Summary
يوضح هذا البروتوكول طريقة الشريط حول كيفية بناء مصفوفة دقيقة للأنسجة يدويا باستخدام كتل مانحة FFPE ذات أعماق مختلفة.
Abstract
يعد المصفوفة الدقيقة للأنسجة (TMA) أداة بحثية مهمة يمكن من خلالها تمثيل العديد من عينات البارافين الثابتة من الفورمالين (FFPE) في كتلة بارافين واحدة. ويتحقق ذلك باستخدام نوى الأنسجة المستخرجة من المنطقة التي تهم كتل FFPE المانحة المختلفة وترتيبها في كتلة بارافين TMA واحدة. بمجرد بنائها ، يمكن استخدام أقسام من TMA المكتملة لإجراء دراسات الكيمياء المناعية ، والكروموجينيك ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) و RNA ISH لتقييم التعبير عن البروتين بالإضافة إلى التعديلات الجينومية والنسخية في العديد من العينات في وقت واحد ، وبالتالي تقليل استخدام الأنسجة وتقليل تكاليف الكاشف. هناك العديد من تقنيات بناء TMA المختلفة. واحدة من أكثر طرق البناء شيوعا هي طريقة المتلقي ، والتي تعمل بشكل أفضل مع النوى من نفس الطول والتي يوصى بطول لا يقل عن 4 مم. لسوء الحظ ، يمكن استئصال كتل الأنسجة بشكل كبير أثناء عملية التشخيص ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى سماكة كتلة مانحة "غير مثالية" أقل من 4 مم. تركز المقالة الحالية والفيديو على طريقة الشريط اللاصق على الوجهين ؛ دليل بديل ، منخفض التكلفة ، سهل الاستخدام ، وطريقة سريعة لبناء TMAs منخفضة الكثافة (<50 نواة) متوافقة للغاية مع كتل المانحين غير المثالية هذه. يوفر هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة حول كيفية بناء TMA باستخدام هذه الطريقة ، مع التركيز على الأهمية الحاسمة للمراجعة المرضية والتحقق من صحة ما بعد البناء.
Introduction
تستخدم أنسجة الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE) على نطاق واسع في دراسات التعبير عن البروتين المورفولوجي والكيميائي المناعي1. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب أبحاث الاكتشاف فحص العديد من العلامات على عدد كبير من الأنسجة ، والتي يمكن أن تستنفد الأنسجة الثمينة. تم تقديم مصفوفة الأنسجة الدقيقة (TMA) في 1980s ، وهي أداة بحثية مهمة تجمع مناطق نموذجية صغيرة ذات أهمية من العديد من كتل الأنسجة FFPE المختلفة في كتلة بارافين واحدة ، مما يسمح بفحص العديد من عينات الأنسجة في وقت واحد2. وبالتالي ، فإن TMAs تتجنب الاستخدام المفرط لعينات الأنسجة الثمينة للغاية ، والنادرة في كثير من الأحيان ، مع تقليل التكاليف المرتبطة بإجراء تطبيقات المصب على العديد من العينات الفردية 3,4.
توجد العديد من التقنيات المختلفة لبناء TMAs5 ، بما في ذلك النهج الآلية وشبه اليدوية 6,7. تستخدم غالبية هذه الأساليب الأخيرة طريقة المتلقي ، حيث يتم إدخال نوى الأنسجة المثقوبة من كتل المانحين في قالب مسبق الصنع. ومع ذلك ، يوصى باستخدام كتل مانحة "مثالية" لا يقل سمكها عن 4 مم لهذه الطريقة 6,7. لسوء الحظ ، فإن كتل المانحين ، وخاصة تلك التي تم تقسيمها على نطاق واسع لأغراض التشخيص السريري قبل إتاحتها للبحث ، غالبا ما يكون سمكها أقل من 4 مم ، مما قد يستبعدها من الاستخدام في بناء TMA باستخدام طريقة المتلقي ، إذا كانت إعادة التضمين لتحقيق عمق 4 مم غير ممكنة أو مرغوب فيها. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الإجراءات في كثير من الأحيان استخدام مصفوفة دقيقة يدوية للأنسجة أو أدوات آلية باهظة الثمن لا يمكن الوصول إليها بسهولة أو بأسعار معقولة لمختبر الأبحاث العادي. في المقابل ، فإن طريقة الشريط اللاصق على الوجهين أو طريقة الشريط ، هي طريقة بناء TMA يدوية متوافقة مع كتل المانحين غير المثالية التي تستخدم مصفوفات الأنسجة المحمولة باليد غير المكلفة أو المتاحة على نطاق واسع أو القابلة لإعادة الاستخدام أو التي يمكن التخلص منها8،9،10. تعكس هذه الطريقة عملية البناء عن طريق صب الكتلة حول النوى المستقيمة المقلوبة التي تتدفق عند الانتهاء مع الجزء العلوي من التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMA) ، بغض النظر عن طول النواة. نتيجة لذلك ، توجد جميع العينات في أقسام TMA عند تقسيمها لأول مرة ، مما يسمح للمنشئ بالحصول على أقصى استفادة من هذه الكتل غير المثالية من البداية. وبالتالي ، فإن طريقة الشريط تمثل بديلا فعالا من حيث التكلفة ومجديا لمختبرات البحوث غير المتخصصة.
لا يخلو بناء TMA من تحدياته ، ويجب توخي الحذر عند اختيار مناطق الأنسجة لاستخراج النوى منها ، مما يجعل المراجعة المرضية جزءا مهما من عملية بناء TMA11,12. وبالتالي ، يهدف هذا البروتوكول إلى التأكيد على الأهمية العميقة للمراجعة المرضية في بناء TMA من خلال تسليط الضوء على بعض المزالق المرضية المرتبطة ببناء TMA التي يجب أن يكون الأفراد الذين يقومون ببناء واستخدام TMAs على دراية بها ، ولماذا يجب أن تستمر مراجعة علم الأمراض طوال عمر كتلة TMA.
ويوجز هذا البروتوكول الخطوات المتخذة في المختبر الأساسي التقني لموارد عينات الإيدز والسرطان (ACSR) لبناء اتفاقات TMA من كتل مانحة غير مثالية باستخدام طريقة الشريط؛ حيث ACSR هو مستودع حيوي تموله المعاهد الوطنية للصحة مخصص لجمع العينات الحيوية من أنسجة سرطان فيروس نقص المناعة البشرية وتوزيعها بشكل عادل من أجل تعزيز أبحاث الأورام الخبيثة لفيروس نقص المناعة البشرية.
Protocol
تم إلغاء تحديد جميع الكتل المانحة أثناء التجميع واستخدامها لبناء التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) وفقا لبروتوكولات IRB المعتمدة في Mayo Clinic (PR16-000507 وPR2207-02).
1. مراجعة علم الأمراض
- استرجع كتل المتبرع بأنسجة FFPE لاستخدامها في بناء TMA.
- أرسل شريحة ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) تم إنشاؤها حديثا13 لكل كتلة مانحة للأنسجة FFPE تم اختيارها للمراجعة النسيجية من قبل أخصائي أمراض معتمد من مجلس الإدارة لتأكيد التشخيص والتعليق على الأنسجة.
ملاحظة: يمكن إجراء تلطيخ H&E في المنزل أو إرساله إلى مختبر الخدمات الأساسية المرضية للتلطيخ ، كما كان الحال في هذا البروتوكول. أحد أهم المفاهيم التي يجب تذكرها عند بناء TMAs هو أن الأنسجة الموجودة في كتل المتبرعين FFPE هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) يمكن أن يتغير شكلها ومحتوى الورم وجدوى الأنسجة بشكل كبير مع زيادة عمق الكتلة. يجب أن يحدد أخصائي علم الأمراض ، بناء على مراجعة قسم الأنسجة الملطخة H & E ، وهو تمثيل 2-dimensional للأنسجة 3D ، أفضل منطقة لاستخراج قلب الأنسجة منها. - أثناء المراجعة النسيجية ، تأكد من أن أخصائي علم الأمراض يحدد ويلقي تعليقات توضيحية على الأنسجة ذات الأهمية / غير ذات الأهمية على الشرائح الملطخة H & E. لإضافة تعليق توضيحي على الشريحة، اتبع الخطوات أدناه.
- استخدم قلم تمييز الشريحة لوضع دائرة حول الأنسجة ذات الاهتمام.
- باستخدام نفس قلم وضع العلامات ، قم بمسح المناطق داخل المنطقة الدائرية التي يجب تجنبها.
- استخدم قلم وضع العلامات لوضع علامة على المناطق التي تعتبر مثالية لأخذ العينات الأساسية واستخراجها.
ملاحظة: من المهم أن تتذكر أن شكل الأنسجة وتكوينها قد يتغير مع عمق الأنسجة في الكتلة. وبالتالي ، قد يتغير تكوين قلب الأنسجة اعتمادا على المكان الذي تم فيه استخراج النواة ، مما يؤكد على الحاجة إلى استمرار التوجيه المرضي. - أرسل أنسجة إضافية للبقع المناعية الكيميائية النسيجية الخاصة بالمرض إلى جانب H&Es ، إذا لزم الأمر ، للمساعدة في المراجعة المرضية. ومن الأمثلة على هذه البقع تلطيخ ERBB2 لسرطان الثدي الإيجابي HER2 14 ، HHV-8 لساركوما كابوسي15 ، CD20 للأورام اللمفاوية للخلايا البائية 16 ، U6 كعلامة عالمية لجودة الحمض النووي الريبي 17 ، EBER لتحديد إيجابية فيروس إبشتاين بار 18 ، و Vimentin كتأكيد للأصول الوسيطة وعلامة مراقبة جودة الأنسجة 19,20.
2. التحضير لبناء TMA
- بمجرد اكتمال مراجعة علم الأمراض ، قم بتجميع القائمة النهائية للكتل المانحة لاستخدامها في بناء TMA وإنشاء خريطة TMA (الشكل 1A). خريطة TMA هي مخطط يحدد أين سيتم وضع النوى في TMA المكتمل وعينات الأنسجة المثبتة على الشريحة التي تم الحصول عليها من TMA الناتج.
- لأغراض التوجيه، تأكد من أن خريطة التحليل الحراري الميكانيكي (TMA) تتجنب وضع النوى في مصفوفة متساوية مثل مصفوفة 3 × 3 أو 4 × 4 وتتضمن علامة اتجاه واحدة على الأقل.
ملاحظة: يمكن أن تكون نوى التوجيه مأخوذة من أدوات التوجيه الملونة الخالية من الأنسجة21 ، أو كتل الأنسجة التي تحتوي على أنسجة مختلفة بشكل واضح عن موضوع TMA. على عكس طريقة المتلقي حيث يتم إدخال النوى المستقيمة في قالب شمع مسبق الصب ، فإن طريقة الشريط تنشئ TMA عن طريق صب الشمع المنصهر حول النوى المقلوبة والمنتصب . يتطلب هذا الانعكاس لعملية البناء خريطة ثانية تعرف باسم خريطة البناء. - قم بإنشاء خريطة البناء عن طريق إنشاء صورة طبق الأصل لخريطة TMA (الشكل 1B). توضح خريطة البناء المكان الذي يجب وضع كل قلب فيه أثناء البناء من أجل الظهور في الموقع الصحيح في التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي المكتمل. احفظ خريطة البناء.
- بمجرد إنشاء الخرائط ، قم بإعداد قالب قاعدة TMA المعدني. استخدم شبكة ورقية متقلبة يمكن التخلص منها لتوجيه موضع النواة وتنظيم فصل النواة.
ملاحظة: يتم توفير شبكة قوالب 6 × 7 (42 نقطة) بحد أقصى 40 نواة (بالإضافة إلى نواتين/ثغرات اتجاه) للاستخدام مع قوالب القاعدة المعدنية المتاحة تجاريا بأبعاد داخلية تبلغ 26 مم × 20 مم في ملف pdf التكميلي. اطبع الشبكة الورقية واقطعها. - قم بقص الشبكة المتقلبة إلى الحجم وقم بلصق قطعة من شريط لاصق على الوجهين (DSST) في الجزء الخلفي من الشبكة. ضع الشبكة وشريط DSST في الدرج المعدني وأضف قطعة ثانية من DSST أعلى الشبكة ، أي أعلى شبكة الورق في قالب القاعدة المعدنية (الشكل 2A).
3. التنسيب الأساسي
- تراكب H & E الذي تمت مراجعته بشكل مرضي على كتلة الأنسجة المقابلة له واستخدام علامات علم الأمراض لتحديد مكان ثقب كتلة الأنسجة (الشكل 2B).
- قم بلكم كتلة مانح FFPE باستخدام لكمة أساسية يدوية (الشكل 2C) في المكان المناسب.
ملاحظة: تتوفر اللكمات الأساسية في مجموعة متنوعة من الأقطار. تستخدم هذه الطريقة لكمة أساسية محمولة باليد قطرها 2 مم.- إذا كنت تستخدم لكمة أساسية قابلة لإعادة الاستخدام ، فتأكد من تنظيفها قبل وبعد كل لكمة في الأنسجة.
- قم بإخراج النواة من اللكمة الأساسية واستخدم معول إبرة لوضع النواة المقذوفة على الشعيرات المتقاطعة للشبكة المغطاة DSST (الشكل 2D). تأكد من أنه عندما يتم وضع النواة على الشبكة ، تكون مقلوبة ومستقيمة بحيث يتصل طرف الأنسجة في النواة ب DSST (الأنسجة والوجه لأسفل). تأكد أيضا من وضع النواة في الموضع المناسب على الشبكة كما هو موضح في خريطة البناء.
- كرر ذلك حتى يتم حفر جميع الكتل المانحة ويتم وضع النوى في مواقعها المناسبة.
4. إكمال التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي
- قم بتشغيل الفرن الموجود على الطاولة ، واضبطه على 78 درجة مئوية ، واترك وقتا كافيا للوصول إلى درجة الحرارة.
- لكل TMA يتم بناؤه ، قم بإذابة 45 جم من كريات البارافين في حاوية مقاومة للفرن.
- ضع علامة على كاسيت بلاستيكي وضعه فوق قالب القاعدة المعدنية الذي يحتوي على النوى (الشكل 2E). يجب ألا يتجاوز ارتفاع النوى عمق الدرج المعدني حيث سيتم إمالة النوى الطويلة أو إسقاطها عند وضع الكاسيت في مكانه.
- ضع القالب مع الكاسيت على صينية لالتقاط الفائض وصب البارافين المذاب بلطف من خلال الكاسيت في صينية النوى (الشكل 2F).
- اسمح للبارافين المنصهر بالفيضان لضمان عدم وجود فقاعات هواء في جسم TMA. تأكد من أن البارافين يملأ الجزء العلوي من الكاسيت بحيث يتم تضمينه في كتلة البارافين وربطه بإحكام بمجرد تصلب البارافين.
- لا تحرك الكتلة أو تزعجها واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم ضعيه في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية حتى يتصلب تماما.
- بمجرد أن يصبح صلبا تماما ، افصل قالب القاعدة المعدنية بلطف عن كتلة البارافين المرتبطة بالكاسيت من النوى.
ملاحظة: يحتفظ DSST بلتصاقه خلال عملية البناء وغالبا ما يتم إرفاقه بكتلة البارافين المشكلة حديثا. إذا كان ذلك ممكنا، قم بإزالة DSST والشبكة برفق من أعلى كتلة TMA المكتملة الآن.
5. التحقق من صحة TMA
- بمجرد إنشاء التحليل الحراري الميكانيكي (TMA)، استخدم ميكروتوم لتقسيم التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي المكتمل حديثا. قطع واحد أو أكثر من قسم الأنسجة كامل الوجه.
- انقل الأقسام إلى الحمام المائي المحفوظ مسبقا وقم بتركيب الأقسام المنزلقة.
ملاحظة: غالبا ما تتطلب الكتل التي تم إنشاؤها حديثا مواجهة الكتلة (قطع البارافين الزائد) من أجل الحصول على أقسام أنسجة الوجه الكاملة التي تحتوي على جميع النوى. - بمجرد أن يجف ، أرسل قسم TMA مثبت على شريحة طازجة لتلطيخ H & E13 وأي تلطيخ كيميائي مناعي إضافي ، إذا لزم الأمر.
- أرسل أقسام TMA H&E الملطخة للمراجعة المرضية.
ملاحظة: أثناء مراجعة علم الأمراض TMA ، يقوم أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة ، ويفضل أن يكون نفس أخصائي علم الأمراض الذي راجع كتل المتبرع ب TMA ، بمراجعة النوى الملطخة TMA H & E لضمان وجود الأنسجة المرغوبة ذات الاهتمام بالفعل. إذا تم تقديم أي أنسجة إضافية أو بقع كيميائية مناعية خاصة بالمرض لمراجعة كتلة المتبرع في الخطوة 1.3.4 ، فيجب تكرار هذه البقع على أقسام TMA وتقديمها إلى جانب TMA H & E للمراجعة المرضية. - سجل نتائج مراجعة التحقق المرضي TMA.
Representative Results
طريقة الشريط لبناء TMA الموصوفة هنا هي الطريقة المفضلة المستخدمة في مختبر ACSR التقني الأساسي للحفاظ على الأنسجة ، والتي بدورها تسمح بالتوزيع المقتصد والعادل للأنسجة الثمينة للغاية للباحثين.
أحد المكونات الحاسمة في عملية البناء هو تحديد الأنسجة ذات الأهمية في كتلة مانحة معينة حيث يجب الحصول على قلب TMA. يتم تحديد ذلك من خلال المراجعة المرضية حيث يقوم أخصائي علم الأمراض المدرب بمراجعة شريحة H & E التي تم إنشاؤها حديثا (الشكل 3). باستخدام علامة ، يدور أخصائي علم الأمراض حول المنطقة الموجودة على شريحة H & E ، مما يشير إلى أنه يجب الحصول على النواة من كتلة المتبرع داخل هذه الدائرة (الشكل 3). قد يضع أخصائي علم الأمراض أيضا علامة على مناطق إضافية مثل المناطق الميتة ، والتي يجب تجنبها ، أو المناطق الحميدة التي يمكن من خلالها الحصول على نوى أنسجة إضافية (الشكل 3). ثم يتم لكم النوى من المناطق المشار إليها وتضمينها في بناء TMA.
هناك مقياسان رئيسيان لإكمال التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي بنجاح باستخدام طريقة الشريط. الأول هو وجود نقاط أساسية للأنسجة في المواقع والمسافات المتوقعة بعيدا عن بعضها البعض ، والتي يتم تقييمها عن طريق الفحص البصري. ويصور الشكل 4A,B اثنين من المخططات الميكانيكية، التي نجحت في التصويب الكامل وشرائح H&E المقابلة لها. يظهر الفحص البصري لكتل TMA أن النوى موجودة ومتباعدة بانتظام في كل TMA. تشمل بعض مشكلات البناء الرئيسية التي يمكن أن تنشأ أثناء عملية بناء طريقة الشريط فصل الكتلة والكاسيت بسبب الإزالة المبكرة للقاعدة المعدنية قبل تصلب الشمع (الشكل 4C). وثمة مشكلة أخرى محتملة لوحظت مع نظام التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMAs) بطريقة الشريط المبنية وهي إسقاط النواة المدمجة أو وضعها أو وضعها (الشكل 4D)؛ مشكلة يمكن أن تنشأ عن صب مضطرب بشكل مفرط من البارافين المنصهر ، والذي يمكن تعزيزه بواسطة DSST ضعيف اللصق. يوضح الشكل 5 صور H&E لنوى TMA1. جميع النواة باستثناء واحدة (البقعة 1) موجودة في H & E من TMA1. ويبين الشكل 5 أيضا أن بعض النوى موجودة كنقاط أنسجة دائرية كاملة (أي البقع 4 و 6 و 13 و 17) في حين أن البعض الآخر غير موجود تماما (أي البقع 3 و 8 و 9 و 12). فقدان الأنسجة الذي حدث في هذه الحالات الأخيرة ليس من غير المألوف وقد يكون بسبب عدم كفاية التقسيم اللازم للكشف عن جميع النوى بالكامل. بدلا من ذلك ، قد ينبع وجود الأنسجة غير المكتملة أو الغياب التام للأنسجة (أي البقعة 1) من سوء جودة الأنسجة في تلك النواة ، مما قد يؤدي إلى فقدان الأنسجة أثناء عملية التلطيخ.
يتم تقييم المقياس الثاني للنجاح من حيث ما إذا كانت نوى TMA قد استحوذت على الأنسجة المثيرة للاهتمام أم لا. ويتحقق ذلك من خلال المراجعة المرضية والتحقق من صحة نوى TMA H&E الفردية (الشكل 5) مقارنة بكتلة المتبرع المثقوبة مسبقا H&Es (الشكل 3) ، وعند الحاجة / إجراء أي بقع كيميائية نسيجية مناعية إضافية أخرى تم إجراؤها. يصور الشكل 6 البقع المثالية التي تم إجراؤها على TMA1 ، بما في ذلك Vimentin و U6 و EBER و CD20. تشير الأنسجة الإيجابية Vimentin (البقعة البنية) إلى أن جميع الأنسجة ذات أصول وسيطة وذات نوعية جيدة يمكن تلطيخها. تشير إيجابية U6 (بقعة أرجوانية داكنة / زرقاء) إلى أن جودة الحمض النووي الريبي في الأنسجة جيدة وتكمل بقع التهجين في الموقع (ISH) مثل EBER ، والتي تستهدف نسخ الجينات. تشير نتائج U6 في الشكل 5 إلى أن جودة الحمض النووي الريبي عالية في أنسجة سرطان الغدد الليمفاوية (البقعة 9) والتحكم الطبيعي في اتجاه أنسجة اللوزتين (البقعة 22) ولكن ليس في الأنسجة الطبيعية في البقعة 19. بعد ذلك ، كان تلطيخ EBER سلبيا في الأنسجة الطبيعية والتحكم في الاتجاه ولكنه إيجابي بقوة في أنسجة سرطان الغدد الليمفاوية (البقعة 9). كما هو متوقع بالنسبة للأنسجة ذات الأصول اللمفاوية ، فإن كلا من النقطتين 9 و 22 ملطختان إيجابية لعلامة الخلايا البائية CD20 ، لكن البقعة 19 ، التي تنبع من أنسجة الحبل الشوكي الطبيعية ، لم تفعل ذلك. يتم تلخيص نتائج التلطيخ لجميع نوى TMA في الجدول 1 وتأكيد التعليق التوضيحي للأنسجة لهذه النوى الأنسجة TMA.
الشكل 1: خرائط التحليل الحراري الميكانيكي (TMA). بمجرد تحديد جميع كتل FFPE وعناصر التحكم في الاتجاه ، يتم إنشاء خريطة مفصلة ، تعرف باسم خريطة TMA (A) ، تحدد مكان وجود كل نواة كتلة مانحة في الكتلة النهائية. من المهم ملاحظة أنه عند إنشاء TMA باستخدام طريقة الشريط ، فإن خريطة البناء (B) هي صورة طبق الأصل لخريطة TMA لأن هذه الطريقة تعكس عملية البناء ، وتصب البارافين المنصهر حول نوى الأنسجة المستقيمة بدلا من إدخال النوى في قالب مسبق الصنع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بناء التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي باستخدام طريقة الشريط. (أ) الطبقة 2 قطعة من الشريط اللاصق على الوجهين (DSST) وشبكة ورقية بترتيب متبع في الجزء السفلي من قالب القاعدة المعدنية. ضع القطعة الأولى من DSST (إدراج 2A) ، متبوعة بشبكة الورق التي يمكن التخلص منها ، ثم القطعة الثانية من DSST في الجزء السفلي من قالب القاعدة المعدنية. (ب) لكل كتلة مانحة، يتم إنشاء H&E جديد ومراجعته من قبل أخصائي علم الأمراض الذي يضع علامة H & E للدلالة على الأنسجة ذات الاهتمام، وأين يتم لكم الكتلة وإذا أمكن أين يمكن تجنب اللكم لاستخراج قلب الأنسجة. (ج) قم بلكم الكتلة المانحة باستخدام مثقوبة TMA المحمولة باليد أو القابلة لإعادة الاستخدام. (د) باستخدام اختيار إبرة ، يتم وضع كل نواة واقفة في وضع مستقيم ، والورم وجهه لأسفل على DSST الذي يغطي الشبكة. (ه) ضع بعناية كاسيت بلاستيكي ملصق مسبقا أعلى الدرج المعدني الذي يحتوي على النوى المستقيمة. (F) يسكب البارافين المذاب بلطف في الدرج من خلال شبكة الكاسيت لإحاطة وغمر النوى المستقيمة أسفل الكاسيت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: كتلة المتبرع H & E وصمة عار. تخضع الأقسام الملطخة ب H & E من كل كتلة مانحة لمراجعة مراقبة الجودة مع أخصائي علم الأمراض التدريبي الذي يعلق على الشريحة الملطخة H & E بعلامة للإشارة إلى المناطق / الأنسجة ذات الأهمية (أي السرطان القابل للحياة (CA) أو الأنسجة الحميدة (BN) ) للجمع الأساسي ، وكذلك المناطق التي يجب تجنبها (أي ، مناطق الأنسجة الميتة). ثم يتم تحديد المناطق المناسبة من كتلة الأنسجة ، كما هو موضح في H & E المشروحة ، ولكمها ، ودمجها في TMA الذي يتم بناؤه. يمكن بعد ذلك الرجوع إلى اللكمة الأساسية الناتجة عن TMA H & E مرة أخرى إلى المنطقة غير المثقوبة من الكتلة المانحة H & E للتأكد من أن الأنسجة ذات الأهمية قد تم التقاطها في اللكمة الأساسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية . (أ ، ب) أكملت بنجاح طريقة الشريط TMAs و H & Es المصاحبة لها للمراجعة المرضية. (ج) فصل الكاسيت البلاستيكي وكتلة البارافين عند إزالة الكاسيت قبل الأوان من قالب القاعدة المعدنية. (د) طريقة الشريط المكتمل TMA التي تظهر النوى التي تم إسقاطها وترحيلها الناتجة عن الصب المضطرب للبارافين المنصهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMA) الأساسي H&Es. قسم H&E ملطخ ل TMA1 ، يوضح H & Es الفردي لكل نواة نسيج تستخدم لبناء TMA (البقع 1-21) بالإضافة إلى نوى التوجيه (البقع 22 و 23). تم الحصول على الصور المعروضة باستخدام هدف 4x ، مزود بكاميرا رقمية متصلة ببرنامج التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الكيمياء النسيجية المناعية النموذجية والحمض النووي الريبي ISH. تم تقييم أقسام الوجه الكامل من TMA1 من قبل IHC لتعبير vimentin و CD20 وبواسطة RNA ISH لتقييم جودة الحمض النووي الريبي (U6) وحالة EBV عبر EBER ISH. تظهر الصور صورا مثالية لثلاثة نوى، بما في ذلك نسيج ورم واحد (البقعة 9)، ونسيج طبيعي واحد (البقعة 19)، بالإضافة إلى أحد عناصر التحكم في الاتجاه (البقعة 22). يشار إلى إيجابية Vimentin بالتلطيخ البني ، والإيجابية U6 يشار إليها بالتلطيخ الأزرق / الأرجواني ، و EBER بالتلطيخ الأزرق / الأرجواني و CD20 بالتلطيخ البني. تم الحصول على الصور المعروضة باستخدام هدف 4x ، مزود بكاميرا رقمية متصلة ببرنامج التصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: نظرة عامة على أنسجة TMA المبنية والبقع التي تم إجراؤها: يوضح الجدول ما إذا كان (أ) النسيج موجودا في كل بقعة من بقع TMA التمثيلية (ب) الورم موجودا في كل بقعة أنسجة ملطخة H & E و (ج) نتائج أي بقع مناعية نسيجية إضافية أجريت على أقسام TMA المجاورة: "-" تشير إلى سلبية ، n / d = لم يتم. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
ملف تكميلي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
أحد المكونات الأكثر أهمية في عملية بناء TMA هو مراجعة علم الأمراض لكتل مانحة FFPE التي سيتم من خلالها الحصول على نوى TMA4. أثناء المراجعة ، يقوم أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة بفحص قسم الأنسجة الملطخة H & E التمثيلي من كل كتلة مانحة. من الضروري أن يتم إنشاء H & E باستخدام قسم الأنسجة المقطوعة حديثا بحيث يكون أفضل تمثيل لكتلة المانحين المقابلة. لا ينصح باستخدام H & Es الأقدم نظرا لأن أنسجة FFPE هي هياكل ثلاثية الأبعاد يمكن أن يتغير ملف تعريف الأنسجة بشكل كبير مع عمق الكتلة والتقسيم الواسع ؛ قد يكون هذا قد حدث منذ إنشاء H & E ، مما قد يجعل تمثيله لكتلة FFPE غير دقيق. عملية الاستعراض ضرورية لاختيار الحالات المناسبة وتحديد مناطق الأنسجة التي ينبغي الحصول على النوى منها، فضلا عن تحديد المناطق التي ينبغي تجنبها عند جمع النوى. في غياب المراجعة المرضية ، يزداد احتمال تضمين الأنسجة غير المناسبة بشكل كبير. إن إدراج مثل هذه الأنسجة لديه القدرة على جعل TMA المبني غير فعال وغير مناسب للغرض المقصود منه. والأهم من ذلك، أن استخدام مثل هذه الاتفاقات غير الفعالة دون علم ينطوي على إمكانات هائلة لأن يؤدي إلى بيانات خاطئة ومضللة. هذا جنبا إلى جنب مع معرفة أن ملف تعريف أنسجة FFPE ، وبالتالي النوى المشتقة منها ، يمكن أن يتغير بشكل كبير مع زيادة العمق يسلط الضوء على أهمية المراجعة المستمرة لعلم الأمراض طوال عمر كتلة TMA المبنية. من الناحية المثالية ، يجب إنشاء H & Es باستخدامكل قسم 15أو 20 لضمان التقاط أي تغييرات في ملفات تعريف الأنسجة في النوى وتسجيلها. كحد أدنى ، يجب إنشاء H & Es ومراجعته في بداية ونهاية المشروع لمراقبة هذه التغييرات المحتملة. في ضوء هذه النقاط وأهمية TMA كأداة بحثية ، من الضروري أن تكون المراجعة المرضية مضمنة بقوة في عملية بناء TMA وطوال عمر كتلة TMA.
غالبا ما يتم تقسيم كتل FFPE على نطاق واسع أثناء المعالجة التشخيصية الروتينية قبل إطلاقها لأغراض البحث. ونتيجة لذلك ، غالبا ما يكون عمق كتلة المتبرع وبالتالي أطوال كتلة المتبرع الأساسية أقل من الطريقة المتلقية المثالية البالغة 4 مم. لقد أوضحنا هنا كيفية بناء TMAs باستخدام بروتوكول بناء طريقة الشريط ، والميزة الرئيسية له هي توافقه مع النوى من كتل أنسجة FFPE غير المثالية. على الرغم من أن طريقة الشريط ذات قيمة بحثية كبيرة وتوفر طريقة غير مكلفة ومريحة ويمكن الوصول إليها لبناء كتل TMA ، إلا أنها لا تخلو من التحديات والقيود. بالمقارنة مع كل من طرق المستلم الآلية واليدوية ، والتي يمكن أن تستوعب 100-1000s من النوى في كتلة TMA واحدة ، يوصى بحد أقصى 40 نواة ل TMAs التي تم إنشاؤها باستخدام طريقة الشريط9. وهناك قيد آخر يتعلق بسهولة البناء. في طريقة المتلقي ، يتم إدخال النوى المثقوبة فقط في قالب مسبق الصب ، والذي يوفر الاستقرار الأساسي عن طريق تغليف كل نواة في بئرها الفردية الخاصة بها ، وبالتالي منع هجرة النواة بالإضافة إلى تعزيز وضع النواة وفصلها بشكل منتظم للغاية22. علاوة على ذلك ، توفر طريقة المستلم الراحة الاختيارية لكونها يدوية بالكامل وشبه يدوية ومؤتمتة بالكامل. في المقابل ، تتطلب طريقة الشريط اليدوي وضعا دقيقا ولطيفا لكل نواة باليد باستخدام اختيار إبرة. على الرغم من أن عدم وجود قالب مسبق الصب في طريقة الشريط يحول دون التنسيب والفصل المنتظمين للغاية مع طريقة المتلقي ، إلا أنه يتم التغلب على هذا النقص من خلال تضمين شبكة متقلبة. من المهم أن يتم تثبيت الشبكة المتقلبة على وسط الدرج المعدني لتجنب وضع حافة الكتلة ، مما يزيد من خطر فقدان النواة إذا لم يكن هناك بارافين كاف يثبت اللب في مكانه. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن عمليات الفصل الأساسية الصغيرة الممكنة مع طريقة المتلقي لا يمكن تحقيقها باستخدام طريقة الشريط بسبب وضع النواة يدويا والحاجة إلى اختيار الإبرة لتناسب بين النوى المجاورة. يتم وضع النوى بطريقة منتصبة قائمة بذاتها مع أصغر مساحة سطح أو بصمة للقلب تلامس الشبكة المغطاة DSST. يوفر هذا الإعداد استقرارا أساسيا أقل بكثير من طريقة المستلم ويمنح خطرا معززا للانقلاب الأساسي و / أو الترحيل عند صب البارافين المنصهر. في الواقع ، واحدة من أهم الخطوات في البروتوكول هي صب البارافين المنصهر. من الضروري أن يتم ذلك بسرعة عند إزالته من الفرن لضمان أن البارافين سائل تماما وأن يتم إجراء الصب بلطف مع الحد الأدنى من الاضطراب. ومن المثير للاهتمام أن تشن وآخرون طوروا جهازا مساعدا جديدا للغاية ، يشبه الاستنسل مع ثقوب قطرها 2 مم موزعة بالتساوي 7 × 11 ، والتي يتم وضعها فوق كتلة بارافين فارغة لتوجيه الإبر عند إنشاء كتلة المتلقي وعند إدخال نوى كتلة المتبرع23. على الرغم من أنه مصمم للمساعدة في بناء كتلة المتلقي ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف هذا الجهاز مع طريقة الشريط لتوجيه الموضع وتنظيم الفصل وزيادة الاستقرار الأساسي أثناء عملية البناء.
واحدة من أهم المؤثرات على الاستقرار الأساسي هو عدد النوى المدرجة في طريقة الشريط TMA. ويرجع ذلك إلى أنه مع زيادة عدد النوى ، يجب أن ينخفض قطر النواة من أجل استيعاب العدد المتزايد من النوى ، مما يقلل بدوره من البصمة الأساسية التي تلتزم ب DSST. يوصى بقطر أساسي لا يقل عن 1 مم لبناء TMA بطريقة الشريط ، حيث وجدنا أن النوى ذات الأقطار الأصغر غير مستقرة بشكل خاص وعرضة للسقوط حتى مع صب البارافين اللطيف للغاية. شهدت دراسة حديثة تبحث في طريقتين مختلفتين داخليتين استخدمتا إبر 16 G (قطر القلب 1.1 مم) ولكمة قطرها 4 مم خسائر كبيرة في الأنسجة مع 1.1 مم (26.5٪) ولكن ليس النوى 4 مم24. يبدو أن هذا يشير إلى أن النوى الصغيرة يمكن أن تكون مشكلة في العمل معها وليس فقط أثناء البناء. علاوة على ذلك ، قد لا تمثل الأقطار الأصغر كتلة المتبرع الأصلية وكذلك النوى الأكبر ، مما يجعل التفسير المرضي صعبا ويزيد من احتمال تمثيل الأنسجة المانحة غير الدقيقة.
إن إدراج ووضع كتل التوجيه له أهمية عميقة في بناء TMA. ومع ذلك ، فإن هذا له أهمية خاصة لطريقة الشريط التي تم إنشاؤها TMAs. ينبع هذا من حقيقة أن طريقة الشريط تعكس عملية البناء وبالتالي تزيد من خطر الارتباك المكاني. ننصح بتضمين ما يصل إلى ثلاثة نوى توجيه في كل كتلة ، وأن يتم وضعها بعيدا عن نوى العينة من أجل توجيه الكتلة بشكل أفضل. يمكن أن تكون نوى التوجيه عبارة عن نوى مأخوذة من كتل الأنسجة التي تحتوي على أنسجة مختلفة بشكل واضح عن موضوع TMA المبني أو أدوات التوجيه الملونة الخالية من الأنسجة21 ، حيث يكون الأخير مفيدا بشكل خاص لغير علماء الأمراض. جنبا إلى جنب مع وضع النواة المصفوفة غير المنتظمة ، تقلل نوى التوجيه من خطر الارتباك.
ينبع الاختلاف الواضح في الطول الأساسي بين التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMAs) الذي تم بناؤه باستخدام الشريط وطرق المتلقي من إدراج عمق كتلة المانحين في عملية صنع القرار عند اختيار طريقة البناء. يستخدم البروتوكول الموضح هنا عتبة حيث يتم إنشاء TMAs باستخدام طرق الشريط والمتلقي عندما يكون للكتل المانحة أعماق <4 مم و 4 مم ، على التوالي. من المهم ملاحظة أن إدراج عمق كتلة المانحين في اختيار طريقة البناء ليس عالميا. على الرغم من أنه من الممكن بناء TMAs باستخدام أي من الطريقتين بغض النظر عن عمق الكتلة المانحة ، إلا أن النوى الأطول يمكن أن تتداخل مع ، أو يتم إسقاطها أو إمالتها ، وضع الكاسيت البلاستيكي أثناء بناء TMA باستخدام طريقة الشريط. يعتمد اختيار تضمين أو حذف المعايير في عملية صنع القرار على وسائل الراحة المتاحة للمختبر والتكلفة والمنتج النهائي المطلوب. بموجب معلمات هذا البروتوكول ، يكون عدد مقاطع TMA المثبتة على الشريحة والتي يمكن الحصول عليها من طريقة الشريط التي تم إنشاؤها TMA أقل بكثير من تلك التي تم الحصول عليها من TMA الذي تم إنشاؤه بطريقة المستلم. على الرغم من أنه من الممكن إعادة حظر أنسجة FFPE لزيادة عمق كتلة المتبرع وجعلها متوافقة مع طريقة المتلقي ، إلا أن احتمال تحقيق نفس اتجاه الأنسجة داخل إعادة الكتلة منخفض. في المقابل ، قد يتطلب هذا مواجهة كتلة واسعة للحصول على قسم كامل الوجه ، والذي من المحتمل أن يشمل فقدان الأنسجة بشكل كبير. بعد مواجهة الكتلة ، تنتج طريقة الشريط التي تم إنشاؤها TMA ما يقرب من 50 قسما TMA مثبتا على الشريحة مع وجود جميع النوى. ومع ذلك ، فإن العدد الدقيق يختلف من كتلة إلى أخرى ويعتمد على طول النوى المستخدمة لبناء TMA وسماكة الأقسام التي يتم قطعها (5 ميكرومتر مقابل 4 ميكرومتر). وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أنه بسبب اختلاف أطوال النواة، فإن النوى سوف تستنفد في أوقات مختلفة حيث يتم تقسيم التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي تدريجيا؛ سمة تؤكد من جديد على الحاجة إلى المراجعة المرضية المستمرة.
على الرغم من أن طريقة المتلقي تقدم فوائد ومزايا كبيرة على طريقة الشريط ، بما في ذلك عمليات بناء أقل مملة وأكثر سرعة ، فإن طريقة الشريط لا تستهدف مختبرات ذات إنتاجية عالية من ذوي الخبرة. وهو يستهدف المختبر العادي، ولا سيما في البيئات المحدودة الموارد، مع إمكانية الوصول إلى كتل المانحين ذات الأعماق المتغيرة ولكن ليس إلى خدمات البناء TMA. ومع ذلك، يمكن أن تشهد التطبيقات المستقبلية أتمتة هذه الطريقة من أجل تعزيز مجموعة العينات المؤهلة في المختبرات عالية الإنتاجية والقضاء على الحاجة إلى إعادة حجب كتل المانحين. في الختام ، يمكن بسهولة إنشاء بروتوكول بناء طريقة الشريط TMA الموصوف في المختبرات غير المتخصصة دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن. ومع ذلك ، ينصح بأن المستخدمين الجدد يجب أن يستخدموا كتل أنسجة FFPE بدون قيمة ، أو أدوات توجيه ملونة خالية من الأنسجة21 أو حتى كتل بارافين ملونة بدون أنسجة في البداية من أجل التعرف على تقنية طريقة الشريط قبل التقدم إلى بناء TMA باستخدام الأنسجة الثمينة. على الرغم من أن بنائها لا يخلو من المزالق المحتملة ، والتي يجب أن يكون كل من الذين يقومون ببناء واستخدام كتل TMA على دراية بها ، إلا أن طريقة بناء TMA "محلية الصنع" غير المصقولة على ما يبدو يمكن أن تسفر عن TMAs عالية الجودة وذات صلة بيولوجية للبحث. في الواقع ، تعد أقسام TMA النابعة من TMAs التي تم إنشاؤها بطريقة الشريط من بين أكثر عينات الأنسجة طلبا في المستودع الحيوي ACSR.
Disclosures
ليس لدينا ما نكشف عنه.
Acknowledgments
تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل المستودع الحيوي لموارد عينات الإيدز والسرطان (ACSR) الممول من المعاهد الوطنية للصحة (www.acsr1.com) ، UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
