Summary
이 프로토콜은 서로 다른 깊이의 FFPE 공여체 블록을 사용하여 조직 마이크로어레이를 수동으로 구성하는 방법에 대한 테이프 방법을 간략하게 설명합니다.
Abstract
조직 마이크로어레이(TMA)는 많은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 샘플이 단일 파라핀 블록으로 표현될 수 있는 중요한 연구 도구입니다. 이것은 상이한 공여체 FFPE 블록의 관심 영역으로부터 추출된 조직 코어를 사용하여 단일 TMA 파라핀 블록으로 배열함으로써 달성된다. 일단 구축되면, 완성된 TMA로부터의 절편은 면역조직화학, 염색체형성, 형광 계내 혼성화(FISH) 및 RNA ISH 연구를 수행하여 단백질 발현뿐만 아니라 많은 샘플에서 게놈 및 전사 변화를 동시에 평가함으로써 조직 사용을 최소화하고 시약 비용을 절감할 수 있다. 여러 가지 TMA 구성 기술이 있습니다. 가장 일반적인 시공 방법 중 하나는 최소 길이 4mm가 권장되는 동일한 길이의 코어에서 가장 잘 작동하는 수용자 방법입니다. 불행히도, 조직 블록은 진단 과정에서 심하게 절제될 수 있으며, 종종 4mm 미만의 "비이상적인" 공여체 블록 두께를 초래합니다. 현재 기사 및 비디오는 양면 접착 테이프 방법에 중점을 둡니다. 이러한 비이상적인 기증자 블록과 매우 호환되는 저밀도 (<50 코어) TMA를 구성하는 대체 매뉴얼, 저렴한 비용, 사용하기 쉬운 신속한 방법. 이 프로토콜은이 방법을 사용하여 TMA를 구성하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공하며, 병리학 적 검토 및 건설 후 검증의 중요한 중요성에 중점을 둡니다.
Introduction
포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직은 형태학적 및 면역조직화학적 단백질 발현 연구1에서 광범위하게 사용된다. 그러나 발견 연구는 종종 귀중한 조직을 배출 할 수있는 많은 수의 조직에서 여러 마커를 검사해야합니다. 1980년대에 도입된 조직 마이크로어레이(TMA)는 다양한 FFPE 조직 블록의 작은 예시적 관심 영역을 단일 파라핀 블록으로 조립하여 많은 조직 샘플을 동시에 검사할 수 있는 중요한 연구 도구입니다2. 따라서, TMA는 매우 귀중하고 종종 드문 조직 샘플의 과도한 사용을 피하면서 많은 개별 샘플(3,4)에서 다운스트림 애플리케이션을 수행하는 것과 관련된 비용을 감소시킨다.
TMAs(5)의 구축을 위한 몇 가지 상이한 기술들이 존재하며, 여기에는 자동화 및 반수동 접근법(6,7)이 포함된다. 이러한 후자의 접근법의 대부분은 수용자 방법을 사용하며, 여기서 기증자 블록으로부터 펀칭된 조직 코어는 프리캐스트 몰드에 삽입된다. 그러나 적어도 4mm 두께의 "이상적인"공여체 블록이이 방법 6,7에 사용되는 것이 좋습니다. 불행히도, 공여체 블록, 특히 연구에 이용가능하게 되기 전에 임상 진단 목적으로 광범위하게 절편화된 블록은 종종 두께가 4mm 미만이며, 이는 수용자 방법을 사용하는 TMA 구축에서의 사용에서 이들을 배제할 수 있고, 4 mm의 깊이를 달성하기 위해 재임베딩하는 경우 불가능하거나 바람직하지 않다. 또한, 이러한 절차는 종종 벤치탑 수동 조직 마이크로어레이러 또는 일반 연구 실험실에서 쉽게 접근할 수 없거나 저렴하지 않은 고가의 자동화 장비를 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 양면 접착 테이프 방법 또는 테이프 방법은, 저렴하고, 널리 이용가능하고, 재사용 가능하거나, 일회용 핸드헬드 조직 마이크로어레이기(8,9,10)를 사용하는 비이상적인 공여체 블록과 양립가능한 수동 TMA 시공 방법이다. 이 방법은 코어 길이에 관계없이 완료 시 TMA의 상단과 플러시되는 거꾸로 된 직립 코어 주위에 블록을 캐스팅하여 구성 프로세스를 반전시킵니다. 결과적으로 모든 샘플은 처음 단면화 될 때 TMA 섹션에 존재하므로 생성자가 처음부터 이러한 비 이상적인 블록을 최대한 활용할 수 있습니다. 따라서, 테이프 방법은 비전문 연구 실험실에 대한 비용 효과적이고 실현 가능한 대안을 나타냅니다.
TMA 구축은 그 도전이 없는 것은 아니며, 코어를 추출할 조직 영역을 선택할 때 주의해야 하며, 병리학적 검토가 TMA 구축 프로세스(11,12)의 중요한 부분이다. 따라서이 프로토콜은 TMA를 구성하고 사용하는 개인이 알아야 할 TMA 구축과 관련된 병리학 적 함정 중 일부와 TMA 블록의 평생 동안 병리학 적 검토가 계속되어야하는 이유를 강조함으로써 TMA 건설에서 병리학 적 검토의 심오한 중요성을 강조하는 것을 목표로합니다.
이 프로토콜은 AIDS 및 암 표본 자원 (ACSR) 기술 핵심 실험실에서 테이프 방법을 사용하여 비 이상적인 기증자 블록에서 TMA를 구성하기 위해 취한 단계를 간략하게 설명합니다. ACSR은 HIV 악성 종양 연구를 촉진하기 위해 HIV 암 조직으로부터 생물 표본의 수집 및 공평한 분배에 전념하는 NIH가 자금을 지원하는 생물 저장소입니다.
Protocol
모든 기증자 블록은 수집 중에 식별되지 않았으며 승인 된 Mayo Clinic IRB 프로토콜 (PR16-000507 및 PR2207-02)에 따라 TMA 구축에 사용되었습니다.
1. 병리학 검토
- TMA 구축에 사용되는 FFPE 조직 공여체 블록을 검색한다.
- 새로 생성된 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색된 슬라이드(13 )를 보드 인증 병리학자에 의한 조직학적 검토를 위해 선택된 각각의 FFPE 조직 공여체 블록에 제출하여 진단을 확인하고 조직에 주석을 달는다.
참고 : H & E 염색은이 프로토콜의 경우와 같이 집에서 수행되거나 염색을 위해 병리학 적 핵심 서비스 실험실로 보내질 수 있습니다. TMA를 구성할 때 기억해야 할 가장 중요한 개념 중 하나는 FFPE 공여체 블록의 조직이 블록 깊이가 증가함에 따라 모양, 종양 함량 및 조직 생존력이 크게 바뀔 수 있는 3차원(3D) 구조라는 것입니다. 병리학자는 3D 조직의 2 차원 표현 인 H & E 염색 조직 섹션의 검토를 기반으로 조직 코어를 추출하기에 가장 적합한 영역을 결정해야합니다. - 조직학적 검토 중에 병리학자가 H&E 염색된 슬라이드에서 관심 있거나 관심 없는 조직을 식별하고 주석을 달아야 합니다. 슬라이드에 주석을 달려면 아래 단계를 따릅니다.
- 슬라이드 마킹 펜을 사용하여 관심 있는 조직을 동그라미로 돌립니다.
- 동일한 마킹 펜을 사용하여 피해야 할 원 영역 내의 영역을 얼룩지게 만듭니다.
- 마킹 펜을 사용하여 코어 샘플링 및 추출에 이상적인 것으로 간주되는 영역을 표시하십시오.
참고 : 조직 모양과 구성이 블록의 조직 깊이에 따라 변경 될 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, 조직 코어의 조성은 코어가 추출된 위치에 따라 변할 수 있으며, 이는 지속적인 병리학적 안내의 필요성을 강조한다. - 필요한 경우 병리학 적 검토를 돕기 위해 H & Es와 함께 질병 별 면역 조직 화학 염색을위한 추가 조직을 제출하십시오. 이러한 염색의 예에는 HER2 양성 유방암에 대한 ERBB2 염색 14, 카포시 육종에 대한 HHV-8 15, B 세포 림프종에 대한 CD20 16, RNA 품질 17에 대한 글로벌 마커로서 U6, 엡스타인-바 바이러스 양성을 결정하기 위한 EBER18, 및 중간엽 기원의 확인으로서 비멘틴 및 조직 품질 관리 마커 19,20이 포함된다.
2. TMA 구축 준비
- 병리학 검토가 완료되면 TMA 구축에 사용할 기증자 블록의 최종 목록을 컴파일하고 TMA 맵을 만듭니다 (그림 1A). TMA 맵은 코어가 완성된 TMA 및 생성된 TMA로부터 수득된 슬라이드 장착 조직 샘플에 위치할 위치를 개략적으로 개략적으로 요약한 것이다.
- 방향을 위해 TMA 맵이 3 x 3 또는 4 x 4 행렬과 같은 짝수 행렬에 코어를 배치하는 것을 방지하고 1개 이상의 방향 마커를 포함하는지 확인하십시오.
참고: 배향 코어는 무조직 착색 배향 도구(21)로부터 취해진 코어일 수 있거나, TMA의 주제로부터 뚜렷하게 상이한 조직을 포함하는 조직 블록일 수 있다. 직립 코어가 프리 캐스트 왁스 몰드에 삽입되는 수용자 방법과 달리, 테이프 방법은 거꾸로 된 직립 코어 주위에 용융 왁스를 부어 TMA를 생성합니다. 건설 프로세스의 이러한 반전에는 건설 맵으로 알려진 두 번째 맵이 필요합니다. - TMA 맵의 미러 이미지를 만들어 건설 맵을 만듭니다(그림 1B). 건설 맵은 완성 된 TMA의 올바른 위치에 나타나기 위해 건설 중에 각 코어를 배치해야하는 위치를 보여줍니다. 건설 맵을 저장합니다.
- 맵이 생성되면 금속 TMA 베이스 몰드를 준비합니다. 일회용 종이 체크 무늬 그리드를 사용하여 코어 배치를 안내하고 코어 분리를 조절하십시오.
참고: 내부 치수가 26mm x 20mm인 상용 금속 베이스 몰드와 함께 사용할 수 있도록 최대 40개 코어(두 개의 방향 코어/갭 포함)를 위한 6 x 7(42스팟) 템플릿 그리드가 보충 pdf에 제공됩니다. 용지 격자를 인쇄하고 잘라냅니다. - 체크 무늬 격자를 크기에 맞게 자르고 양면 스틱 테이프(DSST) 조각을 격자 뒷면에 부착합니다. 그리드 및 DSST 테이프를 금속 트레이에 놓고 그리드 상단, 즉 금속 베이스 몰드의 용지 그리드 위에 DSST의 두 번째 조각을 추가합니다(그림 2A).
3. 코어 배치
- 병리학적으로 검토된 H&E를 해당 조직 블록에 오버레이하고 병리학자 표시를 사용하여 조직 블록을 펀칭할 위치를 확인합니다(그림 2B).
- 적절한 위치에서 수동 코어 펀치(그림 2C)를 사용하여 FFPE 도너 블록을 펀치합니다.
참고: 코어 펀치는 다양한 직경으로 제공됩니다. 이 방법은 직경 2mm 핸드헬드 코어 펀치를 사용합니다.- 재사용 가능한 코어 펀치를 사용하는 경우 각 티슈 펀치 전후에 청소해야 합니다.
- 코어 펀치에서 코어를 꺼내고 바늘 픽을 사용하여 배출된 코어를 DSST 커버 그리드의 십자선에 배치합니다(그림 2D). 코어가 그리드에 배치될 때 코어의 조직 끝이 DSST와 접촉하도록 코어가 반전되고 똑바로 세워졌는지 확인하십시오(조직-면-아래로). 또한 코어가 건설 맵에 표시된 그리드의 적절한 위치에 배치되었는지 확인하십시오.
- 모든 공여체 블록이 부식되고 코어가 적절한 위치에 배치 될 때까지 반복하십시오.
4. TMA 완료
- 벤치 탑 오븐을 켜고 78 °C로 설정하고 온도에 도달하는 데 충분한 시간을 두십시오.
- 각 TMA가 구축될 수 있도록, 45 g의 파라핀 펠릿을 오븐 방지 용기에 녹인다.
- 플라스틱 카세트에 라벨을 붙이고 코어가 들어있는 금속 베이스 몰드 위에 놓습니다(그림 2E). 카세트를 놓을 때 키가 큰 코어가 기울어 지거나 쓰러지기 때문에 코어의 높이는 금속 트레이의 깊이를 초과해서는 안됩니다.
- 카세트가 있는 몰드를 트레이 위에 올려 놓고 오버플로를 잡아내고 녹은 파라핀을 카세트를 통해 코어 트레이에 부드럽게 붓습니다(그림 2F).
- 용융된 파라핀이 넘치도록 허용하여 TMA의 몸체에 기포가 없도록 하십시오. 파라핀이 카세트의 상단으로 채워져 파라핀이 응고되면 파라핀 블록에 매립되고 단단히 결합되도록하십시오.
- 블록을 움직이거나 방해하지 말고 실온에서 30 분 동안 식히십시오. 이어서, 4°C에서 추가로 30분 동안 냉장 보관하여 완전히 응고시킨다.
- 일단 완전히 응고되면, 코어의 카세트 결합된 파라핀 블록으로부터 금속 베이스 몰드를 부드럽게 분리한다.
참고: DSST는 시공 과정을 통해 접착력을 유지하며 새로 형성된 파라핀 블록에 자주 부착됩니다. 해당되는 경우 DSST와 그리드를 현재 완료된 TMA 블록의 상단에서 조심스럽게 제거하십시오.
5. TMA 검증
- TMA가 구축되면 마이크로톰을 사용하여 새로 완성 된 TMA를 절편화하십시오. 하나 이상의 전체 얼굴 조직 섹션을 절단하십시오.
- 섹션을 예열 된 수조로 옮기고 섹션을 슬라이드 마운트하십시오.
참고: 새로 구성된 블록은 모든 코어를 포함하는 전체 얼굴 조직 섹션을 얻기 위해 블록 마주 보는 것(과도한 파라핀을 잘라내는 것)이 필요한 경우가 많습니다. - 일단 건조되면, H&E 염색13 및 필요한 경우 추가적인 면역조직화학 염색을 위해 갓 자른 슬라이드 장착형 TMA 섹션을 제출하십시오.
- 병리학 적 검토를 위해 염색 된 TMA H & E 섹션을 제출하십시오.
참고 : TMA 병리학 검토 중에 보드 인증 병리학자, 바람직하게는 TMA 기증자 블록을 검토 한 동일한 병리학자가 TMA H & E 염색 코어를 검토하여 원하는 조직이 실제로 존재하는지 확인합니다. 1.3.4단계에서 기증자 차단 검토를 위해 추가적인 조직 또는 질병별 면역조직화학 염색이 제출된 경우, 이러한 얼룩은 TMA 절편에서 반복되고 병리학적 검토를 위해 TMA H&E와 함께 제출되어야 합니다. - TMA 병리학 적 검증 검토 결과를 기록하십시오.
Representative Results
여기에 설명 된 TMA 구성의 테이프 방법은 조직을 보존하기 위해 ACSR 기술 핵심 실험실에서 채택 된 선택 방법이며, 이는 매우 귀중한 조직을 연구원에게 검소하고 공평하게 분배 할 수있게합니다.
건설 과정의 중요한 구성 요소는 TMA 코어가 얻어져야하는 곳에서 주어진 공여체 블록에서 관심있는 조직을 식별하는 것입니다. 이것은 훈련 된 병리학자가 새로 생성 된 H & E 슬라이드를 검토하는 병리학 적 검토에 의해 결정됩니다 (그림 3). 병리학자는 마커를 사용하여 H&E 슬라이드의 영역을 원으로 표시하는데, 이는 코어가 이 원 내부의 기증자 블록으로부터 얻어져야 함을 나타냅니다(그림 3). 병리학자는 또한 피해야 할 괴사 부위 또는 추가 조직 코어를 얻을 수있는 양성 영역과 같은 추가 영역을 표시 할 수 있습니다 (그림 3). 그런 다음 코어는 표시된 영역에서 펀칭되어 TMA 건설에 포함됩니다.
테이프 방법으로 TMA를 성공적으로 완료하기 위한 두 가지 주요 메트릭이 있습니다. 첫 번째는 예상되는 위치와 서로 떨어져있는 거리에 조직 코어 점의 존재이며, 이는 육안 검사에 의해 평가됩니다. 그림 4A,B는 성공적으로 완전히 테이프 방식으로 두 개의 TMA와 해당 H&E 슬라이드를 보여줍니다. TMA 블록의 육안 검사는 코어가 존재하고 각 TMA에 정기적으로 이격되어 있음을 보여줍니다. 테이프 방법 시공 공정 중에 발생할 수 있는 주요 구성 문제 중 일부는 왁스 응고 전에 금속 베이스의 조기 제거로 인한 블록과 카세트의 분리를 포함한다(도 4C). 구성된 TMA의 테이프 방법으로 관찰되는 또 다른 잠재적 문제는 임베디드 코어의 코어 토플 및 배치 드리프트입니다(그림 4D). 용융된 파라핀의 과도한 난기류가 쏟아져 나올 수 있는 문제이며, 이는 접착성이 불량한 DSST에 의해 더욱 강화될 수 있다. 그림 5는 TMA1의 코어에 대한 H&E 이미지를 보여준다. 하나의 코어(스폿 1)를 제외한 모든 코어가 TMA1의 H&E에 존재한다. 도 5는 또한 일부 코어가 완전한 원형 조직 도트 (즉, 스폿 4, 6, 13, 17)로서 존재하는 반면, 다른 코어는 완전히 존재하지 않는다는 것을 보여준다 (즉, 스폿 3, 8, 9, 12). 이러한 후자의 경우에 경험하는 조직 손실은 드문 일이 아니며 모든 코어를 완전히 드러내는 데 필요한 절편이 불충분하기 때문일 수 있습니다. 대안적으로, 불완전한 존재, 또는 조직의 전체 부재 (즉, 스폿 1)는 그 코어의 불량한 조직 품질로부터 기인할 수 있으며, 이는 염색 과정 동안 조직 손실을 초래할 수 있다.
성공의 두 번째 메트릭은 TMA 코어가 관심 조직을 포획했는지 여부의 관점에서 평가됩니다. 이는 개별 TMA H&E 코어(그림 5)의 병리학적 검토 및 검증을 통해 사전 펀칭된 공여체 블록 H&Es(그림 3)와 비교하고, 필요한 경우 다른 추가적인 면역조직화학 염색을 수행/수행함으로써 달성됩니다. 도 6은 Vimentin, U6, EBER 및 CD20을 포함하는 TMA1에 대해 수행된 예시적인 염색을 묘사한다. Vimentin 양성 조직 (갈색 얼룩)은 모든 조직이 중간엽 기원이며 염색 할 수있는 좋은 품질임을 나타냅니다. U6 양성 (진한 보라색 / 파란색 염색)은 조직의 RNA 품질이 양호하다는 것을 나타내며 유전자 전사체를 표적으로 삼는 EBER와 같은 계내 혼성화 (ISH) 염색에서 RNA를 보완합니다. 도 5의 U6 결과는 RNA 품질이 림프종 조직(스팟 9) 및 정상 편도선 조직 배향 대조군(스팟 22)에서는 높지만 스팟 19에서는 정상 조직에서는 높지 않다는 것을 나타낸다. 이로부터 EBER 염색은 정상 조직 및 배향 대조군에서는 음성이었지만 림프종 조직에서는 강하게 양성이었다(스팟 9). 림프성 기원의 조직에 대해 예상된 바와 같이, 스팟 9 및 22 둘 다 B 세포 마커 CD20에 대해 양성으로 염색되었지만, 정상 척수 조직으로부터 유래하는 스팟 19는 그렇지 않았다. 모든 TMA 코어에 대한 염색 결과를 표 1에 요약하고 이들 TMA 조직 코어에 대한 조직 주석을 확인하였다.
그림 1: TMA 맵 모든 FFPE 블록과 방향 제어가 선택되면 TMA 맵(A)으로 알려진 상세한 맵이 생성되어 완성된 블록에서 각 도너 블록 코어가 위치할 위치를 윤곽을 그립니다. 테이프 방법을 사용하여 TMA를 구성 할 때, 건설 맵 (B)은 TMA 맵의 미러 이미지입니다.이 방법은 건설 프로세스를 반전시켜 코어를 프리 캐스트 몰드에 삽입하는 대신 직립 조직 코어 주위에 용융 파라핀을 붓기 때문입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 테이프 방법을 사용하여 TMA를 구축한다. (A) 금속 기재 몰드의 바닥에 순서대로 양면 스틱 테이프(DSST) 및 종이 격자의 층 2 조각; DSST의 첫 번째 조각 (2A 인서트)을 놓고 일회용 용지 그리드를 놓은 다음 DSST의 두 번째 조각을 금속 모형 바닥에 놓습니다. (B) 각 기증자 블록에 대해 H&E를 표시하여 관심있는 조직, 블록을 펀치할 위치 및 적용 가능한 경우 조직 코어를 추출하기 위해 펀칭을 피할 수 있는 위치를 나타내는 병리학자에 의해 새로운 H&E가 생성되고 검토됩니다. (C) 폐기 또는 재사용 가능한 휴대용 TMA 펀치로 기증자 블록을 펀치합니다. (d) 바늘 픽업을 사용하여, 각 코어는 똑바로 서서, 종양은 그리드를 덮는 DSST 상에 아래로 향하도록 배치된다. (E) 직립 코어가 들어있는 금속 트레이 위에 미리 라벨이 붙은 플라스틱 카세트를 조심스럽게 놓습니다. (F) 용융된 파라핀을 카세트 격자를 통해 트레이에 부드럽게 부어 카세트 아래의 직립 코어를 둘러싸고 잠수시킨다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기증자 블록 H&E 얼룩. 각 기증자 블록의 H&E 염색된 절편은 H&E 염색된 슬라이드에 마커로 주석을 달아 핵심 수집을 위한 관심 영역/조직(즉, 생존 가능한 암(CA) 또는 양성(BN) 조직)과 피해야 할 영역(즉, 괴사 조직 영역). 주석이 달린 H&E에 의해 지시된 바와 같이 조직 블록의 적절한 영역은 그 후 식별되고, 펀칭되고, 구축되는 TMA에 통합된다. 그런 다음 생성된 TMA 코어 펀치 H&E를 기증자 블록 H&E의 펀칭되지 않은 영역으로 다시 참조하여 관심 조직이 코어 펀치에 포착되었음을 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 대표적인 결과. (A, B) 병리학 적 검토를 위해 테이프 방법 TMA 및 수반되는 H & E를 성공적으로 완료했습니다. (c) 카세트가 금속 베이스 몰드로부터 조기에 제거될 때 플라스틱 카세트와 파라핀 블록의 분리. (d) 용융된 파라핀의 난류 부어짐으로 인한 전복 및 이동된 코어를 보여주는 완성된 테이프 방법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: TMA 코어 H&Es. TMA1에 대한 H&E 염색 절편은 TMA를 구성하는 데 사용되는 각 조직 코어(스팟 1-21)와 배향 코어(스팟 22 및 23)에 대한 개별 H&Es를 보여준다. 표시된 이미지는 이미징 소프트웨어에 연결된 디지털 카메라가 장착된 4x 목표를 사용하여 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 예시적인 면역조직화학 및 RNA ISH. TMA1로부터의 전체 얼굴 절편은 비멘틴 및 CD20 발현에 대해 IHC에 의해 평가되었고, EBER ISH를 통해 RNA 품질 (U6) 및 EBV 상태를 평가하기 위해 RNA ISH에 의해 평가되었다. 이미지는 하나의 종양 조직(스폿 9), 하나의 정상 조직(스폿 19), 및 두 개의 배향 대조군 중 하나(스폿 22)를 포함하는 세 개의 코어에 대한 예시적인 이미지를 보여준다. 비멘틴 양성은 갈색 염색으로 표시되고, U6 양성은 청색/자주색 염색으로, EBER는 청색/자주색 염색으로, CD20은 갈색 염색으로 표시한다. 표시된 이미지는 이미징 소프트웨어에 연결된 디지털 카메라가 장착된 4x 목표를 사용하여 획득되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 구축된 TMA 조직 및 수행된 얼룩의 개요: 표는 (a) 조직이 각각의 대표적인 TMA 스폿에 존재하는지 여부를 간략하게 설명하고, (b) 종양이 각 H&E 염색된 조직 스폿에 존재하고, (c) 인접한 TMA 절편에서 수행된 추가적인 면역조직학적 염색의 결과를 요약한다: "-"는 음성, n/d = 완료되지 않음을 나타낸다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
TMA 구축 공정의 가장 중요한 구성 요소 중 하나는 TMA 코어가 얻어질 FFPE 공여체 블록의 병리학 적 검토입니다4. 검토 중에 보드 인증 병리학자는 각 기증자 블록에서 대표적인 H & E 염색 조직 섹션을 검사합니다. H&E는 갓 절단한 조직 섹션을 사용하여 생성되어 해당 기증자 블록을 가장 잘 표현해야 합니다. FFPE 조직이 블록 깊이와 광범위한 단면화에 따라 조직 프로파일이 크게 바뀔 수있는 3 차원 구조라는 점을 감안할 때 오래된 H & Es의 사용은 권장되지 않습니다. 이것은 H & E가 생성 된 이후 발생했을 수 있으며, 잠재적으로 FFPE 블록의 표현이 부정확 할 수 있습니다. 검토 과정은 적절한 사례를 선택하고 코어를 얻어야하는 조직 영역을 확인하고 코어를 수집 할 때 피해야 할 영역을 식별하는 데 필수적입니다. 병리학 적 검토가없는 경우, 부적절한 조직을 포함 할 확률이 크게 증가합니다. 이러한 조직의 포함은 구축된 TMA를 비효율적이며 그것의 의도된 목적에 부적합하게 만들 가능성이 있다. 중요한 것은 이러한 비효율적 인 TMA를 무의식적으로 사용하면 허위 및 오도 된 데이터가 발생할 수있는 엄청난 잠재력을 가지고 있다는 것입니다. 이것은 FFPE 조직의 프로파일, 따라서 그들의 유도체 코어가 깊이가 증가함에 따라 크게 바뀔 수 있다는 지식과 결합하여 구성된 TMA 블록의 수명 동안 지속적인 병리학 검토의 중요성을 강조합니다. 이상적으로 H&Es는 코어의 조직 프로파일의 변화가 포착되고 기록되도록 하기 위해 매 15번째 또는 20번째 섹션마다 생성되어야 합니다. 최소한 H&Es는 프로젝트의 시작과 끝에서 생성되고 검토되어 이러한 잠재적 변화를 모니터링해야 합니다. 이러한 점과 연구 도구로서의 TMA의 중요성에 비추어 볼 때, 병리학 적 검토가 TMA 건설 과정과 TMA 블록의 수명 전반에 걸쳐 확고하게 내재되어 있어야합니다.
FFPE 블록은 종종 연구 목적으로 출시되기 전에 일상적인 진단 처리 중에 광범위하게 섹션화됩니다. 결과적으로, 공여체 블록 깊이 및 따라서 공여체 블록 코어 길이는 종종 4mm의 이상적인 수용자 방법보다 작다. 여기서 우리는 테이프 방법 구축 프로토콜을 사용하여 TMA를 구성하는 방법을 시연했으며, 그 주요 이점은 비이상적인 FFPE 조직 블록의 코어와의 호환성입니다. 테이프 방법은 연구 가치가 뛰어나고 TMA 블록을 구성하기위한 저렴하고 편리하며 접근 가능한 방법을 제공하지만 도전과 한계가없는 것은 아닙니다. 단일 TMA 블록에 100-1,000개의 코어를 수용할 수 있는 자동 및 수동 수신자 방법과 비교할 때, 테이프 방법9를 사용하여 구성된 TMA에는 최대 40개의 코어가 권장됩니다. 또 다른 한계는 시공의 용이성에 관한 것이다. 수용자 방법에서, 펀칭된 코어는 단지 프리캐스트 몰드에 삽입될 뿐이며, 이는 각각의 코어를 그 자신의 개별 웰에 케이싱함으로써 코어 안정성을 제공함으로써, 코어 마이그레이션을 방지할 뿐만 아니라 매우 규칙적인 코어 배치 및 분리(22)를 촉진한다. 또한 수신자 방법은 완전 수동, 반수동 및 완전 자동화의 선택적 편의성을 제공합니다. 반대로, 수동 테이프 방법은 바늘 선택을 사용하여 각 코어를 손으로 조심스럽게 부드럽게 배치해야합니다. 테이프 방법에 프리 캐스트 몰드가 없기 때문에 수령인 방법에 경험하는 매우 규칙적인 배치 및 분리가 배제되지만 이러한 결함은 체크 무늬 격자를 포함함으로써 극복됩니다. 블록 에지 배치를 피하기 위해 체크 무늬 그리드를 금속 트레이의 중앙에 부착하는 것이 중요하며, 이는 코어를 제자리에 고정시키는 파라핀이 충분하지 않은 경우 코어 손실의 위험을 증가시킵니다. 또한 수용자 방법으로 가능한 작은 코어 분리는 수동 코어 배치와 인접한 코어 사이에 맞추기 위해 바늘 선택이 필요하기 때문에 테이프 방법으로 달성 될 수 없다는 점에 유의해야합니다. 코어는 DSST 커버 그리드와 접촉하는 코어의 가장 작은 표면적 또는 풋프린트로 독립형 직립 방식으로 배치됩니다. 이 설정은 수용자 방법보다 훨씬 적은 코어 안정성을 제공하고 용융 파라핀을 부을 때 코어 전복 및 또는 이동에 대한 향상된 위험을 부여합니다. 실제로, 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 용융 파라핀을 붓는 것입니다. 파라핀이 완전히 액체가되고 부어가 최소한의 난기류로 부드럽게 수행되도록하기 위해 오븐에서 제거 할 때 신속하게 수행해야합니다. 흥미롭게도, Chen 등은 7 x 11 고르게 분포 된 2mm 직경의 구멍이있는 스텐실과 유사한 매우 새로운 보조 장치를 개발했는데, 이는 수용자 블록을 만들 때와 도너 블록 코어(23)를 삽입 할 때 바늘을 안내하기 위해 빈 파라핀 블록 위에 배치됩니다. 수용자 블록 건설을 돕기 위해 설계되었지만, 이러한 장치는 테이프 방법에 쉽게 적응하여 배치를 안내하고, 분리를 조절하고, 건설 프로세스 중에 코어 안정성을 높일 수 있습니다.
코어 안정성의 가장 중요한 이펙터 중 하나는 테이프 방법 TMA에 포함된 코어 수입니다. 코어 수가 증가함에 따라 증가하는 코어 수를 수용하기 위해 코어의 직경을 줄여야 하며, 이로 인해 DSST에 부착되는 코어 풋프린트가 줄어들기 때문입니다. 테이프 방식 TMA 구축에는 최소 코어 직경 1mm가 권장되는데, 직경이 작은 코어는 특히 불안정하고 매우 부드러운 파라핀이 쏟아져 나오더라도 무너지기 쉽다는 것을 발견했습니다. 16G 바늘 (코어 직경 1.1mm)과 직경 4mm 펀치를 사용한 두 가지 사내 방법을 조사한 최근 연구에 따르면 4mm 코어 24가 아닌 1.1mm (26.5 %)의 상당한 조직손실이 발생했습니다. 이것은 작은 코어가 건설 중뿐만 아니라 함께 작업하는 데 문제가 될 수 있음을 나타내는 것으로 보입니다. 더욱이, 더 작은 직경은 원래의 기증자 블록뿐만 아니라 더 큰 코어를 나타내지 않을 수 있으며, 병리학 적 해석을 어렵게 만들고 부정확 한 기증자 조직 표현의 가능성을 증가시킵니다.
방향 블록의 포함 및 배치는 TMA 구성에서 매우 중요합니다. 그러나 이것은 TMA를 구성하는 테이프 방법에 특히 중요합니다. 이것은 테이프 방법이 건설 프로세스를 반전시켜 공간 방향 감각 상실의 위험을 증가시킨다는 사실에서 비롯됩니다. 모든 블록에 최대 세 개의 방향 코어를 포함하고 블록 방향을 가장 잘 맞추기 위해 샘플 코어에서 멀리 배치하는 것이 좋습니다. 배향 코어는 구축된 TMA 또는 조직-무색-착색 배향 도구(21)의 주제로부터 뚜렷하게 상이한 조직을 함유하는 조직 블록으로부터 취해진 코어일 수 있으며, 여기서 후자는 비병리학자에게 특히 유용하다. 비정규 매트릭스 패턴화된 코어 배치와 결합하여, 방향 코어는 방향 방향 상실의 위험을 최소화합니다.
테이프와 수령인 방법을 사용하여 구성된 TMA 간의 코어 길이의 뚜렷한 차이는 건설 방법을 선택할 때 의사 결정 프로세스에 기증자 블록 깊이를 포함시키는 데서 비롯됩니다. 여기에 설명된 프로토콜은 공여체 블록의 깊이가 각각 <4mm 및 4mm일 때 테이프 및 수용자 방법을 사용하여 TMA를 구성하는 임계값을 사용합니다. 건설 방법 선택에 기증자 블록 깊이를 포함시키는 것이 보편적 인 것은 아니라는 점에 유의해야합니다. TMA는 도너 블록 깊이에 관계없이 두 가지 방법 중 하나를 사용하여 구성 할 수 있지만 키가 큰 코어는 테이프 방법을 사용하여 TMA 시공 중에 플라스틱 카세트의 배치를 방해하거나 전복하거나 기울어 질 수 있습니다. 의사 결정 과정에서 기준을 포함하거나 생략하는 선택은 실험실에서 사용할 수있는 편의 시설, 비용 및 원하는 최종 제품에 따라 다릅니다. 이 프로토콜의 파라미터 하에서, 구성된 TMA를 테이프 방법으로부터 얻을 수 있는 슬라이드 장착형 TMA 섹션의 수는 수용자 방식으로 구성된 TMA로부터 수득된 것보다 상당히 적다. FFPE 조직을 재차단하여 공여자 블록 깊이를 증가시키고 수용자 방법과 호환되도록 할 수 있지만, 재차단 내에서 동일한 조직 배향을 달성할 확률은 낮다. 차례로, 이것은 전면 절편을 얻기 위해 광범위한 대면 블록을 필요로 할 수 있으며, 이는 상당한 조직 손실을 포함 할 가능성이 큽니다. 블록 직면 후, TMA로 구성된 테이프 방법은 모든 코어가 존재하는 약 50개의 슬라이드 장착 TMA 섹션을 생성합니다. 그러나 정확한 수는 블록마다 다르며 TMA를 구성하는 데 사용되는 코어의 길이와 절단되는 섹션의 두께 (5 μm 대 4 μm)에 따라 다릅니다. 또한, 코어 길이가 다르기 때문에 TMA가 점진적으로 단면화됨에 따라 코어가 다른 시간에 배출된다는 점에 유의해야합니다. 지속적인 병리학 적 검토의 필요성을 다시 강조하는 속성.
수신자 방법은 덜 지루하고 신속한 건설 프로세스를 포함하여 테이프 방법에 비해 상당한 이점과 이점을 제공하지만 테이프 방법은 경험이 풍부한 높은 처리량의 실험실을 대상으로하지 않습니다. 그것은 평균 실험실, 특히 자원이 제한된 설정에있는 실험실을 대상으로하며, 가변 깊이의 기증자 블록에 액세스 할 수 있지만 TMA 건설 서비스에는 액세스 할 수 없습니다. 그러나 향후 응용 분야에서는 고처리량 실험실에서 적격 샘플 풀을 강화하고 기증자 블록의 재차단 필요성을 없애기 위해이 방법의 자동화를 볼 수 있습니다. 결론적으로, 설명된 TMA 테이프 방법 구축 프로토콜은 고가의 장비 없이도 비전문 실험실에서 쉽게 확립될 수 있다. 그러나, 새로운 사용자는 귀중한 조직을 이용한 TMA 구축으로 발전하기 전에 테이프 방법 기술에 익숙해지기 위해 처음에는 가치가 없는 FFPE 조직 블록, 무조직 착색 배향 도구(21 ) 또는 심지어 조직이 없는 착색된 파라핀 블록을 사용해야 한다는 것이 권고된다. TMA 블록을 건설하고 사용하는 사람들 모두가 알아야 할 잠재적 인 함정이없는 것은 아니지만,이 겉으로보기에는 연마되지 않은 "수제"TMA 건설 방법은 연구를 위해 고품질의 생물학적으로 관련된 TMA를 산출 할 수 있습니다. 실제로, 테이프 방식으로 구성된 TMA에서 유래한 TMA 절편은 ACSR 생물저장소에서 가장 많이 요구되는 조직 샘플 중 하나입니다.
Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업에 대한 기금은 NIH가 자금을 지원하는 AIDS 및 암 표본 자원 (ACSR) 생물 저장소 (www.acsr1.com), UM1CA181255에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
- O'Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. BioTechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Jawhar, N. M. Tissue microarray: A rapidly evolving diagnostic and research tool. Annals of Saudi Medicine. 29 (2), 123-127 (2009).
- Fowler, C. B., et al. Tissue microarrays: construction and uses. Methods in Molecular Biology. 724, 23-35 (2011).
- Voduc, D., Kenney, C., Nielsen, T. O.
- Vogel, U. Overview on techniques to construct tissue arrays with special emphasis on tissue microarrays. Microarrays (Basel). 3 (2), 103-136 (2014).
- Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjostedt, E., Ponten, F. Production of tissue microarrays, immunohistochemistry staining and digitalization within the human protein atlas. Journal of Visualized Experiments. (63), e3620 (2012).
- Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. Journal of Visualized Experiments. (91), e51893 (2014).
- Pires, A. R., Andreiuolo Fda, M., de Souza, S. R. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology. 1, 14 (2006).
- Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 28 (4), 325-330 (2020).
- Wilkens, L. Verfahren und Vorrichtung zur Präparation von Gewebeproben (Method and Apparatus for the Preparation of Tissue Samples). German patent DE. 102, 102 03 524 A1 (2003).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G.
- Bubendorf, L., Nocito, A., Moch, H., Sauter, G. Tissue microarray (TMA) technology: miniaturized pathology archives for high-throughput in situ studies. The Journal of Pathology. 195 (1), 72-79 (2001).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ahn, S., Woo, J. W., Lee, K., Park, S. Y. HER2 status in breast cancer: changes in guidelines and complicating factors for interpretation. Journal of Pathology and Translational Medicine. 54 (1), 34-44 (2020).
- Fukumoto, H., Kanno, T., Hasegawa, H., Katano, H. Pathology of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus infection. Frontiers in Microbiology. 2, 175 (2011).
- Swerdlow, S. H., et al. WHO classification of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 4 end. 2, 449-452 (2017).
- Ramsower, C., et al. Assessment of 2-year storage conditions on protein, RNA, and DNA in unstained human tissue sections, including a novel multiplex digital gene expression profiling method with implications for biobanking. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Weiss, L. M., Chen, Y. Y. EBER in situ hybridization for Epstein-Barr virus. Methods in Molecular Biology. 999, 223-230 (2013).
- Yang, Y., DeYoung, B., Qasem, S. 314 vimentin stain: A useful stain or an ancient change. American Journal of Clinical Pathology. 149, suppl_1 135 (2018).
- Battifora, H. Assessment of antigen damage in immunohistochemistry. The vimentin internal control. American Journal of Clinical Pathology. 96 (5), 669-671 (1991).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the correct tissue every time in multi-tissue blocks. Journal of Visualized Experiments. (99), e52868 (2015).
- Fedor, H. L., De Marzo, A. M. Practical methods for tissue microarray construction. Methods in Molecular Medicine. 103, 89-101 (2005).
- Chen, Y. J., et al. An introduction of an easy-operating and economical technique for tissue microarray preparation. Journal of Clinical Pathology. 73 (7), 403-407 (2020).
- Gomez-de Maria, C., et al. Tissue arrays: Two simple and economical methods for manual construction. Archivos Espanoles de Urologia. 71 (10), 832-839 (2018).
