Summary
Dit protocol schetst de tapemethode voor het handmatig construeren van een weefselmicroarray met behulp van FFPE-donorblokken van verschillende diepten.
Abstract
De weefselmicroarray (TMA) is een belangrijk onderzoeksinstrument waarin veel formaline fixed paraffin embedded (FFPE) monsters kunnen worden weergegeven in een enkel paraffineblok. Dit wordt bereikt door weefselkernen te gebruiken die zijn geëxtraheerd uit het interessegebied van verschillende donor-FFPE-blokken en deze in een enkel TMA-paraffineblok te rangschikken. Eenmaal geconstrueerd, kunnen secties uit de voltooide TMA worden gebruikt om immunohistochemische, chromogene, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en RNA ISH-studies uit te voeren om eiwitexpressie en genomische en transcriptionele veranderingen in veel monsters tegelijkertijd te beoordelen, waardoor weefselgebruik wordt geminimaliseerd en de reagenskosten worden verlaagd. Er zijn verschillende TMA-bouwtechnieken. Een van de meest voorkomende constructiemethoden is de ontvangermethode, die het beste werkt met kernen van dezelfde lengte waarvoor een minimale lengte van 4 mm wordt aanbevolen. Helaas kunnen weefselblokken tijdens het diagnostische proces zwaar worden gereseceerd, wat vaak resulteert in "niet-ideale" donorblokdiktes van minder dan 4 mm. Het huidige artikel en de video richten zich op de dubbelzijdige plakbandmethode; een alternatieve handmatige, goedkope, gebruiksvriendelijke en snelle methode om TMA's met lage dichtheid (<50 kernen) te construeren die zeer compatibel zijn met deze niet-ideale donorblokken. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het construeren van een TMA met behulp van deze methode, met een focus op het kritieke belang van pathologische beoordeling en validatie na de bouw.
Introduction
Formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefsels worden op grote schaal gebruikt in morfologische en immunohistochemische eiwitexpressiestudies1. Ontdekkingsonderzoek vereist echter vaak onderzoek van verschillende markers op een groot aantal weefsels, die kostbare weefsels kunnen uitputten. Geïntroduceerd in de jaren 1980, is de weefselmicroarray (TMA) een belangrijk onderzoeksinstrument dat kleine voorbeeldige interessegebieden uit veel verschillende FFPE-weefselblokken samenvoegt tot een enkel paraffineblok, waardoor veel weefselmonsters tegelijkertijd kunnen worden onderzocht2. Zo vermijden TMA's overmatig gebruik van zeer kostbare en vaak zeldzame weefselmonsters en verlagen ze ook de kosten die gepaard gaan met het uitvoeren van downstream-toepassingen op veel individuele monsters 3,4.
Er bestaan verschillende technieken voor de constructie van TMA's5, waaronder geautomatiseerde en semi-handmatige benaderingen 6,7. De meeste van deze laatste benaderingen gebruiken de ontvangermethode, waarbij weefselkernen die uit donorblokken worden gestanst, in een prefab-mal worden ingebracht. Wel wordt aanbevolen om voor deze methode "ideale" donorblokken te gebruiken die minimaal 4 mm dik zijn 6,7. Helaas zijn donorblokken, met name die welke uitgebreid zijn gesneden voor klinische diagnostische doeleinden voordat ze beschikbaar werden gesteld voor onderzoek, vaak minder dan 4 mm dik, waardoor ze kunnen worden uitgesloten van gebruik in TMA-constructie met behulp van de ontvangermethode, als herinbedding om een diepte van 4 mm te bereiken niet mogelijk of wenselijk is. Bovendien kunnen deze procedures vaak gebruik maken van een benchtop handmatige weefselmicroarrayer of dure geautomatiseerde instrumenten die niet gemakkelijk toegankelijk of betaalbaar zijn voor het gemiddelde onderzoekslaboratorium. Daarentegen is de dubbelzijdige tapemethode of tapemethode een handmatige TMA-constructiemethode die compatibel is met niet-ideale donorblokken die goedkope, algemeen verkrijgbare, herbruikbare of wegwerpbare hand-held tissue microarrayersgebruiken 8,9,10. Deze methode keert het bouwproces om door het blok rond omgekeerde rechtopstaande kernen te gieten die na voltooiing gelijk zijn met de bovenkant van de TMA, ongeacht de kernlengte. Als gevolg hiervan zijn alle monsters aanwezig in TMA-secties wanneer ze voor het eerst worden gesegmenteerd, waardoor de constructor vanaf het begin het meeste uit deze niet-ideale blokken kan halen. De tapemethode vormt dus een kosteneffectief en haalbaar alternatief voor de niet-gespecialiseerde onderzoekslaboratoria.
TMA-constructie is niet zonder uitdagingen en voorzichtigheid is geboden bij het selecteren van de weefselgebieden waaruit de kernen moeten worden geëxtraheerd, waardoor pathologische beoordeling een cruciaal onderdeel is van het TMA-bouwproces11,12. Dit protocol is dus bedoeld om het diepgaande belang van pathologische beoordeling in TMA-constructie te onderstrepen door enkele van de pathologische valkuilen te benadrukken die verband houden met TMA-constructie waarvan personen die TMA's bouwen en gebruiken zich bewust moeten zijn, en waarom pathologiebeoordeling moet doorgaan gedurende de levensduur van een TMA-blok.
Dit protocol schetst de stappen die zijn genomen in het AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory om TMA's te bouwen uit niet-ideale donorblokken met behulp van de tapemethode; waar de ACSR een door de NIH gefinancierde biorepository is die zich toelegt op het verzamelen en rechtvaardig verdelen van biospecimens uit hiv-kankerweefsels om hiv-maligniteitsonderzoek te bevorderen.
Protocol
Alle donorblokken werden tijdens de verzameling gedeïdentificeerd en gebruikt voor TMA-constructie in overeenstemming met goedgekeurde Mayo Clinic IRB-protocollen (PR16-000507 en PR2207-02).
1. Pathologie review
- Haal de FFPE-weefseldonorblokken op voor gebruik in de TMA-constructie.
- Dien een vers gegenereerde hematoxyline en eosine (H & E) gekleurd dia13 in voor elk FFPE-weefseldonorblok dat is geselecteerd voor histologische beoordeling door een door de raad gecertificeerde patholoog om de diagnose te bevestigen en het weefsel te annoteren.
OPMERKING: H & E-kleuring kan in huis worden uitgevoerd of naar een pathologisch kernservicelaboratorium worden gestuurd voor kleuring, zoals het geval was in dit protocol. Een van de belangrijkste concepten om te onthouden bij het construeren van TMA's is dat de weefsels in de FFPE-donorblokken 3-dimensionale (3D) structuren zijn waarvan de vorm, tumorinhoud en weefsel levensvatbaarheid aanzienlijk kunnen veranderen met toenemende blokdiepte. De patholoog moet, op basis van de beoordeling van de H & E-gekleurde weefselsectie, een 2-dimensionale weergave van het 3D-weefsel, het beste gebied bepalen om de weefselkern uit te extraheren. - Zorg er tijdens de histologische beoordeling voor dat de patholoog de weefsels van belang / niet van belang identificeert en annoteert op de H & E-gekleurde dia's. Volg de onderstaande stappen om de dia te annoteren.
- Gebruik een pen voor het markeren van dia's om het gewenste weefsel te omcirkelen.
- Gebruik dezelfde markeerpen om gebieden binnen het omcirkelde gebied uit te wissen die moeten worden vermeden.
- Gebruik de markeerpen om de gebieden te markeren die ideaal worden geacht voor kernbemonstering en -extractie.
OPMERKING: Het is belangrijk om te onthouden dat de vorm en samenstelling van het weefsel kunnen veranderen met de weefseldiepte in het blok. De samenstelling van de weefselkern kan dus veranderen, afhankelijk van waar de kern werd geëxtraheerd, wat de noodzaak van voortdurende pathologische begeleiding benadrukt. - Dien indien nodig extra weefsel in voor ziektespecifieke immunohistochemische vlekken naast de H & E's om de pathologische beoordeling te ondersteunen. Voorbeelden van dergelijke vlekken zijn ERBB2-kleuring voor HER2-positieve borstkanker14, HHV-8 voor Kaposi-sarcoom15, CD20 voor B-cellymfomen16, U6 als wereldwijde marker voor RNA-kwaliteit17, EBER om epstein-barr-virus positiviteit18 te bepalen en Vimentin als bevestiging van mesenchymale oorsprong en weefselkwaliteitscontrolemarker19,20.
2. Voorbereiding voor TMA-constructie
- Zodra de pathologiebeoordeling is voltooid, stelt u de definitieve lijst samen van donorblokken die in de TMA-constructie moeten worden gebruikt en maakt u een TMA-kaart (figuur 1A). De TMA-kaart is een schema dat schetst waar de kernen zich zullen bevinden in de voltooide TMA en op dia gemonteerde weefselmonsters verkregen uit de resulterende TMA.
- Zorg er voor oriëntatiedoeleinden voor dat de TMA-kaart het plaatsen van kernen in een gelijkmatige matrix zoals een matrix van 3 x 3 of 4 x 4 vermijdt en ten minste 1 oriëntatiemarkering bevat.
OPMERKING: Oriëntatiekernen kunnen kernen zijn die zijn genomen van weefselvrije gekleurde oriëntatiehulpmiddelen21, of weefselblokken die duidelijk verschillende weefsels bevatten dan het thema van de TMA. In tegenstelling tot de ontvangermethode waarbij rechtopstaande kernen in een pre-gegoten wasvorm worden ingebracht, creëert de tapemethode een TMA door gesmolten was rond omgekeerde, rechtopstaande kernen te gieten. Deze omkering van het bouwproces vereist een tweede kaart die bekend staat als de bouwkaart. - Maak de bouwkaart door een spiegelbeeld van de TMA-kaart te maken (figuur 1B). De bouwkaart laat zien waar elke kern tijdens de bouw moet worden geplaatst om op de juiste locatie in de voltooide TMA te verschijnen. Sla de bouwkaart op.
- Zodra de kaarten zijn gemaakt, bereidt u de metalen TMA-basismal voor. Gebruik een wegwerppapier geblokt rooster om de plaatsing van de kern te begeleiden en de kernscheiding te regelen.
OPMERKING: Een sjabloonraster van 6 x 7 (42 plaatsen) voor maximaal 40 kernen (plus voor twee oriëntatiekernen/openingen) voor gebruik met in de handel verkrijgbare metalen basismallen met interne afmetingen van 26 mm x 20 mm is opgenomen in de aanvullende pdf. Print en knip het papierraster uit. - Knip het geblokte raster op maat en bevestig een stuk dubbelzijdige plakband (DSST) aan de achterkant van het raster. Plaats het rooster en de DSST-tape in de metalen lade en voeg een tweede stuk DSST toe aan de bovenkant van het raster, d.w.z. bovenop het papierraster in de metalen basisvorm (figuur 2A).
3. Kernplaatsing
- Leg de pathologisch beoordeelde H&E over het overeenkomstige weefselblok en gebruik de patholoogmarkeringen om te identificeren waar het weefselblok moet worden gestanst (figuur 2B).
- Pons het FFPE-donorblok met behulp van een handmatige kernpons (figuur 2C) op de juiste plaats.
OPMERKING: Kernponsen zijn verkrijgbaar in verschillende diameters. Deze methode maakt gebruik van een handheld kernpons met een diameter van 2 mm.- Als u een herbruikbare kernpons gebruikt, zorg er dan voor dat deze voor en na elke weefselpons wordt gereinigd.
- Werp de kern uit de kernpons en gebruik een naaldprikker om de uitgeworpen kern op het vizier van het met DSST bedekte raster te plaatsen (figuur 2D). Zorg ervoor dat wanneer de kern op het rooster wordt geplaatst, deze omgekeerd en rechtop staat, zodat het weefseleinde van de kern in contact komt met de DSST (weefsel-face-down). Zorg er ook voor dat de kern op de juiste positie op het raster wordt geplaatst zoals aangegeven door de bouwkaart.
- Herhaal dit totdat alle donorblokken zijn gekernd en de kernen op hun juiste posities zijn geplaatst.
4. Het voltooien van de TMA
- Zet de tafeloven aan, ingesteld op 78 °C, en geef voldoende tijd om op temperatuur te komen.
- Smelt voor elke te bouwen TMA 45 g paraffinekorrels in een ovenbestendige container.
- Label een plastic cassette en plaats deze bovenop de metalen basisvorm met de kernen (figuur 2E). De hoogte van de kernen mag de diepte van de metalen bak niet overschrijden, omdat hoge kernen worden gekanteld of omgevallen wanneer de cassette op zijn plaats wordt geplaatst.
- Plaats de vorm met de cassette op een bakje om overloop op te vangen en giet de gesmolten paraffine voorzichtig door de cassette in de lade met kernen (figuur 2F).
- Laat de gesmolten paraffine overlopen om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in het lichaam van de TMA zijn. Zorg ervoor dat de paraffine zich tot aan de bovenkant van de cassette vult, zodat deze is ingebed in en stevig gebonden aan het paraffineblok zodra de paraffine is gestold.
- Verplaats of verstoor het blok niet en laat het gedurende 30 minuten op kamertemperatuur afkoelen. Koel vervolgens nog eens 30 minuten bij 4 °C om volledig te stollen.
- Eenmaal volledig gestold, scheidt u de metalen basismal voorzichtig van het cassettegebonden paraffineblok van kernen.
OPMERKING: De DSST behoudt zijn kleefkracht tijdens het bouwproces en wordt vaak bevestigd aan het nieuw gevormde paraffineblok. Verwijder indien van toepassing voorzichtig de DSST en het raster van de bovenkant van het nu voltooide TMA-blok.
5. Valideren van de TMA
- Zodra de TMA is geconstrueerd, gebruikt u een microtoom om de nieuw voltooide TMA te sectieren. Knip een of meer volledige weefselsecties.
- Breng de secties over naar het voorverwarmde waterbad en schuif de secties.
OPMERKING: Nieuw geconstrueerde blokken vereisen vaak blokbekleding (wegsnijden van overtollige paraffine) om volledige gezichtsweefselsecties te verkrijgen die alle kernen bevatten. - Eenmaal droog, dient u een vers gesneden op een dia gemonteerde TMA-sectie in voor H & E-kleuring13 en eventuele extra immunohistochemische kleuring, indien nodig.
- Dien de bevlekte TMA H & E-secties in voor pathologische beoordeling.
OPMERKING: Tijdens de TMA-pathologiebeoordeling beoordeelt een door de raad gecertificeerde patholoog, bij voorkeur dezelfde patholoog die de TMA-donorblokken heeft beoordeeld, de TMA H & E-gekleurde kernen om ervoor te zorgen dat de gewenste weefsels van belang inderdaad aanwezig zijn. Als er extra weefsel- of ziektespecifieke immunohistochemische vlekken zijn ingediend voor beoordeling van het donorblok in stap 1.3.4, moeten deze vlekken worden herhaald op TMA-secties en samen met de TMA H & E worden ingediend voor pathologische beoordeling. - Noteer de resultaten van de pathologische validatiebeoordeling van TMA.
Representative Results
De tapemethode van TMA-constructie die hier wordt beschreven, is de voorkeursmethode die wordt gebruikt in het ACSR Technical Core Laboratory om weefsels te conserveren, wat op zijn beurt een zuinige en rechtvaardige verdeling van zeer kostbare weefsels aan onderzoekers mogelijk maakt.
Een cruciaal onderdeel van het bouwproces is de identificatie van het weefsel dat van belang is in een bepaald donorblok van waaruit de TMA-kern moet worden verkregen. Dit wordt bepaald door pathologische review waarbij een getrainde patholoog een vers gegenereerde H&E-dia beoordeelt (figuur 3). Met behulp van een marker cirkelt de patholoog rond het gebied op de H&E-dia, wat aangeeft dat de kern moet worden verkregen uit het donorblok binnen deze cirkel (figuur 3). De patholoog kan ook extra gebieden markeren, zoals necrotische gebieden, die moeten worden vermeden, of goedaardige gebieden waaruit extra weefselkernen kunnen worden verkregen (figuur 3). Kernen worden vervolgens uit de aangegeven gebieden gestanst en opgenomen in de constructie van de TMA.
Er zijn twee belangrijke statistieken voor het succesvol voltooien van een TMA door de tapemethode. De eerste is de aanwezigheid van weefselkernpunten op de verwachte posities en afstanden van elkaar, die wordt beoordeeld door visuele inspectie. Figuur 4A,B toont twee succesvol volledig tape methode TMA's en hun bijbehorende H&E dia's. Visuele inspectie van de TMA-blokken laat zien dat de kernen aanwezig zijn en regelmatig in elke TMA worden geplaatst. Enkele van de belangrijkste constructieproblemen die zich tijdens het bouwproces van de tapemethode kunnen voordoen, zijn scheiding van het blok en de cassette als gevolg van voortijdige verwijdering van de metalen basis voorafgaand aan wasstolling (figuur 4C). Een ander potentieel probleem dat wordt waargenomen met tapemethode geconstrueerde TMA's is kerntorteling en of plaatsingsdrift van de ingebedde kernen (figuur 4D); een probleem dat kan ontstaan door overmatig turbulent gieten van de gesmolten paraffine, die verder kan worden versterkt door slecht klevende DSST. Figuur 5 toont de H&E-beelden voor de kernen van TMA1. Op één na zijn alle kernen (plek 1) aanwezig in de H&E van TMA1. Figuur 5 laat ook zien dat sommige kernen aanwezig zijn als volledige cirkelvormige weefselpunten (d.w.z. vlekken 4, 6, 13, 17), terwijl andere niet volledig aanwezig zijn (d.w.z. vlekken 3, 8, 9, 12). Het weefselverlies dat in deze laatste gevallen wordt ervaren, is niet ongewoon en kan te wijten zijn aan onvoldoende secties die nodig zijn om alle kernen volledig te onthullen. Als alternatief kan de aanwezigheid van onvolledig of de totale afwezigheid van weefsel (d.w.z. punt 1) voortkomen uit een slechte weefselkwaliteit van die kern, wat kan leiden tot weefselverlies tijdens het kleuringsproces.
De tweede maatstaf voor succes wordt beoordeeld in termen van de vraag of de TMA-kernen al dan niet het weefsel van belang hebben vastgelegd. Dit wordt bereikt door pathologische beoordeling en validatie van de individuele TMA H&E-kernen (figuur 5) in vergelijking met het voorgestanste donorblok H&E's (figuur 3), en waar nodig/uitgevoerd andere extra immunohistochemische vlekken uitgevoerd. Figuur 6 toont voorbeeldige vlekken uitgevoerd op TMA1, waaronder Vimentin, U6, EBER en CD20. Vimentin-positieve weefsels (bruine vlek) geven aan dat alle weefsels van mesenchymale oorsprong zijn en van goede kwaliteit zijn die kunnen worden gekleurd. U6-positiviteit (donkerpaarse/blauwe vlek) geeft aan dat de RNA-kwaliteit in het weefsel goed is en complimenteert RNA in situ hybridisatie (ISH) vlekken zoals EBER, die zich richten op gentranscripten. De U6-resultaten in figuur 5 geven aan dat de RNA-kwaliteit hoog is in het lymfoomweefsel (spot 9) en de normale amandelweefseloriëntatiecontrole (spot 22), maar niet in het normale weefsel op plek 19. Na deze EBER was de kleuring negatief in het normale weefsel en de oriëntatiecontrole, maar sterk positief in het lymfoomweefsel (spot 9). Zoals verwacht voor weefsels van lymfoïde oorsprong, kleurden zowel vlekken 9 als 22 positief voor de B-celmarker CD20, maar spot 19, die voortkomt uit normaal ruggenmergweefsel, niet. De kleuringsresultaten voor alle TMA-kernen zijn samengevat in tabel 1 en bevestigen de weefselannotatie voor deze TMA-weefselkernen.
Figuur 1: TMA kaarten. Zodra alle FFPE-blokken en oriëntatieregelaars zijn geselecteerd, wordt een gedetailleerde kaart gemaakt, bekend als een TMA-kaart (A), waarin wordt aangegeven waar elke donorblokkern zich in het voltooide blok zal bevinden. Het is belangrijk op te merken dat bij het construeren van een TMA met behulp van de tapemethode, de bouwkaart (B) een spiegelbeeld is van de TMA-kaart, omdat deze methode het bouwproces omkeert en gesmolten paraffine rond rechtopstaande weefselkernen giet in plaats van de kernen in een prefab-mal in te brengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Het bouwen van de TMA met behulp van de tapemethode. (A) Laag 2 stukken dubbelzijdige plakband (DSST) en een papieren raster in de volgende volgorde op de bodem van de metalen basismal; plaats het eerste stuk DSST (2A-inzetstuk), gevolgd door het wegwerppapierraster en vervolgens het tweede stuk DSST aan de onderkant van de metalen basisvorm. (B) Voor elk donorblok wordt een nieuwe H&E gegenereerd en beoordeeld door een patholoog die de H&E markeert om het betreffende weefsel aan te geven, waar het blok moet worden geslagen en, indien van toepassing, waar moet worden vermeden dat er wordt geponst om een weefselkern te extraheren. (C) Pons het donorblok met een verwijderings- of herbruikbare handheld TMA-pons. (D) Met behulp van een naaldprikker wordt elke kern rechtop geplaatst, tumor naar beneden op de DSST die het rooster bedekt. (E) Plaats voorzichtig een voorgelabelde plastic cassette bovenop de metalen lade met de rechtopstaande kernen. (F) Gesmolten paraffine wordt voorzichtig door het cassetterooster in de lade gegoten om de rechtopstaande kernen onder de cassette te omringen en onder te dompelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Donorblok H&E vlek. H & E-gekleurde secties van elk donorblok worden onderworpen aan QC-beoordeling met een trainingspatholoog die de H & E-gekleurde dia met een marker annoteert om de gebieden / weefsels van belang aan te geven (dwz levensvatbare kanker (CA) of goedaardige (BN) weefsels) voor kernverzameling, evenals gebieden die moeten worden vermeden (dwz, necrotische weefselgebieden). De juiste delen van het weefselblok, zoals aangegeven door de geannoteerde H & E, worden vervolgens geïdentificeerd, gestanst en opgenomen in de TMA die wordt geconstrueerd. De resulterende TMA-kernpunch H & E kan vervolgens worden terugverwezen naar het ongestrafte gebied van het donorblok H & E om te bevestigen dat het weefsel van belang werd gevangen in de kernpunch. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten. (A,B) Succesvol afgeronde tapemethode TMA's en de bijbehorende H&E's voor pathologisch onderzoek. (C) Scheiding van de plastic cassette en het paraffineblok wanneer de cassette voortijdig uit de metalen basismal wordt verwijderd. (D) Voltooide tapemethode TMA met omgevallen en gemigreerde kernen als gevolg van turbulente gieten van de gesmolten paraffine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: TMA core H&Es. H&E-gekleurde sectie voor TMA1, met de individuele H&Es voor elke weefselkern die wordt gebruikt om de TMA te construeren (vlekken 1-21) en de oriëntatiekernen (vlekken 22 en 23). De getoonde beelden werden verkregen met behulp van een 4x objectief, uitgerust met een digitale camera aangesloten op de beeldbewerkingssoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeldige immunohistochemische en RNA-ISH. Volledige gezichtssecties van TMA1 werden beoordeeld door IHC voor vimentine- en CD20-expressie en door RNA ISH om de RNA-kwaliteit (U6) en EBV-status te beoordelen via EBER ISH. Beelden tonen voorbeeldbeelden voor drie kernen, waaronder één tumorweefsel (spot 9), één normaal weefsel (spot 19) en één van de twee oriëntatiecontroles (spot 22). Vimentin positivity wordt aangeduid door bruine kleuring, U6 positiviteit wordt aangeduid door blauw/paarse kleuring, EBER door blauw/paarse kleuring en CD20 door bruine kleuring. De getoonde beelden werden verkregen met behulp van een 4x objectief, uitgerust met een digitale camera aangesloten op de beeldbewerkingssoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Overzicht van geconstrueerde TMA-weefsels en uitgevoerde vlekken: Tabel schetst of (a) weefsel aanwezig is in elk van de representatieve TMA-vlekken (b) tumor aanwezig is in elke H & E-gekleurde weefselvlek en (c) de resultaten van eventuele aanvullende immunohistologische vlekken uitgevoerd op aangrenzende TMA-secties: "-" duidt op negatief, n / d = niet gedaan. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Een van de meest kritische componenten van het TMA-bouwproces is pathologiebeoordeling van FFPE-donorblokken waaruit de TMA-kernen zullen worden verkregen4. Tijdens de beoordeling onderzoekt een door de raad gecertificeerde patholoog een representatieve H & E-gekleurde weefselsectie van elk donorblok. Het is absoluut noodzakelijk dat de H & E wordt gegenereerd met behulp van een vers gesneden weefselsectie, zodat het de beste weergave is van het bijbehorende donorblok. Het gebruik van oudere H&Es wordt niet aanbevolen, aangezien FFPE-weefsels 3-dimensionale structuren zijn waarvan het weefselprofiel aanzienlijk kan veranderen met blokdiepte en uitgebreide sectie; dit kan zijn gebeurd sinds de H & E werd gegenereerd, waardoor de weergave van het FFPE-blok mogelijk onnauwkeurig is. Het beoordelingsproces is van essentieel belang voor de selectie van geschikte gevallen en de identificatie van weefselgebieden waaruit kernen moeten worden verkregen, evenals voor de identificatie van gebieden die moeten worden vermeden bij het verzamelen van kernen. Bij afwezigheid van pathologische beoordeling neemt de kans op het opnemen van ongeschikte weefsels aanzienlijk toe. Het opnemen van dergelijke weefsels kan de geconstrueerde TMA ineffectief en ongeschikt maken voor het beoogde doel. Belangrijk is dat het onbewust gebruiken van dergelijke ineffectieve TMA's een enorm potentieel heeft om te resulteren in valse en misleidende gegevens. Dit in combinatie met de wetenschap dat het profiel van FFPE-weefsels, en dus hun afgeleide kernen, aanzienlijk kan veranderen met toenemende diepte benadrukt het belang van voortdurende pathologiebeoordeling gedurende de levensduur van een geconstrueerd TMA-blok. Idealiter moeten H &E's worden gegenereerd met behulp van elke15e of20e sectie om ervoor te zorgen dat eventuele veranderingen in de weefselprofielen van de kernen worden vastgelegd en geregistreerd. Op zijn minst moeten H&E's worden gegenereerd en beoordeeld aan het begin en einde van een project om deze potentiële veranderingen te monitoren. In het licht van deze punten en het belang van de TMA als onderzoeksinstrument, is het noodzakelijk dat de pathologische beoordeling stevig is ingebed in het TMA-bouwproces en gedurende de hele levensduur van het TMA-blok.
FFPE-blokken worden vaak uitgebreid gesneden tijdens routinematige diagnostische verwerking voordat ze worden vrijgegeven voor onderzoeksdoeleinden. Hierdoor zijn de diepte van het donorblok en dus de lengte van de donorblokkern vaak minder dan de ontvangermethode van 4 mm. Hier hebben we gedemonstreerd hoe TMA's kunnen worden geconstrueerd met behulp van het tapemethodeconstructieprotocol, waarvan het belangrijkste voordeel de compatibiliteit is met kernen van niet-ideale FFPE-weefselblokken. Hoewel de tapemethode van grote onderzoekswaarde is en een goedkope, handige en toegankelijke methode biedt voor het bouwen van TMA-blokken, is deze niet zonder uitdagingen en beperkingen. In vergelijking met zowel geautomatiseerde als handmatige ontvangstmethoden, die plaats bieden aan 100-1.000 kernen in één TMA-blok, wordt een maximum van 40 kernen aanbevolen voor TMA's die zijn geconstrueerd met behulp van de tapemethode9. Een andere beperking is met betrekking tot het gemak van de bouw. In de ontvangermethode worden gestanste kernen slechts in een prefab-mal geplaatst, die kernstabiliteit biedt door elke kern in zijn eigen individuele put te omhullen, waardoor kernmigratie wordt voorkomen en zeer regelmatige kernplaatsing en -scheidingwordt bevorderd 22. Bovendien biedt de ontvangermethode het optionele gemak om volledig handmatig, semi-handmatig en volledig geautomatiseerd te zijn. De handmatige tapemethode vereist daarentegen een zorgvuldige, zachte plaatsing van elke kern met de hand met behulp van een naaldprikker. Hoewel de afwezigheid van een prefab-mal in de tapemethode de zeer regelmatige plaatsing en scheiding die wordt ervaren met de ontvangermethode uitsluit, wordt dit tekort overwonnen door de opname van een geblokt raster. Het is belangrijk dat het geblokte rooster in het midden van de metalen lade wordt bevestigd om plaatsing van de blokrand te voorkomen, wat het risico op kernverlies verhoogt als er onvoldoende paraffine is dat de kern op zijn plaats houdt. Er moet ook worden opgemerkt dat de kleine kernscheidingen die mogelijk zijn met de ontvangermethode niet kunnen worden bereikt met de tapemethode vanwege de handmatige plaatsing van de kern en de noodzaak dat de naaldprikker tussen aangrenzende kernen past. Kernen worden vrijstaand geplaatst met het kleinste oppervlak of de kleinste voetafdruk van de kern die in contact komt met het met DSST bedekte raster. Deze opstelling biedt aanzienlijk minder kernstabiliteit dan de ontvangermethode en geeft een verhoogd risico op kernomvervorming en of migratie bij het gieten van de gesmolten paraffine. Inderdaad, een van de meest kritieke stappen in het protocol is het gieten van de gesmolten paraffine. Het is essentieel dat dit snel gebeurt na verwijdering uit de oven om ervoor te zorgen dat de paraffine volledig vloeibaar is en dat het gieten voorzichtig wordt uitgevoerd met minimale turbulentie. Interessant is dat Chen et al. een zeer nieuw hulpapparaat ontwikkelden, vergelijkbaar met een stencil met gaten met een diameter van 7 x 11 x 11 gelijkmatig verdeeld en 2 mm, dat bovenop een leeg paraffineblok wordt geplaatst om naalden te geleiden bij het maken van het ontvangerblok en bij het inbrengen van de donorblokkernen23. Hoewel ontworpen om de bouw van het ontvangerblok te ondersteunen, kan een dergelijk apparaat eenvoudig worden aangepast aan de tapemethode om de plaatsing te begeleiden, de scheiding te regelen en de kernstabiliteit tijdens het bouwproces te vergroten.
Een van de belangrijkste effectoren van kernstabiliteit is het aantal kernen dat is opgenomen in een tapemethode TMA. Dit komt omdat naarmate het aantal kernen toeneemt, de diameter van de kern moet afnemen om het toenemende aantal kernen op te vangen, wat op zijn beurt de kernvoetafdruk vermindert die zich aan de DSST houdt. Een minimale kerndiameter van 1 mm wordt aanbevolen voor tapemethode TMA-constructie, omdat we hebben ontdekt dat kernen met kleinere diameters bijzonder onstabiel zijn en vatbaar voor omvallen, zelfs met zeer zachte paraffinegieten. Een recente studie die twee verschillende interne methoden onderzocht waarbij 16 G-naalden (kerndiameter van 1,1 mm) en een pons met een diameter van 4 mm werden gebruikt, ondervond aanzienlijke weefselverliezen met de 1,1 mm (26,5%) maar niet met de 4 mm-kernen24. Dit lijkt erop te wijzen dat kleine kernen problematisch kunnen zijn om mee te werken en niet alleen tijdens de bouw. Bovendien vertegenwoordigen kleinere diameters mogelijk niet het oorspronkelijke donorblok en grotere kernen, waardoor pathologische interpretatie moeilijk wordt en de kans op onnauwkeurige donorweefselrepresentatie toeneemt.
Het opnemen en plaatsen van oriëntatieblokken is van groot belang in de TMA-constructie. Dit is echter van bijzonder belang voor tapemethode geconstrueerde TMA's. Dit komt voort uit het feit dat de tapemethode het bouwproces omkeert, waardoor het risico op ruimtelijke desoriëntatie toeneemt. We adviseren om in elk blok maximaal drie oriëntatiekernen op te nemen en deze uit de buurt van de monsterkernen te plaatsen om het blok het beste te oriënteren. Oriëntatiekernen kunnen kernen zijn die zijn genomen van weefselblokken die duidelijk verschillende weefsels bevatten uit het thema van de geconstrueerde TMA of weefselvrij gekleurde oriëntatiehulpmiddelen21, waarbij dit laatste vooral nuttig is voor niet-pathologen. In combinatie met niet-regelmatige matrixpatroonkernplaatsing minimaliseren oriëntatiekernen het risico op desoriëntatie.
Het uitgesproken verschil in kernlengte tussen TMA's die zijn geconstrueerd met behulp van de tape- en ontvangermethoden komt voort uit het opnemen van donorblokdiepte in het besluitvormingsproces bij het selecteren van de bouwmethode. Het hier beschreven protocol hanteert een drempel waarbij TMA's worden geconstrueerd met behulp van de tape- en ontvangermethoden wanneer de donorblokken een diepte van respectievelijk <4 mm en 4 mm hebben. Het is belangrijk op te merken dat het opnemen van donorblokdiepte in de keuze van de bouwmethode niet universeel is. Hoewel het mogelijk is dat TMA's met behulp van beide methoden worden geconstrueerd, ongeacht de diepte van het donorblok, kunnen hogere kernen de plaatsing van de plastic cassette tijdens de TMA-constructie met behulp van de tapemethode verstoren en of omvallen of kantelen. De keuze om criteria op te nemen of weg te laten in het besluitvormingsproces hangt af van de voorzieningen die beschikbaar zijn voor het laboratorium, de kosten en het gewenste eindproduct. Onder de parameters van dit protocol is het aantal op dia's gemonteerde TMA-secties dat kan worden verkregen uit een tapemethode geconstrueerde TMA aanzienlijk minder dan dat verkregen uit een ontvangermethode geconstrueerd TMA. Hoewel het mogelijk is om FFPE-weefsels opnieuw te blokkeren om de diepte van het donorblok te vergroten en ze compatibel te maken met de ontvangermethode, is de kans op het bereiken van dezelfde weefseloriëntatie binnen het herblok laag. Dit kan op zijn beurt een uitgebreide blokbekleding vereisen om een volledige sectie te verkrijgen, wat waarschijnlijk aanzienlijk weefselverlies zou omvatten. Na blokzijde levert een tapemethode geconstrueerde TMA ongeveer 50 op dia gemonteerde TMA-secties op met alle kernen aanwezig. Het exacte aantal varieert echter van blok tot blok en hangt af van de lengte van de kernen die worden gebruikt om de TMA te construeren en de dikte van de secties die worden gesneden (5 μm versus 4 μm). Bovendien moet ook worden opgemerkt dat vanwege hun verschillende kernlengtes, de kernen op verschillende tijdstippen zullen uitputten naarmate de TMA geleidelijk wordt gesneden; een attribuut dat de noodzaak van voortdurende pathologische herziening opnieuw benadrukt.
Hoewel de ontvangermethode aanzienlijke voordelen en voordelen biedt ten opzichte van de tapemethode, waaronder een minder vervelend en sneller bouwproces, is de tapemethode niet gericht op ervaren laboratoria met een hoge doorvoer. Het is gericht op het gemiddelde laboratorium, met name die in omgevingen met beperkte middelen, met toegang tot donorblokken van variabele diepten, maar niet tot TMA-bouwdiensten. Toekomstige toepassingen zouden echter automatisering van deze methode kunnen zien om de pool van in aanmerking komende monsters in laboratoria met een hoge doorvoer te verbeteren en de noodzaak van het opnieuw blokkeren van donorblokken te elimineren. Kortom, het beschreven TMA-tapemethodeconstructieprotocol kan eenvoudig worden vastgesteld in niet-gespecialiseerde laboratoria zonder dat dure apparatuur nodig is. Het wordt echter geadviseerd dat nieuwe gebruikers FFPE-weefselblokken zonder waarde, weefselvrije gekleurde oriëntatiehulpmiddelen21 of zelfs gekleurde paraffineblokken zonder weefsel in eerste instantie moeten gebruiken om vertrouwd te raken met de tapemethodetechniek voordat ze doorgaan naar TMA-constructie met behulp van kostbare weefsels. Hoewel hun constructie niet zonder potentiële valkuilen is, waar zowel degenen die TMA-blokken bouwen als gebruiken zich bewust van moeten zijn, kan deze schijnbaar ongepolijste "zelfgemaakte" TMA-bouwmethode hoogwaardige, biologisch relevante TMA's voor onderzoek opleveren. Inderdaad, TMA-secties die voortkomen uit tapemethode geconstrueerde TMA's behoren tot een van de meest gevraagde weefselmonsters in de ACSR-biorepository.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Financiering voor dit werk werd verstrekt door de door de NIH gefinancierde AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O. Tissue microarrays in clinical oncology. Seminars in Radiation Oncology. 18 (2), 89-97 (2008).
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue microarrays. Methods in Molecular Biology. 1381, 53-65 (2016).
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
