og antal rammegennemsnit. Optag 4-5 billeder for hver kombination af indstillinger. Baseret på disse billedserier skal du vælge den højeste hastighed og de laveste gennemsnitlige indstillinger, der giver acceptabel billedstøj og billed-til-billed-variation.
    BEMÆRK: En scanningshastighed på 600 Hz og 1-2 rammer til gennemsnit fungerer i gennemsnit godt i de fleste tilfælde.
  12. Ved hjælp af en ny coverlip skal du optage en time-lapse-serie med de optimerede indstillinger.
    BEMÆRK: Seriens varighed og billedinterval skal ligne de planlagte eksperimenters.
  13. I slutningen af time-lapse-serien tilsættes 1 mL 2x DA-opløsning til optagelseskammeret. Billede i yderligere 2 min.
  14. Aspirere billedbufferen ved hjælp af en peristaltisk pumpe eller håndholdt pipette. Tilføj 1 mL 1x DTT-opløsning. Billede i yderligere 5 min.
  15. Analysere tidsforsenende eksperimentet (se afsnit 5).
    1. Kontroller, at ingen af de to kanaler bliver over- eller undereksponeret under DA- og DTT-behandling med de optimerede indstillinger.
    2. Sørg for, at ingen af de to kanaler viser betydelig blegning under time-lapse-optagelsen; mål for <2% tab af intensitet mellem det første og sidste billede.
    3. Kontroller, at forholdet 405:488 ikke ændres væsentligt under billeddannelsen.
  16. Gentag hele proceduren på en iterativ måde ved hjælp af flere coverslips, indtil indstillinger, der konsekvent giver acceptable resultater, er defineret.

4. Vurdering af basal redox-status

  1. Start mikroskopet, og indlæs de optimerede indstillinger fra afsnit 3.
  2. Indstil rammegennemsnittet til 3-5.
  3. Monter en coverlip med celler ind i billedkammeret, tilsæt 1 mL billedbuffer, og placer kammeret på mikroskopet.
  4. Brug okularet og transmitteret lys til at fokusere cellerne.
    BEMÆRK: Brug ikke epifluorescencelys til at finde og fokusere celler. Selv ved lav effekt vil dette påvirke cellerne negativt.
  5. Skift til scanningstilstand , og brug 488 nm-kanalen i live view til at fokusere og finde celler til billeddannelse.
  6. Brug multipunktfunktionen til at vælge 3-5 synsfelter på omslagssedlen.
  7. Optage et oprindeligt billede.
  8. Tilsæt 1 mL 2x DA opløsning til kammeret.
  9. Efter 1, 2 og 3 min skal du bruge live view til at bekræfte/justere fokus og derefter optage et billede.
    BEMÆRK: Cellerne oxideres typisk fuldt ud efter 2 min.
  10. Udskift bufferen i billedkammeret med 1 mL 1x DTT-opløsning.
  11. Efter 3 og 5 min skal du bruge live view til at bekræfte/justere fokus og derefter optage et billede.
    BEMÆRK: Cellerne reduceres typisk fuldt ud efter 4-5 min.

5. Live imaging af akutte behandlinger

BEMÆRK: Protokollen nedenfor beskriver billeddannelse af mitokondrie redox respons på NMDA behandling. Billedintervaller og varighed af eksperimentet skal muligvis justeres for andre behandlinger.

  1. Start mikroskopet, og indlæs de optimerede indstillinger fra afsnit 3.
  2. Indstil tidsforskydningsintervallet til 30 s og varighed til 25 min.
  3. Monter en coverlip med celler ind i billedkammeret, tilsæt 1 mL billedbuffer, og placer kammeret på mikroskopet.
    BEMÆRK: For at undgå termisk fokusdrift skal cellerne efterlades på mikroskopstadiet i 10-15 min, før du starter time-lapse imaging.
  4. Brug okularet og transmitteret lys til at fokusere cellerne.
    BEMÆRK: Brug ikke epifluorescencelys til at finde og fokusere celler. Selv ved lav effekt vil dette påvirke cellerne negativt.
  5. Skift til scanningstilstand , og brug 488 nm-kanalen i live view til at fokusere og finde celler til billeddannelse.
  6. Valgfrit: Hvis du vil øge antallet af registrerede celler pr. kørsel, skal du bruge multipunktfunktionen til at afbilde 2-3 visningsfelter pr. forside.
  7. Start tidsforgangskøbet, og optag 5 billeder som 2 min baseline-optagelse.
  8. Tilsæt 500 μL 3x NMDA-opløsning til kammeret (endelig koncentration 30 μM) og optag yderligere 20 billeder som 10 min NMDA-respons.
    BEMÆRK: Neuroner er meget følsomme over for ændringer i osmolarity. Sørg derfor for at minimere fordampning af billedbufferen. Ved længere behandlinger skal billedkammeret være dækket af et låg.
  9. Tilsæt 500 μL 4x DA-opløsning til kammeret, og optag yderligere 6 billeder (3 min. maksimal kalibrering).
  10. Aspirer bufferen fra billedkammeret og udskift den med 1 mL 1x DTT-opløsning. Optag 10 flere billeder (5 min minimum kalibrering).
  11. Afslut optagelsen, og gem billedserien.

6. Dataanalyse

  1. Dataimport og billedforbehandling i FIJI
    1. Brug Bioformatimportøren til at åbne en gruppe billeder fra trin 4 eller en billedfil fra trin 5. Klik på Plugins | Bioformater | Bio-Formater Importør. Brug Vis stak med: Hyperstack, angiv farvetilstand: standard, vælg Autoskaler, og opdel ikke i separate vinduer.
      BEMÆRK: Automatisk skalering optimerer visningen af dataene på computerskærmen. Det ændrer ikke pixelintensiteter.
    2. Hvis individuelle billeder fra trin 4 blev åbnet, skal du klikke på | Stakke | Værktøjer | Sammenkæd for at flette dem sammen til en stak med et enkelt billede.
    3. Hvis der er XY-drift under billedserien, skal du klikke på Plugins | StackReg for at registrere billederne. Vælg Stiv brødtekst eller oversættelse i dialogboksen .
    4. Skift billedformatet til 32 bit ved at klikke på Billed | Skriv | 32-bit.
    5. Opdele farvekanalerne i separate vinduer ved at klikke på | Farve | Opdel kanaler.
    6. Vælg kanal 1 (405 nm), og juster tærsklen for at vælge mitokondrier til analyse ved at klikke på Billede | Juster | Tærskel. Vælg Standard, Rød, Mørk baggrund og Stak histogram i dialogboksen , og vent på, at de markerede pixel vises rødt. Klik på Anvend. Vælg Indstil baggrundspixel til NaN, og behandl alle billeder.
      BEMÆRK: For at undgå potentiel observatørfordomme bør der anvendes automatisk tærskelbestemmelse. FIJI tilbyder flere automatiserede metoder (f.eks. Default, Huang, Intermodes, Otsu), der kan vælges fra en rullemenu i tærskeldialogboksen. Standardmetoden giver typisk et godt resultat. Det anbefales at sammenligne flere metoder under den første analyse for at finde den bedste tærskelmetode for det givne sæt billeder. Når en metode er valgt, skal den anvendes på alle billeder.
    7. Gentag trin 6.1.6 for kanal 2 (488 nm).
    8. Opret et forholdsbillede for at visualisere forholdet 405:488 nm ved at klikke på Proces | Billedberegner. Vælg Billede 1: kanal 1, Operation: Divider, Billede 2: kanal 2, Opret nyt vindue, Behandl alle billeder i dialogboksen.
    9. Rediger opslagstabellen for forholdets billede til pseudofarve. Hvis du f.eks. vil skifte til Brand, skal du klikke på | Opslagstabeller | Skyd.
  2. Billedanalyse
    1. Tegn ROI'er omkring individuelle celler eller mitokondrier på forholdets billede. Når du har tegnet hvert investeringsafkast, skal du føje det til ROI Manager. Analyser | Værktøjer | ROI Manager | Tilføj. (tastaturgenvej: 'T') Vælg Vis alle.
      BEMÆRK: Da baggrundspixel er indstillet til 'ikke et tal' (NaN) i trin 6.1.6 og 6.1.7, vil de ikke påvirke resultatet af målingen. Derfor er det acceptabelt at medtage nogle baggrundspixel i investeringsafkast.
    2. Mål 405:488-forholdet mellem de enkelte celler ved at klikke på ROI Manager | ctrl+A for at markere alle investeringsafkast | Mere | Multimål. Vælg Mål alle udsnit og Én række pr. udsnit i dialogboksen .
    3. Eksporter målingerne til regnearkssoftware.
    4. Vælg billedet på 405 nm. Mål intensiteten af alle investeringsafkast som i trin 6.2.2. ved hjælp af de investeringsafkast, der er gemt i ROI Manager.
    5. Eksporter målingerne til regnearkssoftware.
    6. Vælg billedet på 488 nm. Måle intensiteten af alle investeringsafkast som i trin 6.2.2. ved hjælp af de investeringsafkast, der er gemt i ROI Manager.
    7. Eksporter målingerne til regnearkssoftware.
    8. Gem investeringsafkast til fremtidig reference ved at klikke på ROI Manager | ctrl+A for at markere alle investeringsafkast | Mere | Spar.
    9. Anbefalet: Generer intensitet vs. tidsplotter af sporene på 405 og 488 nm. Kontroller, at der ikke er nogen markant blegning i nogen af kanalerne (signalintensiteten i slutningen af billedserien skal være ≥98% af det første billede), og at de to spor bevæger sig i modsatte retninger under sensorrespons (f.eks. skal sporingen på 405 nm øges under oxidation, mens sporingen på 488 nm skal falde).
  3. Data normalisering
    1. For hvert investeringsafkast fra forholdets billede bestemmes maksimumværdien under DA-behandlingen (Rmax) og minimumværdien under DTT-behandling (Rmin).
    2. Beregn det normaliserede forhold på følgende måde:
      Equation 1
      BEMÆRK: Dette vil sætte det maksimale forhold til 1,0 og minimumforholdet til 0.
  4. Analyse af mitokondrie morfologi
    1. Hvis du vil opnå målinger af mitokondriemorfologi parallelt med roGFP-intensiteterne i trin 6.2.6, skal du gå til Analyze | Angiv målinger , og kontroller figurbeskrivelser og Tilpas ellipse.
      BEMÆRK: Ud over den gennemsnitlige intensitet vil målingerne i resultatvinduet omfatte længden af den store akse (Major), længden af den mindre akse (Minor), højde-bredde-forholdet (AR; større akse divideret med mindre akse; runde mitokondrier har en AR ~ 1, langstrakt mitokondrier har en større AR) samt målinger af cirkularitet (Circ.) og rundhed (Runde).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kvantificering af forskelle i steady-state mitokondrie redox tilstand efter vækstfaktor tilbagetrækning
For at demonstrere kvantificeringen af steady-state forskelle i mitokondrie redox tilstand, primære neuroner dyrket i standard medium blev sammenlignet med neuroner dyrket uden vækstfaktorer for 48 timer før billeddannelse. Vækstfaktor tilbagetrækning resulterer i apoptotisk neuronal celle død efter 72 h16. Celler blev afbildet efter 48 timer for at teste, om dette er forud for ændringer i mitokondrie redox tilstand. Primære rotte kortikale neuroner dyrket på poly-L-ornithine-coatede coverslips blev inficeret med rAAV-mito-Grx1-roGFP2 på dage in vitro 6 (DIV6) og blev afbildet på DIV12. Live imaging blev udført ved stuetemperatur i henhold til afsnit 4 i denne protokol på en omvendt laser scanning konfokal mikroskop udstyret med en 40x/1.10 vand nedsænkning mål. Confocal indstillinger var pinhole 7 luftige enheder, pixel størrelse 568.7 nm (512 x 512 pixels), scanning hastighed 600 Hz, laser magt 405 nm 3%, laser magt 488 nm 1%, emission båndbredde 505-550 nm, og ramme gennemsnit 4. Der var ingen større forskel mellem de rå 405:488 nm-forhold mellem de to betingelser (figur 3B). Efter data normalisering kunne en delmængde af celler med et øget forhold på 405:488 nm påvises i vækstfaktorudtrækningsgruppen (Figur 3C). Dette indikerer, at mitokondrie redox ændringer kan gå forud neuronal celledød, og det understreger relevansen af max / min data normalisering for sammenligning af basal redox tilstande mellem grupper.

Dynamiske ændringer i mitokondrie redox tilstand ved behandling af neuroner med NMDA
NMDA-typen glutamat receptor (NMDAR) spiller en central rolle i neuronal plasticitet, men kan også mægle neuronal skade og celledød. Patologisk aktivering af NMDAR fører til flere bivirkninger på mitokondrier, der omfatter matrix calcium overbelastning, mitokondrie oxidation og fragmentering, og mitokondrie permeabilitet overgang. I en tidligere undersøgelse blev ovennævnte protokol brugt til at undersøge en årsagssammenhæng mellem NMDA-induceret mitokondrie calcium overbelastning og mitokondrie oxidation13. Primære rotte hippocampale neuroner dyrket på poly-D-lysin/laminin-coatede coverslips blev inficeret med rAAV-mito-Grx1-roGFP2 på DIV4 og afbildet på DIV12. Levende billeddannelse blev udført ved 37 °C på et omvendt roterende skivekonfokalt mikroskop udstyret med et 20x/0.75 multi immersion mål (vand nedsænkning blev brugt) og et inkubationssystem på scenen. Mito-Grx1-roGFP2 var sekventielt ophidset hver 20 s ved hjælp af 405 nm og 488 nm laser linjer, og emission blev indsamlet med en 527/55 nm emissionsfilter for begge excitation bølgelængder. Behandling af neuroner med 30 μM NMDA forårsagede oxidation af mitokondrier inden for få minutter (figur 4A,B). Nmda-induceret mitokondriesyreose forårsagede betydelig slukning af roGFP2 fluorescens i overensstemmelse med dens velkendte pH-følsomhed8. For at bekræfte, at denne pH-afhængige slukning ikke påvirkede 405:488-forholdet9, blev mitokondrier fuldt oxideret af DA før tilsætning af NMDA i et kontrolforsøg. Forbehandling med DA udelukker yderligere oxidation af mitokondrier fra NMDA' s, og forholdet på 405:488 ændrede sig derfor ikke i dette eksperiment på trods af en betydelig slukning af roGFP2 fluorescensintensiteten (figur 4C).

Multiparametrisk analyse af NMDA-inducerede ændringer af dendritisk mitokondrier
For at vurdere den tidsmæssige sekvens af NMDA-inducerede ændringer i mitokondriemorfologi, membranpotentiale og redox-tilstand blev parallel billeddannelse af TMRE- og mito-Grx1-roGFP2 fluorescens udført ved høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Primære rotte kortikale neuroner dyrket på poly-L-ornithine-coatede coverslips blev inficeret med rAAV-mito-Grx1-roGFP2 på DIV6 og afbildet på DIV12. Live imaging blev udført ved stuetemperatur på en omvendt confocal laser scanning mikroskop ved hjælp af en 63x/1.40 olie nedsænkning mål, en scanning hastighed på 600 Hz, en pixel størrelse på 90,2 nm (1024 x 1024 pixels på 2x scan zoom), en pinhole størrelse på 3 luftige enheder, og en ramme gennemsnit på 2. Hver 30 s, tre billeder blev optaget i sekventiel tilstand: 405 nm excitation/505-550 nm emission; 488 nm excitation/505-550 nm emission 552 nm excitation/560-600 nm emission. Behandling af neuroner med 60 μM NMDA resulterede i tab af TMRE-signal og en stigning i roGFP-forholdet på 405:488 nm efterfulgt af en forsinket afrunding af mitokondrier (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af Grx1-roGFP2 funktion og roGFP2 excitation spektre. (A) Oxidativ stress og virkningen af antioxidant forsvarssystemer oxidere cellulær glutathion pool. Grx1 i Grx1-roGPF2 fusion protein fremmer den hurtige ækvilibrering af roGFP2 redox tilstand med redox tilstand glutathion pool. RoGFP2-puljens redox-status kan vurderes ved at overvåge forholdet mellem GFP-fluorescensemission ved 510 nm efter excitation ved 405 nm og 488 nm. Reducerede arter er vist i blåt; oxiderede arter er vist med rødt. (B) Excitationsspektre af fuldt reduceret (blå) og oxideret (rød) roGFP2. Ved oxidation af roGFP2 øges fluorescensemissionen ved 400 nm excitation, mens emissionen ved 490 nm excitation falder. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation13. Excitationsspektre i B blev tegnet på grundlag af figur 1B fra 8. Stiplede linjer i B angiver bølgelængderne af almindeligt anvendte 405 nm og 488 nm laserlinjer. Forkortelser: GSH = glutathion; GSSG = oxideret glutathion; Grx = glutaredoxin; roGFP = redox-følsomme grønne fluorescerende protein variant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Metodens arbejdsgang. Udtryk for excitation-ratiometrisk redox-følsomme fluorescerende protein roGFP2 i neuroner kan opnås gennem flere metoder, der omfatter transfekt, lipofection, viral genoverførsel, og transgene dyr. Sensoren kan bruges til at studere neuronal redox tilstand i dyrkede primære neuroner, ex vivo væv explants, og intakte dyr. roGFP2 billeddannelse kan udføres på en række mikroskoper, der omfatter widefield fluorescerende mikroskoper, konfokale mikroskoper, og 2-foton mikroskoper. Analyse af roGFP2 billeddata kan udføres med den frit tilgængelige software ImageJ / FIJI. Forkortelse: roGFP = redox-følsomme grønne fluorescerende protein variant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Tilbagetrækning af vækstfaktor forårsager oxidation af neuronal mitokondrier. (A) Repræsentant 405:488 nm ratio billeder af neuroner, der dyrkes i nærværelse (+ GF) eller fravær (- GF) af vækstfaktorer i 48 timer før billeddannelse. Farvekodede skalaer repræsenterer ikke-normaliserede 405:488 nm-forhold (lavere nøgletal svarer til en reduceret tilstand, højere nøgletal svarer til en oxideret tilstand). Skalastænger = 50 μm. (B) Kvantificering af forholdet på 405:488 nm hos individuelle neuroner. (C) Max/min kalibreret 405:488 nm forhold mellem de enkelte neuroner. Runde symboler repræsenterer enkelte celler. repræsenterer middelværdi. N = 40-44 celler fra 3 coverslips fra et præparat. Forkortelse: GF = vækstfaktor. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: NMDA-induceret oxidation af neuronal mitokondrier. (A) Repræsentativ 405:488 nm ratio billeder før og efter behandling med 30 μM NMDA og efter max/min kalibrering med DA og DTT. Ved denne forstørrelse, roGFP signal er for det meste detekteres i soma og proksimale dendritter. Den farvekodede skala repræsenterer ikke-normaliserede 405:488 nm-nøgletal (lavere nøgletal svarer til en reduceret tilstand, højere nøgletal svarer til en oxideret tilstand). Skalastænger = 50 μm. (B) Kvantificering af billeddannelseskørslen vist i A. NMDA fremkalder en hurtig og vedvarende mitokondrieoxidation, der kan kalibreres ved hjælp af DA og DTT. (C) NMDA-induceret mitokondriesyreose forårsager en dråbe GFP fluorescens på både 405 nm og 488 nm excitation (øverste panel). For at isolere den pH-drevne effekt og bekræfte, at forholdet på 405:488 nm er pH-ufølsomt, blev neuroner først maksimalt oxideret ved hjælp af DA og efterfølgende udfordret med NMDA i nærværelse af DA (lavere panel). Under disse forhold forårsager NMDA stadig mitokondriesyreose, men ingen yderligere mitokondrieoxidation. Selv om både 405 nm og 488 nm spor viser et pH-drevet fald i fluorescensintensiteten, forbliver forholdet på 405:488 nm stabilt. Dette tal er ændret fra 13. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; roGFP = redox-følsomme grønne fluorescerende protein variant; NMDA = N-methyl-D-aspartat; DA = diamid; DTT = dithiothreitol. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: NMDA-inducerede ændringer i membranpotentialet, redoxtilstanden og morfologien af dendritisk mitokondrier. (A) Tre billeder med høj forstørrelse fra et tidsfortænksomt eksperiment, erhvervet ved t = 1, 4 og 9 min, der viser dendritisk og axonal mitokondrier. Farvelægning repræsenterer TMRE-intensitet (se kalibreringslinje). (B) 405:488 nm roGFP-forholdsbilleder fra samme tidsfordistanceeksperiment som i (A) ved t = 1, 4 og 9 min. Bemærk, at på grund af begrænset AAV infektion effektivitet, kun en delmængde af neuroner udtrykker mito-Grx1-roGFP2, og derfor ikke alle TMRE-positive mitokondrier er roGFP-positive. Den farvekodede kalibreringslinje repræsenterer ikke-normaliserede 405:488 nm-nøgletal (lavere nøgletal svarer til en reduceret tilstand, højere nøgletal svarer til en oxideret tilstand). (C) Kvantificering af TMRE-intensitet, roGFP 405:488 nm ratio og rundhed af en enkelt mitokondrie (angivet med pile i A, B). Efter 1 min baseline-registrering blev der tilsat 60 μM NMDA til badeopløsningen. Skalastænger = 5 μm. Y-aksen i C viser 405:488 nm roGFP-forholdet i forhold til baseline T0 (grøn stiplet linje), TMRE fluorescensintensiteten i forhold til baseline T0 (rød prikket linje) og FIJI/ImageJ-formbeskrivelsen "roundness" (sort fast linje). Forkortelser: GFP = roGFP = redox-følsomme grønne fluorescerende proteinvariant; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxin-1 smeltet til N-endestation for roGFP; AAV = adeno-associeret virus; TMRE = tetramethylrhodamin, ethyl ester; NMDA = N-methyl-D-aspartat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitative og dynamiske målinger af mitokondrie redox tilstand giver vigtige oplysninger om mitokondrie og cellulær fysiologi. Flere fluorogene kemiske sonder er tilgængelige, der registrerer reaktive iltarter, "redox stress" eller "oxidativ stress." Sidstnævnte udtryk er imidlertid ikke veldefinerede og mangler ofte specificitet9,17,18. Sammenlignet med kemiske farvestoffer tilbyder Grx1-roGFP2 flere fordele9,19: (i) som excitationsrationsmetrisk sensor giver det iboende normalisering for sensorudtrykniveau, absolut fluorescensintensitet og celle- eller organeltæthed; ii) som en genetisk kodet sonde kan den målrettes organeller eller specifikke subcellulære rum såsom præsynaptiske terminaler eller postsynaptiske dendritiske pigge — sensorens genetiske udtryk undgår behovet for farvebelastning, som i tilfælde af kemiske farvestoffer kan være stressende for primære neuroner iv) Grx1-roGFP2 er i modsætning til generelle rødoxfølsomme kemiske farvestoffer meget specifik for glutathion redox-potentialet v) oxidation og reduktion af sensoren er reversibel, hvilket gør det muligt at måle forbigående redox-ændringer vi) I modsætning til kemiske farvestoffer, der kun gør det muligt at påvise relative ændringer, kan Grx1-roGPF2 fluorescensnøgletal kalibreres til at bestemme absolutte redoxpotentialer i mV9.

Denne protokol beskriver dynamiske målinger af mitokondrie glutathion redox potentiale i primære neuroner. Analyse af mitokondrier i intakte celler har flere fordele15. Sammenlignet med studiet af isolerede mitokondrier bevarer mitokondrier i cellerne fysiologisk relevante kontakter med andre organeller (f.eks. endoplasmisk reticulum-mitokondrier, mitokondrier-lysosomkontakter) og udsættes for cellulære koncentrationer af signalmolekyler og metabolitter. Sammenlignet med studiet af intakte dyr giver primære neuroner bedre tilgængelighed for genetiske og farmakologiske manipulationer og mikroskopi. For visse spørgsmål vil analyse af isolerede mitokondrier dog være bedre egnet, da dette giver mulighed for præcis kontrol over leverede substrater og hæmmere. Især kan mito-Grx1-roGFP2 også bruges i isolerede mitokondrier20. For at studere neuronal mitokondrier inden for intakt væv eller dyr er transgene flyve- og muselinjer tilgængelige, der udtrykker mito-Grx1-roGFP2 i nervesystemet21,22,23. Navnlig er excitationsspektret af roGFP2 modtageligt for to-foton excitation, der muliggør ex vivo og in vivo to-foton imaging i væv explants og intakte dyr, henholdsvis23,24. Spektrale varianter af thiol redox-følsomme fluorescerende proteiner er også tilgængelige såsom gul rxYFP-Grx1p25 og rød Grx1-roCherry26. Disse giver yderligere fleksibilitet til multiplexing og muliggør i princippet samtidig måling af redox-respons i forskellige celletyper eller cellerum.

Som beskrevet i protokollen kan forholdet på 405:488 nm kalibreres ved at måle maksimal- og minimal fluorescensforholdet efter påføring af henholdsvis DA og DTT. Denne normalisering er ikke afgørende, fordi sensoren giver en vis grad af iboende normalisering på grund af dens ratiometriske karakter. Vi anbefaler dog, at du udfører max/min kalibrering efter hver billedbehandlingskørsel, mest af to grunde. For det første sikrer det, at sensorrespons ikke blev mættet under eksperimentet. For det andet er det absolutte 405:488 nm-forhold et vilkårligt tal, der afhænger af mikroskopindstillingerne for begge kanaler. Selv når man holder de samme indstillinger, kan man ikke være sikker på, at laserkraft og detektorydelse forbliver den samme mellem eksperimenter, især når disse er flere uger fra hinanden. En løsning ville være at indstille det gennemsnitlige oprindelige forhold mellem kontrolceller til 1,0 i hvert eksperiment. Dette giver mulighed for relativ kvantificering af behandlingsfremkaldte redox-forstyrrelser i et givet forsøg, men begrænser sammenligneligheden af forskellige eksperimenter. Især når man sammenligner den basale redox tilstand af celler fra forskellige eksperimenter eller celletyper, er det vigtigt at opnå max / min kalibreret absolut kvantificering. Lejlighedsvis falder forholdet på 405:488 nm ikke under baseline-forholdet efter DTT-behandling, især hvis mitokondrier allerede var i en relativt reduceret tilstand ved baseline. Dette er typisk et tegn på sensor blegning under langvarige time-lapse eksperimenter. I dette tilfælde gentages eksperimentet med mikroskopindstillinger, der forårsager mindre lyseksponering.

Det er altafgørende at bruge mikroskopindstillinger, der ikke forårsager blegning af sensoren eller fototoksicitet-induceret oxidation af mitokondrier. Sørg for at tage tilstrækkelig tid til protokoloptimering, før du starter faktiske eksperimenter. Når acceptable indstillinger er defineret, kan de bruges i efterfølgende eksperimenter med minimale justeringer. mito-Grx1-roGFP2 billeddannelse kan udføres ved stuetemperatur eller 35-37 °C på et opvarmet stadium. Sensoren vil arbejde i begge tilfælde; Kinetikken af signalering kaskader og enzymreaktioner inde i cellerne vil naturligvis variere baseret på temperatur. Derfor kan kinetika og amplituder af sensorrespons variere afhængigt af den valgte temperatur. Valget af temperatur er op til brugeren, afhængigt af eksperimentets specifikke behov.

Endelig vil vi gerne påpege to begrænsninger af sensoren. For det første er intensiteten af udsendt lys betydeligt lavere med excitation ved 405 nm end med excitation ved 488 nm, hvilket ofte resulterer i temmelig støjende 405 nm billeder. Højere lasereffekt er nødvendig for at forbedre signalet til støj i 405 nm-kanalen. Excitation ved 405 nm er dog typisk mere fototoksisk og genererer mere autofluorescence end excitation ved 488 nm, hvilket begrænser den tilladte 405 nm laserintensitet. For eksempel forhindrede svag roGFP fluorescens kombineret med betydelig 405 nm ophidset væv autofluorescence erhvervelsen af robuste data fra mito-Grx1-roGFP2-udtrykkende ganglionceller i levende nethinde flatmounts (Depp og Bas-Orth, ikke-offentliggjort observation). For det andet, selv om forholdet på 405:488 nm er ufølsomt over for pH-ændringer inden for et fysiologisk interval omkring pH 5,5 til pH 8,5 (figur 4)9, kan pH-afhængig dæmpning af roGFP2-emission medføre, at det typisk svage 405 nm signal falder under mikroskopets detektionsgrænse, hvilket forhindrer erhvervelse af kvantificerbare ratiobilleder. For eksempel var dette tilfældet under NMDA-induceret acidose i den neuronale cytosol13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FOR 2289: BA 3679/4-2). A.K. støttes af et ERASMUS+-stipendium. Vi takker Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner og Andrea Schlicksupp for forberedelsen af primære neuroner. Vi takker Dr. Tobias Dick for at levere pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Eksperimenter vist i figur 4 blev udført på Nikon Imaging Center, Universitetet i Heidelberg. Figur 2 blev udarbejdet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Tags

Neurovidenskab Grx1-roGFP2 konfokal mikroskopi oxidativ stress hippocampal neuroner excitotoxicity mitokondriemembran potentiale
Live Imaging af Mitokondrie Glutathione Redox tilstand i primære neuroner ved hjælp af en ratiometrisk indikator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsalifis, A., Casaril, A. M.,… More

Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter