Summary
Questo protocollo delinea il metodo del nastro su come costruire manualmente un microarray di tessuto utilizzando blocchi di donatori FFPE di diverse profondità.
Abstract
Il tissue microarray (TMA) è un importante strumento di ricerca in cui molti campioni di formalina fissa di paraffina incorporata (FFPE) possono essere rappresentati in un singolo blocco di paraffina. Ciò si ottiene utilizzando nuclei di tessuto estratti dalla regione di interesse di diversi blocchi FFPE donatori e disponendoli in un singolo blocco di paraffina TMA. Una volta costruite, le sezioni del TMA completato possono essere utilizzate per eseguire studi di immunoistochimica, cromogenia, ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) e RNA ISH per valutare l'espressione proteica e le alterazioni genomiche e trascrizionali in molti campioni contemporaneamente, riducendo così al minimo l'utilizzo dei tessuti e riducendo i costi dei reagenti. Esistono diverse tecniche di costruzione TMA. Uno dei metodi di costruzione più comuni è il metodo ricevente, che funziona meglio con nuclei della stessa lunghezza per i quali si consiglia una lunghezza minima di 4 mm. Sfortunatamente, i blocchi di tessuto possono essere pesantemente resecati durante il processo diagnostico, spesso con conseguenti spessori di blocchi donatori "non ideali" inferiori a 4 mm. L'articolo e il video attuali si concentrano sul metodo del nastro biadesivo; un metodo alternativo manuale, a basso costo, facile da usare e rapido per costruire TMA a bassa densità (<50 core) che è altamente compatibile con questi blocchi donatori non ideali. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo su come costruire un TMA utilizzando questo metodo, con particolare attenzione all'importanza critica della revisione patologica e della convalida post-costruzione.
Introduction
I tessuti ffPE (Formalin fixed paraffin embedded) sono ampiamente utilizzati negli studi morfologici e immunoistochimici sull'espressione proteica1. Tuttavia, la ricerca di scoperta richiede spesso l'esame di diversi marcatori su un gran numero di tessuti, che possono esaurire tessuti preziosi. Introdotto nel 1980, il tissue microarray (TMA) è un importante strumento di ricerca che assembla piccole regioni esemplari di interesse da molti diversi blocchi di tessuto FFPE in un singolo blocco di paraffina, consentendo l'esame di molti campioni di tessuto contemporaneamente2. Pertanto, le TMA evitano l'uso eccessivo di campioni di tessuto altamente preziosi e spesso rari, riducendo al contempo i costi associati all'esecuzione di applicazioni a valle su molti singoli campioni 3,4.
Esistono diverse tecniche per la costruzione di TMA5, compresi gli approcci automatizzati e semi-manuali 6,7. La maggior parte di questi ultimi approcci utilizza il metodo ricevente, in cui i nuclei di tessuto perforati dai blocchi del donatore vengono inseriti in uno stampo prefabbricato. Tuttavia, si raccomanda di utilizzare blocchi donatori "ideali" di almeno 4 mm di spessore per questo metodo 6,7. Sfortunatamente, i blocchi dei donatori, in particolare quelli che sono stati ampiamente sezionati per scopi diagnostici clinici prima di essere resi disponibili per la ricerca, hanno spesso uno spessore inferiore a 4 mm, il che potrebbe escluderli dall'uso nella costruzione di TMA utilizzando il metodo ricevente, se il reincorporazione per raggiungere una profondità di 4 mm non è possibile o auspicabile. Inoltre, queste procedure possono spesso utilizzare un microarrayer di tessuti manuale da banco o costosi strumenti automatizzati che non sono facilmente accessibili o convenienti per il laboratorio di ricerca medio. Al contrario, il metodo del nastro biadesivo o metodo del nastro, è un metodo di costruzione TMA manuale compatibile con blocchi di donatori non ideali che utilizza microarrayer di tessuti portatili economici, ampiamente disponibili, riutilizzabili o usa e getta 8,9,10. Questo metodo inverte il processo di costruzione lanciando il blocco attorno a nuclei verticali invertiti che al completamento sono a filo con la parte superiore del TMA, indipendentemente dalla lunghezza del nucleo. Di conseguenza, tutti gli esempi sono presenti nelle sezioni TMA quando vengono sezionati per la prima volta, il che consente al costruttore di ottenere il massimo da questi blocchi non ideali fin dall'inizio. Pertanto, il metodo del nastro rappresenta un'alternativa economica e fattibile per i laboratori di ricerca non specializzati.
La costruzione del TMA non è priva di sfide e si deve prestare attenzione quando si selezionano le regioni tissutali da cui estrarre i nuclei, rendendo la revisione patologica una parte critica del processo di costruzione della TMA11,12. Pertanto, questo protocollo mira a sottolineare la profonda importanza della revisione patologica nella costruzione della TMA evidenziando alcune delle insidie patologiche associate alla costruzione della TMA di cui gli individui che costruiscono e utilizzano TMA dovrebbero essere consapevoli e perché la revisione della patologia dovrebbe continuare per tutta la durata di un blocco TMA.
Questo protocollo delinea le misure adottate presso l'AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory per costruire TMA da blocchi di donatori non ideali utilizzando il metodo del nastro; dove l'ACSR è un biorepository finanziato dal NIH dedicato alla raccolta e all'equa distribuzione di biocampioni dai tessuti del cancro dell'HIV al fine di promuovere la ricerca sulla malignità dell'HIV.
Protocol
Tutti i blocchi dei donatori sono stati deidentificati durante la raccolta e utilizzati per la costruzione di TMA in conformità con i protocolli IRB approvati della Mayo Clinic (PR16-000507 e PR2207-02).
1. Revisione della patologia
- Recuperare i blocchi di donatori di tessuto FFPE da utilizzare nella costruzione TMA.
- Presentare un vetrino13 colorato di ematossilina ed eosina (H & E) appena generato per ogni blocco di donatore di tessuto FFPE selezionato per la revisione istologica da un patologo certificato per confermare la diagnosi e annotare il tessuto.
NOTA: la colorazione H & E può essere eseguita internamente o inviata a un laboratorio di servizi di base patologici per la colorazione, come nel caso di questo protocollo. Uno dei concetti più importanti da ricordare quando si costruiscono TMA è che i tessuti nei blocchi donatori FFPE sono strutture tridimensionali (3D) la cui forma, contenuto tumorale e vitalità tissutale possono cambiare significativamente con l'aumentare della profondità del blocco. Il patologo deve determinare, in base alla revisione della sezione di tessuto colorato H & E, che è una rappresentazione bidimensionale del tessuto 3D, la regione migliore da cui estrarre il nucleo del tessuto. - Durante la revisione istologica, assicurarsi che il patologo identifichi e annoti i tessuti di interesse / non di interesse sui vetrini colorati H & E. Per annotare la diapositiva, attenersi alla seguente procedura.
- Utilizzare una penna per la marcatura a scorrimento per cerchiare il tessuto di interesse.
- Usando la stessa penna di marcatura, cancella le aree all'interno della regione cerchiata che dovrebbero essere evitate.
- Utilizzare la penna di marcatura per contrassegnare le aree ritenute ideali per il campionamento e l'estrazione del nucleo.
NOTA: È importante ricordare che la forma e la composizione del tessuto possono cambiare con la profondità del tessuto nel blocco. Pertanto, la composizione del nucleo tissutale può cambiare a seconda di dove è stato estratto il nucleo, il che sottolinea la necessità di una guida patologica continua. - Presentare tessuto aggiuntivo per macchie immunoistochimiche specifiche della malattia insieme agli H & E, se necessario, per assistere la revisione patologica. Esempi di tali macchie includono la colorazione ERBB2 per il cancro al seno HER2 positivo14, HHV-8 per il sarcoma di Kaposi15, CD20 per i linfomi a cellule B16, U6 come marcatore globale per la qualitàdell'RNA 17, EBER per determinare la positività al virus Epstein-Barr18 e Vimentin come conferma delle origini mesenchimali e del marcatore di controllo della qualità dei tessuti19,20.
2. Preparazione per la costruzione di TMA
- Una volta completata la revisione della patologia, compilare l'elenco finale dei blocchi donatori da utilizzare nella costruzione TMA e creare una mappa TMA (Figura 1A). La mappa TMA è uno schema che delinea dove i nuclei saranno posizionati nel TMA completato e campioni di tessuto montati su vetrino ottenuti dal TMA risultante.
- Ai fini dell'orientamento, assicurarsi che la mappa TMA eviti di posizionare i nuclei in una matrice uniforme come una matrice 3 x 3 o 4 x 4 e includa almeno 1 marcatore di orientamento.
NOTA: i nuclei di orientamento possono essere nuclei prelevati da strumenti di orientamento colorato senza tessuto21 o blocchi di tessuto contenenti tessuti nettamente diversi dal tema del TMA. A differenza del metodo ricevente in cui i nuclei verticali vengono inseriti in uno stampo di cera prefabbricato, il metodo del nastro crea un TMA versando cera fusa attorno a nuclei invertiti ed eretti. Questa inversione del processo di costruzione richiede una seconda mappa nota come mappa di costruzione. - Creare la mappa di costruzione creando un'immagine speculare della mappa TMA (Figura 1B). La mappa di costruzione mostra dove ogni nucleo deve essere posizionato durante la costruzione per apparire nella posizione corretta nel TMA completato. Salva la mappa di costruzione.
- Una volta create le mappe, preparare lo stampo di base TMA in metallo. Utilizzare una griglia a scacchi di carta usa e getta per guidare il posizionamento del nucleo e regolare la separazione del nucleo.
NOTA: una griglia di modello 6 x 7 (42 spot) per un massimo di 40 nuclei (più due nuclei / spazi vuoti di orientamento) per l'uso con stampi di base in metallo disponibili in commercio con dimensioni interne di 26 mm x 20 mm è fornita nel pdf supplementare. Stampa e ritaglia la griglia della carta. - Tagliare la griglia a scacchi a misura e apporre un pezzo di nastro biadesivo (DSST) sul retro della griglia. Posizionare la griglia e il nastro DSST nel vassoio metallico e aggiungere un secondo pezzo di DSST sopra la griglia, cioè sopra la griglia di carta nello stampo di base metallica (Figura 2A).
3. Posizionamento del nucleo
- Sovrapporre l'H&E patologicamente rivisto sul suo corrispondente blocco tissutale e utilizzare i segni del patologo per identificare dove il blocco tissutale deve essere perforato (Figura 2B).
- Punzonare il blocco donatore FFPE utilizzando un punzone manuale (Figura 2C) nel punto appropriato.
NOTA: i punzoni core sono disponibili in una varietà di diametri. Questo metodo impiega un punzone del nucleo portatile di 2 mm di diametro.- Se si utilizza un punzone riutilizzabile, assicurarsi che venga pulito prima e dopo ogni punzonatura del tessuto.
- Espellere il nucleo dal punzone del nucleo e utilizzare un plettro ad ago per posizionare il nucleo espulso sul mirino della griglia coperta DSST (Figura 2D). Assicurarsi che quando il nucleo è posizionato sulla griglia, sia invertito e verticale in modo tale che l'estremità del tessuto del nucleo contatti il DSST (tessuto a faccia in giù). Assicurarsi inoltre che il nucleo sia posizionato nella posizione appropriata sulla griglia come indicato dalla mappa di costruzione.
- Ripetere fino a quando tutti i blocchi donatori sono animati e i nuclei sono posizionati nelle posizioni appropriate.
4. Completamento del TMA
- Accendere il forno da banco, impostato su 78 °C, e lasciare il tempo sufficiente per arrivare alla temperatura.
- Per ogni TMA da costruire, fondere 45 g di pellet di paraffina in un contenitore a prova di forno.
- Etichettare una cassetta di plastica e posizionarla sopra lo stampo di base in metallo contenente i nuclei (Figura 2E). L'altezza delle anime non deve superare la profondità del vassoio metallico poiché le anime alte verranno inclinate o rovesciate quando la cassetta viene messa in posizione.
- Posizionare lo stampo con la cassetta su un vassoio per catturare il trabocco e versare delicatamente la paraffina fusa attraverso la cassetta nel vassoio dei nuclei (Figura 2F).
- Lasciare traboccare la paraffina fusa per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nel corpo del TMA. Assicurarsi che la paraffina si riempia nella parte superiore della cassetta in modo che sia incorporata e saldamente legata al blocco di paraffina una volta che la paraffina si è solidificata.
- Non spostare o disturbare il blocco e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, conservare in frigorifero a 4 °C per altri 30 minuti per solidificare completamente.
- Una volta completamente solidificato, separare delicatamente lo stampo di base metallico dal blocco di paraffina legato alla cassetta delle anime.
NOTA: il DSST mantiene la sua adesività durante il processo di costruzione ed è spesso attaccato al blocco di paraffina appena formato. Se applicabile, rimuovere delicatamente il DSST e la griglia dalla parte superiore del blocco TMA ora completato.
5. Convalida del TMA
- Una volta costruito il TMA, utilizzare un microtomo per sezionare il TMA appena completato. Tagliare una o più sezioni di tessuto a faccia intera.
- Trasferire le sezioni al bagno d'acqua prebellico e montare a scorrimento le sezioni.
NOTA: i blocchi di nuova costruzione spesso richiedono il rivestimento del blocco (taglio della paraffina in eccesso) al fine di ottenere sezioni di tessuto a faccia intera che contengono tutti i nuclei. - Una volta asciutto, inviare una sezione TMA appena tagliata montata su vetrino per la colorazione H & E13 e qualsiasi colorazione immunoistochimica aggiuntiva, se necessario.
- Invia le sezioni TMA H & E colorate per la revisione patologica.
NOTA: Durante la revisione della patologia TMA, un patologo certificato, preferibilmente lo stesso patologo che ha esaminato i blocchi di donatori TMA, esamina i nuclei colorati TMA H & E per garantire che i tessuti desiderati di interesse siano effettivamente presenti. Se ulteriori macchie immunoistochimiche tessuto o specifiche della malattia sono state presentate per la revisione del blocco del donatore nel passaggio 1.3.4, queste macchie devono essere ripetute sulle sezioni TMA e presentate insieme al TMA H & E per la revisione patologica. - Registrare i risultati della revisione della convalida patologica TMA.
Representative Results
Il metodo a nastro di costruzione TMA qui descritto è il metodo di scelta impiegato presso l'ACSR Technical Core Laboratory per conservare i tessuti, che a sua volta consente una distribuzione frugale ed equa di tessuti altamente preziosi ai ricercatori.
Una componente critica del processo di costruzione è l'identificazione del tessuto di interesse in un determinato blocco donatore da cui dovrebbe essere ottenuto il nucleo TMA. Ciò è determinato dalla revisione patologica in cui un patologo addestrato esamina un vetrino H & E appena generato (Figura 3). Utilizzando un marcatore, il patologo circonda l'area sul vetrino H & E, il che indica che il nucleo deve essere ottenuto dal blocco del donatore all'interno di questo cerchio (Figura 3). Il patologo può anche contrassegnare aree aggiuntive come aree necrotiche, che dovrebbero essere evitate, o aree benigne da cui è possibile ottenere ulteriori nuclei tissutali (Figura 3). I nuclei vengono quindi perforati dalle aree indicate e inclusi nella costruzione del TMA.
Esistono due metriche principali per il completamento con successo di un TMA con il metodo del nastro. Il primo è la presenza di punti di nucleo tissutale nelle posizioni e nelle distanze previste l'una dall'altra, che viene valutata mediante ispezione visiva. La Figura 4A,B illustra con successo due TMA con metodo completamente a nastro e le corrispondenti diapositive H&E. L'ispezione visiva dei blocchi TMA mostra che i nuclei sono presenti e regolarmente distanziati in ciascun TMA. Alcuni dei principali problemi di costruzione che possono sorgere durante il processo di costruzione del metodo a nastro includono la separazione del blocco e della cassetta a causa della rimozione prematura della base metallica prima della solidificazione della cera (Figura 4C). Un altro potenziale problema osservato con le TMA costruite con il metodo del nastro è il ribaltamento del nucleo e/o la deriva di posizionamento dei nuclei incorporati (Figura 4D); un problema che può derivare dal versamento eccessivamente turbolento della paraffina fusa, che può essere ulteriormente rafforzato da un DSST scarsamente adesivo. La Figura 5 mostra le immagini H&E per i core di TMA1. Tutti i core tranne uno (spot 1) sono presenti nell'H&E di TMA1. La Figura 5 mostra anche che alcuni nuclei sono presenti come punti di tessuto circolari completi (cioè punti 4, 6, 13, 17) mentre altri non sono completamente presenti (cioè punti 3, 8, 9, 12). La perdita di tessuto sperimentata in questi ultimi casi non è rara e può essere dovuta a un sezionamento insufficiente necessario per rivelare tutti i nuclei per intero. In alternativa, la presenza di incompleto, o la totale assenza di tessuto (cioè spot 1), può derivare da una scarsa qualità tissutale di quel nucleo, che può causare la perdita di tessuto durante il processo di colorazione.
La seconda metrica di successo viene valutata in termini di se i nuclei TMA hanno catturato o meno il tessuto di interesse. Ciò si ottiene attraverso la revisione patologica e la convalida dei singoli nuclei TMA H& E (Figura 5) rispetto al blocco di donatori pre-perforato H&Es (Figura 3) e, ove necessario/eseguito, qualsiasi altra colorazione immunoistochimica aggiuntiva eseguita. La Figura 6 raffigura macchie esemplari eseguite su TMA1, tra cui Vimentin, U6, EBER e CD20. I tessuti positivi alla vimentina (macchia marrone) indicano che tutti i tessuti sono di origine mesenchimale e sono di buona qualità che possono essere colorati. La positività all'U6 (macchia viola scuro / blu) indica che la qualità dell'RNA nel tessuto è buona e completa le macchie di ibridazione dell'RNA in situ (ISH) come EBER, che prendono di mira i trascritti genici. I risultati U6 nella Figura 5 indicano che la qualità dell'RNA è elevata nel tessuto del linfoma (spot 9) e nel normale controllo dell'orientamento del tessuto tonsillare (spot 22), ma non nel tessuto normale nel punto 19. A seguito di questo EBER la colorazione è risultata negativa nel tessuto normale e nel controllo dell'orientamento, ma fortemente positiva nel tessuto linfoma (spot 9). Come previsto per i tessuti di origine linfoide, entrambi i punti 9 e 22 sono risultati positivi per il marcatore delle cellule B CD20, ma lo spot 19, che deriva dal normale tessuto del midollo spinale, non lo ha fatto. I risultati della colorazione per tutti i nuclei TMA sono riassunti nella Tabella 1 e confermano l'annotazione tissutale per questi nuclei di tessuto TMA.
Figura 1: Mappe TMA. Una volta selezionati tutti i blocchi FFPE e i controlli di orientamento, viene creata una mappa dettagliata, nota come mappa TMA (A), che delinea dove si troverà ogni nucleo del blocco donatore nel blocco finito. È importante notare che quando si costruisce un TMA utilizzando il metodo del nastro, la mappa di costruzione (B) è un'immagine speculare della mappa TMA perché questo metodo inverte il processo di costruzione, versando paraffina fusa attorno a nuclei di tessuto verticale piuttosto che inserire i nuclei in uno stampo prefabbricato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Costruzione del TMA utilizzando il metodo del nastro. (A) Strati 2 pezzi di nastro biadesivo (DSST) e una griglia di carta in ordine seguente sul fondo dello stampo di base metallica; posizionare il primo pezzo di DSST (inserto 2A), seguito dalla griglia di carta usa e getta, quindi il secondo pezzo di DSST nella parte inferiore dello stampo di base in metallo. (B) Per ogni blocco donatore, un nuovo H&E viene generato e rivisto da un patologo che contrassegna l'H&E per indicare il tessuto di interesse, dove perforare il blocco e, se applicabile, dove evitare la punzonatura per estrarre un nucleo di tessuto. (C) Punzonare il blocco del donatore con un punzone TMA portatile riutilizzabile o riutilizzabile. (D) Utilizzando un plettro ad ago, ogni nucleo è posto in posizione verticale, tumore a faccia in giù sul DSST che copre la griglia. (E) Posizionare con cautela una cassetta di plastica pre-etichettata sopra il vassoio metallico contenente i nuclei verticali. (F) La paraffina fusa viene delicatamente versata nel vassoio attraverso il reticolo della cassetta per circondare e immergere i nuclei verticali sotto la cassetta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Colorazione H&E del blocco donatore. Le sezioni colorate di H & E di ciascun blocco di donatore sono sottoposte a revisione QC con un patologo di formazione che annota il vetrino colorato H & E con un marcatore per indicare le aree / tessuti di interesse (ad esempio, tumori vitali (CA) o tessuti benigni (BN)) per la raccolta del nucleo, nonché le aree che dovrebbero essere evitate (ad esempio, aree del tessuto necrotico). Le aree appropriate del blocco tissutale, come indicato dall'H&E annotato, vengono quindi identificate, perforate e incorporate nel TMA in costruzione. Il punzone del nucleo TMA risultante H & E può quindi essere rinviato all'area non perforata del blocco donatore H & E per confermare che il tessuto di interesse è stato catturato nel pugno centrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi. (A,B) Completato con successo i TMA del metodo a nastro e i relativi H&E di accompagnamento per la revisione patologica. (C) Separazione della cassetta di plastica e del blocco di paraffina quando la cassetta viene rimossa prematuramente dallo stampo di base metallica. (D) Metodo a nastro completato TMA che mostra nuclei rovesciati e migrati risultanti da versamenti turbolenti della paraffina fusa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: H&Es core TMA. Sezione colorata H & E per TMA1, che mostra i singoli H & E per ciascun nucleo di tessuto utilizzato per costruire il TMA (punti 1-21) e i nuclei di orientamento (punti 22 e 23). Le immagini mostrate sono state ottenute utilizzando un obiettivo 4x, dotato di una fotocamera digitale collegata al software di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Immunoistochimica esemplare e RNA ISH. Le sezioni a faccia intera di TMA1 sono state valutate dall'IHC per l'espressione di vimentina e CD20 e dall'RNA ISH per valutare la qualità dell'RNA (U6) e lo stato dell'EBV tramite EBER ISH. Le immagini mostrano immagini esemplari per tre nuclei, tra cui un tessuto tumorale (spot 9), un tessuto normale (spot 19) e uno dei due controlli di orientamento (spot 22). La positività della vimentina è indicata dalla colorazione marrone, la positività U6 è indicata dalla colorazione blu / viola, EBER dalla colorazione blu / viola e CD20 dalla colorazione marrone. Le immagini mostrate sono state ottenute utilizzando un obiettivo 4x, dotato di una fotocamera digitale collegata al software di imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Panoramica dei tessuti e delle macchie TMA costruiti eseguiti: La tabella delinea se (a) il tessuto è presente o meno in ciascuna delle macchie TMA rappresentative (b) il tumore è presente in ogni punto tissutale colorato H & E e (c) i risultati di eventuali ulteriori macchie immunoistologiche eseguite su sezioni TMA adiacenti: "-" indica negativo, n / d = non fatto. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
Fascicolo supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Uno dei componenti più critici del processo di costruzione del TMA è la revisione patologica dei blocchi donatori FFPE da cui si otterranno i nuclei TMA4. Durante la revisione, un patologo certificato esamina una sezione rappresentativa di tessuto colorato H & E da ciascun blocco di donatore. È imperativo che l'H & E sia generato utilizzando una sezione di tessuto appena tagliata in modo che sia la migliore rappresentazione del suo corrispondente blocco donatore. L'uso di H&E più vecchi non è raccomandato dato che i tessuti FFPE sono strutture tridimensionali il cui profilo tissutale può cambiare significativamente con la profondità del blocco e il sezionamento esteso; ciò potrebbe essersi verificato da quando è stato generato l'H & E, rendendo potenzialmente imprecisa la sua rappresentazione del blocco FFPE. Il processo di revisione è essenziale per la selezione dei casi idonei e l'identificazione delle aree tissutali da cui dovrebbero essere ottenuti i nuclei, nonché per l'identificazione delle aree che dovrebbero essere evitate durante la raccolta dei nuclei. In assenza di revisione patologica, aumenta significativamente la probabilità di includere tessuti inadatti. L'inclusione di tali tessuti ha il potenziale di rendere la TMA costruita inefficace e inadatta allo scopo previsto. È importante sottolineare che l'uso inconsapevole di tali TMA inefficaci ha un enorme potenziale per portare a dati falsi e fuorvianti. Questo, combinato con la consapevolezza che il profilo dei tessuti FFPE, e quindi dei loro nuclei derivati, può cambiare in modo significativo con l'aumentare della profondità evidenzia l'importanza di una revisione continua della patologia per tutta la durata di vita di un blocco TMA costruito. Idealmente gli H&E dovrebbero essere generati utilizzando ogni 15° o 20° sezione per garantire che eventuali cambiamenti nei profili tissutali dei nuclei vengano catturati e registrati. Come minimo, gli H&E dovrebbero essere generati e rivisti all'inizio e alla fine di un progetto per monitorare questi potenziali cambiamenti. Alla luce di questi punti e dell'importanza del TMA come strumento di ricerca, è imperativo che la revisione patologica sia saldamente incorporata nel processo di costruzione della TMA e per tutta la vita del blocco TMA.
I blocchi FFPE sono spesso ampiamente sezionati durante l'elaborazione diagnostica di routine prima di essere rilasciati per scopi di ricerca. Di conseguenza, la profondità del blocco del donatore e quindi le lunghezze del nucleo del blocco del donatore sono spesso inferiori all'ideale del metodo ricevente di 4 mm. Qui abbiamo dimostrato come costruire TMA utilizzando il protocollo di costruzione del metodo a nastro, il cui vantaggio principale è la sua compatibilità con nuclei di blocchi di tessuto FFPE non ideali. Sebbene il metodo del nastro sia di grande valore di ricerca e offra un metodo economico, conveniente e accessibile per la costruzione di blocchi TMA, non è privo di sfide e limiti. Rispetto ai metodi di destinatario automatizzati e manuali, che possono ospitare 100-1.000 core in un singolo blocco TMA, si consiglia un massimo di 40 core per le TMA costruite utilizzando il metodo a nastro9. Un'altra limitazione è rispetto alla facilità di costruzione. Nel metodo ricevente, i nuclei perforati vengono semplicemente inseriti in uno stampo prefabbricato, che fornisce stabilità al nucleo racchiudendo ogni nucleo nel proprio pozzo individuale, impedendo così la migrazione del nucleo e promuovendo il posizionamento e la separazione del nucleo altamente regolari22. Inoltre, il metodo destinatario offre la comodità opzionale di essere completamente manuale, semi-manuale e completamente automatizzato. Al contrario, il metodo del nastro manuale richiede un posizionamento attento e delicato di ciascun nucleo a mano utilizzando un plettro ad ago. Sebbene l'assenza di uno stampo prefabbricato nel metodo del nastro precluda il posizionamento e la separazione altamente regolari sperimentati con il metodo ricevente, questa carenza viene superata attraverso l'inclusione di una griglia a scacchi. È importante che la griglia a scacchi sia fissata al centro del vassoio metallico per evitare il posizionamento del bordo del blocco, il che aumenta il rischio di perdita del nucleo se non c'è paraffina insufficiente che tiene il nucleo in posizione. Va inoltre notato che le piccole separazioni del nucleo possibili con il metodo ricevente non possono essere ottenute con il metodo del nastro a causa del posizionamento manuale del nucleo e della necessità che il plettro dell'ago si adatti tra nuclei adiacenti. I nuclei sono posizionati in modo eretto indipendente con la più piccola superficie o impronta del nucleo che contatta la griglia coperta DSST. Questa configurazione fornisce una stabilità del nucleo significativamente inferiore rispetto al metodo ricevente e conferisce un rischio maggiore di ribaltamento e/o migrazione del nucleo quando si versa la paraffina fusa. In effetti, uno dei passaggi più critici nel protocollo è versare la paraffina fusa. È essenziale che questo venga fatto rapidamente al momento della rimozione dal forno per garantire che la paraffina sia completamente liquida e che il versamento venga eseguito delicatamente con turbolenze minime. È interessante notare che Chen et al. hanno sviluppato un dispositivo ausiliario altamente nuovo, simile a uno stencil con fori di diametro 7 x 11 distribuiti uniformemente di 2 mm, che viene posizionato sopra un blocco di paraffina bianco per guidare gli aghi durante la creazione del blocco ricevente e quando si inseriscono i nuclei del blocco donatore23. Sebbene progettato per aiutare la costruzione del blocco ricevente, tale dispositivo potrebbe essere facilmente adattato al metodo del nastro per guidare il posizionamento, regolare la separazione e aumentare la stabilità del nucleo durante il processo di costruzione.
Uno degli effettori più significativi della stabilità del core è il numero di core inclusi in un metodo a nastro TMA. Questo perché con l'aumentare del numero di core, il diametro del core deve ridursi per adattarsi al numero crescente di core, che a sua volta riduce l'ingombro del core aderendo al DSST. Un diametro minimo del nucleo di 1 mm è raccomandato per la costruzione TMA con metodo a nastro, poiché abbiamo scoperto che i nuclei con diametri più piccoli sono particolarmente instabili e inclini a rovesciarsi anche con versamenti di paraffina molto delicati. Un recente studio che ha studiato due diversi metodi interni che utilizzavano aghi da 16 G (diametro del nucleo di 1,1 mm) e un punzone di diametro di 4 mm ha subito notevoli perdite di tessuto con i nuclei da 1,1 mm (26,5%) ma non i nuclei da 4 mm24. Questo sembra indicare che i piccoli nuclei possono essere problematici con cui lavorare e non solo durante la costruzione. Inoltre, diametri più piccoli potrebbero non rappresentare il blocco originale del donatore e nuclei più grandi, rendendo difficile l'interpretazione patologica e aumentando la probabilità di una rappresentazione imprecisa del tessuto del donatore.
L'inclusione e il posizionamento di blocchi di orientamento è di profonda importanza nella costruzione di TMA. Tuttavia, questo è di particolare importanza per le TMA costruite con metodo a nastro. Ciò deriva dal fatto che il metodo del nastro inverte il processo di costruzione aumentando così il rischio di disorientamento spaziale. Si consiglia di includere fino a tre nuclei di orientamento in ogni blocco e di posizionarli lontano dai nuclei campione per orientare al meglio il blocco. I nuclei di orientamento possono essere nuclei prelevati da blocchi di tessuto contenenti tessuti nettamente diversi dal tema del TMA costruito o strumenti di orientamento colorati privi di tessuti21, dove quest'ultimo è particolarmente utile per i non patologi. In combinazione con il posizionamento del nucleo a matrice non regolare, i nuclei di orientamento riducono al minimo il rischio di disorientamento.
La marcata differenza nella lunghezza del nucleo tra le TMA costruite utilizzando il nastro e i metodi riceventi deriva dall'inclusione della profondità del blocco del donatore nel processo decisionale durante la selezione del metodo di costruzione. Il protocollo qui delineato impiega una soglia in cui i TMA sono costruiti utilizzando i metodi del nastro e del ricevente quando i blocchi donatori hanno profondità rispettivamente di <4 mm e 4 mm. È importante notare che l'inclusione della profondità del blocco del donatore nella scelta del metodo di costruzione non è universale. Sebbene sia possibile costruire TMA utilizzando entrambi i metodi indipendentemente dalla profondità del blocco del donatore, i nuclei più alti possono interferire con, e o essere rovesciati o inclinati da, il posizionamento della cassetta di plastica durante la costruzione TMA utilizzando il metodo del nastro. La scelta di includere o omettere criteri nel processo decisionale dipende dai servizi disponibili per il laboratorio, dal costo e dal prodotto finale desiderato. Secondo i parametri di questo protocollo, il numero di sezioni TMA montate su slitta che possono essere ottenute da un TMA costruito con metodo a nastro è significativamente inferiore a quello ottenuto da un metodo ricevente costruito TMA. Sebbene sia possibile ri-bloccare i tessuti FFPE per aumentare la profondità del blocco del donatore e renderli compatibili con il metodo ricevente, la probabilità di ottenere lo stesso orientamento tissutale all'interno del re-blocco è bassa. A sua volta, ciò potrebbe richiedere un ampio blocco per ottenere una sezione a faccia intera, che probabilmente includerebbe una significativa perdita di tessuto. Dopo il rivestimento del blocco, un TMA costruito con il metodo del nastro produce circa 50 sezioni TMA montate su scorrimento con tutti i nuclei presenti. Tuttavia, il numero esatto varierà da blocco a blocco e dipende dalla lunghezza dei nuclei utilizzati per costruire il TMA e dallo spessore delle sezioni da tagliare (5 μm contro 4 μm). Inoltre, va anche notato che a causa delle loro diverse lunghezze del nucleo, i nuclei si esauriranno in momenti diversi man mano che il TMA viene progressivamente sezionato; un attributo che sottolinea nuovamente la necessità di una continua revisione patologica.
Sebbene il metodo del destinatario offra vantaggi e vantaggi significativi rispetto al metodo a nastro, inclusi processi di costruzione meno noiosi e più rapidi, il metodo del nastro non è rivolto a laboratori esperti ad alta produttività. Si rivolge al laboratorio medio, in particolare a quelli in ambienti con risorse limitate, con accesso a blocchi donatori di profondità variabile ma non ai servizi di costruzione TMA. Tuttavia, le applicazioni future potrebbero vedere l'automazione di questo metodo al fine di migliorare il pool di campioni idonei nei laboratori ad alta produttività ed eliminare la necessità di ri-bloccare i blocchi dei donatori. In conclusione, il protocollo di costruzione del metodo a nastro TMA descritto può essere facilmente stabilito in laboratori non specializzati senza la necessità di costose attrezzature. Tuttavia, si consiglia ai nuovi utenti di utilizzare blocchi di tessuto FFPE senza valore, strumenti di orientamento colorato privi di tessuto21 o anche blocchi di paraffina colorati senza tessuto all'inizio per familiarizzare con la tecnica del metodo del nastro prima di avanzare alla costruzione TMA utilizzando tessuti preziosi. Sebbene la loro costruzione non sia priva di potenziali insidie, di cui dovrebbero essere consapevoli sia coloro che costruiscono che utilizzano blocchi TMA, questo metodo di costruzione TMA "fatto in casa" apparentemente non lucidato può produrre TMA di alta qualità e biologicamente rilevanti per la ricerca. In effetti, le sezioni TMA derivanti da TMA costruite con metodo a nastro sono tra i campioni di tessuto più richiesti nel biorepository ACSR.
Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal biorepository AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) finanziato dal NIH (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
