Summary
Этот протокол описывает метод ленты о том, как вручную построить тканевый микрочип с использованием донорских блоков FFPE различной глубины.
Abstract
Тканевый микрочип (TMA) является важным исследовательским инструментом, в котором многие образцы с фиксированным парафином (FFPE) могут быть представлены в одном парафиновом блоке. Это достигается за счет использования тканевых стержней, извлеченных из интересующей области различных донорских блоков FFPE и организации их в один парафиновый блок TMA. После построения участки из завершенного ТМА могут быть использованы для выполнения иммуногистохимических, хромогенных, флуоресцентных гибридизаций in situ (FISH) и исследований РНК ISH для оценки экспрессии белка, а также геномных и транскрипционных изменений во многих образцах одновременно, тем самым сводя к минимуму использование тканей и снижая затраты на реагенты. Существует несколько различных методов строительства TMA. Одним из наиболее распространенных методов строительства является метод получателя, который лучше всего работает с сердечниками той же длины, для которых рекомендуется минимальная длина 4 мм. К сожалению, тканевые блоки могут быть сильно резецированы во время диагностического процесса, что часто приводит к «неидеальным» толщиной донорского блока менее 4 мм. В настоящей статье и видео основное внимание уделяется методу двусторонней клейкой ленты; альтернативный ручной, недорогой, простой в использовании и быстрый метод построения TMA низкой плотности (<50 ядер), который очень совместим с этими неидеальными донорскими блоками. Этот протокол предоставляет пошаговое руководство о том, как построить TMA с использованием этого метода, с акцентом на критическую важность патологического обзора и валидации после строительства.
Introduction
Формалиновые фиксированные парафиновые внедренные (FFPE) ткани широко используются в морфологических и иммуногистохимических исследованиях экспрессии белка1. Однако открытие исследований часто требует исследования нескольких маркеров на большом количестве тканей, которые могут исчерпать драгоценные ткани. Введенный в 1980-х годах, тканевый микрочип (TMA) является важным исследовательским инструментом, который собирает небольшие образцовые области, представляющие интерес, из множества различных тканевых блоков FFPE в один блок парафина, что позволяет исследовать множество образцов тканей одновременно2. Таким образом, TMA избегают чрезмерного использования очень ценных и часто редких образцов тканей, а также снижают затраты, связанные с выполнением последующих применений на многих отдельных образцах 3,4.
Для построения ТМА5 существует несколько различных методов, включая автоматизированные и полуручные подходы 6,7. Большинство этих последних подходов используют метод реципиента, в котором тканевые стержни, пробитые из донорских блоков, вставляются в сборную форму. Однако рекомендуется использовать для этого метода «идеальные» донорские блоки толщиной не менее 4 мм 6,7. К сожалению, донорские блоки, особенно те, которые были широко разделены для клинических диагностических целей до того, как они были предоставлены для исследований, часто имеют толщину менее 4 мм, что может исключить их из использования в конструкции ТМА с использованием метода реципиента, если повторное встраивание для достижения глубины 4 мм невозможно или желательно. Кроме того, в этих процедурах часто может использоваться настольный ручной тканевый микрочип или дорогостоящие автоматизированные инструменты, которые не являются легкодоступными или недорогими для средней исследовательской лаборатории. Напротив, метод двусторонней клейкой ленты или ленточный метод представляет собой ручной метод построения TMA, который совместим с неидеальными донорскими блоками, в которых используются недорогие, широко доступные, многоразовые или одноразовые ручные тканевые микрочипы 8,9,10. Этот метод инвертирует процесс строительства путем отливки блока вокруг перевернутых вертикальных сердечников, которые по завершении заподлицо с верхней частью TMA, независимо от длины сердечника. В результате все образцы присутствуют в разделах TMA при первом секционировании, что позволяет конструктору получить максимальную отдачу от этих неидеальных блоков с самого начала. Таким образом, ленточный метод представляет собой экономически эффективную и осуществимую альтернативу для неспециализированных исследовательских лабораторий.
Конструкция TMA не лишена своих проблем, и следует соблюдать осторожность при выборе тканевых областей для извлечения стержней, что делает патологический обзор важной частью процесса строительства TMA11,12. Таким образом, этот протокол направлен на то, чтобы подчеркнуть глубокую важность патологического обзора в строительстве TMA, выделив некоторые патологические ловушки, связанные со строительством TMA, о которых должны знать лица, строящие и использующие TMA, и почему обзор патологии должен продолжаться в течение всего срока службы блока TMA.
В этом протоколе описываются шаги, предпринятые в Технической основной лаборатории по спиду и раковым образцам (ACSR) для создания TMA из неидеальных донорских блоков с использованием ленточного метода; где ACSR является финансируемым NIH биорепозиторием, предназначенным для сбора и справедливого распределения биообразцов из раковых тканей ВИЧ в целях содействия исследованиям злокачественных новообразований ВИЧ.
Protocol
Все донорские блоки были деидентифицированы во время сбора и использованы для строительства TMA в соответствии с утвержденными протоколами IRB клиники Майо (PR16-000507 и PR2207-02).
1. Обзор патологии
- Извлеките донорские блоки ткани FFPE для использования в конструкции TMA.
- Представьте свежегенерированный гематоксилин и эозин (H&E) окрашенный слайд13 для каждого блока донора ткани FFPE, выбранного для гистологического обзора сертифицированным патологоанатомом для подтверждения диагноза и аннотирования ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание H &E может быть выполнено дома или отправлено в лабораторию патологических основных услуг для окрашивания, как это было в этом протоколе. Одна из наиболее важных концепций, которую следует помнить при построении TMA, заключается в том, что ткани в донорских блоках FFPE представляют собой 3-мерные (3D) структуры, форма, содержание опухоли и жизнеспособность тканей могут значительно изменяться с увеличением глубины блока. Патологоанатом должен определить, основываясь на обзоре окрашенного участка ткани H & E, который представляет собой 2-мерное представление 3D-ткани, лучшую область для извлечения ядра ткани. - Во время гистологического обзора убедитесь, что патологоанатом идентифицирует и аннотирует ткани, представляющие интерес / не представляющие интерес на окрашенных слайдах H & E. Чтобы добавить примечания к слайду, выполните следующие действия.
- Используйте ручку для маркировки слайдов, чтобы обвести интересующую ткань.
- Используя ту же маркировочную ручку, стирайте области в обведенной области, которых следует избегать.
- Используйте маркировочную ручку, чтобы отметить области, которые считаются идеальными для отбора проб и извлечения керна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно помнить, что форма и состав ткани могут меняться с глубиной ткани в блоке. Таким образом, состав ядра ткани может меняться в зависимости от того, где было извлечено ядро, что подчеркивает необходимость продолжения патологического руководства. - Представьте дополнительную ткань для специфических для заболевания иммуногистохимических пятен вместе с H&Es, если это необходимо, чтобы помочь патологическому обзору. Примеры таких пятен включают окрашивание ERBB2 для HER2-положительного рака молочной железы14, HHV-8 для саркомы Капоши15, CD20 для В-клеточных лимфом16, U6 в качестве глобального маркера качества РНК17, EBER для определения положительности вируса Эпштейна-Барра18 и виментин в качестве подтверждения мезенхимального происхождения и маркера контроля качества тканей19,20.
2. Подготовка к строительству ТМА
- Как только обзор патологии будет завершен, составьте окончательный список донорских блоков для использования в конструкции TMA и создайте карту TMA (рисунок 1A). Карта TMA представляет собой схему, описывающую, где сердечники будут расположены в завершенных образцах TMA и скользящих тканей, полученных из полученного TMA.
- Для целей ориентации убедитесь, что карта TMA позволяет избежать размещения ядер в ровной матрице, такой как матрица 3 x 3 или 4 x 4, и включает по крайней мере 1 маркер ориентации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фокусировочные ядра могут быть ядрами, взятыми из бестканевных цветных инструментов ориентации21, или тканевыми блоками, содержащими отчетливо отличающиеся ткани из темы ТМА. В отличие от метода реципиента, когда вертикальные стержни вставляются в предварительно отлитую восковую форму, ленточный метод создает TMA путем заливки расплавленного воска вокруг перевернутых, прямостоячих стержней. Эта инверсия процесса строительства требует второй карты, известной как строительная карта. - Создайте строительную карту, создав зеркальное отражение карты TMA (рисунок 1B). Строительная карта показывает, где каждое ядро должно быть размещено во время строительства, чтобы появиться в правильном месте в завершенном TMA. Сохраните карту строительства.
- После того, как карты будут созданы, подготовьте металлическую базовую форму TMA. Используйте одноразовую бумажную клетчатую сетку для управления размещением сердечника и регулирования разделения сердечника.
ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнительном pdf-файле приведена типовая сетка размером 6 x 7 (42 точечных) для максимум 40 стержней (плюс для двух сердечников/зазоров ориентации) для использования с коммерчески доступными металлическими базовыми формами с внутренними размерами 26 мм x 20 мм. Распечатайте и вырежьте бумажную сетку. - Разрежьте клетчатую сетку по размеру и прикрепите кусок двусторонней палочной ленты (DSST) к задней части сетки. Поместите сетку и ленту DSST в металлический лоток и добавьте второй кусок DSST поверх сетки, т.е. поверх бумажной сетки в металлической базовой форме (рисунок 2A).
3. Размещение ядра
- Наложите патологически рассмотренный H &E на соответствующий тканевой блок и используйте маркировку патологоанатома, чтобы определить, где тканевый блок должен быть пробит (рисунок 2B).
- Пробивайте донорский блок FFPE с помощью ручного сердечника (рисунок 2C) в соответствующем месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечниковые перфораторы доступны в различных диаметрах. Этот метод использует ручной сердечник диаметром 2 мм.- При использовании многоразового сердечника убедитесь, что он очищен до и после каждого удара ткани.
- Извлеките ядро из сердечника и используйте игольчатый отмычек, чтобы поместить выброшенное ядро на перекрестие сетки, покрытой DSST (рисунок 2D). Убедитесь, что, когда ядро помещено на сетку, оно перевернуто и вертикально, так что тканевый конец ядра контактирует с DSST (ткань лицевой стороной вниз). Также убедитесь, что ядро расположено в соответствующем месте на сетке, как указано на карте строительства.
- Повторяйте до тех пор, пока все донорские блоки не будут очищены и ядра не будут размещены в соответствующих положениях.
4. Заполнение TMA
- Включите настольную духовку, установите на 78 °C и дайте достаточно времени, чтобы достичь температуры.
- Для каждого ТМА, который будет изготовлен, расплавите 45 г гранул парафина в контейнере, защищенном от печи.
- Наклейте этикетку на пластиковую кассету и поместите ее поверх металлической базовой формы, содержащей сердечники (рисунок 2E). Высота сердечников не должна превышать глубину металлического лотка, так как высокие сердечники будут наклоняться или опрокидываться при установке кассеты на место.
- Поместите форму с кассетой на лоток, чтобы уловить переполнение, и аккуратно вылейте расплавленный парафин через кассету в лоток с сердечниками (рисунок 2F).
- Позвольте расплавленному парафину перелиться, чтобы убедиться, что в теле ТМА нет пузырьков воздуха. Убедитесь, что парафин заполняется до верхней части кассеты так, чтобы он был встроен и прочно связан с парафиновым блоком после затвердевания парафина.
- Не двигайте и не мешайте блоку и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем охладите при 4 °C в течение дополнительных 30 минут, чтобы полностью затвердеть.
- После полного затвердевания аккуратно отделите форму металлической основы от связанного с кассетой парафинового блока сердечников.
ПРИМЕЧАНИЕ: DSST сохраняет свою адгезивность в процессе строительства и часто прикрепляется к вновь образованному парафиновому блоку. Если применимо, аккуратно удалите DSST и сетку с верхней части теперь завершенного блока TMA.
5. Проверка TMA
- После того, как TMA построен, используйте микротом для секционирования недавно завершенного TMA. Вырежьте один или несколько полнолицых участков ткани.
- Перенесите секции на доваренную водяную баню и смонтируйте секции на горке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Недавно построенные блоки часто требуют облицовки блока (вырезания избытка парафина), чтобы получить полнолицевые участки тканей, которые содержат все ядра. - После высыхания отправьте свежевырезанную скользящую секцию TMA для окрашивания H&E13 и любого дополнительного иммуногистохимического окрашивания, если это необходимо.
- Отправьте окрашенные разделы TMA H & E для патологического обзора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время обзора патологии TMA сертифицированный патологоанатом, предпочтительно тот же патологоанатом, который рассматривал донорские блоки TMA, рассматривает окрашенные ядра TMA H & E, чтобы убедиться, что желаемые ткани, представляющие интерес, действительно присутствуют. Если какие-либо дополнительные тканевые или специфические для заболевания иммуногистохимические пятна были представлены для рассмотрения донорского блока на этапе 1.3.4, эти пятна должны быть повторены на участках TMA и представлены вместе с TMA H & E для патологического обзора. - Запишите результаты патологического валидационного обзора ТМА.
Representative Results
Ленточный метод построения TMA, описанный здесь, является методом выбора, используемым в Лаборатории технического ядра ACSR для сохранения тканей, что, в свою очередь, позволяет бережливо и справедливо распределять высокодрагоценные ткани среди исследователей.
Критическим компонентом процесса строительства является идентификация ткани, представляющей интерес в данном донорском блоке, из которого должно быть получено ядро TMA. Это определяется патологическим обзором, в котором обученный патологоанатом просматривает недавно сгенерированный слайд H&E (рисунок 3). Используя маркер, патологоанатом обводит область на слайде H&E, что указывает на то, что ядро должно быть получено из донорского блока внутри этого круга (рисунок 3). Патологоанатом может также отмечать дополнительные области, такие как некротические области, которых следует избегать, или доброкачественные области, из которых могут быть получены дополнительные тканевые ядра (рисунок 3). Стержни затем пробиваются из указанных областей и включаются в конструкцию ТМА.
Существует два основных показателя успешного завершения TMA ленточным методом. Во-первых, это наличие тканевых стержневых точек в ожидаемых положениях и расстояниях друг от друга, что оценивается путем визуального осмотра. На рисунке 4A,B изображены два успешно полностью ленточных метода TMA и соответствующие им слайды H&E. Визуальный осмотр блоков TMA показывает, что ядра присутствуют и регулярно расположены в каждом TMA. Некоторые из основных строительных проблем, которые могут возникнуть в процессе строительства ленточным методом, включают разделение блока и кассеты из-за преждевременного удаления металлической основы перед восковым затвердеванием (рисунок 4C). Другой потенциальной проблемой, наблюдаемой при построении TMA ленточным методом, является опрокидывание ядра и/или дрейф размещения встроенных ядер (рисунок 4D); проблема, которая может возникнуть из-за чрезмерно турбулентного разлива расплавленного парафина, который может быть дополнительно усилен плохо адгезивным DSST. На рисунке 5 показаны изображения H&E для ядер TMA1. Все, кроме одного ядра (пятно 1), присутствуют в H&E TMA1. На рисунке 5 также показано, что некоторые ядра присутствуют в виде полных круговых тканевых точек (т.е. пятен 4, 6, 13, 17), в то время как другие присутствуют не полностью (т.е. пятна 3, 8, 9, 12). Потеря тканей, испытываемая в этих последних случаях, не является редкостью и может быть связана с недостаточным сечением, необходимым для выявления всех ядер в полном объеме. Альтернативно, наличие неполной или полного отсутствия ткани (т.е. пятна 1) может быть связано с плохим качеством ткани этого ядра, что может привести к потере ткани во время процесса окрашивания.
Второй показатель успеха оценивается с точки зрения того, захватили ли ядра TMA интересующую ткань. Это достигается путем патологического обзора и валидации отдельных ядер TMA H&E (рисунок 5) по сравнению с предварительно пробивным донорским блоком H&Es (Рисунок 3) и, где это необходимо/выполнено, любых других дополнительных иммуногистохимических пятен. На рисунке 6 показаны образцовые пятна, выполненные на TMA1, включая виментин, U6, EBER и CD20. Виментин положительные ткани (коричневое пятно) указывают на то, что все ткани имеют мезенхимальное происхождение и имеют хорошее качество, которое может быть окрашено. Положительность U6 (темно-фиолетовое / синее пятно) указывает на то, что качество РНК в ткани хорошее, и дополняет пятна гибридизации РНК in situ (ISH), такие как EBER, которые нацелены на транскрипты генов. Результаты U6 на рисунке 5 показывают, что качество РНК высокое в ткани лимфомы (пятно 9) и нормальном контроле ориентации ткани миндалин (пятно 22), но не в нормальной ткани в точке 19. После этого окрашивание EBER было отрицательным в нормальной ткани и контроле ориентации, но сильно положительным в ткани лимфомы (пятно 9). Как и ожидалось для тканей лимфоидного происхождения, оба пятна 9 и 22 окрашены положительно для маркера В-клеток CD20, но пятно 19, которое происходит из нормальной ткани спинного мозга, этого не сделало. Результаты окрашивания для всех ядер TMA обобщены в таблице 1 и подтверждают аннотацию ткани для этих тканевых ядер TMA.
Рисунок 1: Карты TMA. После того, как все блоки FFPE и элементы управления ориентацией были выбраны, создается подробная карта, известная как карта TMA (A), с указанием того, где каждое ядро донорского блока будет расположено в готовом блоке. Важно отметить, что при построении TMA с использованием ленточного метода строительная карта (B) является зеркальным отражением карты TMA, поскольку этот метод инвертирует процесс строительства, заливая расплавленный парафин вокруг вертикальных сердечников ткани, а не вставляя сердечники в сборную форму. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Построение TMA с использованием ленточного метода. (A) Слой 2 куски двусторонней стикерной ленты (DSST) и бумажная сетка в следующем порядке на нижней части металлической базовой формы; поместите первый кусок DSST (вставка 2A), затем одноразовую бумажную сетку, а затем второй кусок DSST в нижней части металлической базовой формы. (B) Для каждого донорского блока свежий H & E генерируется и рассматривается патологоанатомом, который отмечает H & E для обозначения интересующей ткани, где пробить блок и, если применимо, где избежать удара для извлечения ядра ткани. (C) Пробить донорский блок с помощью утилизационного или многоразового ручного TMA-перфоратора. (D) Используя иглу, каждая сердцевина помещается вертикально, опухоль лицевой стороной вниз на DSST, покрывающей сетку. (E) Аккуратно поместите предварительно маркированную пластиковую кассету поверх металлического лотка, содержащего вертикальные сердечники. (F) Расплавленный парафин осторожно выливается в лоток через кассетную решетку, чтобы окружить и погрузить вертикальные сердечники под кассету. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Донорский блок H&E окрашивание. Окрашенные участки H&E из каждого донорского блока подвергаются проверке QC с обучающим патологоанатомом, который аннотирует окрашенный H&E слайд маркером, чтобы указать области / ткани, представляющие интерес (т. Е. Жизнеспособные раковые (CA) или доброкачественные (BN) ткани) для сбора ядра, а также области, которые следует избегать (т. Е. некротические участки тканей). Соответствующие области тканевого блока, как указано в аннотированном H&E, затем идентифицируются, пробиваются и включаются в строящийся TMA. Полученный удар ядра TMA H & E затем может быть отнесен обратно к невыпуклой области донорского блока H & E, чтобы подтвердить, что ткань, представляющая интерес, была захвачена в сердечнике. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты. (A,B) Успешно завершенный ленточный метод TMA и сопровождающие их H&Es для патологического обзора. (C) Отделение пластиковой кассеты и парафинового блока при преждевременном извлечении кассеты из металлической базовой формы. (D) Завершен ленточный метод TMA, показывающий опрокидывание и миграцию кернов в результате турбулентного разлива расплавленного парафина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Ядро TMA H&Es. Окрашенный участок H&E для TMA1, показывающий отдельные H&Es для каждого ядра ткани, используемого для построения TMA (пятна 1-21), а также сердечники ориентации (пятна 22 и 23). Показанные изображения были получены с использованием объектива 4x, оснащенного цифровой камерой, подключенной к программному обеспечению для обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Примерный иммуногистохимический и РНК ISH. Полнолицевые участки из TMA1 были оценены IHC для экспрессии виментина и CD20 и РНК ISH для оценки качества РНК (U6) и статуса EBV через EBER ISH. Изображения показывают примерные изображения для трех ядер, включая одну опухолевую ткань (пятно 9), одну нормальную ткань (пятно 19), а также один из двух элементов управления ориентацией (пятно 22). Позитивность виментина обозначается коричневым окрашиванием, положительность U6 обозначается синим / фиолетовым окрашиванием, EBER - синим / фиолетовым окрашиванием и CD20 - коричневым окрашиванием. Показанные изображения были получены с использованием объектива 4x, оснащенного цифровой камерой, подключенной к программному обеспечению для обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Обзор выполненных конструируемых ТМА тканей и пятен: В таблице указано, присутствует ли (а) ткань в каждом из репрезентативных пятен ТМА, (б) опухоль присутствует в каждом окрашенном H&E пятне ткани и (в) результаты любых дополнительных иммуногистологических пятен, выполненных на соседних участках ТМА: «-» указывает на отрицательный, n/d = не сделано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Одним из наиболее важных компонентов процесса строительства TMA является патологический обзор донорских блоков FFPE, из которых будут получены ядра TMA4. Во время обзора сертифицированный патологоанатом исследует репрезентативный участок окрашенной ткани H&E из каждого донорского блока. Крайне важно, чтобы H & E генерировался с использованием свежеразрезанного участка ткани, чтобы он был лучшим представлением соответствующего донорского блока. Использование более старых H&Es не рекомендуется, учитывая, что ткани FFPE представляют собой 3-мерные структуры, профиль ткани которых может значительно изменяться с глубиной блока и обширным сечением; это могло произойти с тех пор, как был сгенерирован H&E, что потенциально делает его представление блока FFPE неточным. Процесс обзора имеет важное значение для отбора подходящих случаев и выявления участков тканей, из которых должны быть получены керны, а также для выявления областей, которых следует избегать при сборе кернов. При отсутствии патологического обзора вероятность включения неподходящих тканей значительно возрастает. Включение таких тканей может сделать построенную ТМА неэффективной и непригодной для ее целевого назначения. Важно отметить, что неосознанное использование таких неэффективных TMA имеет огромный потенциал для получения ложных и вводящих в заблуждение данных. Это в сочетании со знанием того, что профиль тканей FFPE и, следовательно, их производных ядер может значительно изменяться с увеличением глубины, подчеркивает важность продолжения обзора патологии в течение всего срока службы построенного блока TMA. В идеале H&Es должен генерироваться с использованием каждой15-й или20-й секции, чтобы обеспечить захват и регистрацию любых изменений в профилях тканей ядер. Как минимум, H&Es должны генерироваться и пересматриваться в начале и в конце проекта для мониторинга этих потенциальных изменений. В свете этих моментов и важности TMA как исследовательского инструмента крайне важно, чтобы патологический обзор прочно вошел в процесс строительства TMA и на протяжении всего срока службы блока TMA.
Блоки FFPE часто широко секционируются во время рутинной диагностической обработки, прежде чем быть выпущенными для исследовательских целей. В результате глубина донорского блока и, следовательно, длина ядра донорского блока часто меньше, чем идеальный метод реципиента 4 мм. Здесь мы продемонстрировали, как конструировать TMA с использованием протокола построения ленточного метода, основным преимуществом которого является его совместимость с сердечниками из неидеальных тканевых блоков FFPE. Хотя ленточный метод имеет большую исследовательскую ценность и предлагает недорогой, удобный и доступный метод построения блоков TMA, он не лишен своих проблем и ограничений. По сравнению с автоматизированными и ручными методами реципиента, которые могут вместить 100-1000 ядер в одном блоке TMA, для TMA, для TMA, построенных с использованием ленточного метода9, рекомендуется максимум 40 ядер. Еще одно ограничение касается простоты строительства. В методе реципиента перфорированные сердечники просто вставляются в сборную форму, которая обеспечивает стабильность сердечника путем заключения каждого сердечника в его собственную индивидуальную скважину, тем самым предотвращая миграцию ядра, а также способствуя очень регулярному размещению и разделениюядра 22. Кроме того, метод получателя предлагает дополнительное удобство быть полностью ручным, полуручным и полностью автоматизированным. Напротив, ручной метод ленты требует осторожного, бережного размещения каждого стержня вручную с помощью игольчатого отмычка. Хотя отсутствие сборной формы в ленточном методе исключает очень регулярное размещение и разделение, испытываемое с помощью метода реципиента, этот недостаток преодолевается путем включения клетчатой сетки. Важно, чтобы клетчатая сетка прикреплялась к центру металлического лотка, чтобы избежать размещения кромки блока, что увеличивает риск потери сердечника при недостаточном количестве парафина, удерживающего сердечник на месте. Следует также отметить, что разделение небольших сердечников, возможное с помощью метода реципиента, не может быть достигнуто с помощью ленточного метода из-за ручного размещения сердечника и необходимости того, чтобы игольчатый отмычек помещался между соседними сердечниками. Сердечники размещаются в отдельно стоящем вертикальном режиме с наименьшей площадью поверхности или площадью сердечника, контактирующего с сеткой, покрытой DSST. Эта установка обеспечивает значительно меньшую стабильность ядра, чем метод реципиента, и повышает риск опрокидывания и/или миграции ядра при заливке расплавленного парафина. Действительно, одним из наиболее важных шагов в протоколе является заливка расплавленного парафина. Важно, чтобы это было сделано быстро после извлечения из печи, чтобы убедиться, что парафин полностью жидкий и что заливка выполняется осторожно с минимальной турбулентностью. Интересно, что Chen et al. разработали очень новое вспомогательное устройство, похожее на трафарет с 7 x 11 равномерно распределенными отверстиями диаметром 2 мм, которое помещается поверх пустого парафинового блока для направления игл при создании блока реципиента и при вставке донорского блокасердечников 23. Несмотря на то, что такое устройство предназначено для облегчения строительства блока получателя, оно может быть легко адаптировано к ленточному методу для управления размещением, регулирования разделения и повышения стабильности сердечника во время процесса строительства.
Одним из наиболее значимых эффекторов стабильности ядра является количество ядер, входящих в ленточный метод TMA. Это связано с тем, что по мере увеличения числа ядер диаметр ядра должен уменьшаться, чтобы вместить растущее число ядер, что, в свою очередь, уменьшает площадь ядра, придерживающуюся DSST. Минимальный диаметр сердечника 1 мм рекомендуется для конструкции TMA ленточным методом, так как мы обнаружили, что сердечники с меньшими диаметрами особенно нестабильны и склонны к опрокидыванию даже при очень щадящем заливке парафином. Недавнее исследование, изучающее два различных внутренних метода, в которых использовались иглы 16 G (диаметр сердечника 1,1 мм) и перфоратор диаметром 4 мм, испытало значительные потери тканей с 1,1 мм (26,5%), но не с сердечниками 4 мм24. Это, по-видимому, указывает на то, что с небольшими ядрами может быть проблематично работать, а не только во время строительства. Кроме того, меньшие диаметры могут не представлять исходный донорский блок, а также более крупные ядра, что затрудняет патологическую интерпретацию и увеличивает вероятность неточного представления донорской ткани.
Включение и размещение блоков ориентации имеет огромное значение в строительстве TMA. Однако это имеет особое значение для конструируемых ТМА ленточным методом. Это связано с тем, что ленточный метод инвертирует процесс строительства, тем самым увеличивая риск пространственной дезориентации. Мы советуем включать до трех ядер ориентации в каждый блок и размещать их вдали от кернов образца, чтобы наилучшим образом ориентировать блок. Ориентационные ядра могут быть ядрами, взятыми из тканевых блоков, содержащих отчетливо отличающиеся ткани из темы построенного TMA или бестканевого цвета инструменты ориентации21, где последний особенно полезен для непатологоанатомов. В сочетании с нерегулярным матричным шаблонным размещением ядер ориентации ядра минимизируют риск дезориентации.
Выраженная разница в длине керна между TMA, построенными с использованием ленточного и реципиентного методов, обусловлена включением глубины донорского блока в процесс принятия решений при выборе метода построения. Протокол, описанный здесь, использует пороговое значение, при котором TMA строятся с использованием ленточного и реципиентного методов, когда донорские блоки имеют глубину <4 мм и 4 мм соответственно. Важно отметить, что включение глубины донорского блока в выбор метода строительства не является универсальным. Хотя TMA могут быть построены с использованием любого метода независимо от глубины донорского блока, более высокие сердечники могут мешать и или быть опрокинутыми или наклоненными размещением пластиковой кассеты во время строительства TMA с использованием ленточного метода. Выбор включения или исключения критериев в процессе принятия решений зависит от удобств, доступных для лаборатории, стоимости и желаемого конечного продукта. По параметрам этого протокола количество смонтированных на слайдах участков TMA, которые могут быть получены из ленточного метода, построенного TMA, значительно меньше, чем количество полученных из метода реципиента, построенного TMA. Хотя можно повторно блокировать ткани FFPE, чтобы увеличить глубину донорского блока и сделать их совместимыми с методом реципиента, вероятность достижения той же ориентации ткани в пределах повторного блока низка. В свою очередь, это может потребовать обширной облицовки блока для получения полного участка лица, что, вероятно, будет включать значительную потерю тканей. После облицовки блока ленточным методом TMA получается около 50 секций TMA, установленных на слайдах, со всеми присутствующими сердечниками. Однако точное число будет варьироваться от блока к блоку и зависит от длины сердечников, используемых для построения TMA, и толщины разрезаемых секций (5 мкм против 4 мкм). Кроме того, следует также отметить, что из-за их различной длины ядра ядра будут исчерпываться в разное время по мере постепенного разделения TMA; атрибут, который вновь подчеркивает необходимость продолжения патологического обзора.
Хотя метод реципиента предлагает значительные преимущества и преимущества по сравнению с ленточным методом, включая менее утомительные и более быстрые процессы строительства, ленточный метод не предназначен для опытных лабораторий с высокой пропускной способностью. Он предназначен для средних лабораторий, особенно в условиях ограниченных ресурсов, с доступом к донорским блокам различной глубины, но не к строительным услугам TMA. Тем не менее, в будущих приложениях можно было бы автоматизировать этот метод, чтобы расширить пул приемлемых образцов в лабораториях с высокой пропускной способностью и устранить необходимость повторной блокировки донорских блоков. В заключение, описанный протокол построения ленточного метода TMA может быть легко установлен в неспециализированных лабораториях без необходимости дорогостоящего оборудования. Тем не менее, рекомендуется, чтобы новые пользователи сначала использовали тканевые блоки FFPE, не имеющие ценности, инструменты ориентации21 без ткани без ткани или даже цветные парафиновые блоки без ткани, чтобы ознакомиться с техникой ленточного метода, прежде чем переходить к строительству TMA с использованием драгоценных тканей. Хотя их строительство не лишено потенциальных ловушек, о которых должны знать как те, кто строит и использует блоки TMA, этот, казалось бы, неполированный «самодельный» метод строительства TMA может дать высококачественные, биологически значимые TMA для исследований. Действительно, участки TMA, полученные из ТМА, построенные ленточным методом, являются одними из наиболее востребованных образцов тканей в биорепозитории ACSR.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование этой работы было предоставлено финансируемым NIH биорепозиторием ПО СПИДу и раку (ACSR) (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
