Este protocolo descreve o método de fita sobre como construir manualmente uma microarray tecidual usando blocos de doadores FFPE de diferentes profundidades.
A microarray tecidual (TMA) é uma importante ferramenta de pesquisa na qual muitas amostras de parafina fixa formalina incorporadas (FFPE) podem ser representadas em um único bloco de parafina. Isso é conseguido utilizando núcleos de tecido extraídos da região de interesse de diferentes blocos FFPE doadores e organizando-os em um único bloco de parafina TMA. Uma vez construídas, seções do TMA concluído podem ser usadas para realizar estudos de imunohistoquímica, cromogênico, fluorescência nos estudos de hibridização situ (FISH) e RNA ISH para avaliar a expressão proteica, bem como alterações genômicas e transcricionais em muitas amostras simultaneamente, minimizando o uso de tecidos e reduzindo os custos de reagente. Existem várias técnicas diferentes de construção de TMA. Um dos métodos de construção mais comuns é o método receptor, que funciona melhor com núcleos do mesmo comprimento para os quais recomenda-se um comprimento mínimo de 4 mm. Infelizmente, os blocos de tecido podem ser fortemente ressecados durante o processo de diagnóstico, resultando frequentemente em espessuras de blocos de doadores “não ideais” de menos de 4 mm. O artigo e o vídeo atuais se concentram no método de fita adesiva de dois lados; um manual alternativo, de baixo custo, fácil de usar e método rápido para construir TMAs de baixa densidade (<50 núcleos) altamente compatíveis com esses blocos de doadores não ideais. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre como construir um TMA usando este método, com foco na importância crítica da revisão patológica e validação pós-construção.
Os tecidos de parafina fixa formalina (FFPE) são usados extensivamente em estudos de expressão de proteína morfológica e imunohistoquímica1. No entanto, a pesquisa de descobertas muitas vezes requer o exame de vários marcadores em um grande número de tecidos, que podem esgotar tecidos preciosos. Introduzido na década de 1980, a microarray tecidual (TMA) é uma importante ferramenta de pesquisa que reúne pequenas regiões exemplares de interesse de muitos diferentes blocos de tecido FFPE em um único bloco de parafina, permitindo o exame de muitas amostras de tecido simultaneamente2. Assim, os TMAs evitam o uso excessivo de amostras de tecido altamente preciosas e, muitas vezes, raras, ao mesmo tempo em que reduzem os custos associados à realização de aplicações a jusante em muitas amostras individuais 3,4.
Existem várias técnicas diferentes para a construção de TMAs5, incluindo abordagens automatizadas e semi-manuais 6,7. A maioria dessas últimas abordagens utiliza o método receptor, no qual os núcleos teciduais perfurados a partir de blocos de doadores são inseridos em um molde pré-moldado. No entanto, recomenda-se que blocos de doadores “ideais” com pelo menos 4 mm de espessura sejam utilizados para este método 6,7. Infelizmente, os blocos de doadores, particularmente aqueles que foram extensivamente seccionados para fins de diagnóstico clínico antes de serem disponibilizados para pesquisa, são frequentemente com menos de 4 mm de espessura, o que poderia excluí-los do uso na construção de TMA usando o método receptor, se a reinscrição para alcançar uma profundidade de 4 mm não for possível ou desejável. Além disso, esses procedimentos podem muitas vezes usar um microarrayer de tecido manual de bancada ou instrumentos automatizados caros que não são facilmente acessíveis ou acessíveis ao laboratório de pesquisa médio. Em contraste, o método de fita adesiva de dois lados ou método de fita, é um método manual de construção de TMA compatível com blocos de doadores não ideais que usam microarrayers de tecido de mão baratos, amplamente disponíveis, reutilizáveis ou descartáveis 8,9,10. Este método inverte o processo de construção lançando o bloco em torno de núcleos eretos invertidos que, após a conclusão, estão alinhados com a parte superior do TMA, independentemente do comprimento do núcleo. Como resultado, todas as amostras estão presentes nas seções TMA quando seccionadas pela primeira vez, o que permite ao construtor tirar o máximo desses blocos não ideais desde o início. Assim, o método da fita representa uma alternativa econômica e viável para os laboratórios de pesquisa não especializados.
A construção do TMA não está sem seus desafios, e deve-se ter cuidado ao selecionar as regiões teciduais para extrair os núcleos, fazendo da revisão patológica uma parte crítica do processo de construção do TMA11,12. Assim, este protocolo visa ressaltar a profunda importância da revisão patológica na construção do TMA, destacando algumas das armadilhas patológicas associadas à construção do TMA que os indivíduos que constroem e utilizam TMAs devem estar cientes, e por que a revisão patológica deve continuar durante a vida útil de um bloco de TMA.
Este protocolo descreve as medidas tomadas no Laboratório de Núcleo Técnico do Recurso de Amostra de Aids e Câncer (ACSR) para construir TMAs a partir de blocos de doadores não ideais usando o método de fita; onde o ACSR é um biorepositório financiado pelo NIH dedicado à coleta e distribuição equitativa de bioespecimens de tecidos de câncer do HIV, a fim de promover a pesquisa sobre a malignidade do HIV.
Um dos componentes mais críticos do processo de construção do TMA é a revisão patológica dos blocos de doadores ffpe dos quais os núcleos TMA serão obtidos4. Durante a revisão, um patologista certificado pelo conselho examina uma seção representativa de tecido manchado de H&E de cada bloco de doadores. É imperativo que o H&E seja gerado usando uma seção de tecido recém-cortada para que seja a melhor representação de seu bloco de doadores correspondente. O uso de H&Es mais antigos não é recomendado, dado que os tecidos FFPE são estruturas tridimensionais cujo perfil tecidual pode mudar significativamente com profundidade de bloco e secção extensiva; isso pode ter ocorrido desde que o H&E foi gerado, potencialmente tornando sua representação do bloco FFPE imprecisa. O processo de revisão é essencial para a seleção de casos adequados e identificação de áreas de tecido de onde os núcleos devem ser obtidos, bem como identificação de áreas que devem ser evitadas na coleta de núcleos. Na ausência de revisão patológica, a probabilidade de incluir tecidos inadequados aumenta significativamente. A inclusão desses tecidos tem o potencial de tornar o TMA construído ineficaz e inadequado para seu propósito pretendido. É importante ressaltar que, sem saber, o uso de TMAs tão ineficazes tem um enorme potencial para resultar em dados falsos e enganosos. Isso combinado com o conhecimento de que o perfil dos tecidos FFPE e, portanto, seus núcleos derivados, podem mudar significativamente com o aumento da profundidade destaca a importância da revisão patológica contínua ao longo da vida de um bloco de TMA construído. O ideal é que os H&Es sejam gerados utilizando-se a cada15 ou 20seções para garantir que quaisquer alterações nos perfis teciduais dos núcleos sejam capturadas e registradas. No mínimo, os H&Es devem ser gerados e revisados no início e no final de um projeto para monitorar essas possíveis mudanças. Diante desses pontos e da importância do TMA como ferramenta de pesquisa, é imprescindível que a revisão patológica esteja firmemente incrustada no processo de construção do TMA e ao longo da vida útil do bloco TMA.
Os blocos FFPE são frequentemente extensivamente seccionados durante o processamento de diagnóstico de rotina antes de serem liberados para fins de pesquisa. Como resultado, a profundidade do bloco de doadores e, portanto, os comprimentos do núcleo do bloco de doadores são muitas vezes menores do que o método receptor ideal de 4 mm. Aqui demonstramos como construir TMAs usando o protocolo de construção do método de fita, a principal vantagem disso é sua compatibilidade com núcleos de blocos de tecido FFPE não ideais. Embora o método de fita seja de grande valor de pesquisa e ofereça um método barato, conveniente e acessível para a construção de blocos de TMA, não é sem seus desafios e limitações. Em comparação com os métodos automatizados e manuais de receptores, que podem acomodar 100-1.000 núcleos em um único bloco TMA, um máximo de 40 núcleos é recomendado para TMAs construídos usando o métodode fita 9. Outra limitação é no que diz respeito à facilidade de construção. No método receptor, os núcleos perfurados são meramente inseridos em um molde pré-moldado, que proporciona estabilidade central ao cercar cada núcleo em seu próprio poço individual, impedindo assim a migração do núcleo, bem como promovendo a colocaçãoe separação do núcleo altamente regular. Além disso, o método do destinatário oferece a conveniência opcional de ser totalmente manual, semi-manual e totalmente automatizado. Em contraste, o método manual de fita requer uma colocação cuidadosa e suave de cada núcleo à mão usando uma picareta de agulha. Embora a ausência de um molde precast no método de fita impeça a colocação e separação altamente regulares experimentadas com o método receptor, essa deficiência é superada através da inclusão de uma grade quadrimestada. É importante que a grade quadrimesca seja afixada no centro da bandeja metálica, a fim de evitar a colocação da borda do bloco, o que aumenta o risco de perda do núcleo se não houver parafina suficiente segurando o núcleo no lugar. Deve-se notar também que as pequenas separações do núcleo possíveis com o método receptor não podem ser alcançadas com o método de fita devido à colocação manual do núcleo e à necessidade da picareta da agulha para caber entre os núcleos adjacentes. Os núcleos são colocados de forma independente com a menor área de superfície ou pegada do núcleo que entra em contato com a grade coberta do DSST. Esta configuração fornece significativamente menos estabilidade do núcleo do que o método receptor e confere um risco aumentado para derrubada e ou migração do núcleo ao derramar a parafina derretida. De fato, um dos passos mais críticos do protocolo é derramar a parafina derretida. É essencial que isso seja feito rapidamente após a remoção do forno para garantir que a parafina seja completamente líquida e que o derramamento seja realizado suavemente com mínima turbulência. Curiosamente, Chen et al. desenvolveram um dispositivo auxiliar altamente novo, semelhante a um estêncil com 7 x 11 buracos de diâmetro distribuídos uniformemente, que é colocado em cima de um bloco de parafina em branco para guiar agulhas ao criar o bloco receptor e ao inserir os núcleos do bloco de doadores23. Embora projetado para ajudar a construção do bloco do destinatário, tal dispositivo poderia ser facilmente adaptado ao método de fita para orientar a colocação, regular a separação e aumentar a estabilidade do núcleo durante o processo de construção.
Um dos efeitos mais significativos da estabilidade do núcleo é o número de núcleos incluídos em um método de fita TMA. Isso porque, à medida que o número de núcleos aumenta, o diâmetro do núcleo deve reduzir para acomodar o crescente número de núcleos, o que, por sua vez, reduz a pegada do núcleo aderindo ao DSST. Um diâmetro mínimo do núcleo de 1 mm é recomendado para a construção do método de fita TMA, pois descobrimos que núcleos com diâmetros menores são particularmente instáveis e propensos a derrubar mesmo com derramamento de parafina muito suave. Um estudo recente que investigou dois métodos internos diferentes que utilizaram agulhas de 16 G (diâmetro do núcleo de 1,1 mm) e um soco de 4 mm de diâmetro experimentou perdas substanciais de tecido com os 1,1 mm (26,5%), mas não os núcleos de 4 mm24. Isso parece indicar que pequenos núcleos podem ser problemáticos para trabalhar e não apenas durante a construção. Além disso, diâmetros menores podem não representar o bloco original de doadores, bem como núcleos maiores, dificultando a interpretação patológica e aumentando a probabilidade de representação imprecisa do tecido doador.
A inclusão e colocação de blocos de orientação é de grande importância na construção do TMA. No entanto, isso é de particular importância para o método de fita construído TMAs. Isso decorre do fato de que o método da fita inverte o processo de construção aumentando assim o risco de desorientação espacial. Aconselhamos incluir até três núcleos de orientação em cada bloco, e que eles sejam colocados longe dos núcleos de amostra, a fim de melhor orientar o bloco. Os núcleos de orientação podem ser núcleos retirados de blocos de tecidos contendo tecidos distintamente diferentes do tema do TMA construído ou ferramentas de orientação de cor livre de tecido21, onde este último é particularmente útil para não-patologistas. Combinados com a colocação do núcleo padrão de matriz não regular, os núcleos de orientação minimizam o risco de desorientação.
A diferença pronunciada no comprimento central entre os TMAs construídos usando a fita e os métodos receptores decorre da inclusão da profundidade do bloco de doadores no processo de tomada de decisão ao selecionar o método de construção. O protocolo aqui descrito emprega um limiar onde os TMAs são construídos usando a fita e os métodos de receptor quando os blocos de doadores têm profundidades de < 4 mm e 4 mm, respectivamente. É importante notar que a inclusão da profundidade do bloco de doadores na escolha do método de construção não é universal. Embora seja possível que os TMAs sejam construídos usando qualquer método, independentemente da profundidade do bloco de doadores, núcleos mais altos podem interferir, e ou ser derrubados ou inclinados, a colocação do de plástico durante a construção do TMA usando o método de fita. A escolha de incluir ou omitir critérios no processo de tomada de decisão depende das comodidades disponíveis para o laboratório, o custo e o produto final desejado. De acordo com os parâmetros deste protocolo, o número de seções TMA montadas em slides que podem ser obtidas a partir de um TMA construído pelo método de fita é significativamente menor do que o obtido a partir de um método de destinatário construído TMA. Embora seja possível re-bloquear tecidos FFPE para aumentar a profundidade do bloco de doadores e torná-los compatíveis com o método receptor, a probabilidade de alcançar a mesma orientação tecidual dentro do re-bloco é baixa. Por sua vez, isso pode exigir um bloqueio extensivo voltado para obter uma seção de rosto completo, o que provavelmente incluiria perda significativa de tecido. Após o bloqueio, um método de fita construído TMA produz aproximadamente 50 seções TMA montadas em slides com todos os núcleos presentes. No entanto, o número exato varia de bloco para bloco e depende do comprimento dos núcleos utilizados para construir o TMA e da espessura das seções que estão sendo cortadas (5 μm versus 4 μm). Além disso, deve-se notar também que, devido aos seus diferentes comprimentos principais, os núcleos esgotarão em momentos diferentes, pois o TMA é progressivamente seccionado; um atributo que reenfatiza a necessidade de revisão patológica contínua.
Embora o método do destinatário ofereça benefícios e vantagens significativos sobre o método de fita, incluindo um processo de construção menos tedioso e mais rápido, o método de fita não é destinado a laboratórios experientes de alto rendimento. Destina-se ao laboratório médio, particularmente aqueles em configurações limitadas de recursos, com acesso a blocos de doadores de profundidades variáveis, mas não aos serviços de construção de TMA. No entanto, aplicações futuras poderiam ver a automação deste método, a fim de melhorar o pool de amostras elegíveis em laboratórios de alto rendimento e eliminar a necessidade de re-bloqueio de blocos de doadores. Em conclusão, o protocolo de construção do método de fita TMA descrito pode ser facilmente estabelecido em laboratórios não especializados sem a necessidade de equipamentos caros. No entanto, é aconselhável que novos usuários devem empregar blocos de tecido FFPE sem valor, ferramentas de orientação coloridassem tecido 21 ou mesmo blocos de parafina coloridos sem tecido no início, a fim de se familiarizar com a técnica do método de fita antes de avançar para a construção de TMA usando tecidos preciosos. Embora sua construção não seja sem potenciais armadilhas, que tanto aqueles que constroem quanto usam blocos de TMA devem estar cientes, este método de construção de TMA aparentemente não polido pode produzir TMAs de alta qualidade e biologicamente relevantes para pesquisa. De fato, as seções de TMA decorrentes do método de fita construída TMAs estão entre uma das amostras de tecido mais solicitadas no biorepositório ACSR.
The authors have nothing to disclose.
O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo biorepositório de recursos para aids e câncer financiado pelo NIH (www.acsr1.com), UM1CA181255.
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