Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi

Published: October 20, 2021 doi: 10.3791/63073
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Medical Cell Biology, Institute for Anatomy and Cell Biology, Heidelberg University, 2Department of Neurogenetics, Max-Planck-Institute for Experimental Medicine

Summary

Bu makalede, konfokal canlı mikroskopi kullanılarak primer hipokampal ve kortikal nöronlarda bazal redoks durumundaki farklılıkları ve akut pertürbasyonlara redoks yanıtlarını belirlemek için bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, diğer hücre tiplerine ve mikroskoplara minimum değişiklikle uygulanabilir.

Abstract

Mitokondriyal redoks homeostaz nöronal canlılık ve fonksiyon için önemlidir. Mitokondri birkaç redoks sistemi içermese de, oldukça bol miktarda tiyol-disülfid redoks tampon glutatyon antioksidan savunmada merkezi bir oyuncu olarak kabul edilir. Bu nedenle, mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin ölçülmesi mitokondriyal redoks durumu ve oksidatif stres hakkında yararlı bilgiler sağlar. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2), 400 nm ve 490 nm'de tek emisyon zirvesi olan iki redoks durumuna duyarlı uyarlama zirvesine sahip glutatyon redoks potansiyelinin genetik olarak kodlanmış, yeşil floresan protein (GFP) bazlı bir oransal göstergesidir. Bu makalede primer hipokampal ve kortikal nöronlarda mitokondri hedefli Grx1-roGFP2 konfokal canlı mikroskopinin nasıl gerçekleştirilği açıklanmaktadır. Sabit durum mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin (örneğin, hastalık durumlarını veya uzun süreli tedavileri karşılaştırmak için) nasıl değerlendirileceğini ve akut tedavilerde redoks değişikliklerinin nasıl ölçüleceğini (örnek olarak ekssostoksik ilaç N-metil-D-aspartat (NMDA) kullanılarak) açıklar. Buna ek olarak, makale Grx1-roGFP2 ve mitokondriyal membran potansiyel göstergesi, tetrametrikrhodamin, etil ester (TMRE), Grx1-roGPF2'nin çok boyutlu analizler için ek göstergelerle nasıl çok sayıdan olabileceğini göstermek için ortak görüntüleme sunar. Bu protokol, (i) konfokal lazer tarama mikroskop ayarlarının nasıl optimize edilmesi, (ii) uyarılma için ilaçların nasıl uygulanacağı ve ardından diamid ve dithiothreitol ile sensör kalibrasyonunun nasıl uygulanacağı ve (iii) ImageJ/FIJI ile verilerin nasıl analiz edilmesi gerektiği hakkında ayrıntılı bir açıklama sağlar.

Introduction

Birkaç önemli mitokondriyal enzim ve sinyal molekülü tiol redoks regülasyonuna tabidir1. Ayrıca, mitokondri reaktif oksijen türlerinin önemli bir hücresel kaynağıdır ve oksidatif hasara karşı seçici olarak savunmasızdır2. Buna göre, mitokondriyal redoks potansiyeli biyoenergetikleri, hücre sinyallerini, mitokondriyal fonksiyonu ve nihayetinde hücre canlılığını doğrudan etkiler3,4. Mitokondriyal matris, redoks homeostazını korumak ve antioksidan savunmaları monte etmek için yüksek miktarlarda (1-15 mM) tiyol-disülfid redoks tampon glutatyon (GSH) içerir5,6. GSH, redoks durumlarını ve aktivitelerini kontrol etmek için hedef proteinlere (S-glutatyonilasyon) birlikte bağlanabilir ve oksitlenmiş proteinleri azaltan bir dizi detoksifiye edici enzim tarafından kullanılır. Bu nedenle, mitokondriyal glutatyon redoks potansiyeli, mitokondriyal fonksiyon ve patofizyoloji incelerken oldukça bilgilendirici bir parametredir.

roGFP2, yapay bir dithiol-disülfid çifti oluşturan yüzeye maruz kalan iki sisteinin eklenmesiyle redoks duyarlı hale getirilmiş bir GFP çeşididir7,8. ~510 nm'de tek bir emisyon zirvesine ve ~400 nm ve 490 nm'de iki heyecan zirvesine sahiptir. Daha da önemlisi, iki ekscitasyon zirvesinin bağıl genlikleri roGFP2'nin redoks durumuna bağlıdır (Şekil 1), bu proteini oranmetrik bir sensör haline getirir. Grx1-roGFP2 sensöründe, insan glutaredoxin-1 (Grx1) roGFP29,10'un N-terminusu ile kaynaşmıştır. Grx1 enziminin roGFP2'ye katan bağlanması sensörün iki önemli iyileştirmesini sağlar: sensör yanıtını GSH/GSSG glutatyon redoks çiftine özgü hale getirir (Şekil 1) ve GSSG ile roGFP2 arasındaki dengeyi en az 100.0009 kat hızlandırır. Bu nedenle, Grx1-roGFP2 hücresel glutatyon redoks potansiyelinin spesifik ve dinamik görüntülenmesini sağlar.

GRX1-roGFP2 görüntüleme, geniş alan floresan mikroskopları, dönen disk konfokal mikroskopları ve lazer tarama konfokal mikroskopları dahil olmak üzere çok çeşitli mikroskoplarda yapılabilir. Birincil nöronlarda sensörün ekspresyonu lipofeksiyon11, DNA/kalsiyum-fosfat koprecipitation12, virüs aracılı gen transferi veya transgenik hayvanların hücre kaynağı olarak kullanılması gibi çeşitli yöntemlerle elde edilebilir (Şekil 2). Bu makaledeki deneyler için 1:1 AAV1 oranı ve AAV2 kapsid proteinleri 13,14 içeren sözde rekombinant adeno ilişkili virüsler (rAAV) kullanılmıştır. Bu vektör ile maksimal sensör ekspresyonuna genellikle enfeksiyondan 4-5 gün sonra ulaşılır ve en az iki hafta stabil kalır. Grx1-roGFP2'yi fare ve sıçanlardan birincil hipokampal ve kortikal nöronlarda başarıyla kullandık.

Bu makalede, primer sıçan hipokampal ve kortikal nöronlarda mitokondri hedefli Grx1-roGFP2'nin rAAV aracılı ekspresyonu bazal mitokondriyal glutatyon redoks durumunu ve akut pertürbasyonunu değerlendirmek için kullanılır. (i) lazer tarama konfokal mikroskop ayarlarının nasıl optimizeılacağı, (ii) canlı görüntüleme deneyinin nasıl çalıştırılacağı ve (iii) FIJI ile verilerin nasıl analizılacağına ilişkin ayrıntılı talimatlar içeren konfokal canlı görüntüleme için bir protokol sağlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/AB Konsey Direktifi de dahil olmak üzere ulusal ve kurumsal yönergelere uygun olan ve tam İçişleri Bakanlığı etik onayına sahip olan tüm hayvan deneyleri (Heidelberg Üniversitesi Hayvan Refahı Ofisi ve Regierungspraesidium Karlsruhe, T14/21 ve T13/21 lisansları). Primer hipokampal ve kortikal nöronlar yenidoğan fare veya sıçan yavrularından standart prosedürlere göre hazırlandı ve daha önce tanımlandığı gibi 12-14 gün boyunca muhafaza edildi13.

1. Çözümlerin hazırlanması

  1. Görüntüleme tamponu için stok çözümleri
    1. Her stok çözeltisini Tablo 1'e göre hazırlayın ve 4 °C'de tutun. Uzun süreli depolama için (>3 ay), aliquots 'u -20 °C'de tutun.
Parça MW Konsantrasyon (M) Tutar (g) Birim (mL)
NaCl 58.44 5 14.61 50
Kartal 74.55 3 1.12 5
MgCl2· 6H2O 203.3 1.9 2 5
CaCl2·2H2O 147.01 1 1.47 10
Glisin 75.07 0.1 0.375 50
Sakaroz 342.3 1.5 25.67 50
Sodyum piruvat 110.04 0.1 0.55 50
HEPES 238.3 1 11.9 50
Glikoz 180.15 2.5 45 100

Tablo 1: Görüntüleme tamponu için stok çözümleri.

  1. İlaç ve boyaların stok çözümleri
    1. 0,5 M stok çözeltisi (örneğin, 11.615 mL su içinde 1 g) elde etmek için suda diamid (DA; maksimum 405:488 oranının kalibrasyonu için kullanılır) çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
    2. 1 M stok çözeltisi (örneğin, 32.425 mL su içinde 5 g) elde etmek için suda dithiothreitol (DTT; minimum 405:488 oranının kalibrasyonu için kullanılır) çözün. Aliquot ve -20 °C'de en fazla 3 ay saklayın.
    3. 10 mM stok çözeltisi (örneğin, 16.991 mL suda 25 mg) elde etmek için N-metil-D-aspartatını (NMDA; eksotoksisite ve mitokondriyal oksidasyona neden olmak için kullanılır) suda çözün. Aliquotları -20 °C'de saklayın. Uzun süreli depolama için (>6 ay), aliquotları -80 °C'de tutun.
    4. Tetrametrinhodamin etil ester perklorat (TMRE; mitokondriyal membran potansiyelinin küçük moleküllü bir göstergesi)
      1. 20 mM stok elde etmek için TMRE tozunu metanolde çözün (örneğin, 2.427 mL metanolde 25 mg).
      2. 20 μM stok elde etmek için 20 mM stoku 1:1.000 metanolde seyreltin.
      3. 20 mM ve 20 μM stok çözeltilerini aliquot, parafilm ile mühürleyin ve -20 °C'de ışıktan korunan depolayın.
        NOT: Her iki stok çözümü de birkaç yıldır istikrarlıdır. Deneyler için 1.000x stok çözeltisini (20 μM) kullanın.
  2. Görüntüleme arabelleği
    1. Tablo 2'den 80 mL'ye kadar tüm bileşenleri bir ölçüm silindirine ekleyerek 100 mL görüntüleme tamponu hazırlayın. Hacmi steril suyla 100 mL'ye kadar getirin. Çözelti homojen görünene kadar ölçüm silindirini dikkatlice sallayarak karıştırın.
      NOT: Tamponun omomolaritesini kontrol etmek için bir kilometre sayacı kullanılması önerilir. Hücrelerin büyüme ortamına mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Burada, bu 315 mOsmol / L. Görüntüleme tamponunun ve büyüme ortamının ozmolaritesine uyacak şekilde sakkaroz konsantrasyonunun gerektiği gibi arttırın veya azaltın.
    2. pH'ı 7,4'e ayarlayın. Aliquots yapın ve iki haftaya kadar 4 °C'de tutun. Uzun süreli depolama için aliquotları -20 °C'de tutun. Kullanmadan önce görüntüleme tamponu oda sıcaklığına ulaşsın.
Parça Stok çözümü (M) Son konsantrasyon (mM) Birim (mL)
NaCl 5 114 2.3
Kartal 3 5.29 0.176
MgCl2 1.9 1 0.053
CaCl2 1 2 0.2
Glisin 0.1 0.005 0.005
Sakaroz 1.5 52 3.5
Sodyum piruvat 0.1 0.5 0.5
HEPES 1 10 1
Glikoz 2.5 5 0.2

Tablo 2: Görüntüleme tamponunun bileşimi. Belirtilen birimler 100 mL görüntüleme tamponunun hazırlanması için kullanılır.

  1. Stimülasyon ve kalibrasyon çözümleri
    NOT: Deneyden hemen önce görüntüleme tamponu içine belirtilen ilaçların stok çözeltilerini ekleyerek her zaman taze stimülasyon çözümleri hazırlayın. Stimülasyon ve kalibrasyon çözümleri bir deney sırasında görüntüleme odasına ardışık olarak eklenecektir (bkz. bölümler 3-5). Deney türüne bağlı olarak, görüntüleme odasındaki ilgili son hacimde aynı uç konsantrasyona ulaşmak için farklı çözümler gereklidir.
    1. 6.937 mL görüntüleme tamponuna 10 mM NMDA stoğunun 63 μL'sini ekleyerek 3x NMDA çözeltisi (90 μM; haznede son konsantrasyon: 30 μM) hazırlayın. Elde eden çözeltinin 500 μL'lik kısmını odaya ekleyin (son hacim: 1,5 mL).
    2. 6.986 mL görüntüleme tamponuna 0,5 M DA stoğunun 14 μL'si ekleyerek 3 ve 4 adım (1 mM; haznedeki son konsantrasyon: 0,5 mM) için 2x DA çözeltisi hazırlayın. Hazneye 1 mL ekleyin (son hacim: 2 mL).
    3. 6.972 mL görüntüleme tamponuna 0,5 M DA stoğunun 28 μL'si ekleyerek 4x DA çözeltisini 5. Odaya 500 μL ekleyin (son hacim: 2 mL).
    4. 8955 μL görüntüleme tamponuna 45 μL 1 M DTT stok ekleyerek 1x DTT çözeltisi (5 mM; haznede son konsantrasyon: 5 mM) hazırlayın. Görüntüleme tamponu (son hacim: 1 mL) aspirasyondan sonra bu çözeltinin 1 mL'lik kısmını odaya ekleyin.

2. Hücrelerin TMRE ile yüklenmesi

NOT: Bu protokolde, TMRE söndürme olmayan mod15'te 20 nM'lik son konsantrasyonda kullanılır. Genel olarak, tercih ettiği mikroskopta hala yeterli sinyal yoğunluğu sağlayan mümkün olan en düşük TMRE konsantrasyonu kullanılmalıdır. Düzensiz buharlaşma nedeniyle, farklı kuyulardaki ortamın hacmi uzun vadeli birincil kültürlerde farklılık gösterebilir. Tüm kuyularda tutarlı bir TMRE konsantrasyonu sağlamak için TMRE'yi doğrudan kuyulara eklemeyin. Bunun yerine, her kuyudaki ortamı aynı miktarda TMRE içeren ortamla değiştirin. Aşağıdaki protokol, kuyu başına ~1 mL orta içeren 24 kuyulu plakalardaki birincil nöronlar için tasarlanmıştır.

  1. Bir doku kültürü laminar akış davlumbazında çalışarak, her kuyudan tek bir konik tüpe 500 μL orta toplayın.
  2. Kuyu başına, konik boruya 0,5 μL 20 μM TMRE stoğu ekleyin (örneğin, 24 kuyu için 12 μL).
  3. Kalan ortamı ilk kuyudan dikkatlice emiş ve 500 μL TMRE içeren ortamla değiştirin. Kalan kuyularla devam edin.
    NOT: Hücrelerin kurumasına ve hücreleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
  4. Hücreleri inkübatöre geri verin ve boya denge için en az 60 dakika bekleyin.
    NOT: Yükleme süresi olumsuz etkileri olmadan birkaç saate kadar uzatılabilir.
  5. Görüntüleme deneyi boyunca tutarlı TMRE konsantrasyonları ve denge sağlamak için, görüntüleme tamponuna ve tüm stimülasyon çözeltilerine 20 nM TMRE'lik son bir konsantrasyon eklenin.

3. Tarama konfokal mikroskop ayarlarının optimizasyonu

NOT: Bu adım, canlı görüntüleme sırasında görüntü kalitesi ve hücre canlılığı arasında en iyi uzlaşmayı bulmayı amaçlamaktadır. Bu bölümde roGFP görüntüleme ayarlarının en iyi duruma getirilmesi açıklanmaktadır. Çokparametrik görüntüleme yapılırsa, ek göstergeler için ağartma veya fototoksiklik belirtisi olmadan kararlı bir taban çizgisi kontrolü de dahil olmak üzere benzer optimizasyonun yapılması gerekir.

  1. Konfokal mikroskobu başlatın ve GFP görüntüleme için standart ayarları yükleyin (488 nm heyecan, 505 - 550 nm emisyon).
  2. Dedektörü 12 bit veya 16 bit olarak ayarlayın.
    NOT: Genellikle nicel görüntüleme için 8 bit yeterli değildir.
  3. Sıralı tarama modunu etkinleştirin ve ikinci sırayı / parçayı ekleyin (405 nm heyecan, 505 - 550 nm emisyon).
  4. Her iki kanal için de aşırı ve az maruz kalan pikselleri (örneğin GLOW OU) gösteren bir sahte renk arama tablosu seçin.
  5. İlgi çekici nesneye uygun bir hedef seçin.
    NOT: 10x-40x tek hücreli analiz için, 63x-100x tek mitokondrion analizi için uygundur.
  6. Görüntüleme odasına hücrelerle bir kapak kapağı takın, 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskop üzerine yerleştirin.
  7. Hücreleri odaklamak için göz merceği ve iletilen ışığı kullanın.
    NOT: Hücreleri bulmak ve odaklamak için epifluoresans ışığı kullanmayın. Düşük güçte bile, bu hücreleri olumsuz yönde etkileyecektir.
  8. Görüntüleri farklı piksel formatlarıyla kaydedin. Bu görüntülere dayanarak, ilgi çekici yapının kabul edilebilir bir çözünürlüğünü veren en düşük piksel numarasını seçin.
    NOT: Genellikle, 512 x 512 piksel 20x ve 40x hedefleri olan tek hücreli görüntüleme için iyi çalışır ve 1024 x 1024 veya 2048 x2048 pikselleri genellikle 63x hedefli tek mitokondrion görüntüleme için iyi çalışır.
  9. Farklı iğne deliği boyutlarıyla görüntüleri kaydedin. Bu görüntülere dayanarak, ilgi çekici yapının kabul edilebilir bir çözünürlüğünü veren en büyük iğne deliği boyutunu seçin.
    NOT: Tipik olarak, 3-7 havadar ünite iyi çalışır.
  10. Farklı lazer yoğunluklarıyla görüntüleri kaydedin.
    1. Dedektör kazancını ve eşiğini buna göre ayarlayın. Bu görüntülere dayanarak, kabul edilebilir sinyal yoğunluğu ve sinyal-arka plan oranı sağlayan en düşük lazer yoğunluğunu seçin.
      1. Sinyal-arka plan oranını belirlemek için, hücre veya mitokondri (ROI1) içeren ilgi çekici bir bölgedeki (ROI) ve hücreleri veya mitokondrilerin (ROI2) olmadığı bir yatırım getirisinde sinyal yoğunluğunu ölçün. Ardından, ROI1'in yoğunluğunu ROI2'nin yoğunluğuna bölün.
        NOT: > %1-3 lazer gücü ile 405 nm heyecan için 200-1.000 200-1.000 bireysel 100-1.000 1 ve 300-1.500 bireysel RBI'lerin yoğunlukları için 488 nm'lik bir sinyal-arka plan oranı ve %1 lazer gücü ile 488 nm'lik bir ekscitasyon hedefleyin.
  11. Görüntüleri farklı tarama hızları ve kare ortalamalarının sayısıyla kaydedin. Ayarların her birleşimi için 4-5 görüntü kaydedin. Bu görüntü serilerine bağlı olarak, kabul edilebilir görüntü paraziti ve görüntüden görüntüye değişkenlik sağlayan en yüksek hızı ve en düşük ortalama ayarları seçin.
    NOT: Ortalama için 600 Hz ve 1-2 kare tarama hızı çoğu durumda iyi çalışır.
  12. Yeni bir kapak kılıfı kullanarak, optimize edilmiş ayarlarla bir zaman atlamalı seri kaydedin.
    NOT: Serinin süresi ve görüntü aralığı planlanan deneylere benzemelidir.
  13. Hızlandırılmış serinin sonunda, kayıt odasına 1 mL 2x DA çözeltisi ekleyin. Ek 2 dakika için görüntü.
  14. Görüntüleme tamponu peristaltik bir pompa veya el pipeti kullanarak epire edin. 1 mL 1x DTT çözümü ekleyin. Ek 5 dakika için görüntü.
  15. Zaman atlamalı denemeyi analiz edin (bkz. bölüm 5).
    1. Optimize edilmiş ayarlarla DA ve DTT tedavisi sırasında iki kanaldan hiçbirinin aşırı veya az maruz kalmadığını doğrulayın.
    2. Zaman atlamalı kayıt sırasında iki kanaldan hiçbirinin önemli ölçüde ağartma olmadığından emin olun; ilk ve son görüntüler arasında %<2 yoğunluk kaybı hedeflenmektedir.
    3. Görüntüleme sırasında 405:488 oranının önemli ölçüde değişmediğini doğrulayın.
  16. Sürekli olarak kabul edilebilir sonuçlar sağlayan ayarlar tanımlanana kadar, birkaç kapak kılıfı kullanarak tüm yordamı yinelemeli bir şekilde tekrarlayın.

4. Bazal redoks durumunun değerlendirilmesi

  1. Mikroskobu başlatın ve optimize edilmiş ayarları bölüm 3'ten yükleyin.
  2. Çerçeve ortalamasını 3-5 olarak ayarlayın.
  3. Görüntüleme odasına hücrelerle bir kapak kapağı takın, 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskop üzerine yerleştirin.
  4. Hücreleri odaklamak için göz merceği ve iletilen ışığı kullanın.
    NOT: Hücreleri bulmak ve odaklamak için epifluoresans ışığı kullanmayın. Düşük güçte bile, bu hücreleri olumsuz yönde etkileyecektir.
  5. Tarama moduna geçin ve görüntüleme için hücreleri odaklamak ve bulmak için canlı görünümde 488 nm kanalını kullanın.
  6. Kapak arasında 3-5 görüş alanı seçmek için çok noktalı işlevi kullanın.
  7. Temel görüntü kaydedin.
  8. Odaya 1 mL 2x DA çözeltisi ekleyin.
  9. 1, 2 ve 3 dakika sonra, odağı onaylamak /ayarlamak ve ardından bir görüntü kaydetmek için canlı görünümü kullanın.
    NOT: Hücreler genellikle 2 dakika sonra tamamen oksitlenir.
  10. Görüntüleme odasındaki tamponu 1 mL 1x DTT çözelti ile değiştirin.
  11. 3 ve 5 dakika sonra, odağı onaylamak / ayarlamak ve ardından bir görüntü kaydetmek için canlı görünümü kullanın.
    NOT: Hücreler genellikle 4-5 dakika sonra tamamen azalır.

5. Akut tedavilerin canlı görüntülenmesi

NOT: Aşağıdaki protokolde NMDA tedavisine mitokondriyal redoks yanıtının görüntülenmesi açıklanmaktadır. Diğer tedaviler için görüntü aralıklarının ve deneme süresinin ayarlanması gerekebilir.

  1. Mikroskobu başlatın ve optimize edilmiş ayarları bölüm 3'ten yükleyin.
  2. Zaman atlama aralığını 30 s'ye ve süreyi 25 dakikaya ayarlayın.
  3. Görüntüleme odasına hücrelerle bir kapak kapağı takın, 1 mL görüntüleme tamponu ekleyin ve odayı mikroskop üzerine yerleştirin.
    NOT: Termal odak sürüklenmesini önlemek için, zaman atlamalı görüntülemeye başlamadan önce hücreleri mikroskop aşamasında 10-15 dakika bekletin.
  4. Hücreleri odaklamak için göz merceği ve iletilen ışığı kullanın.
    NOT: Hücreleri bulmak ve odaklamak için epifluoresans ışığı kullanmayın. Düşük güçte bile, bu hücreleri olumsuz yönde etkileyecektir.
  5. Tarama moduna geçin ve görüntüleme için hücreleri odaklamak ve bulmak için canlı görünümde 488 nm kanalını kullanın.
  6. İsteğe bağlı: Çalışma başına kaydedilen hücre sayısını artırmak için, kapak altlığı başına 2-3 görüş alanını görüntülemek için çok noktalı işlevi kullanın.
  7. Zaman atlamalı alıma başlayın ve 5 görüntü 2 dakikalık temel kayıt olarak kaydedin.
  8. Odaya 500 μL 3x NMDA çözeltisi ekleyin (son konsantrasyon 30 μM) ve 10 dakikalık NMDA yanıtı olarak ek 20 görüntü kaydedin.
    NOT: Nöronlar ozmolaritedeki değişikliklere karşı çok hassastır. Bu nedenle, görüntüleme arabelleği buharlaşmasını en aza indirdiğinizi unutmayın. Daha uzun tedaviler için görüntüleme odası bir kapakla kaplanmalıdır.
  9. Hazneye 500 μL 4x DA çözeltisi ekleyin ve 6 görüntü daha kaydedin (3 dakika maksimum kalibrasyon).
  10. Tamponu görüntüleme odasından epire edin ve 1 mL 1x DTT çözelti ile değiştirin. 10 görüntü daha kaydedin (5 dakika minimum kalibrasyon).
  11. Kaydı sonlandırın ve görüntü serisini kaydedin.

6. Veri analizi

  1. FIJI'de veri alma ve görüntü ön işleme
    1. 4. adımdan bir görüntü grubunu veya 5. Eklentiler | tıklayın Biyo-Formatlar | Biyo-Format İthalatçısı. iletişim kutusunda Yığını görüntüle'yi kullanın: Hyperstack, Renk modunu ayarla: varsayılan, Otomatik Ölçeklendir'i seçin ve ayrı pencerelere bölmeyin.
      NOT: Otomatik ölçeklendirme , verilerin bilgisayar ekranında görüntülenmesini en iyi duruma getirmektedir. Piksel yoğunluklarını değiştirmez.
    2. 4. adımdaki tek tek görüntüler açıldıysa, Resim | Yığınlar | Araçlar | Bunları tek bir görüntü yığınında birleştirmek için birleştirin.
    3. Görüntü serisi sırasında XY-drift varsa, Eklentiler | Görüntüleri kaydetmek için StackReg . iletişim kutusunda Sert Gövde veya Çeviri'yi seçin.
    4. Resim | tıklayarak görüntü biçimini 32 bit olarak değiştirme | yazın 32-bit.
    5. Görüntü |'na tıklayarak renk kanallarını ayrı pencerelere bölme Renk | Kanalları Böl.
    6. Kanal 1'i (405 nm) seçin ve Görüntü | tıklayarak analiz için mitokondriyi seçmek için eşiği ayarlayın | ayarlama Eşik. iletişim kutusunda Varsayılan, Kırmızı, Koyu arka plan ve Yığın histogramı'nı seçin ve seçili piksellerin kırmızı görünmesini bekleyin. Uygula'yı tıklatın. Arka Plan Piksellerini NaN Olarak Ayarla'yı seçin ve Tüm görüntüleri işleyin.
      NOT: Olası gözlemci önyargısını önlemek için otomatik eşik belirleme kullanılmalıdır. FIJI, eşik iletişim kutusundaki bir açılır menüden seçilebilen çeşitli otomatik yöntemler (Varsayılan, Huang, Intermodes, Otsu gibi) sunar. Genellikle, Default yöntemi iyi bir sonuç verir. Verilen görüntü kümesi için en iyi eşik yöntemini bulmak için ilk analiz sırasında birkaç yöntemi karşılaştırmanız önerilir. Bir yöntem seçildikten sonra, tüm görüntülere uygulanması gerekir.
    7. Kanal 2 (488 nm) için 6.1.6 adımlarını yineleyin.
    8. İşlem | tıklayarak 405:488 nm oranını görselleştirmek için bir oran görüntüsü oluşturun Görüntü hesaplayıcısı. İletişim kutusunda Görüntü 1: kanal 1, İşlem: Bölme, Görüntü 2: kanal 2, Yeni pencere oluştur, Tüm görüntüleri işle'yi seçin.
    9. Oran görüntüsünün arama tablosunu sahte renkle değiştirin. Örneğin, Ateş olarak değiştirmek için Resim | Arama Tabloları | Ateş, ateş.
  2. Görüntü analizi
    1. Oran görüntüsünde, ROI'leri tek tek hücrelerin veya mitokondrilerin etrafına çizin. Her yatırım getirisini çizdikten sonra yatırım getirisi yöneticisine ekleyin. | Çözümle Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi | Ekle. (klavye kısayol: 'T') Tümlerini Göster'i seçin.
      NOT: Arka plan pikselleri 6.1.6 ve 6.1.7 adımlarında 'sayı değil' (NaN) olarak ayarlandığı için ölçüm sonucunu etkilemez. Bu nedenle, yatırım getirisine bazı arka plan pikselleri dahil etmek kabul edilebilir.
    2. Tüm ROI'leri seçmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi | ctrl+A tuşlarına tıklayarak tek tek hücrelerin 405:488 oranlarını ölçün| Daha fazla | Çok Ölçülü. iletişim kutusunda Tüm dilimleri ölç ve Dilim başına bir satır'ı seçin.
    3. Ölçümleri elektronik tablo yazılımına dışa aktarın.
    4. 405 nm görüntüyü seçin. Adım 6.2.2'de olduğu gibi tüm ROI'lerin yoğunluklarını ölçün. yatırım getirisi yöneticisinde depolanan ROI'leri kullanarak.
    5. Ölçümleri elektronik tablo yazılımına dışa aktarın.
    6. 488 nm görüntüyü seçin. Adım 6.2.2'de olduğu gibi tüm ROI'lerin yoğunluklarını ölçün. yatırım getirisi yöneticisinde depolanan ROI'leri kullanarak.
    7. Ölçümleri elektronik tablo yazılımına dışa aktarın.
    8. Tüm ROI'leri seçmek için YATıRıM Getirisi Yöneticisi | ctrl+A tuşlarına tıklayarak ROI'leri ileride başvurmak üzere kaydedin| Daha fazla | Kaydet.
    9. Önerilen: 405 ve 488 nm izlemelerinin zaman çizi çizilerine göre yoğunluk oluşturun. Her iki kanalda da belirgin bir ağartma olmadığını doğrulayın (görüntüleme serisinin sonundaki sinyal yoğunluğu ≥1 ilk görüntünün % 98'i olmalıdır) ve sensör yanıtları sırasında iki izin zıt yönlere doğru hareket ettiğini doğrulayın (örneğin, 488 nm iz azalırken oksidasyon sırasında 405 nm iz artmalıdır).
  3. Veri normalleştirme
    1. Oran görüntüsünden her yatırım getirisi için, DA tedavisi (Rmax) sırasında maksimum değeri ve DTT tedavisi (Rmin) sırasında minimum değeri belirleyin.
    2. Normalleştirilmiş oranı aşağıdaki gibi hesaplayın:
      Equation 1
      NOT: Bu, maksimum oranı 1,0'a ve minimum oranı 0 olarak ayarlar.
  4. Mitokondriyal morfolojinin analizi
    1. 6.2.6 adımındaki roGFP yoğunluklarına paralel olarak mitokondriyal morfoloji ölçümleri elde etmek için Analiz | Ölçümleri ayarlayın ve Şekil tanımlayıcılarını ve Elips sığdır'ı kontrol edin.
      NOT: Ortalama yoğunluğa ek olarak, sonuçlar penceresindeki ölçümler ana eksenin uzunluğunu (Majör), küçük eksenin uzunluğunu (Minör), en boy oranını (AR; küçük eksene bölünmüş ana ekseni; yuvarlak mitokondri bir AR ~1'e, uzun mitokondriler daha büyük bir AR'ye sahiptir) ve dairesellik (Circ.) ve yuvarlaklık (Yuvarlak) ölçümlerini içerecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Büyüme faktörü geri çekilmesinden sonra sabit durum mitokondriyal redoks durumundaki farklılıkların ölçülmesi
Mitokondriyal redoks durumundaki sabit durum farklılıklarının nicelliğini göstermek için, standart ortamda yetişen primer nöronlar, görüntülemeden önce 48 saat boyunca büyüme faktörü olmadan kültürlenen nöronlarla karşılaştırıldı. Büyüme faktörü çekilmesi 72 h16'dan sonra apoptotik nöronal hücre ölümü ile sonuçlanır. Hücreler, mitokondriyal redoks durumundaki değişikliklerden önce olup olmadığını test etmek için 48 saat sonra görüntülenmiştir. Poli-L-ornitin kaplı kapaklarda yetişen primer sıçan kortikal nöronları , in vitro 6 (DIV6) günlerinde rAAV-mito-Grx1-roGFP2 ile enfekte edildi ve DIV12'de resmedildi. 40x/1.10 su daldırma hedefi ile donatılmış ters lazer tarama konfokal mikroskop üzerinde bu protokolün bölüm 4'üne göre oda sıcaklığında canlı görüntüleme yapıldı. Konfokal ayarlar pinhole 7 havadar üniteler, piksel boyutu 568.7 nm (512 x 512 piksel), tarama hızı 600 Hz, lazer gücü 405 nm 3%, lazer gücü 488 nm 1%, emisyon bant genişliği 505-550 nm ve çerçeve ortalaması 4 idi. İki koşulun ham 405:488 nm oranları arasında büyük bir fark yoktu (Şekil 3B). Veri normalleştirmeden sonra büyüme faktörü geri çekilme grubunda 405:488 nm oranı artmış bir hücre alt kümesi tespit edildi (Şekil 3C). Bu, mitokondriyal redoks değişikliklerinin nöronal hücre ölümünden önce gelebileceğini gösterir ve bazal redoks durumlarının gruplar arasında karşılaştırılması için maksimum/dk veri normalleştirmesinin ilgisinin altını çizer.

NMDA ile nöronların tedavisi üzerine mitokondriyal redoks durumunda dinamik değişiklikler
NMDA tipi glutamat reseptörü (NMDAR) nöronal plastisitede merkezi bir rol oynar, ancak nöronal hasara ve hücre ölümüne de aracılık edebilir. NMDAR'ın patolojik aktivasyonu mitokondriler üzerinde matris kalsiyum aşırı yüklemesi, mitokondriyal oksidasyon ve parçalanma ve mitokondriyal geçirgenlik geçişi gibi çeşitli olumsuz etkilere yol açar. Daha önceki bir çalışmada, yukarıda açıklanan protokol, NMDA kaynaklı mitokondriyal kalsiyum aşırı yüklemesi ile mitokondriyal oksidasyon13 arasındaki nedensel ilişkiyi araştırmak için kullanılmıştır. Poli-D-lizin/laminin kaplı kapaklarda yetişen primer sıçan hipokampal nöronlar DIV4'te rAAV-mito-Grx1-roGFP2 ile enfekte edildi ve DIV12'de görüntülendi. Canlı görüntüleme 37 °C'de 20x/0.75 çoklu daldırma hedefi (suya daldırma kullanıldı) ve sahnede inkübasyon sistemi ile donatılmış ters dönen disk konfokal mikroskop üzerinde gerçekleştirildi. Mito-Grx1-roGFP2, 405 nm ve 488 nm lazer hatlarını kullanarak her 20 sn'de sırayla heyecanlandı ve emisyon, her iki eksitasyon dalga boyu için 527/55 nm emisyon filtresi ile toplandı. Nöronların 30 μM NMDA ile tedavisi birkaç dakika içinde mitokondrilerin oksidasyonuna neden oldu (Şekil 4A,B). Özellikle, NMDA kaynaklı mitokondriyal asidoz, iyi bilinen pH duyarlılığına paralel olarak roGFP2 floresanının önemli ölçüde söndürülmesine neden oldu8. Bu pH'a bağımlı söndürmenin 405:488 oranını etkilemediğini doğrulamak için, mitokondriler bir kontrol deneyine NMDA eklenmeden önce DA tarafından tamamen oksitlendi. DA ile ön işlem, mitokondrilerin NMDA tarafından daha fazla oksidasyonunu önler ve buna bağlı olarak, roGFP2 floresan yoğunluğunun önemli ölçüde söndürülmesine rağmen bu deneyde 405:488 oranı değişmedi (Şekil 4C).

Dendritik mitokondrilerin NMDA kaynaklı değişikliklerinin multiparametrik analizi
Mitokondriyal morfoloji, membran potansiyeli ve redoks durumunda NMDA kaynaklı değişikliklerin zamansal dizisini değerlendirmek için, TMRE ve mito-Grx1-roGFP2 floresan paralel görüntülemesi yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte gerçekleştirildi. Poli-L-ornitin kaplı coverliplerde yetişen primer sıçan kortikal nöronları DIV6'da rAAV-mito-Grx1-roGFP2 ile enfekte edildi ve DIV12'de resmedildi. Oda sıcaklığında 63x/1.40 yağ daldırma hedefi, 600 Hz tarama hızı, 90.2 nm piksel boyutu (2x tarama yakınlaştırmada 1024 x 1024 piksel), 3 havadar birim pinhole boyutu ve ortalama 2 kare kullanılarak ters konfokal lazer tarama mikroskobu üzerinde canlı görüntüleme gerçekleştirildi. Her 30 sn, üç görüntü sıralı modda kaydedildi: 405 nm heyecan/505-550 nm emisyon; 488 nm ekscitasyon/505-550 nm emisyon; 552 nm ekscitasyon/560-600 nm emisyon. Nöronların 60 μM NMDA ile tedavisi TMRE sinyalinin kaybına ve 405:488 nm roGFP oranında bir artışa ve ardından mitokondrilerin bazı gecikmeli yuvarlanmasına neden oldu (Şekil 5).

Figure 1
Şekil 1: Grx1-roGFP2 fonksiyonunun şematik gösterimi ve roGFP2 eksitasyon spektrumu. (A) Oksidatif stres ve antioksidan savunma sistemlerinin etkisi hücresel glutatyon havuzunu oksitler. Grx1-roGPF2 füzyon proteinindeki GRX1, glutatyon havuzunun redoks durumu ile roGFP2 redoks durumunun hızlı dengelenmesini teşvik eder. RoGFP2 havuzunun redoks durumu, 405 nm ve 488 nm'de heyecandan sonra 510 nm'de GFP-floresan emisyon oranını izleyerek değerlendirilebilir. Azaltılmış türler mavi renkte gösterilir; oksitlenmiş türler kırmızı renkte gösterilir. (B) Tamamen azaltılmış (mavi) ve oksitlenmiş (kırmızı) roGFP2'nin heyecan spektrumları. RoGFP2'nin oksidasyonu üzerine, 400 nm'lik ekscitasyonda floresan emisyonu artarken, 490 nm'lik ekscitasyonda emisyon azalır. Bu rakam önceki bir yayından değiştirilmiştir13. B'deki uyarlama spektrumları Şekil 1B'ye göre 8'den çizilmiştir. B'deki noktalı çizgiler, yaygın olarak kullanılan 405 nm ve 488 nm lazer çizgilerinin dalga boylarını gösterir. Kısaltmalar: GSH = glutatyon; GSSG = oksitlenmiş glutatyon; Grx = glutaredoxin; roGFP = redoksa duyarlı yeşil floresan protein varyantı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Yöntemin iş akışı. Nöronlarda eksitasyon-oranmetrik redoks duyarlı floresan protein roGFP2 ekspresyonu transfeksiyon, lipoteksiyon, viral gen transferi ve transgenik hayvanlar gibi çeşitli yöntemlerle elde edilebilir. Sensör, kültürlü birincil nöronlarda, eks vivo doku eksplantlarında ve bozulmamış hayvanlarda nöronal redoks durumunu incelemek için kullanılabilir. roGFP2 görüntüleme, geniş alan floresan mikroskoplar, konfokal mikroskoplar ve 2 foton mikroskoplar içeren çeşitli mikroskoplarda yapılabilir. RoGFP2 görüntüleme verilerinin analizi, serbestçe kullanılabilen ImageJ/FIJI yazılımı ile gerçekleştirilebilir. Kısaltma: roGFP = redoksa duyarlı yeşil floresan protein varyantı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Büyüme faktörü çekilmesi nöronal mitokondrilerin oksidasyonuna neden olur. (A) Temsilci 405:488 Görüntülemeden önce büyüme faktörlerinin varlığında (+ GF) veya yokluğunda (- GF) kültürlenmiş nöronların nm oran görüntüleri. Renk kodlu ölçekler normalleştirilmemiş 405:488 nm oranlarını temsil eder (düşük oranlar azaltılmış bir duruma karşılık gelir; daha yüksek oranlar oksitlenmiş bir duruma karşılık gelir). Ölçek çubukları = 50 μm. (B) Bireysel nöronlarda 405:488 nm oranının nicelemesi. (C) Bireysel nöronların maksimum/dk kalibre edilmiş 405:488 nm oranı. Yuvarlak semboller tek hücreleri temsil eder; bar ortalamayı temsil eder. N = Bir preparattan 3 kapak kılıfından 40-44 hücre. Kısaltma: GF = büyüme faktörü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Nöronal mitokondrilerin NMDA kaynaklı oksidasyonu. (A) Temsilci 405:488 nm oranlı görüntüler tedaviden önce ve sonra 30 μM NMDA ve DA ve DTT ile maks/dk kalibrasyondan sonra. Bu büyütmede, roGFP sinyali çoğunlukla soma ve proksimal dendritlerde tespit edilir. Renk kodlu ölçek normalleştirilmemiş 405:488 nm oranlarını temsil eder (düşük oranlar azaltılmış bir duruma karşılık gelir; daha yüksek oranlar oksitlenmiş bir duruma karşılık gelir). Ölçek çubukları = 50 μm. (B) A'da gösterilen görüntüleme çalışmasının nicelemesi. NMDA, DA ve DTT kullanılarak kalibre edilebilen hızlı ve sürekli bir mitokondriyal oksidasyona neden olur. (C) NMDA kaynaklı mitokondriyal asidoz, hem 405 nm hem de 488 nm uyarılmada (üst panel) GFP floresanının düşmesine neden olur. pH güdümlü etkiyi izole etmek ve 405:488 nm oranının pH-duyarsız olduğunu doğrulamak için, nöronlar önce DA kullanılarak maksimum oksitlendi ve daha sonra DA (alt panel) varlığında NMDA ile meydan okundu. Bu koşullar altında, NMDA hala mitokondriyal asidoza neden olur, ancak daha fazla mitokondriyal oksidasyona neden olmaz. Buna göre, hem 405 nm hem de 488 nm iz floresan yoğunluğunda pH odaklı bir düşüş gösterse de, 405:488 nm oranı sabit kalır. Bu rakam 13'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; roGFP = redoksa duyarlı yeşil floresan protein varyantı; NMDA = N-metil-D-aspartat; DA = diamid; DTT = dithiothreitol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Membran potansiyelinde NMDA kaynaklı değişiklikler, redoks durumu ve dendritik mitokondri morfolojisi. (A) T = 1, 4 ve 9 dk'da elde edilen ve dendritik ve aksonal mitokondri gösteren bir zaman atlamalı deneyden üç yüksek büyütme görüntüsü. Renklendirme TMRE yoğunluğunu temsil eder (bkz. kalibrasyon çubuğu). (B) 405:488 nm roGFP oranı görüntüleri t = 1, 4 ve 9 dk'da (A) ile aynı zaman atlamalı deneyden. Sınırlı AAV enfeksiyon verimliliği nedeniyle, sadece bir nöron alt kümesinin mito-Grx1-roGFP2'yi ifade ettiğini ve bu nedenle tüm TMRE pozitif mitokondrilerin roGFP pozitif olmadığını unutmayın. Renk kodlu kalibrasyon çubuğu normalleştirilmemiş 405:488 nm oranlarını temsil eder (düşük oranlar azaltılmış bir duruma karşılık gelir; daha yüksek oranlar oksitlenmiş bir duruma karşılık gelir). (C) TMRE yoğunluğunun nicelleştirilmesi, roGFP 405:488 nm oranı ve tek bir mitokondryonun yuvarlaklığı (A, B'de oklarla gösterilir). 1 dakikalık temel kayıt yapıldıktan sonra banyo çözeltisine 60 μM NMDA eklendi. Ölçek çubukları = 5 μm. C'deki y ekseni, temel T0'a (yeşil kesikli çizgi), TMRE floresan yoğunluğunu temel T0'a (kırmızı noktalı çizgi) göre 405:488 nm roGFP oranını ve FIJI/ImageJ şekil tanımlayıcısı "yuvarlaklığı" (siyah düz çizgi) gösterir. Kısaltmalar: GFP = roGFP = redoksa duyarlı yeşil floresan protein varyantı; mito-Grx1-roGFP2 = Glutaredoxin-1 roGFP'nin N-terminus'una kaynaşmış; AAV = adeno ilişkili virüs; TMRE = tetrametilrhodamin, etil ester; NMDA = N-metil-D-aspartat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mitokondriyal redoks durumunun nicel ve dinamik ölçümleri mitokondriyal ve hücresel fizyoloji hakkında önemli bilgiler sağlar. Reaktif oksijen türlerini, "redoks stres" veya "oksidatif stresi" tespit eden çeşitli florojenik kimyasal problar mevcuttur. Bununla birlikte, ikinci terimler iyi tanımlanmamıştır ve genellikle özgüllüklerden yoksundur9,17,18. Kimyasal boyalarla karşılaştırıldığında, Grx1-roGFP2 çeşitli avantajlar sunar9,19: (i) bir heyecan-oranmetrik sensör olarak, sensör ifade seviyesi, mutlak floresan yoğunluğu ve hücre veya organel yoğunluğu için doğal normalleşme sağlar; (ii) genetik olarak kodlanmış bir prob olarak, organellere veya presynaptik terminaller veya postsinaptik dendritik dikenler gibi belirli hücre altı bölmelere hedeflenebilir; (iii) sensörün genetik ifadesi, kimyasal boyalar durumunda birincil nöronlar için stresli olabilen boya yükleme ihtiyacını ortadan yaratır; (iv) genel redoksa duyarlı kimyasal boyaların aksine, Grx1-roGFP2 glutatyon redoks potansiyeli için son derece spesifiktir; (v) sensörün oksidasyonu ve azaltılması, geçici redoks değişikliklerinin ölçülmesini sağlayan geri dönüşümlüdür; (vi) yalnızca göreli değişikliklerin algılanmasını sağlayan kimyasal boyaların aksine, Grx1-roGPF2 floresan oranları mV9'daki mutlak redoks potansiyellerini belirlemek için kalibre edilebilir.

Bu protokol, primer nöronlarda mitokondriyal glutatyon redoks potansiyelinin dinamik ölçümlerini açıklar. Sağlam hücreler içinde mitokondri analizinin çeşitli avantajları vardır15. İzole mitokondri çalışması ile karşılaştırıldığında, hücrelerdeki mitokondriler fizyolojik olarak diğer organellerle (örneğin, endoplazmik reticulum-mitokondri temasları, mitokondri-lizozom temasları) temas eder ve sinyal moleküllerinin ve metabolitlerin hücresel konsantrasyonlarına maruz kalır. Sağlam hayvanların çalışması ile karşılaştırıldığında, birincil nöronlar genetik ve farmakolojik manipülasyonlar ve mikroskopi için daha iyi erişilebilirlik sağlar. Bununla birlikte, bazı sorular için, izole mitokondrilerin analizi daha uygun olacaktır, çünkü bu, teslim edilen substratlar ve inhibitörler üzerinde hassas kontrol sağlar. Özellikle, mito-Grx1-roGFP2 izole mitokondri20'de de kullanılabilir. Bozulmamış dokular veya hayvanlar içindeki nöronal mitokondrileri incelemek için, sinir sisteminde mito-Grx1-roGFP2'yi ifade eden transgenik sinek ve fare çizgileri mevcuttur21,22,23. Özellikle, roGFP2'nin heyecan spektrumu, sırasıyla 23,24 doku eksplantlarında ve bozulmamış hayvanlarda ex vivo ve in vivo iki foton görüntülemeyi sağlayan iki fotonlu ekscitasyona açıktır. Sarı rxYFP-Grx1p25 ve kırmızı Grx1-roCherry26 gibi tiyol redoks duyarlı floresan proteinlerin spektral varyantları da mevcuttur. Bunlar çoklama için ek esneklik sağlar ve prensip olarak farklı hücre tiplerinde veya hücresel bölmelerde redoks yanıtlarının aynı anda ölçülemesini sağlar.

Protokolde açıklandığı gibi, 405:488 nm oranı, SıRASıYLA DA ve DTT uygulamasından sonra maksimum ve minimum floresan oranları ölçülerek kalibre edilebilir. Bu normalleşme gerekli değildir, çünkü sensör oranmetrik doğası nedeniyle belirli bir dereceye kadar doğal bir normalleşme sağlar. Ancak, her görüntüleme çalışmasından sonra, çoğunlukla iki nedenden dolayı maksimum /dk kalibrasyon yapmanızı öneririz. İlk olarak, sensör yanıtlarının deney sırasında doygun olmamasını sağlar. İkincisi, mutlak 405:488 nm oranı, her iki kanalın mikroskop ayarlarına bağlı olan rastgele bir sayıdır. Aynı ayarları korurken bile, lazer gücü ve dedektör performansının deneyler arasında aynı kalacağından emin olunamaz, özellikle de bunlar birkaç hafta arayla olduğunda. Geçici çözümlerden biri, her denemede denetim hücrelerinin ortalama taban çizgisi oranını 1,0 olarak ayarlamak olacaktır. Bu, belirli bir deneyde tedaviye bağlı redoks pertürbasyonlarının göreceli olarak ölçülmesine izin verir, ancak farklı deneylerin karşılaştırılmasını sınırlar. Özellikle farklı deneylerden veya hücre tiplerinden hücrelerin bazal redoks durumu karşılaştırılırken, maksimum/dk kalibre edilmiş mutlak nicelik elde etmek önemlidir. Bazen, 405:488 nm oranı DTT tedavisinden sonra taban çizgisi oranının altına düşmez, özellikle mitokondri zaten taban çizgisine göre nispeten azaltılmış bir durumdaysa. Bu genellikle uzun süreli zaman atlamalı deneyler sırasında sensör ağartma işaretidir. Bu durumda, daha az ışığa maruz kalmasına neden olan mikroskop ayarlarıyla denemeyi tekrarlayın.

Sensörün ağartmaya veya mitokondrilerin fototoksikite kaynaklı oksidasyonuna neden olmayan mikroskop ayarlarını kullanmak çok önemlidir. Gerçek denemelere başlamadan önce protokol iyileştirmesi için yeterli zaman ayırıp kullanmazken emin olun. Kabul edilebilir ayarlar tanımlandıktan sonra, sonraki denemelerde minimum ayarlamalarla kullanılabilirler. mito-Grx1-roGFP2 görüntüleme oda sıcaklığında veya ısıtmalı bir sahnede 35-37 °C'de yapılabilir. Sensör her iki durumda da çalışacaktır; bununla birlikte, hücrelerin içindeki sinyal basamaklarının ve enzim reaksiyonlarının kinetiği doğal olarak sıcaklığa göre farklılık gösterecektir. Bu nedenle, sensör yanıtlarının kinetiği ve genlikleri seçilen sıcaklığa bağlı olarak değişebilir. Sıcaklık seçimi, deneyin özel ihtiyaçlarına bağlı olarak kullanıcıya bağlıdır.

Son olarak, sensörün iki sınırlamasına dikkat çekmek istiyoruz. İlk olarak, yayılan ışığın yoğunluğu 405 nm'de heyecanlanma ile 488 nm'de heyecanlanmadan çok daha düşüktür, bu da genellikle oldukça gürültülü 405 nm görüntülerle sonuçlanır. 405 nm kanalında gürültü sinyalini iyileştirmek için daha yüksek lazer gücüne ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, 405 nm'deki heyecan tipik olarak daha fototoksiktir ve 488 nm'de heyecanlanmadan daha fazla otofluoresans üretir ve izin verilen 405 nm lazer yoğunluğunu sınırlar. Örneğin, bu çalışmada, zayıf roGFP floresan önemli 405 nm heyecanlı doku otoflüoresansı ile birleştiğinde, canlı retina düzlüklerinde (Depp ve Bas-Orth, yayınlanmamış gözlem) mito-Grx1-roGFP2 ifade eden ganglion hücrelerinden sağlam verilerin eldelanmasını engelledi. İkinci olarak, 405:488 nm oranı pH 5.5 ila pH 8.5 (Şekil 4)9 civarındaki fizyolojik bir aralıktaki pH değişikliklerine karşı duyarsız olsa da, roGFP2 emisyonunun pH'a bağımlı olarak söndürülmesi, tipik olarak zayıf olan 405 nm sinyalinin mikroskop algılama sınırının altına düşmesine neden olarak ölçülebilir oran görüntülerinin alınmasını engelleyebilir. Örneğin, nöronal sitozol13'te NMDA kaynaklı asidoz sırasında durum böyleydi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; 2289 İÇİN: BA 3679/4-2). A.K. ERASMUS+ bursu ile desteklenmektedir. Birincil nöronların hazırlanması için Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner ve Andrea Schlicksupp'a teşekkür ederiz. PLPCX-mito-Grx1-roGFP2 sağladığı için Dr. Tobias Dick'e teşekkür ederiz. Şekil 4'te gösterilen deneyler Heidelberg Üniversitesi Nikon Görüntüleme Merkezi'nde gerçekleştirildi. Şekil 2 BioRender.com ile hazırlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roede, J. R., Go, Y. M., Jones, D. P. Redox equivalents and mitochondrial bioenergetics. Methods in Molecular Biology. 810, 249-280 (2012).
  2. Turrens, J. F. Mitochondrial formation of reactive oxygen species. Journal of Physiology. 552, Pt 2 335-344 (2003).
  3. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  4. Manfredi, G., Beal, M. F. The role of mitochondria in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Brain Pathology. 10 (3), 462-472 (2000).
  5. Mari, M., Morales, A., Colell, A., Garcia-Ruiz, C., Fernandez-Checa, J. C. Mitochondrial glutathione, a key survival antioxidant. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (11), 2685-2700 (2009).
  6. Murphy, M. P. Mitochondrial thiols in antioxidant protection and redox signaling: distinct roles for glutathionylation and other thiol modifications. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (6), 476-495 (2012).
  7. Dooley, C. T., et al. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  8. Hanson, G. T., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. Journal of Biological Chemistry. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  9. Gutscher, M., et al. Real-time imaging of the intracellular glutathione redox potential. Nature Methods. 5 (6), 553-559 (2008).
  10. Morgan, B., Sobotta, M. C., Dick, T. P. Measuring E(GSH) and H2O2 with roGFP2-based redox probes. Free Radical Biology & Medicine. 51 (11), 1943-1951 (2011).
  11. Marwick, K. F. M., Hardingham, G. E. Transfection in primary cultured neuronal cells. Methods in Molecular Biology. 1677, 137-144 (2017).
  12. Kohrmann, M., et al. convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. Journal of Neuroscience Research. 58 (6), 831-835 (1999).
  13. Depp, C., Bas-Orth, C., Schroeder, L., Hellwig, A., Bading, H. Synaptic activity protects neurons against calcium-mediated oxidation and contraction of mitochondria during excitotoxicity. Antioxidants & Redox Signaling. 29 (12), 1109-1124 (2018).
  14. Hauck, B., Chen, L., Xiao, W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Molecular Therapy. 7 (3), 419-425 (2003).
  15. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  16. Zhang, S. J., et al. Nuclear calcium signaling controls expression of a large gene pool: identification of a gene program for acquired neuroprotection induced by synaptic activity. PLoS Genetics. 5 (8), 1000604 (2009).
  17. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  18. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  19. Lukyanov, K. A., Belousov, V. V. Genetically encoded fluorescent redox sensors. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (2), 745-756 (2014).
  20. Nietzel, T., et al. Redox-mediated kick-start of mitochondrial energy metabolism drives resource-efficient seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 741-751 (2020).
  21. Albrecht, S. C., et al. Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).
  22. Albrecht, S. C., Barata, A. G., Grosshans, J., Teleman, A. A., Dick, T. P. In vivo mapping of hydrogen peroxide and oxidized glutathione reveals chemical and regional specificity of redox homeostasis. Cell Metabolism. 14 (6), 819-829 (2011).
  23. Breckwoldt, M. O., et al. Multiparametric optical analysis of mitochondrial redox signals during neuronal physiology and pathology in vivo. Nature Medicine. 20 (5), 555-560 (2014).
  24. Ricke, K. M., et al. Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons. Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).
  25. Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein. Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).
  26. Shokhina, A. G., et al. Red fluorescent redox-sensitive biosensor Grx1-roCherry. Redox Biology. 21, 101071 (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 176 Grx1-roGFP2 konfokal mikroskopi oksidatif stres hipokampal nöronlar ekssostoksiklik mitokondriyal membran potansiyeli
Primer Nöronlarda Mitokondriyal Glutatyon Redoksu Durumunun Oranmetrik Gösterge Kullanılarak Canlı Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Katsalifis, A., Casaril, A. M.,… More

Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter