Summary
פרוטוקול זה מתווה את שיטת הקלטת כיצד לבנות באופן ידני מיקרו-מערך רקמות באמצעות בלוקים של תורמי FFPE בעומקים שונים.
Abstract
מיקרו-מערך הרקמות (TMA) הוא כלי מחקר חשוב שבו ניתן לייצג דגימות רבות של פרפין קבוע פורמלין (FFPE) בבלוק פרפין יחיד. זה מושג על ידי שימוש בליבות רקמה המופקות מאזור העניין של בלוקי FFPE שונים של תורמים וסידורם לבלוק פרפין TMA יחיד. לאחר בנייתם, ניתן להשתמש בקטעים מה-TMA שהושלם כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, כרומוגניות, פלואורסצנציה בהכלאה באתרה (FISH) ומחקרי RNA ISH להערכת ביטוי חלבונים, כמו גם שינויים גנומיים ושעתוק בדגימות רבות בו זמנית, ובכך למזער את השימוש ברקמות ולהפחית את עלויות הריאגנטים. ישנן מספר טכניקות שונות לבניית TMA. אחת משיטות הבנייה הנפוצות ביותר היא שיטת הנמען, שעובדת בצורה הטובה ביותר עם ליבות באותו אורך שעבורן מומלץ אורך מינימלי של 4 מ"מ. למרבה הצער, ניתן לכרות בכבדות בלוקי רקמות במהלך תהליך האבחון, מה שמביא לעתים קרובות לעובי בלוקים "לא אידיאליים" של פחות מ-4 מ"מ. המאמר והסרטון הנוכחיים מתמקדים בשיטת סרט הדבקה הדו-צדדי; שיטה ידנית חלופית, זולה, קלה לשימוש ומהירה לבניית TMAs בצפיפות נמוכה (<50 ליבות) התואמת מאוד לבלוקים אלה של תורמים שאינם אידיאליים. פרוטוקול זה מספק מדריך שלב אחר שלב כיצד לבנות TMA בשיטה זו, תוך התמקדות בחשיבות הקריטית של סקירה פתולוגית ואימות לאחר בנייה.
Introduction
רקמות מוטבעות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) נמצאות בשימוש נרחב במחקרי ביטוי חלבונים מורפולוגיים ואימונוהיסטוכימיים1. עם זאת, מחקר גילוי דורש לעתים קרובות בדיקה של כמה סמנים על מספר רב של רקמות, אשר יכול להתיש רקמות יקרות. המיקרו-מערך של הרקמה (TMA), שהוצג בשנות ה-80 של המאה ה-20, הוא כלי מחקר חשוב המרכיב אזורי מופת קטנים בעלי עניין מבלוקים רבים ושונים של רקמת FFPE לגוש פרפין יחיד, ומאפשר בדיקה של דגימות רקמה רבות בו זמנית2. לפיכך, TMAs נמנעים משימוש מופרז בדגימות רקמות יקרות מאוד, ולעתים קרובות נדירות, תוך הפחתת העלויות הכרוכות בביצוע יישומים במורד הזרם על דגימות בודדות רבות 3,4.
קיימות מספר טכניקות שונות לבניית TMAs5, כולל גישות אוטומטיות וחצי ידניות 6,7. רוב הגישות האחרונות הללו משתמשות בשיטת המקבל, לפיה ליבות רקמות המנוקבות מבלוקים של תורמים מוכנסות לתבנית טרומית. עם זאת, מומלץ כי בלוקים תורמים "אידיאליים" כי הם לפחות 4 מ"מ עובי משמשים לשיטה זו 6,7. למרבה הצער, בלוקים של תורמים, במיוחד אלה שחולקו באופן נרחב למטרות אבחון קליניות לפני שהם זמינים למחקר, הם לעתים קרובות בעובי של פחות מ-4 מ"מ, מה שעלול להחריג אותם משימוש בבניית TMA בשיטת המקבל, אם הטבעה מחדש כדי להשיג עומק של 4 מ"מ אינה אפשרית או רצויה. יתר על כן, הליכים אלה יכולים לעתים קרובות להשתמש במיקרו-מערך רקמות ידני או במכשירים אוטומטיים יקרים שאינם נגישים או משתלמים למעבדת המחקר הממוצעת. לעומת זאת, שיטת סרט הדבקה הדו-צדדי או שיטת הטייפ, היא שיטת בניית TMA ידנית התואמת לבלוקים לא אידיאליים של תורמים המשתמשת במיקרו-מערכים ידניים זולים, זמינים באופן נרחב, רב-פעמיים או חד פעמיים מסוג 8,9,10. שיטה זו הופכת את תהליך הבנייה על ידי יציקת הבלוק סביב ליבות זקופות הפוכות שעם השלמתן משופעות בחלק העליון של ה-TMA, ללא קשר לאורך הליבה. כתוצאה מכך, כל הדגימות נמצאות בקטעי TMA כאשר הן מחולקות לראשונה, מה שמאפשר לבנאי להפיק את המרב מהגושים הלא אידיאליים האלה מההתחלה. לפיכך, שיטת הקלטת מייצגת חלופה חסכונית וישימה למעבדות המחקר שאינן מיוחדות.
בניית TMA אינה נטולת אתגרים, ויש לנקוט משנה זהירות בעת בחירת אזורי הרקמה שמהם ניתן לחלץ את הליבות, מה שהופך את הסקירה הפתולוגית לחלק קריטי בתהליך הבנייה של TMA11,12. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להדגיש את החשיבות העמוקה של סקירה פתולוגית בבניית TMA על ידי הדגשת כמה מהמלכודות הפתולוגיות הקשורות לבניית TMA שאנשים הבונים ומשתמשים ב- TMAs צריכים להיות מודעים אליהם, ומדוע סקירת הפתולוגיה צריכה להימשך לאורך חייו של בלוק TMA.
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו במעבדת הליבה הטכנית של משאב דגימת האיידס והסרטן (ACSR) כדי לבנות TMAs מבלוקים תורמים שאינם אידיאליים באמצעות שיטת הקלטת; כאשר ה- ACSR הוא ביו-רפוזיטוריה במימון NIH המוקדשת לאיסוף והפצה שוויונית של ביו-פסימנים מרקמות סרטן HIV על מנת לקדם מחקר ממאירות HIV.
Protocol
כל בלוקי התורמים לא הוכנסו לשימוש במהלך האיסוף ושימשו לבניית TMA בהתאם לפרוטוקולי ה-IRB המאושרים של מאיו קליניק (PR16-000507 ו-PR2207-02).
1. סקירת פתולוגיה
- אחזור בלוקים של תורם רקמת FFPE שישמשו בבניית TMA.
- הגש שקופית13 מוכתמת של המטוקסילין ואאוזין (H&E) שנוצרה זה עתה עבור כל בלוק תורם רקמת FFPE שנבחר לבדיקה היסטולוגית על ידי פתולוג מוסמך כדי לאשר את האבחנה ולבאר את הרקמה.
הערה: צביעת H&E עשויה להתבצע בבית או להישלח למעבדת שירותי ליבה פתולוגית לצורך צביעה, כפי שקרה בפרוטוקול זה. אחד המושגים החשובים ביותר שיש לזכור בעת בניית TMAs הוא שהרקמות בבלוקים של תורמי FFPE הן מבנים תלת-ממדיים (3D) שצורתם, תכולת הגידול וכדאיות הרקמות שלהם יכולים להשתנות באופן משמעותי עם הגדלת עומק הבלוק. הפתולוג חייב לקבוע, על סמך סקירת סעיף הרקמה המוכתמת H&E, שהוא ייצוג דו-ממדי של הרקמה התלת-ממדית, האזור הטוב ביותר לחלץ ממנו את ליבת הרקמה. - במהלך סקירה היסטולוגית, ודא כי הפתולוג מזהה ומבאר את הרקמות המעניינות / לא מעניינות בשקופיות המוכתמות של H&E. כדי להוסיף הערות לשקופית, בצע את השלבים הבאים.
- השתמש בעט סימון שקופיות כדי להקיף את הרקמה המעניינת.
- באמצעות אותו עט סימון, מכתים אזורים בתוך האזור המקיף שיש להימנע מהם.
- השתמש בעט הסימון כדי לסמן את האזורים הנחשבים אידיאליים לדגימה ומיצוי של הליבה.
הערה: חשוב לזכור שצורת הרקמה והרכבה עשויים להשתנות עם עומק הרקמה בבלוק. לפיכך, הרכב ליבת הרקמה עשוי להשתנות בהתאם למקום שבו הליבה הופקה, מה שמדגיש את הצורך בהמשך הדרכה פתולוגית. - שלח רקמות נוספות עבור כתמים אימונוהיסטוכימיים ספציפיים למחלה לצד H&Es, במידת הצורך, כדי לסייע לסקירה הפתולוגית. דוגמאות לכתמים כאלה כוללות צביעת ERBB2 עבור סרטן שד חיובי ל-HER214, HHV-8 עבור סרקומה קאפוסי15, CD20 עבור לימפומות של תאי B16, U6 כסמן עולמי לאיכות RNA17, EBER לקביעתהחיוביות של נגיף אפשטיין-בר 18, ו-Vimentin כאישור למקורות מזנכימליים ולסמן בקרת איכות רקמות19,20.
2. הכנה לבניית TMA
- לאחר השלמת סקירת הפתולוגיה, ערכו את הרשימה הסופית של בלוקי התורמים שישמשו בבניית TMA וצרו מפת TMA (איור 1A). מפת ה-TMA היא מתווה סכמטי היכן הליבות ימוקמו בדגימות ה-TMA וההחלקה המורכבות שהושלמו, שיתקבלו מה-TMA שייווצר.
- למטרות כיוון, ודא שמפת ה- TMA נמנעת מהצבת ליבות במטריצה אחידה כגון מטריצה של 3 x 3 או 4 x 4 וכוללת לפחות סמן כיוון אחד.
הערה: ליבות אוריינטציה יכולות להילקח מכלי אוריינטציה צבעוניים ללא רקמות21, או בלוקי רקמה המכילים רקמות שונות באופן מובהק מהנושא של ה-TMA. שלא כמו שיטת הנמען שבה ליבות זקופות מוכנסות לתבנית שעווה יצוקה מראש, שיטת הקלטת יוצרת TMA על ידי מזיגת שעווה מותכת סביב ליבות הפוכות וזקופות. היפוך זה של תהליך הבנייה דורש מפה שנייה המכונה מפת הבנייה. - צור את מפת הבנייה על-ידי יצירת תמונת מראה של מפת TMA (איור 1B). מפת הבנייה מראה היכן יש למקם כל ליבה במהלך הבנייה על מנת להופיע במיקום הנכון ב- TMA שהושלם. שמור את מפת הבנייה.
- לאחר שהמפות נוצרו, הכינו את תבנית הבסיס TMA המתכתית. השתמש ברשת חד-פעמית של בדיקת נייר כדי להנחות את מיקום הליבה ולווסת את הפרדת הליבה.
הערה: רשת תבנית בגודל 6 x 7 (42 נקודות) עבור 40 ליבות לכל היותר (בנוסף לשתי ליבות/מרווחי כיוון) לשימוש עם תבניות בסיס מתכת זמינות מסחרית עם ממדים פנימיים של 26 מ"מ x 20 מ"מ מסופקת בקובץ PDF המשלים. הדפס וגזור את רשת הנייר. - חותכים את הרשת המשובצת לגודל ומצמידים חתיכת סרט הדבקה דו-צדדי (DSST) לחלק האחורי של הרשת. הניחו את הרשת ואת סרט ה-DSST לתוך מגש המתכת והוסיפו חתיכה שנייה של DSST על גבי הרשת, כלומר על גבי רשת הנייר בתבנית הבסיס המתכתית (איור 2A).
3. מיקום הליבה
- שכבו את ה-H&E שנסקר באופן פתולוגי על גוש הרקמה המתאים לו והשתמשו בסימוני הפתולוגים כדי לזהות היכן יש לנקב את גוש הרקמה (איור 2B).
- אגרוף את בלוק התורם של FFPE באמצעות אגרוף ליבה ידני (איור 2C) במקום המתאים.
הערה: אגרופי ליבה זמינים במגוון קטרים. שיטה זו משתמשת באגרוף ליבה כף יד בקוטר 2 מ"מ.- אם אתם משתמשים באגרוף ליבה לשימוש חוזר, ודאו שהוא מנוקה לפני ואחרי כל אגרוף טישו.
- הוציאו את הליבה מהליבה והשתמשו במוט מחט כדי למקם את הליבה שנפלטה על הכוונת של הרשת המכוסה ב-DSST (איור 2D). ודאו שכאשר הליבה ממוקמת על הרשת, היא הפוכה וזקופה כך שקצה הרקמה של הליבה יוצר קשר עם ה-DSST (רקמה-עם הפנים כלפי מטה). כמו כן, יש לוודא כי הליבה ממוקמת במיקום המתאים ברשת כפי שמצוין על ידי מפת הבנייה.
- חזרו על הפעולה עד שכל בלוקי התורמים יתווספו והליבות יוצבו בעמדות המתאימות להם.
4. השלמת ה-TMA
- הפעילו את התנור על הספסל, הקפידו על 78 מעלות צלזיוס, והקדישו מספיק זמן כדי להגיע לטמפרטורה.
- כדי שכל TMA ייבנה, יש להמיס 45 גרם של כדורי פרפין במיכל חסין תנור.
- תייג קלטת פלסטיק והנח אותה על גבי תבנית בסיס המתכת המכילה את הליבות (איור 2E). גובה הליבות לא יעלה על עומק מגש המתכת מכיוון שליבות גבוהות יוטות או יתמוטטו כאשר הקלטת תונח במקומה.
- הניחו את התבנית עם הקלטת על מגש כדי לתפוס את הצפתכם ולשפוך בעדינות את הפרפין המומס דרך הקלטת לתוך מגש הליבות (איור 2F).
- אפשרו לפרפין המותך לעלות על גדותיו כדי להבטיח שאין בועות אוויר בגוף ה-TMA. ודא שהפרפין מתמלא בחלק העליון של הקלטת כך שהוא מוטבע פנימה ונקשר היטב לבלוק הפרפין לאחר שהפרפין התמצק.
- אין להזיז או להפריע לבלוק ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, יש לשמור בקירור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות נוספות כדי להתמצק לחלוטין.
- לאחר שהתמצק לחלוטין, הפרד בעדינות את תבנית בסיס המתכת מגוש הליבות של הקלטת הקשורה לפרפין.
הערה: ה- DSST שומר על דבקותו בתהליך הבנייה והוא מחובר לעתים קרובות לבלוק הפרפין החדש שנוצר. אם רלוונטי, הסר בעדינות את ה- DSST והרשת מהחלק העליון של בלוק ה- TMA שהושלם כעת.
5. אימות ה-TMA
- לאחר בניית ה-TMA, השתמש במיקרוטום כדי לנתח את ה-TMA שזה עתה הושלם. חותכים חלק טישו אחד או יותר עם פנים מלאות.
- מעבירים את הקטעים לאמבטיית המים המחוממת מראש ומחליקים את החלקים.
הערה: בלוקים חדשים שנבנו דורשים לעתים קרובות פני בלוקים (חיתוך של עודף פרפין) על מנת לקבל מקטעי רקמת פנים מלאים המכילים את כל הליבות. - לאחר הייבוש, שלחו חתך TMA טרי שהורכב על החלקה עבור צביעת H&E13 וכל צביעה אימונוהיסטוכימית נוספת, במידת הצורך.
- שלח את קטעי TMA H&E המוכתמים לבדיקה פתולוגית.
הערה: במהלך סקירת הפתולוגיה של TMA, פתולוג מוסמך, רצוי אותו פתולוג שסקר את בלוקי תורמי ה- TMA, סוקר את הליבות המוכתמות של TMA H&E כדי להבטיח שהרקמות הרצויות של העניין אכן קיימות. אם כתמים אימונוהיסטוכימיים נוספים של רקמות או כתמים אימונוהיסטוכימיים ספציפיים למחלה הוגשו לבדיקת בלוק התורם בשלב 1.3.4, יש לחזור על כתמים אלה בקטעי TMA ולהגישם לצד TMA H&E לבדיקה פתולוגית. - רשום את התוצאות של סקירת האימות הפתולוגי של TMA.
Representative Results
שיטת הקלטת של בניית TMA המתוארת כאן היא שיטת הבחירה המופעלת במעבדת הליבה הטכנית ACSR לשימור רקמות, אשר בתורה מאפשרת חלוקה חסכנית ושוויונית של רקמות יקרות מאוד לחוקרים.
מרכיב קריטי בתהליך הבנייה הוא זיהוי הרקמה המעניינת בלוק תורם נתון שממנו יש להשיג את ליבת ה-TMA. זה נקבע על ידי סקירה פתולוגית שבה פתולוג מיומן סוקר שקופית H&E שנוצרה לאחרונה (איור 3). באמצעות סמן, הפתולוג מקיף את האזור בשקופית H&E, מה שמצביע על כך שיש לקבל את הליבה מגוש התורם בתוך המעגל הזה (איור 3). הפתולוג עשוי גם לסמן אזורים נוספים כגון אזורים נמקיים, שיש להימנע מהם, או אזורים שפירים שמהם ניתן לקבל ליבות רקמה נוספות (איור 3). הליבות מנוקבות לאחר מכן מהאזורים שצוינו ונכללות בבניית ה- TMA.
ישנם שני מדדים עיקריים לסיום מוצלח של TMA בשיטת הקלטת. הראשון הוא נוכחות של נקודות ליבת רקמה במיקומים ובמרחקים הצפויים זה מזה, אשר מוערך על ידי בדיקה חזותית. איור 4A,B מתארים שני TMAs של שיטת קלטת בהצלחה מלאה ואת שקופיות ה-H&E המתאימות שלהם. בדיקה חזותית של בלוקי ה-TMA מראה שהליבות קיימות ומרווחות באופן קבוע בכל TMA. חלק מבעיות הבנייה העיקריות שיכולות להתעורר במהלך תהליך הבנייה של שיטת הקלטת כוללות הפרדת הבלוק והקסטה עקב הסרה מוקדמת של בסיס המתכת לפני התמצקות השעווה (איור 4C). בעיה פוטנציאלית נוספת שנצפתה ב-TMAs שנבנו בשיטת הקלטת היא הפלת הליבה או סחף המיקום של הליבות המוטבעות (איור 4D); בעיה שיכולה לנבוע מזיגה סוערת מדי של הפרפין המותך, אשר עשוי להיות מחוזק עוד יותר על ידי DSST דבק גרוע. איור 5 מציג את תמונות H&E עבור הליבות של TMA1. כל הליבות מלבד ליבה אחת (נקודה 1) נמצאות ב- H&E של TMA1. איור 5 גם מראה כי חלק מהליבות נמצאות כנקודות רקמה מעגליות שלמות (כלומר, כתמים 4, 6, 13, 17) בעוד שאחרות אינן קיימות לחלוטין (כלומר, כתמים 3, 8, 9, 12). אובדן הרקמה שחווה במקרים אחרונים אלה אינו נדיר וייתכן שהוא נובע מחתך לא מספיק הדרוש כדי לחשוף את כל הליבות במלואן. לחלופין, נוכחות של לא שלמה, או היעדר מוחלט של רקמה (כלומר, נקודה 1), עשויה לנבוע מאיכות רקמה ירודה של אותה ליבה, מה שעלול לגרום לאובדן רקמות במהלך תהליך ההכתמה.
המדד השני להצלחה מוערך במונחים של האם ליבות ה-TMA תפסו את הרקמה המעניינת או לא. זה מושג באמצעות סקירה פתולוגית ואימות של ליבות ה-H&E הבודדות של TMA (איור 5) בהשוואה לבלוק התורם המנוקב מראש H&Es (איור 3), ובמידת הצורך/ביצעו כתמים אימונוהיסטוכימיים נוספים שבוצעו. איור 6 מתאר כתמים למופת שבוצעו ב-TMA1, כולל Vimentin, U6, EBER ו-CD20. רקמות חיוביות של וימנטין (כתם חום) מצביעות על כך שכל הרקמות הן ממוצא מזנכימלי והן באיכות טובה שניתן להכתים. חיוביות U6 (כתם סגול כהה/כחול) מצביעה על כך שאיכות הרנ"א ברקמה טובה ומחמיאה לכתמי הכלאה של RNA in situ (ISH) כגון EBER, המכוונים לתעתיקי גנים. תוצאות U6 באיור 5 מצביעות על כך שאיכות הרנ"א גבוהה ברקמת הלימפומה (נקודה 9) ובקרת הכיוון הרגילה של רקמת השקדים (נקודה 22) אך לא ברקמה הרגילה במקום 19. בהמשך לצביעת EBER זו הייתה שלילית ברקמה התקינה ובקרת הכיוון אך חיובית מאוד ברקמת הלימפומה (נקודה 9). כצפוי עבור רקמות שמקורן בלימפואידים, שני הכתמים 9 ו-22 הוכתמו כחיוביים עבור סמן תאי B CD20, אך נקודה 19, הנובעת מרקמת חוט שדרה תקינה, לא עשתה זאת. תוצאות ההכתמה עבור כל ליבות ה-TMA מסוכמות בטבלה 1 ומאששות את ביאור הרקמה עבור ליבות רקמת TMA אלה.
איור 1: מפות TMA. לאחר שנבחרה כל בלוקי ה-FFPE ובקרות ההתמצאות, נוצרה מפה מפורטת, המכונה מפת TMA (A), המפרטת היכן כל ליבת בלוק תורם תמוקם בבלוק המוגמר. חשוב לציין כי בעת בניית TMA בשיטת הקלטת, מפת הבנייה (B) היא תמונת מראה של מפת TMA מכיוון ששיטה זו הופכת את תהליך הבנייה, ושופכת פרפין מותך סביב ליבות רקמה זקופה במקום להכניס את הליבות לתבנית precast. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: בניית ה-TMA בשיטת הקלטת. מקם את החלק הראשון של DSST (2A להוסיף), ואחריו את רשת הנייר החד פעמית, ולאחר מכן את החלק השני של DSST בתחתית תבנית בסיס המתכת. (B) עבור כל בלוק תורם, H&E טרי נוצר ונבדק על ידי פתולוג המסמן את H&E כדי לציין את הרקמה המעניינת, היכן לנקב את הבלוק ואם ישים היכן ישים היכן להימנע מניקוב כדי לחלץ ליבת רקמה. (C) להכות את בלוק התורם עם סילוק או אגרוף TMA ידני לשימוש חוזר. (D) באמצעות פיק מחט, כל ליבה ממוקמת בעמידה זקופה, גידול עם הפנים כלפי מטה על ה-DSST המכסה את הרשת. (E) הניחו בזהירות קלטת פלסטיק מסומנת מראש על גבי מגש המתכת המכילה את הליבות הזקופות. (F) פרפין מומס נשפך בעדינות לתוך המגש דרך הסריג של הקלטת כדי להקיף ולהטביע את הליבות הזקופות מתחת לקלטת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כתם H&E בלוק תורם. מקטעים מוכתמים של H&E מכל בלוק תורם כפופים לבדיקה של QC עם פתולוג אימון המבאר את השקופית המוכתמת ב- H&E עם סמן כדי לציין את האזורים / הרקמות המעניינות (כלומר, רקמות סרטן בר קיימא (CA) או שפיר (BN) לאיסוף ליבה, כמו גם אזורים שיש להימנע מהם (כלומר, אזורי רקמה נמקית). האזורים המתאימים של בלוק הרקמה, כפי שמצוין על ידי H&E המבואר, מזוהים לאחר מכן, מנוקבים ומשולבים ב- TMA הנבנה. לאחר מכן ניתן להפנות את אגרוף ליבת ה-TMA H&E שנוצר בחזרה לאזור הלא מרוסן של בלוק התורם H&E כדי לאשר שהרקמה המעניינת נלכדה באגרוף הליבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תוצאות מייצגות. (A,B) TMAs של שיטת הקלטת שהושלמו בהצלחה ואת ה-H&Es הנלווים אליהם לצורך סקירה פתולוגית. (C) הפרדת קלטת הפלסטיק וגוש הפרפין כאשר הקלטת מוסרת בטרם עת מתבנית בסיס המתכת. (D) שיטת קלטת שהושלמה TMA המציגה ליבות מופלות ומנודדות כתוצאה מזיגה סוערת של הפרפין המותך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: ליבת TMA H&Es H&Es. מקטע מוכתם H&E עבור TMA1, המציג את ה-H&Es הבודדים עבור כל ליבת רקמה המשמשת לבניית ה-TMA (כתמים 1-21) וכן את ליבות הכיוון (כתמים 22 ו-23). התמונות שהוצגו התקבלו באמצעות מטרה של 4x, מצוידת במצלמה דיגיטלית המחוברת לתוכנת ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: אימונוהיסטוכימי למופת ו-RNA ISH. קטעי פנים מלאים מ- TMA1 הוערכו על ידי IHC לביטוי וימנטין ו- CD20 ועל ידי RNA ISH כדי להעריך את איכות ה- RNA (U6) ומצב ה- EBV באמצעות EBER ISH. התמונות מציגות תמונות מופתיות לשלוש ליבות, כולל רקמת גידול אחת (נקודה 9), רקמה נורמלית אחת (נקודה 19), וכן אחת משתי פקדי הכיוון (נקודה 22). חיוביות Vimentin מסומנת על ידי כתמים חומים, חיוביות U6 מסומנת על ידי כתמים כחולים / סגולים, EBER על ידי כתמים כחולים / סגולים ו- CD20 על ידי צביעה חומה. התמונות שהוצגו התקבלו באמצעות מטרה של 4x, מצוידת במצלמה דיגיטלית המחוברת לתוכנת ההדמיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: סקירה כללית של רקמות TMA בנויות וכתמים שבוצעו: הטבלה מתארת אם (א) רקמה קיימת בכל אחד מכתמי ה-TMA המייצגים (ב) הגידול נמצא בכל כתם רקמה מוכתם ב-H&E ו-(ג) התוצאות של כתמים אימונוהיסטולוגיים נוספים שבוצעו בקטעי TMA סמוכים: "-" מציין שלילי, n/d = לא נעשה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Discussion
אחד המרכיבים הקריטיים ביותר בתהליך הבנייה של TMA הוא סקירת פתולוגיה של בלוקים של תורמי FFPE שמהם יקבלו ליבות ה- TMA4. במהלך הסקירה, פתולוג מוסמך בוחן חתך רקמות מוכתם H&E מייצג מכל גוש תורם. זה הכרחי כי H&E נוצר באמצעות קטע רקמה חתוך טרי, כך שהוא הייצוג הטוב ביותר של בלוק התורם המקביל שלה. השימוש ב-H&Es ישנים יותר אינו מומלץ בהתחשב בכך שרקמות FFPE הן מבנים תלת-ממדיים שפרופיל הרקמה שלהם יכול להשתנות באופן משמעותי עם עומק הבלוק וחתך נרחב; ייתכן שזה קרה מאז שנוצר ה-H&E, מה שעלול להפוך את הייצוג שלו של בלוק ה-FFPE ללא מדויק. תהליך הבדיקה חיוני לבחירת מקרים מתאימים ולזיהוי אזורי רקמות שמהם יש להשיג ליבות, כמו גם לזיהוי אזורים שיש להימנע מהם בעת איסוף ליבות. בהיעדר סקירה פתולוגית, ההסתברות לכלול רקמות לא מתאימות עולה באופן משמעותי. להכללה של רקמות כאלה יש פוטנציאל להפוך את ה-TMA המובנה ללא יעיל ולא מתאים למטרתו המיועדת. חשוב לציין, לשימוש לא מודע ב-TMAs לא יעילים כאלה יש פוטנציאל עצום לגרום לנתונים כוזבים ומטעים. זה בשילוב עם הידיעה שהפרופיל של רקמות FFPE, ולכן הליבות הנגזרות שלהן, יכולים להשתנות באופן משמעותי עם הגדלת העומק מדגיש את החשיבות של המשך סקירת הפתולוגיה לאורך כל חייו של בלוק TMA בנוי. באופן אידיאלי יש ליצור H&Es באמצעות כלמקטע 15 או 20כדי להבטיח שכל שינוי בפרופילי הרקמה של הליבות נלכדים ומתועדים. לכל הפחות, יש ליצור H&Es ולהיבדק בתחילתו ובסיומו של פרויקט כדי לעקוב אחר שינויים פוטנציאליים אלה. לאור נקודות אלה וחשיבותו של ה- TMA ככלי מחקר, חובה על הסקירה הפתולוגית להיות מוטמעת היטב בתהליך בניית ה- TMA ולאורך כל חייו של בלוק ה- TMA.
בלוקי FFPE מחולקים לעתים קרובות באופן נרחב במהלך עיבוד אבחון שגרתי לפני שהם משוחררים למטרות מחקר. כתוצאה מכך, עומק בלוק התורם ולכן אורכי הליבה של בלוק התורם הם לעתים קרובות פחותים מהאידיאל של שיטת המקבל של 4 מ"מ. כאן הדגמנו כיצד לבנות TMAs באמצעות פרוטוקול בניית שיטת הקלטת, שהיתרון העיקרי שלו הוא תאימותו לליבות מבלוקים לא אידיאליים של רקמת FFPE. למרות ששיטת הקלטת היא בעלת ערך מחקרי רב ומציעה שיטה זולה, נוחה ונגישה לבניית בלוקי TMA, היא אינה נטולת אתגרים ומגבלות. בהשוואה לשיטות נמענים אוטומטיות וידניות, שיכולות להכיל 100-1,000 ליבות בבלוק TMA יחיד, מומלץ לכל היותר 40 ליבות עבור TMAs שנבנו בשיטת הקלטת9. מגבלה נוספת היא ביחס לקלות הבנייה. בשיטת הנמען, ליבות מנוקבות מוכנסות רק לתבנית precast, המספקת יציבות ליבה על ידי עטיפת כל ליבה בבאר האינדיבידואלית שלה, ובכך מונעת נדידת ליבה כמו גם מקדמת מיקום ליבה והפרדה רגילים מאוד22. יתר על כן, שיטת הנמען מציעה את הנוחות האופציונלית של להיות ידני לחלוטין, חצי ידני, ואוטומטי לחלוטין. לעומת זאת, שיטת הטייפ הידנית דורשת מיקום זהיר ועדין של כל ליבה ביד באמצעות בחירת מחט. למרות שהיעדר תבנית precast בשיטת הקלטת מונע את המיקום וההפרדה הרגילים ביותר שחווים בשיטת הנמען, חסר זה מתגבר באמצעות הכללת רשת משובצת. חשוב שהרשת המשובצת תוצמד למרכז מגש המתכת על מנת למנוע מיקום קצה בלוק, מה שמגדיל את הסיכון לאובדן הליבה אם אין מספיק פרפין שמחזיק את הליבה במקומה. כמו כן יש לציין כי הפרדות הליבה הקטנות האפשריות בשיטת הנמען אינן ניתנות להשגה בשיטת הקלטת בשל מיקום הליבה הידני והצורך בבחירת המחט כדי להתאים בין ליבות סמוכות. הליבות ממוקמות בצורה זקופה העומדת בפני עצמה עם שטח הפנים או טביעת הרגל הקטנים ביותר של הליבה היוצרת קשר עם הרשת המכוסה DSST. הגדרה זו מספקת יציבות ליבה נמוכה משמעותית משיטת הנמען ומעניקה סיכון מוגבר להפלת ליבה או הגירה בעת שפיכת הפרפין המותך. ואכן, אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הוא מזיגת הפרפין המותך. זה חיוני כי זה נעשה במהירות עם ההסרה מהתנור כדי להבטיח את הפרפין הוא נוזלי לחלוטין וכי המזיגה מבוצעת בעדינות עם מערבולות מינימליות. באופן מעניין, Chen et al. פיתחו מכשיר עזר חדשני ביותר, הדומה לשבלונה עם 7 x 11 חורים בקוטר 2 מ"מ המפוזרים באופן שווה, הממוקמת על גבי בלוק פרפין ריק כדי להנחות מחטים בעת יצירת בלוק המקבל וכאשר מכניסים את ליבות בלוק התורם23. למרות שתוכנן לסייע בבניית בלוקים של מקבלים, מכשיר כזה יכול בקלות להיות מותאם לשיטת הקלטת כדי להנחות את המיקום, לווסת את ההפרדה ולהגביר את יציבות הליבה במהלך תהליך הבנייה.
אחד הגורמים המשפיעים המשמעותיים ביותר על יציבות הליבה הוא מספר הליבות הכלולות בשיטת קלטת TMA. הסיבה לכך היא שככל שמספר הליבות גדל, קוטר הליבה חייב לרדת על מנת להתאים למספר ההולך וגדל של ליבות, מה שבתורו מקטין את טביעת הרגל של הליבה הדבקה בשעון הקיץ. קוטר ליבה מינימלי של 1 מ"מ מומלץ לבניית TMA בשיטת קלטת, שכן מצאנו כי ליבות עם קטרים קטנים יותר אינן יציבות במיוחד ונוטות להפיל אפילו עם מזיגת פרפין עדינה מאוד. מחקר שנערך לאחרונה ובחן שתי שיטות פנימיות שונות שהשתמשו במחטים של 16 גרם (קוטר ליבה של 1.1 מ"מ) ובאגרוף בקוטר 4 מ"מ חוו אובדן רקמות משמעותי עם 1.1 מ"מ (26.5%) אך לא עם ליבות 4 מ"מ24. נראה כי הדבר מצביע על כך שליבות קטנות יכולות להיות בעייתיות לעבוד איתן ולא רק במהלך הבנייה. יתר על כן, קטרים קטנים יותר עשויים שלא לייצג את גוש התורם המקורי כמו גם ליבות גדולות יותר, מה שמקשה על פרשנות פתולוגית ומגדיל את ההסתברות לייצוג לא מדויק של רקמות התורם.
להכללה ולמיקום של בלוקי התמצאות יש חשיבות עמוקה בבניית TMA. עם זאת, יש לכך חשיבות מיוחדת עבור TMAs שנבנו בשיטת קלטת. זה נובע מהעובדה ששיטת הקלטת הופכת את תהליך הבנייה ובכך מגדילה את הסיכון לדיסאוריינטציה מרחבית. אנו ממליצים לכלול עד שלוש ליבות כיוון בכל בלוק, וכי הן ממוקמות הרחק מליבות הדגימה על מנת לכוון את הבלוק בצורה הטובה ביותר. ליבות אוריינטציה יכולות להיות ליבות שנלקחו מגושי רקמות המכילים רקמות שונות באופן מובהק מהנושא של TMA הבנוי או כלי אוריינטציה ללא רקמות21, כאשר האחרון מועיל במיוחד למי שאינם פתולוגים. בשילוב עם מיקום ליבה לא רגיל בתבנית מטריצה, ליבות אוריינטציה ממזערות את הסיכון לדיסאוריינטציה.
ההבדל הבולט באורך הליבה בין TMAs שנבנו בשיטות הקלטת והמקבל נובע מהכללת עומק בלוק התורם בתהליך קבלת ההחלטות בעת בחירת שיטת הבנייה. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בסף שבו TMAs נבנים בשיטות הקלטת והמקבל כאשר לבלוקי התורם יש עומקים של <4 מ"מ ו-4 מ"מ, בהתאמה. חשוב לציין כי הכללת עומק בלוק התורם בבחירת שיטת הבנייה אינה אוניברסלית. למרות שניתן לבנות TMAs בשתי השיטות ללא קשר לעומק בלוק התורם, ליבות גבוהות יותר יכולות להפריע, או להפיל או להטות על ידי, את המיקום של קלטת הפלסטיק במהלך בניית TMA באמצעות שיטת הקלטת. הבחירה לכלול או להשמיט קריטריונים בתהליך קבלת ההחלטות תלויה בנוחיות הזמינה למעבדה, בעלות ובתוצר הסופי הרצוי. תחת הפרמטרים של פרוטוקול זה, מספר קטעי ה- TMA המותקנים בשקופיות שניתן לקבל משיטת קלטת שנבנתה TMA נמוך משמעותית מזה המתקבל משיטת נמען שנבנתה על ידי TMA. למרות שניתן לחסום מחדש את רקמות ה- FFPE כדי להגדיל את עומק בלוק התורם ולהפוך אותן לתואמות לשיטת המקבל, ההסתברות להשיג את אותה כיוון רקמה בתוך הבלוק מחדש היא נמוכה. בתורו, זה עשוי לדרוש חסימה נרחבת מול כדי לקבל קטע פנים מלא, אשר ככל הנראה יכלול אובדן רקמות משמעותי. לאחר הפנייה לחסימה, שיטת קלטת שנבנתה TMA מניבה כ-50 קטעי TMA המותקנים על שקופיות כאשר כל הליבות קיימות. עם זאת, המספר המדויק ישתנה מגוש לבלוק ותלוי באורך הליבות המשמשות לבניית ה-TMA ובעובי החלקים שנחתכו (5 מיקרומטר לעומת 4 מיקרומטר). יתר על כן, יש לציין גם כי בגלל אורכי הליבה השונים שלהם, הליבות יתישו בזמנים שונים ככל שה- TMA מחולק בהדרגה; תכונה המדגישה מחדש את הצורך בהמשך סקירה פתולוגית.
למרות ששיטת הנמען מציעה יתרונות ויתרונות משמעותיים על פני שיטת הקלטת, כולל תהליכי בנייה פחות מייגעים ומהירים יותר, שיטת הקלטת אינה מכוונת למעבדות מנוסות בתפוקה גבוהה. הוא מכוון למעבדה הממוצעת, במיוחד אלה שנמצאים במסגרות מוגבלות במשאבים, עם גישה לבלוקים תורמים בעומקים משתנים אך לא לשירותי בנייה של TMA. עם זאת, יישומים עתידיים עשויים לראות אוטומציה של שיטה זו על מנת לשפר את מאגר הדגימות הזכאיות במעבדות בעלות תפוקה גבוהה ולבטל את הצורך בחסימה מחדש של בלוקים של תורמים. לסיכום, ניתן להקים בקלות את פרוטוקול בניית שיטת הקלטת TMA המתואר במעבדות שאינן מתמחות ללא צורך בציוד יקר. עם זאת, מומלץ כי משתמשים חדשים צריכים להשתמש בלוקים רקמת FFPE ללא ערך, כלי אוריינטציה צבעונית ללא רקמות21 או אפילו בלוקים פרפין צבעוניים ללא רקמה בהתחלה על מנת להכיר את טכניקת שיטת הקלטת לפני התקדמות לבניית TMA באמצעות רקמות יקרות. למרות שבנייתם אינה נטולת מלכודות פוטנציאליות, שגם אלה שבונים וגם משתמשים בבלוקים של TMA צריכים להיות מודעים אליהם, שיטת הבנייה "תוצרת בית" הלא מלוטשת לכאורה הזו של TMA יכולה להניב TMAs איכותיים ורלוונטיים ביולוגית למחקר. ואכן, מקטעי TMA הנובעים משיטת קלטת שנבנתה TMAs הם בין דגימות הרקמה המבוקשות ביותר בביו-רפוזיטוריה של ACSR.
Disclosures
אין לנו מה לחשוף.
Acknowledgments
המימון לעבודה זו סופק על ידי משאב דגימת האיידס והסרטן (ACSR) הממומן על ידי NIH (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
