Summary
Este protocolo descreve o método de fita sobre como construir manualmente uma microarray tecidual usando blocos de doadores FFPE de diferentes profundidades.
Abstract
A microarray tecidual (TMA) é uma importante ferramenta de pesquisa na qual muitas amostras de parafina fixa formalina incorporadas (FFPE) podem ser representadas em um único bloco de parafina. Isso é conseguido utilizando núcleos de tecido extraídos da região de interesse de diferentes blocos FFPE doadores e organizando-os em um único bloco de parafina TMA. Uma vez construídas, seções do TMA concluído podem ser usadas para realizar estudos de imunohistoquímica, cromogênico, fluorescência nos estudos de hibridização situ (FISH) e RNA ISH para avaliar a expressão proteica, bem como alterações genômicas e transcricionais em muitas amostras simultaneamente, minimizando o uso de tecidos e reduzindo os custos de reagente. Existem várias técnicas diferentes de construção de TMA. Um dos métodos de construção mais comuns é o método receptor, que funciona melhor com núcleos do mesmo comprimento para os quais recomenda-se um comprimento mínimo de 4 mm. Infelizmente, os blocos de tecido podem ser fortemente ressecados durante o processo de diagnóstico, resultando frequentemente em espessuras de blocos de doadores "não ideais" de menos de 4 mm. O artigo e o vídeo atuais se concentram no método de fita adesiva de dois lados; um manual alternativo, de baixo custo, fácil de usar e método rápido para construir TMAs de baixa densidade (<50 núcleos) altamente compatíveis com esses blocos de doadores não ideais. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre como construir um TMA usando este método, com foco na importância crítica da revisão patológica e validação pós-construção.
Introduction
Os tecidos de parafina fixa formalina (FFPE) são usados extensivamente em estudos de expressão de proteína morfológica e imunohistoquímica1. No entanto, a pesquisa de descobertas muitas vezes requer o exame de vários marcadores em um grande número de tecidos, que podem esgotar tecidos preciosos. Introduzido na década de 1980, a microarray tecidual (TMA) é uma importante ferramenta de pesquisa que reúne pequenas regiões exemplares de interesse de muitos diferentes blocos de tecido FFPE em um único bloco de parafina, permitindo o exame de muitas amostras de tecido simultaneamente2. Assim, os TMAs evitam o uso excessivo de amostras de tecido altamente preciosas e, muitas vezes, raras, ao mesmo tempo em que reduzem os custos associados à realização de aplicações a jusante em muitas amostras individuais 3,4.
Existem várias técnicas diferentes para a construção de TMAs5, incluindo abordagens automatizadas e semi-manuais 6,7. A maioria dessas últimas abordagens utiliza o método receptor, no qual os núcleos teciduais perfurados a partir de blocos de doadores são inseridos em um molde pré-moldado. No entanto, recomenda-se que blocos de doadores "ideais" com pelo menos 4 mm de espessura sejam utilizados para este método 6,7. Infelizmente, os blocos de doadores, particularmente aqueles que foram extensivamente seccionados para fins de diagnóstico clínico antes de serem disponibilizados para pesquisa, são frequentemente com menos de 4 mm de espessura, o que poderia excluí-los do uso na construção de TMA usando o método receptor, se a reinscrição para alcançar uma profundidade de 4 mm não for possível ou desejável. Além disso, esses procedimentos podem muitas vezes usar um microarrayer de tecido manual de bancada ou instrumentos automatizados caros que não são facilmente acessíveis ou acessíveis ao laboratório de pesquisa médio. Em contraste, o método de fita adesiva de dois lados ou método de fita, é um método manual de construção de TMA compatível com blocos de doadores não ideais que usam microarrayers de tecido de mão baratos, amplamente disponíveis, reutilizáveis ou descartáveis 8,9,10. Este método inverte o processo de construção lançando o bloco em torno de núcleos eretos invertidos que, após a conclusão, estão alinhados com a parte superior do TMA, independentemente do comprimento do núcleo. Como resultado, todas as amostras estão presentes nas seções TMA quando seccionadas pela primeira vez, o que permite ao construtor tirar o máximo desses blocos não ideais desde o início. Assim, o método da fita representa uma alternativa econômica e viável para os laboratórios de pesquisa não especializados.
A construção do TMA não está sem seus desafios, e deve-se ter cuidado ao selecionar as regiões teciduais para extrair os núcleos, fazendo da revisão patológica uma parte crítica do processo de construção do TMA11,12. Assim, este protocolo visa ressaltar a profunda importância da revisão patológica na construção do TMA, destacando algumas das armadilhas patológicas associadas à construção do TMA que os indivíduos que constroem e utilizam TMAs devem estar cientes, e por que a revisão patológica deve continuar durante a vida útil de um bloco de TMA.
Este protocolo descreve as medidas tomadas no Laboratório de Núcleo Técnico do Recurso de Amostra de Aids e Câncer (ACSR) para construir TMAs a partir de blocos de doadores não ideais usando o método de fita; onde o ACSR é um biorepositório financiado pelo NIH dedicado à coleta e distribuição equitativa de bioespecimens de tecidos de câncer do HIV, a fim de promover a pesquisa sobre a malignidade do HIV.
Protocol
Todos os blocos de doadores foram identificados durante a coleta e utilizados para a construção do TMA em conformidade com os protocolos aprovados da Mayo Clinic IRB (PR16-000507 e PR2207-02).
1. Revisão patológica
- Recuperar os blocos de doadores de tecido FFPE a serem utilizados na construção do TMA.
- Envieum slide manchado de hematoxilina e eosina (H&E) recém-gerado para cada bloco de doador de tecido FFPE selecionado para revisão histológica por um patologista certificado pelo conselho para confirmar o diagnóstico e anotar o tecido.
NOTA: A coloração da H&E pode ser realizada internamente ou enviada a um laboratório de serviços do núcleo patológico para coloração, como foi o caso deste protocolo. Um dos conceitos mais importantes a serem lembrados na construção de TMAs é que os tecidos nos blocos de doadores FFPE são estruturas tridimensionais (3D) cuja forma, conteúdo tumoral e viabilidade tecidual podem mudar significativamente com o aumento da profundidade do bloco. O patologista deve determinar, com base na revisão da seção de tecido manchado de H&E, que é uma representação bidimensional do tecido 3D, a melhor região para extrair o núcleo tecidual. - Durante a revisão histológica, certifique-se de que o patologista identifique e anote os tecidos de interesse/não de interesse nos slides manchados de H&E. Para anotar o slide, siga os passos abaixo.
- Use uma caneta de marcação de slides para circular o tecido de interesse.
- Usando a mesma caneta de marcação, apage áreas dentro da região circunviária que devem ser evitadas.
- Use a caneta de marcação para marcar as áreas consideradas ideais para amostragem e extração do núcleo.
NOTA: É importante lembrar que a forma e a composição do tecido podem mudar com a profundidade do tecido no bloco. Assim, a composição do núcleo tecidual pode mudar dependendo de onde o núcleo foi extraído, o que enfatiza a necessidade de orientação patológica contínua. - Submeta tecido adicional para doenças imunohistoquímicas específicas ao lado dos H&Es, se necessário, para auxiliar na revisão patológica. Exemplos dessas manchas incluem coloração ERBB2 para câncer de mama her2 positivo14, HHV-8 para Kaposi sarcoma15, CD20 para linfomas de células B16, U6 como um marcador global para a qualidade do RNA17, EBER para determinar a positividade do vírus Epstein-Barr18, e Vimentin como confirmação de origens mesenquimais e marcador de controle de qualidade tecidual19,20.
2. Preparação para construção de TMA
- Uma vez concluída a revisão patológica, compile a lista final de blocos de doadores a serem utilizados na construção do TMA e crie um mapa TMA (Figura 1A). O mapa TMA é um delineamento esquemático onde os núcleos estarão localizados no TMA completo e amostras de tecido montado em lâminas obtidas do TMA resultante.
- Para fins de orientação, certifique-se de que o mapa TMA evite colocar núcleos em uma matriz uniforme, como uma matriz 3 x 3 ou 4 x 4 e inclui pelo menos 1 marcador de orientação.
NOTA: Os núcleos de orientação podem ser núcleos retirados de ferramentas de orientação coloridas livres de tecido21, ou blocos de tecido contendo tecidos distintamente diferentes do tema do TMA. Ao contrário do método receptor onde núcleos eretos são inseridos em um molde de cera pré-moldado, o método de fita cria um TMA derramando cera derretida em torno de núcleos invertidos e eretos. Essa inversão do processo de construção requer um segundo mapa conhecido como mapa de construção. - Crie o mapa de construção criando uma imagem espelhada do mapa TMA (Figura 1B). O mapa de construção mostra onde cada núcleo deve ser colocado durante a construção, a fim de aparecer no local correto no TMA concluído. Salve o mapa de construção.
- Uma vez criados os mapas, prepare o molde de base TMA metálico. Use uma grade quadrimedeira de papel descartável para orientar a colocação do núcleo e regular a separação do núcleo.
NOTA: Uma grade de modelo 6 x 7 (42 pontos) para um máximo de 40 núcleos (mais para dois núcleos de orientação/lacunas) para uso com moldes de base metálica comercialmente disponíveis com dimensões internas de 26 mm x 20 mm é fornecida no pdf suplementar. Imprima e corte a grade de papel. - Corte a grade quadrimesca ao tamanho e afixe um pedaço de fita adesiva de duas faces (DSST) na parte de trás da grade. Coloque a grade e a fita DSST na bandeja de metal e adicione um segundo pedaço de DSST no topo da grade, ou seja, em cima da grade de papel no molde da base metálica (Figura 2A).
3. Colocação do núcleo
- Sobrepor o H&E patologicamente revisado em seu bloco de tecido correspondente e usar as marcas patologistas para identificar onde o bloco de tecido deve ser perfurado (Figura 2B).
- Perfurar o bloco de doadores FFPE usando um soco manual do núcleo (Figura 2C) no local apropriado.
NOTA: Os socos principais estão disponíveis em uma variedade de diâmetros. Este método emprega um soco do núcleo portátil de 2 mm de diâmetro.- Se estiver usando um soco do núcleo reutilizável, certifique-se de que ele seja limpo antes e depois de cada soco de tecido.
- Ejete o núcleo do soco do núcleo e use uma picareta de agulha para colocar o núcleo ejetado na mira da grade coberta DSST (Figura 2D). Certifique-se de que quando o núcleo é colocado na grade, ele é invertido e ereto de tal forma que a extremidade do tecido do núcleo entra em contato com o DSST (tecido-de-face para baixo). Certifique-se também de que o núcleo seja colocado na posição apropriada na grade, conforme denotado pelo mapa de construção.
- Repita até que todos os blocos de doadores sejam corados e os núcleos sejam colocados em suas posições apropriadas.
4. Completando o TMA
- Ligue o forno de bancada, atenha-se a 78 °C e deixe tempo suficiente para chegar à temperatura.
- Para cada TMA a ser construído, derreta 45 g de pelotas de parafina em um recipiente à prova de forno.
- Rotule um plástico e coloque-o em cima do molde da base metálica contendo os núcleos (Figura 2E). A altura dos núcleos não deve exceder a profundidade da bandeja de metal, pois os núcleos altos serão inclinados ou derrubados quando o for colocado no lugar.
- Coloque o molde com o sobre uma bandeja para pegar o transbordamento e despeje suavemente a parafina derretida através da fita na bandeja de núcleos (Figura 2F).
- Deixe que a parafina derretida transborda para garantir que não haja bolhas de ar no corpo do TMA. Certifique-se de que a parafina encha até o topo da fita para que ela fique embutida e firmemente ligada ao bloco de parafina uma vez que a parafina se solidificou.
- Não se mova ou perturbe o bloco e deixe esfriar à temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, leve à geladeira a 4 °C por mais 30 minutos para solidificar completamente.
- Uma vez completamente solidificado, separe suavemente o molde da base metálica do bloco de parafina ligado à fita.
NOTA: O DSST mantém sua adesão através do processo de construção e é frequentemente anexado ao bloco de parafina recém-formado. Se for o caso, remova suavemente o DSST e a grade da parte superior do bloco TMA agora concluído.
5. Validação do TMA
- Uma vez construído o TMA, use um microtome para seção do TMA recém-concluído. Corte uma ou mais seção de tecido de cara cheia.
- Transfira as seções para o banho de água pré-armado e deslize para montar as seções.
NOTA: Blocos recém-construídos muitas vezes requerem face de bloco (cortando o excesso de parafina) a fim de obter seções completas de tecido facial que contenham todos os núcleos. - Uma vez seco, envie uma seção TMA recém-cortada para a coloração de H&E13 e qualquer coloração imunohistoquímica adicional, se necessário.
- Envie as seções de H&E do TMA manchado para revisão patológica.
NOTA: Durante a revisão da patologia do TMA, um patologista certificado pelo conselho, de preferência o mesmo patologista que revisou os blocos de doadores do TMA, revisa os núcleos manchados de TMA H&E para garantir que os tecidos desejados de interesse estejam realmente presentes. Se alguma mancha imunohistoquímica específica do tecido ou doença foi submetida à revisão do bloco de doadores na etapa 1.3.4, essas manchas devem ser repetidas nas seções de TMA e submetidas juntamente com o TMA H&E para revisão patológica. - Regissos os resultados da revisão de validação patológica do TMA.
Representative Results
O método de fita da construção de TMA descrito aqui é o método de escolha empregado no Laboratório de Núcleo Técnico da ACSR para conservar tecidos, o que, por sua vez, permite a distribuição frugal e equitativa de tecidos altamente preciosos aos pesquisadores.
Um componente crítico do processo de construção é a identificação do tecido de interesse em um determinado bloco de doadores de onde o núcleo TMA deve ser obtido. Isso é determinado por revisão patológica em que um patologista treinado revisa um slide de H&E recém-gerado (Figura 3). Usando um marcador, o patologista circula a área no slide de H&E, o que indica que o núcleo deve ser obtido a partir do bloco de doadores dentro deste círculo (Figura 3). O patologista também pode marcar áreas adicionais, como áreas necrosadas, que devem ser evitadas, ou áreas benignas de onde podem ser obtidos núcleos de tecido adicionais (Figura 3). Os núcleos são então perfurados das áreas indicadas e incluídos na construção do TMA.
Existem duas métricas principais para a conclusão bem sucedida de um TMA pelo método de fita. A primeira é a presença de pontos do núcleo de tecido nas posições e distâncias esperadas, além um do outro, que é avaliado pela inspeção visual. Figura 4A,B retrata dois TMAs método completamente de fita com sucesso e seus slides H&E correspondentes. A inspeção visual dos blocos TMA mostra que os núcleos estão presentes e regularmente espaçados em cada TMA. Algumas das principais questões de construção que podem surgir durante o processo de construção do método de fita incluem a separação do bloco e do devido à remoção prematura da base metálica antes da solidificação da cera (Figura 4C). Outro problema potencial observado com os TMAs construídos pelo método de fita é a derrubada do núcleo e ou a deriva de colocação dos núcleos incorporados (Figura 4D); uma questão que pode surgir de derramamento excessivamente turbulento da parafina derretida, que pode ser ainda mais reforçada por DSST mal adesivo. A Figura 5 mostra as imagens de H&E para os núcleos do TMA1. Todos, exceto um núcleo (ponto 1) estão presentes no H&E do TMA1. A Figura 5 também mostra que alguns núcleos estão presentes como pontos de tecido circular completos (ou seja, manchas 4, 6, 13, 17) enquanto outros não estão completamente presentes (ou seja, manchas 3, 8, 9, 12). A perda de tecido experimentada nestes últimos casos não é incomum e pode ser devido à secção insuficiente necessária para revelar todos os núcleos na íntegra. Alternativamente, a presença de tecido incompleto, ou a total ausência de tecido (ou seja, mancha 1), pode decorrer da má qualidade tecidual desse núcleo, o que pode resultar em perda de tecido durante o processo de coloração.
A segunda métrica de sucesso é avaliada em termos de se os núcleos TMA capturaram ou não o tecido de interesse. Isso é conseguido através de revisão patológica e validação dos núcleos individuais de TMA H&E (Figura 5) em comparação com o bloco de doadores pré-perfurado H&Es (Figura 3), e quando necessário/realizado quaisquer outras manchas imunohistoquímicas adicionais realizadas. A Figura 6 retrata manchas exemplares realizadas no TMA1, incluindo Vimentin, U6, EBER e CD20. Os tecidos positivos de vimentina (mancha marrom) indicam que todos os tecidos são de origem mesenquimal e são de boa qualidade que podem ser manchados. A positividade U6 (mancha roxa/azul escura) indica que a qualidade do RNA no tecido é boa e elogia as manchas de hibridização in situ (ISH) como o EBER, que tem como alvo transcrições genéticas. Os resultados do U6 na Figura 5 indicam que a qualidade do RNA é alta no tecido linfoma (ponto 9) e no controle normal de orientação do tecido das amígdalas (ponto 22), mas não no tecido normal no ponto 19. O acompanhamento desta coloração EBER foi negativo no tecido normal e no controle de orientação, mas fortemente positivo no tecido linfoma (ponto 9). Como esperado para tecidos de origem linfoide, ambos os pontos 9 e 22 mancharam positivo para o marcador de células B CD20, mas o ponto 19, que decorre do tecido medular normal, não. Os resultados de coloração para todos os núcleos TMA são resumidos na Tabela 1 e confirmam a anotação tecidual desses núcleos de tecido TMA.
Figura 1: Mapas TMA. Uma vez selecionados todos os blocos FFPE e controles de orientação, um mapa detalhado, conhecido como mapa TMA (A), delineando onde cada núcleo de bloco de doadores estará localizado no bloco acabado. É importante notar que ao construir um TMA usando o método de fita, o mapa de construção (B) é uma imagem espelhada do mapa TMA porque este método inverte o processo de construção, derramando parafina derretida em torno de núcleos de tecido vertical em vez de inserir os núcleos em um molde pré-moldado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Construção do TMA usando o método de fita. (A) Camada 2 peças de fita adesiva de dupla face (DSST) e uma grade de papel na ordem de seguimento na parte inferior do molde da base metálica; coloque o primeiro pedaço de DSST (inserção 2A), seguido pela grade de papel descartável e, em seguida, o segundo pedaço de DSST na parte inferior do molde da base metálica. (B) Para cada bloco de doadores, um H&E fresco é gerado e revisado por um patologista que marca o H&E para denotar o tecido de interesse, onde perfurar o bloco e, se aplicável, onde evitar socos para extrair um núcleo tecidual. (C) Perfurar o bloco de doadores com um descarte ou soco TMA portátil reutilizável. (D) Utilizando uma picareta de agulha, cada núcleo é colocado em pé, com a face do tumor para baixo no DSST cobrindo a grade. (E) Coloque cuidadosamente um de plástico pré-rotulado em cima da bandeja de metal contendo os núcleos eretos. (F) A parafina derretida é suavemente derramada na bandeja através da rede de fita para cercar e submergir os núcleos eretos sob o. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mancha de bloco de doadores H&E. Seções manchadas de H&E de cada bloco de doadores são submetidas à revisão do QC com um patologista de treinamento que anota o slide manchado de H&E com um marcador para indicar as áreas/tecidos de interesse (ou seja, câncer viável (CA) ou tecidos benignos (BN) para coleta do núcleo, bem como áreas que devem ser evitadas (ou seja, áreas de tecido necrosado). As áreas apropriadas do bloco tecidual, conforme indicado pelo H&E anotado, são então identificadas, perfuradas e incorporadas ao TMA que está sendo construído. O soco principal tma resultante H&E pode então ser referenciado de volta para a área sem golpes do bloco de doadores H&E para confirmar que o tecido de interesse foi capturado no soco principal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados Representativos. (A,B) Método de fita concluído com sucesso TMAs e seus H&Es que acompanham para revisão patológica. (C) Separação do plástico e do bloco de parafina quando o é removido prematuramente do molde da base metálica. (D) Método de fita completa TMA mostrando núcleos derrubados e migrados resultantes do derramamento turbulento da parafina derretida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Núcleo TMA H&Es. Seção manchada de H&E para TMA1, mostrando os H&Es individuais para cada núcleo tecidual usado para construir o TMA (manchas 1-21) bem como os núcleos de orientação (pontos 22 e 23). As imagens mostradas foram obtidas por meio de um objetivo 4x, equipado com uma câmera digital conectada ao software de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Imunohistoquímico exemplar e RNA ISH. As seções faciais completas do TMA1 foram avaliadas pelo IHC para expressão de vimentina e CD20 e pelo RNA ISH para avaliar a qualidade do RNA (U6) e o status de EBV via EBER ISH. As imagens mostram imagens exemplares para três núcleos, incluindo um tecido tumoral (mancha 9), um tecido normal (ponto 19), bem como um dos dois controles de orientação (ponto 22). A positividade de vimentina é denotada pela coloração marrom, a positividade U6 é denotada pela coloração azul/roxa, EBER por coloração azul/roxa e CD20 por coloração marrom. As imagens mostradas foram obtidas por meio de um objetivo 4x, equipado com uma câmera digital conectada ao software de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Visão geral dos tecidos e manchas TMA construídos: A tabela descreve se o tecido (a) está ou não presente em cada um dos pontos representativos do tumor TMA (b) presente em cada mancha de tecido manchado de H&E e (c) os resultados de quaisquer manchas imunohistológicas adicionais realizadas em seções adjacentes de TMA: "-" indica negativo, n/d = não feito. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Arquivo suplementar. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Discussion
Um dos componentes mais críticos do processo de construção do TMA é a revisão patológica dos blocos de doadores ffpe dos quais os núcleos TMA serão obtidos4. Durante a revisão, um patologista certificado pelo conselho examina uma seção representativa de tecido manchado de H&E de cada bloco de doadores. É imperativo que o H&E seja gerado usando uma seção de tecido recém-cortada para que seja a melhor representação de seu bloco de doadores correspondente. O uso de H&Es mais antigos não é recomendado, dado que os tecidos FFPE são estruturas tridimensionais cujo perfil tecidual pode mudar significativamente com profundidade de bloco e secção extensiva; isso pode ter ocorrido desde que o H&E foi gerado, potencialmente tornando sua representação do bloco FFPE imprecisa. O processo de revisão é essencial para a seleção de casos adequados e identificação de áreas de tecido de onde os núcleos devem ser obtidos, bem como identificação de áreas que devem ser evitadas na coleta de núcleos. Na ausência de revisão patológica, a probabilidade de incluir tecidos inadequados aumenta significativamente. A inclusão desses tecidos tem o potencial de tornar o TMA construído ineficaz e inadequado para seu propósito pretendido. É importante ressaltar que, sem saber, o uso de TMAs tão ineficazes tem um enorme potencial para resultar em dados falsos e enganosos. Isso combinado com o conhecimento de que o perfil dos tecidos FFPE e, portanto, seus núcleos derivados, podem mudar significativamente com o aumento da profundidade destaca a importância da revisão patológica contínua ao longo da vida de um bloco de TMA construído. O ideal é que os H&Es sejam gerados utilizando-se a cada15 ou 20seções para garantir que quaisquer alterações nos perfis teciduais dos núcleos sejam capturadas e registradas. No mínimo, os H&Es devem ser gerados e revisados no início e no final de um projeto para monitorar essas possíveis mudanças. Diante desses pontos e da importância do TMA como ferramenta de pesquisa, é imprescindível que a revisão patológica esteja firmemente incrustada no processo de construção do TMA e ao longo da vida útil do bloco TMA.
Os blocos FFPE são frequentemente extensivamente seccionados durante o processamento de diagnóstico de rotina antes de serem liberados para fins de pesquisa. Como resultado, a profundidade do bloco de doadores e, portanto, os comprimentos do núcleo do bloco de doadores são muitas vezes menores do que o método receptor ideal de 4 mm. Aqui demonstramos como construir TMAs usando o protocolo de construção do método de fita, a principal vantagem disso é sua compatibilidade com núcleos de blocos de tecido FFPE não ideais. Embora o método de fita seja de grande valor de pesquisa e ofereça um método barato, conveniente e acessível para a construção de blocos de TMA, não é sem seus desafios e limitações. Em comparação com os métodos automatizados e manuais de receptores, que podem acomodar 100-1.000 núcleos em um único bloco TMA, um máximo de 40 núcleos é recomendado para TMAs construídos usando o métodode fita 9. Outra limitação é no que diz respeito à facilidade de construção. No método receptor, os núcleos perfurados são meramente inseridos em um molde pré-moldado, que proporciona estabilidade central ao cercar cada núcleo em seu próprio poço individual, impedindo assim a migração do núcleo, bem como promovendo a colocaçãoe separação do núcleo altamente regular. Além disso, o método do destinatário oferece a conveniência opcional de ser totalmente manual, semi-manual e totalmente automatizado. Em contraste, o método manual de fita requer uma colocação cuidadosa e suave de cada núcleo à mão usando uma picareta de agulha. Embora a ausência de um molde precast no método de fita impeça a colocação e separação altamente regulares experimentadas com o método receptor, essa deficiência é superada através da inclusão de uma grade quadrimestada. É importante que a grade quadrimesca seja afixada no centro da bandeja metálica, a fim de evitar a colocação da borda do bloco, o que aumenta o risco de perda do núcleo se não houver parafina suficiente segurando o núcleo no lugar. Deve-se notar também que as pequenas separações do núcleo possíveis com o método receptor não podem ser alcançadas com o método de fita devido à colocação manual do núcleo e à necessidade da picareta da agulha para caber entre os núcleos adjacentes. Os núcleos são colocados de forma independente com a menor área de superfície ou pegada do núcleo que entra em contato com a grade coberta do DSST. Esta configuração fornece significativamente menos estabilidade do núcleo do que o método receptor e confere um risco aumentado para derrubada e ou migração do núcleo ao derramar a parafina derretida. De fato, um dos passos mais críticos do protocolo é derramar a parafina derretida. É essencial que isso seja feito rapidamente após a remoção do forno para garantir que a parafina seja completamente líquida e que o derramamento seja realizado suavemente com mínima turbulência. Curiosamente, Chen et al. desenvolveram um dispositivo auxiliar altamente novo, semelhante a um estêncil com 7 x 11 buracos de diâmetro distribuídos uniformemente, que é colocado em cima de um bloco de parafina em branco para guiar agulhas ao criar o bloco receptor e ao inserir os núcleos do bloco de doadores23. Embora projetado para ajudar a construção do bloco do destinatário, tal dispositivo poderia ser facilmente adaptado ao método de fita para orientar a colocação, regular a separação e aumentar a estabilidade do núcleo durante o processo de construção.
Um dos efeitos mais significativos da estabilidade do núcleo é o número de núcleos incluídos em um método de fita TMA. Isso porque, à medida que o número de núcleos aumenta, o diâmetro do núcleo deve reduzir para acomodar o crescente número de núcleos, o que, por sua vez, reduz a pegada do núcleo aderindo ao DSST. Um diâmetro mínimo do núcleo de 1 mm é recomendado para a construção do método de fita TMA, pois descobrimos que núcleos com diâmetros menores são particularmente instáveis e propensos a derrubar mesmo com derramamento de parafina muito suave. Um estudo recente que investigou dois métodos internos diferentes que utilizaram agulhas de 16 G (diâmetro do núcleo de 1,1 mm) e um soco de 4 mm de diâmetro experimentou perdas substanciais de tecido com os 1,1 mm (26,5%), mas não os núcleos de 4 mm24. Isso parece indicar que pequenos núcleos podem ser problemáticos para trabalhar e não apenas durante a construção. Além disso, diâmetros menores podem não representar o bloco original de doadores, bem como núcleos maiores, dificultando a interpretação patológica e aumentando a probabilidade de representação imprecisa do tecido doador.
A inclusão e colocação de blocos de orientação é de grande importância na construção do TMA. No entanto, isso é de particular importância para o método de fita construído TMAs. Isso decorre do fato de que o método da fita inverte o processo de construção aumentando assim o risco de desorientação espacial. Aconselhamos incluir até três núcleos de orientação em cada bloco, e que eles sejam colocados longe dos núcleos de amostra, a fim de melhor orientar o bloco. Os núcleos de orientação podem ser núcleos retirados de blocos de tecidos contendo tecidos distintamente diferentes do tema do TMA construído ou ferramentas de orientação de cor livre de tecido21, onde este último é particularmente útil para não-patologistas. Combinados com a colocação do núcleo padrão de matriz não regular, os núcleos de orientação minimizam o risco de desorientação.
A diferença pronunciada no comprimento central entre os TMAs construídos usando a fita e os métodos receptores decorre da inclusão da profundidade do bloco de doadores no processo de tomada de decisão ao selecionar o método de construção. O protocolo aqui descrito emprega um limiar onde os TMAs são construídos usando a fita e os métodos de receptor quando os blocos de doadores têm profundidades de < 4 mm e 4 mm, respectivamente. É importante notar que a inclusão da profundidade do bloco de doadores na escolha do método de construção não é universal. Embora seja possível que os TMAs sejam construídos usando qualquer método, independentemente da profundidade do bloco de doadores, núcleos mais altos podem interferir, e ou ser derrubados ou inclinados, a colocação do de plástico durante a construção do TMA usando o método de fita. A escolha de incluir ou omitir critérios no processo de tomada de decisão depende das comodidades disponíveis para o laboratório, o custo e o produto final desejado. De acordo com os parâmetros deste protocolo, o número de seções TMA montadas em slides que podem ser obtidas a partir de um TMA construído pelo método de fita é significativamente menor do que o obtido a partir de um método de destinatário construído TMA. Embora seja possível re-bloquear tecidos FFPE para aumentar a profundidade do bloco de doadores e torná-los compatíveis com o método receptor, a probabilidade de alcançar a mesma orientação tecidual dentro do re-bloco é baixa. Por sua vez, isso pode exigir um bloqueio extensivo voltado para obter uma seção de rosto completo, o que provavelmente incluiria perda significativa de tecido. Após o bloqueio, um método de fita construído TMA produz aproximadamente 50 seções TMA montadas em slides com todos os núcleos presentes. No entanto, o número exato varia de bloco para bloco e depende do comprimento dos núcleos utilizados para construir o TMA e da espessura das seções que estão sendo cortadas (5 μm versus 4 μm). Além disso, deve-se notar também que, devido aos seus diferentes comprimentos principais, os núcleos esgotarão em momentos diferentes, pois o TMA é progressivamente seccionado; um atributo que reenfatiza a necessidade de revisão patológica contínua.
Embora o método do destinatário ofereça benefícios e vantagens significativos sobre o método de fita, incluindo um processo de construção menos tedioso e mais rápido, o método de fita não é destinado a laboratórios experientes de alto rendimento. Destina-se ao laboratório médio, particularmente aqueles em configurações limitadas de recursos, com acesso a blocos de doadores de profundidades variáveis, mas não aos serviços de construção de TMA. No entanto, aplicações futuras poderiam ver a automação deste método, a fim de melhorar o pool de amostras elegíveis em laboratórios de alto rendimento e eliminar a necessidade de re-bloqueio de blocos de doadores. Em conclusão, o protocolo de construção do método de fita TMA descrito pode ser facilmente estabelecido em laboratórios não especializados sem a necessidade de equipamentos caros. No entanto, é aconselhável que novos usuários devem empregar blocos de tecido FFPE sem valor, ferramentas de orientação coloridassem tecido 21 ou mesmo blocos de parafina coloridos sem tecido no início, a fim de se familiarizar com a técnica do método de fita antes de avançar para a construção de TMA usando tecidos preciosos. Embora sua construção não seja sem potenciais armadilhas, que tanto aqueles que constroem quanto usam blocos de TMA devem estar cientes, este método de construção de TMA aparentemente não polido pode produzir TMAs de alta qualidade e biologicamente relevantes para pesquisa. De fato, as seções de TMA decorrentes do método de fita construída TMAs estão entre uma das amostras de tecido mais solicitadas no biorepositório ACSR.
Disclosures
Não temos nada para revelar.
Acknowledgments
O financiamento para este trabalho foi fornecido pelo biorepositório de recursos para aids e câncer financiado pelo NIH (www.acsr1.com), UM1CA181255.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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