Summary

Live-Bildgebung des mitochondrialen Glutathion-Redox-Zustands in primären Neuronen unter Verwendung eines ratiometrischen Indikators

Published: October 20, 2021
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Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Bestimmung von Unterschieden im basalen Redoxzustand und in den Redoxreaktionen auf akute Störungen in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen unter Verwendung der konfokalen Live-Mikroskopie. Das Protokoll kann mit minimalen Modifikationen auf andere Zelltypen und Mikroskope angewendet werden.

Abstract

Die mitochondriale Redoxhomöostase ist wichtig für die neuronale Lebensfähigkeit und Funktion. Obwohl Mitochondrien mehrere Redoxsysteme enthalten, gilt der sehr häufige Thiol-Disulfid-Redoxpuffer Glutathion als zentraler Akteur in der antioxidativen Abwehr. Daher liefert die Messung des mitochondrialen Glutathion-Redoxpotentials nützliche Informationen über den mitochondrialen Redoxstatus und oxidativen Stress. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) ist ein genetisch kodierter, auf grün fluoreszierendem Protein (GFP) basierender ratiometrischer Indikator des Glutathion-Redoxpotentials, der zwei Redox-Zustands-sensitive Anregungspeaks bei 400 nm und 490 nm mit einem einzigen Emissionspeak bei 510 nm aufweist. Dieser Artikel beschreibt, wie man konfokale Live-Mikroskopie von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen durchführt. Es beschreibt, wie das mitochondriale Glutathion-Redoxpotenzial im Steady-State-Stadium beurteilt werden kann (z. B. zum Vergleich von Krankheitszuständen oder Langzeitbehandlungen) und wie Redoxveränderungen bei akuten Behandlungen gemessen werden können (am Beispiel des exzitoxischen Arzneimittels N-Methyl-D-Aspartat (NMDA). Darüber hinaus stellt der Artikel die Co-Imaging von Grx1-roGFP2 und dem mitochondrialen Membranpotentialindikator Tetramethylrhodamin, Ethylester (TMRE) vor, um zu demonstrieren, wie Grx1-roGPF2 mit zusätzlichen Indikatoren für multiparametrische Analysen gemultiplext werden kann. Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Beschreibung, wie (i) konfokale Laser-Scanning-Mikroskopeinstellungen optimiert, (ii) Medikamente zur Stimulation mit anschließender Sensorkalibrierung mit Diamid und Dithiothreitol angewendet und (iii) Daten mit ImageJ/FIJI analysiert werden.

Introduction

Mehrere wichtige mitochondriale Enzyme und Signalmoleküle unterliegen der Thiol-Redox-Regulation1. Darüber hinaus sind Mitochondrien eine wichtige zelluläre Quelle reaktiver Sauerstoffspezies und selektiv anfällig für oxidative Schäden2. Dementsprechend wirkt sich das mitochondriale Redoxpotential direkt auf die Bioenergetik, die Zellsignalisierung, die mitochondriale Funktion und letztendlich auf die Lebensfähigkeit der Zellen aus3,4. Die mitochondriale Matrix enthält hohe Mengen (1-15 mM) des Thiol-Disulfid-Redoxpuffers Glutathion (GSH), um die Redoxhomöostase aufrechtzuerhalten und die antioxidative Abwehr aufzubauen5,6. GSH kann kovalent an Zielproteine gebunden werden (S-Glutathionylierung), um ihren Redoxstatus und ihre Aktivität zu kontrollieren, und wird von einer Reihe von entgiftenden Enzymen verwendet, die oxidierte Proteine reduzieren. Daher ist das mitochondriale Glutathion-Redoxpotential ein sehr informativer Parameter bei der Untersuchung der mitochondrialen Funktion und Pathophysiologie.

roGFP2 ist eine Variante von GFP, die durch Zugabe von zwei oberflächenexponierten Cysteinen, die ein künstliches Dithiol-Disulfid-Paar bilden, redoxempfindlich gemacht wurde7,8. Es hat einen einzelnen Emissionspeak bei ~510 nm und zwei Anregungsspitzen bei ~400 nm und 490 nm. Wichtig ist, dass die relativen Amplituden der beiden Anregungsspitzen vom Redoxzustand von roGFP2 abhängen (Abbildung 1), was dieses Protein zu einem ratiometrischen Sensor macht. Im Grx1-roGFP2-Sensor wurde humanes Glutaredoxin-1 (Grx1) mit dem N-Terminus von roGFP29,10 verschmolzen. Die kovalente Bindung des Grx1-Enzyms an roGFP2 ermöglicht zwei wesentliche Verbesserungen des Sensors: Es macht die Sensorantwort spezifisch für das GSH/GSSG-Glutathion-Redox-Paar (Abbildung 1) und beschleunigt das Gleichgewicht zwischen GSSG und roGFP2 um einen Faktor von mindestens 100.0009. Daher ermöglicht Grx1-roGFP2 eine spezifische und dynamische Abbildung des zellulären Glutathion-Redoxpotentials.

Grx1-roGFP2-Bildgebung kann auf einer Vielzahl von Mikroskopen durchgeführt werden, einschließlich Weitfeldfluoreszenzmikroskopen, rotierenden konfokalen Scheibenmikroskopen und konfokalen Laserscanning-Mikroskopen. Die Expression des Sensors in primären Neuronen kann durch verschiedene Methoden erreicht werden, darunter Lipofektion11, DNA/Calcium-Phosphat-Kopräzipitation12, virusvermittelter Gentransfer oder die Verwendung transgener Tiere als Zellquelle (Abbildung 2). Pseudotypisierte rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAV), die ein 1:1-Verhältnis von AAV1- und AAV2-Kapsidproteinen 13,14 enthielten, wurden für die Experimente in diesem Artikel verwendet. Mit diesem Vektor wird die maximale Sensorexpression typischerweise 4-5 Tage nach der Infektion erreicht und bleibt mindestens zwei Wochen lang stabil. Wir haben Grx1-roGFP2 erfolgreich in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen von Mäusen und Ratten eingesetzt.

In diesem Artikel wird die rAAV-vermittelte Expression von Mitochondrien-gerichtetem Grx1-roGFP2 in primären Hippocampus- und kortikalen Neuronen der Ratte verwendet, um den basalen mitochondrialen Glutathion-Redoxzustand und seine akute Störung zu beurteilen. Für die konfokale Live-Bildgebung wird ein Protokoll mit detaillierten Anweisungen bereitgestellt, wie (i) die Einstellungen für konfokale Laserscanning-Mikroskope optimiert, (ii) ein Live-Imaging-Experiment durchgeführt und (iii) Daten mit FIJI analysiert werden können.

Protocol

Alle Tierversuche entsprachen den nationalen und institutionellen Richtlinien, einschließlich der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments des Rates, und verfügten über eine vollständige ethische Genehmigung des Innenministeriums (Tierwohlamt der Universität Heidelberg und Regierungspraesidium Karlsruhe, Lizenzen T14/21 und T13/21). Primäre Hippocampus- und kortikale Neuronen wurden aus neugeborenen Maus- oder Rattenwelpen nach Standardverfahren hergestellt und wie zuvor beschrieben für 12-14 Tage <sup c…

Representative Results

Quantifizierung von Unterschieden im stationären mitochondrialen Redoxzustand nach WachstumsfaktorentzugUm die Quantifizierung von Steady-State-Unterschieden im mitochondrialen Redoxzustand zu demonstrieren, wurden primäre Neuronen, die in einem Standardmedium gezüchtet wurden, mit Neuronen verglichen, die 48 Stunden vor der Bildgebung ohne Wachstumsfaktoren kultiviert wurden. Der Entzug des Wachstumsfaktors führt nach 72 h16 zum apoptotischen neuronalen Zelltod. Die Zelle…

Discussion

Quantitative und dynamische Messungen des mitochondrialen Redoxzustandes liefern wichtige Informationen über die mitochondriale und zelluläre Physiologie. Es stehen mehrere fluorogene chemische Sonden zur Verfügung, die reaktive Sauerstoffspezies, “Redoxstress” oder “oxidativen Stress” erkennen. Die letztgenannten Begriffe sind jedoch nicht klar definiert und haben oft keine Spezifität9,17,18. Im Vergleich zu chemischen Farb…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; FÜR 2289: BA 3679/4-2). A.K. wird durch ein ERASMUS+ Stipendium unterstützt. Wir danken Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner und Andrea Schlicksupp für die Präparation primärer Neuronen. Wir danken Dr. Tobias Dick für die Bereitstellung von pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Die in Abbildung 4 gezeigten Experimente wurden am Nikon Imaging Center der Universität Heidelberg durchgeführt. Abbildung 2 wurde mit BioRender.com erstellt.

Materials

reagents
Calcium chloride (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306
Diamide (DA) Sigma-Aldrich D3648
Dithiothreitol (DTT) Carl Roth GmbH 6908.1
Glucose (2.5 M stock solution) Sigma-Aldrich G8769
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Glycine neoFroxx GmbH LC-4522.2
HEPES (1 M stock solution) Sigma-Aldrich 15630-080
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich 442611-M
N-methyl-D-aspartate (NMDA) Sigma-Aldrich M3262
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P3911
Sodium chloride (NaCl) neoFroxx GmbH LC-5932.1
Sodium pyruvate (0.1 M stock solution) Sigma-Aldrich S8636
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P8574
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.1
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (TMRE) Sigma-Aldrich 87917
equipment
imaging chamber Life Imaging Services (Basel, Switzerland) 10920 Ludin Chamber Type 3 for Ø12mm coverslips
laser scanning confocal microscope, microscope Leica DMI6000
laser scanning confocal microscope, scanning unit Leica SP8
peristaltic pump VWR PP1080 181-4001
spinning disc confocal microscope, camera Hamamatsu C9100-02 EMCCD
spinning disc confocal microscope, incubationsystem TokaiHit INU-ZILCF-F1
spinning disc confocal microscope, microscope Nikon Ti microscope
spinning disc confocal microscope, scanning unit Yokagawa CSU-X1
software
FIJI https://fiji.sc
StackReg plugin https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java
TurboReg plugin https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java

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Katsalifis, A., Casaril, A. M., Depp, C., Bas-Orth, C. Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator. J. Vis. Exp. (176), e63073, doi:10.3791/63073 (2021).

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