Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Bandmethode zur manuellen Konstruktion eines Gewebe-Microarrays mit FFPE-Spenderblöcken unterschiedlicher Tiefe.
Abstract
Das Tissue Microarray (TMA) ist ein wichtiges Forschungsinstrument, bei dem viele in Formalin fixiertes Paraffin eingebettete (FFPE) Proben in einem einzigen Paraffinblock dargestellt werden können. Dies wird erreicht, indem Gewebekerne aus der interessierenden Region verschiedener FFPE-Spenderblöcke extrahiert und zu einem einzigen TMA-Paraffinblock angeordnet werden. Einmal konstruiert, können Abschnitte aus der abgeschlossenen TMA verwendet werden, um immunhistochemische, chromogene, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungs- (FISH) und RNA-ISH-Studien durchzuführen, um die Proteinexpression sowie genomische und transkriptionelle Veränderungen in vielen Proben gleichzeitig zu bewerten, wodurch der Gewebeverbrauch minimiert und die Reagenzienkosten gesenkt werden. Es gibt verschiedene TMA-Bautechniken. Eine der gebräuchlichsten Konstruktionsmethoden ist die Empfängermethode, die am besten mit Kernen gleicher Länge funktioniert, für die eine Mindestlänge von 4 mm empfohlen wird. Leider können Gewebeblöcke während des Diagnoseprozesses stark reseziert werden, was häufig zu "nicht idealen" Spenderblockdicken von weniger als 4 mm führt. Der aktuelle Artikel und das Video konzentrieren sich auf das doppelseitige Klebebandverfahren; Eine alternative manuelle, kostengünstige, einfach zu bedienende und schnelle Methode zum Aufbau von TMAs mit geringer Dichte (<50 Kerne), die mit diesen nicht idealen Spenderblöcken sehr kompatibel ist. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Erstellen eines TMA mit dieser Methode, wobei der Schwerpunkt auf der kritischen Bedeutung der pathologischen Überprüfung und der Validierung nach der Konstruktion liegt.
Introduction
Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) Gewebe werden in großem Umfang in morphologischen und immunhistochemischen Proteinexpressionsstudienverwendet 1. Die Entdeckungsforschung erfordert jedoch häufig die Untersuchung mehrerer Marker auf einer großen Anzahl von Geweben, die wertvolles Gewebe erschöpfen können. Das in den 1980er Jahren eingeführte Tissue Microarray (TMA) ist ein wichtiges Forschungsinstrument, das kleine, beispielhafte Regionen von Interesse aus vielen verschiedenen FFPE-Gewebeblöcken zu einem einzigen Paraffinblock zusammenfügt und die gleichzeitige Untersuchung vieler Gewebeproben ermöglicht2. So vermeiden TMAs die übermäßige Verwendung von hochwertvollen und oft seltenen Gewebeproben und reduzieren gleichzeitig die Kosten, die mit der Durchführung nachgelagerter Anwendungen an vielen einzelnen Proben verbunden sind 3,4.
Für die Konstruktion von TMAs5 gibt es verschiedene Techniken, einschließlich automatisierter und halbmanueller Ansätze 6,7. Die meisten dieser letzteren Ansätze verwenden die Empfängermethode, bei der aus Spenderblöcken gestanzte Gewebekerne in eine Fertigteilform eingeführt werden. Es wird jedoch empfohlen, für diese Methode 6,7 "ideale" Donorblöcke mit einer Dicke von mindestens 4 mm zu verwenden. Leider sind Spenderblöcke, insbesondere solche, die für klinische Diagnosezwecke umfassend geschnitten wurden, bevor sie für die Forschung zur Verfügung gestellt wurden, häufig weniger als 4 mm dick, was sie von der Verwendung in der TMA-Konstruktion mit der Empfängermethode ausschließen könnte, wenn eine erneute Einbettung zur Erreichung einer Tiefe von 4 mm nicht möglich oder wünschenswert ist. Darüber hinaus können diese Verfahren oft einen manuellen Tissue-Microarrayer auf dem Labortisch oder teure automatisierte Instrumente verwenden, die für das durchschnittliche Forschungslabor nicht leicht zugänglich oder erschwinglich sind. Im Gegensatz dazu ist die doppelseitige Klebebandmethode oder die Bandmethode eine manuelle TMA-Konstruktionsmethode, die mit nicht idealen Spenderblöcken kompatibel ist und kostengünstige, weit verbreitete, wiederverwendbare oder Einweg-Handgewebe-Microarrayerverwendet 8,9,10. Diese Methode kehrt den Bauprozess um, indem der Block um invertierte aufrechte Kerne gegossen wird, die nach Fertigstellung bündig mit der Oberseite des TMA sind, unabhängig von der Kernlänge. Infolgedessen sind alle Proben beim ersten Abschnitt in TMA-Abschnitten vorhanden, sodass der Konstruktor von Anfang an das Beste aus diesen nicht idealen Blöcken herausholen kann. Somit stellt die Bandmethode eine kostengünstige und praktikable Alternative für die nicht spezialisierten Forschungslaboratorien dar.
Die TMA-Konstruktion ist nicht ohne Herausforderungen, und bei der Auswahl der Geweberegionen, aus denen die Kerne extrahiert werden sollen, ist Vorsicht geboten, was die pathologische Überprüfung zu einem kritischen Teil des TMA-Bauprozesses macht 11,12. Daher zielt dieses Protokoll darauf ab, die tiefgreifende Bedeutung der pathologischen Überprüfung bei der TMA-Konstruktion zu unterstreichen, indem einige der pathologischen Fallstricke im Zusammenhang mit der TMA-Konstruktion hervorgehoben werden, die Personen, die TMAs konstruieren und verwenden, beachten sollten, und warum die pathologische Überprüfung während der gesamten Lebensdauer eines TMA-Blocks fortgesetzt werden sollte.
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die im AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory unternommen wurden, um TMAs aus nicht idealen Spenderblöcken mit der Bandmethode zu konstruieren. wobei das ACSR ein NIH-finanziertes Biorepository ist, das sich der Sammlung und gerechten Verteilung von Bioproben aus HIV-Krebsgewebe widmet, um die HIV-Malignitätsforschung zu fördern.
Protocol
Alle Spenderblöcke wurden während der Entnahme deidentifiziert und für den TMA-Bau in Übereinstimmung mit den genehmigten Imsengco Clinic IRB-Protokollen (PR16-000507 und PR2207-02) verwendet.
1. Pathologische Überprüfung
- Rufen Sie die FFPE-Gewebespenderblöcke ab, die in der TMA-Konstruktion verwendet werden sollen.
- Reichen Sie einen frisch erzeugten Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Objektträger13 für jeden FFPE-Gewebespenderblock ein, der für die histologische Überprüfung durch einen Board-zertifizierten Pathologen ausgewählt wurde, um die Diagnose zu bestätigen und das Gewebe zu annotieren.
HINWEIS: Die H & E-Färbung kann intern durchgeführt oder zur Färbung an ein pathologisches Kerndienstleistungslabor gesendet werden, wie dies in diesem Protokoll der Fall war. Eines der wichtigsten Konzepte, an die man sich bei der Konstruktion von TMAs erinnern sollte, ist, dass die Gewebe in den FFPE-Spenderblöcken 3-dimensionale (3D) Strukturen sind, deren Form, Tumorgehalt und Gewebelebensfähigkeit sich mit zunehmender Blocktiefe signifikant verändern können. Der Pathologe muss auf der Grundlage der Überprüfung des H & E-gefärbten Gewebeabschnitts, bei dem es sich um eine 2-dimensionale Darstellung des 3D-Gewebes handelt, die beste Region bestimmen, um den Gewebekern zu extrahieren. - Stellen Sie während der histologischen Überprüfung sicher, dass der Pathologe die Gewebe von Interesse / nicht von Interesse auf den H & E-gefärbten Objektträgern identifiziert und kommentiert. Führen Sie die folgenden Schritte aus, um die Folie mit Anmerkungen zu versehen.
- Verwenden Sie einen Objektträgermarkierungsstift, um das Gewebe von Interesse zu umkreisen.
- Mit demselben Markierungsstift löschen Sie Bereiche innerhalb des eingekreisten Bereichs aus, die vermieden werden sollten.
- Verwenden Sie den Markierungsstift, um die Bereiche zu markieren, die für die Kernprobenahme und -extraktion als ideal erachtet werden.
HINWEIS: Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass sich die Gewebeform und -zusammensetzung mit der Gewebetiefe im Block ändern kann. Daher kann sich die Zusammensetzung des Gewebekerns je nachdem, wo der Kern extrahiert wurde, ändern, was die Notwendigkeit einer fortgesetzten pathologischen Anleitung betont. - Reichen Sie bei Bedarf neben den H&Es zusätzliches Gewebe für krankheitsspezifische immunhistochemische Färbungen ein, um die pathologische Überprüfung zu unterstützen. Beispiele für solche Flecken sind ERBB2-Färbung für HER2-positiven Brustkrebs 14, HHV-8 für Kaposi-Sarkom 15, CD20 für B-Zell-Lymphome 16, U6 als globaler Marker für RNA-Qualität 17, EBER zur Bestimmung der Epstein-Barr-Virus-Positivität 18 und Vimentin als Bestätigung mesenchymaler Ursprünge und Gewebequalitätskontrollmarker 19,20.
2. Vorbereitung auf die TMA-Konstruktion
- Sobald die Pathologieüberprüfung abgeschlossen ist, stellen Sie die endgültige Liste der Spenderblöcke zusammen, die in der TMA-Konstruktion verwendet werden sollen, und erstellen Sie eine TMA-Karte (Abbildung 1A). Die TMA-Karte ist eine schematische Skizze, in der sich die Kerne in den abgeschlossenen TMA- und Objektträger-montierten Gewebeproben befinden, die aus der resultierenden TMA gewonnen wurden.
- Stellen Sie zu Orientierungszwecken sicher, dass die TMA-Karte das Platzieren von Kernen in einer geraden Matrix wie einer 3 x 3- oder 4 x 4-Matrix vermeidet und mindestens 1 Orientierungsmarkierung enthält.
HINWEIS: Orientierungskerne können Kerne sein, die aus gewebefreien farbigen Orientierungswerkzeugen21 entnommen wurden, oder Gewebeblöcke, die deutlich unterschiedliche Gewebe aus dem Thema der TMA enthalten. Im Gegensatz zur Empfängermethode, bei der aufrechte Kerne in eine vorgefertigte Wachsform eingeführt werden, erzeugt die Bandmethode eine TMA, indem geschmolzenes Wachs um invertierte, aufrechte Kerne gegossen wird. Diese Umkehrung des Bauprozesses erfordert eine zweite Karte, die als Konstruktionskarte bezeichnet wird. - Erstellen Sie die Konstruktionskarte, indem Sie ein Spiegelbild der TMA-Karte erstellen (Abbildung 1B). Die Konstruktionskarte zeigt, wo jeder Kern während des Baus platziert werden muss, um an der richtigen Stelle im fertigen TMA zu erscheinen. Speichern Sie die Konstruktionskarte.
- Sobald die Karten erstellt wurden, bereiten Sie die TMA-Basisform aus Metall vor. Verwenden Sie ein kariertes Einweggitter aus Papier, um die Kernplatzierung zu steuern und die Kerntrennung zu regulieren.
HINWEIS: Ein 6 x 7 (42 Punkte) Schablonenraster für maximal 40 Kerne (plus für zwei Orientierungskerne/-lücken) zur Verwendung mit handelsüblichen Metallgrundformen mit Innenmaßen von 26 mm x 20 mm wird im ergänzenden PDF bereitgestellt. Drucken und schneiden Sie das Papierraster aus. - Schneiden Sie das karierte Raster auf die Größe und befestigen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband (DSST) auf der Rückseite des Gitters. Legen Sie das Gitter und das DSST-Band in das Metallfach, und fügen Sie ein zweites Stück DSST auf das Raster auf, d. h. auf das Papiergitter in der Metallbasisform (Abbildung 2A).
3. Kernplatzierung
- Überlagern Sie das pathologisch überprüfte H&E auf den entsprechenden Gewebeblock und verwenden Sie die pathologischen Markierungen, um zu identifizieren, wo der Gewebeblock gestanzt werden soll (Abbildung 2B).
- Stanzen Sie den FFPE-Donorblock mit einem manuellen Kernstempel (Abbildung 2C) an der entsprechenden Stelle.
HINWEIS: Kernstempel sind in einer Vielzahl von Durchmessern erhältlich. Bei diesem Verfahren wird ein Handheld-Kernstempel mit einem Durchmesser von 2 mm verwendet.- Wenn Sie einen wiederverwendbaren Kernstempel verwenden, stellen Sie sicher, dass er vor und nach jedem Gewebestempel gereinigt wird.
- Werfen Sie den Kern aus dem Kernstempel, und platzieren Sie den ausgestoßenen Kern mit einem Nadelstocher im Fadenkreuz des DSST-bedeckten Gitters (Abbildung 2D). Stellen Sie sicher, dass, wenn der Kern auf dem Gitter platziert wird, er invertiert und aufrecht ist, so dass das Gewebeende des Kerns den DSST (Tissue-Face-Down) berührt. Stellen Sie außerdem sicher, dass der Kern an der entsprechenden Position auf dem Raster platziert ist, wie in der Konstruktionskarte angegeben.
- Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Spenderblöcke entkernt und die Kerne an den entsprechenden Positionen platziert sind.
4. Ausfüllen der TMA
- Schalten Sie den auf 78 °C eingestellten Tischofen ein und lassen Sie genügend Zeit, um die Temperatur zu erreichen.
- Für jedes zu konstruierende TMA werden 45 g Paraffinpellets in einem ofenfesten Behälter geschmolzen.
- Beschriften Sie eine Kunststoffkassette, und legen Sie sie auf die Metallbasisform, die die Kerne enthält (Abbildung 2E). Die Höhe der Kerne sollte die Tiefe des Metallfachs nicht überschreiten, da hohe Kerne gekippt oder umgestürzt werden, wenn die Kassette eingesetzt wird.
- Legen Sie die Form mit der Kassette auf ein Tablett, um einen Überlauf aufzufangen, und gießen Sie das geschmolzene Paraffin vorsichtig durch die Kassette in das Kernblech (Abbildung 2F).
- Lassen Sie das geschmolzene Paraffin überlaufen, um sicherzustellen, dass sich keine Luftblasen im Körper des TMA befinden. Stellen Sie sicher, dass sich das Paraffin bis zur Oberseite der Kassette füllt, so dass es in den Paraffinblock eingebettet und fest mit ihm verbunden ist, sobald das Paraffin erstarrt ist.
- Bewegen oder stören Sie den Block nicht und lassen Sie ihn 30 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen. Dann bei 4 ° C für weitere 30 Minuten kühlen, um vollständig zu erstarren.
- Nach vollständiger Erstarrung trennen Sie vorsichtig die Metallgrundform vom kassettengebundenen Paraffinblock der Kerne.
HINWEIS: Der DSST behält seine Haftkraft während des gesamten Bauprozesses und wird häufig an dem neu gebildeten Paraffinblock befestigt. Falls zutreffend, entfernen Sie vorsichtig den DSST und das Raster von der Oberseite des jetzt fertiggestellten TMA-Blocks.
5. Validierung der TMA
- Sobald die TMA erstellt ist, verwenden Sie ein Mikrotom, um die neu abgeschlossene TMA zu schneiden. Schneiden Sie einen oder mehrere vollgesichtige Gewebeabschnitte ab.
- Übertragen Sie die Abschnitte in das vorgewärmte Wasserbad und schieben Sie die Halterung der Abschnitte.
HINWEIS: Neu konstruierte Blöcke erfordern oft eine Blockverkleidung (Abschneiden von überschüssigem Paraffin), um vollständige Gesichtsgewebeabschnitte zu erhalten, die alle Kerne enthalten. - Nach dem Trocknen reichen Sie einen frisch geschnittenen, an einem Objektträger montierten TMA-Abschnitt für die H & E-Färbung13 und bei Bedarf für zusätzliche immunhistochemische Färbungen ein.
- Reichen Sie die gefärbten TMA H & E-Abschnitte zur pathologischen Überprüfung ein.
HINWEIS: Während der TMA-Pathologie-Überprüfung überprüft ein Board-zertifizierter Pathologe, vorzugsweise derselbe Pathologe, der die TMA-Spenderblöcke überprüft hat, die TMA H & E-gefärbten Kerne, um sicherzustellen, dass die gewünschten Gewebe von Interesse tatsächlich vorhanden sind. Wenn in Schritt 1.3.4 zusätzliche gewebe- oder krankheitsspezifische immunhistochemische Färbungen zur Überprüfung des Spenderblocks eingereicht wurden, sollten diese Flecken auf TMA-Abschnitten wiederholt und zusammen mit dem TMA H&E zur pathologischen Überprüfung eingereicht werden. - Zeichnen Sie die Ergebnisse der pathologischen Validierungsüberprüfung der TMA auf.
Representative Results
Die hier beschriebene Bandmethode der TMA-Konstruktion ist die Methode der Wahl, die im ACSR Technical Core Laboratory zur Konservierung von Geweben eingesetzt wird, was wiederum eine sparsame und gerechte Verteilung von sehr wertvollem Gewebe an Forscher ermöglicht.
Eine kritische Komponente des Bauprozesses ist die Identifizierung des interessierenden Gewebes in einem bestimmten Spenderblock, aus dem der TMA-Kern gewonnen werden soll. Dies wird durch eine pathologische Überprüfung bestimmt, bei der ein ausgebildeter Pathologe eine frisch generierte H & E-Folie überprüft (Abbildung 3). Mit einem Marker umkreist der Pathologe den Bereich auf dem H & E-Objektträger, was darauf hinweist, dass der Kern aus dem Spenderblock innerhalb dieses Kreises gewonnen werden sollte (Abbildung 3). Der Pathologe kann auch zusätzliche Bereiche wie nekrotische Bereiche, die vermieden werden sollten, oder gutartige Bereiche, aus denen zusätzliche Gewebekerne gewonnen werden können, markieren (Abbildung 3). Kerne werden dann aus den angegebenen Bereichen gestanzt und in die Konstruktion des TMA einbezogen.
Es gibt zwei Hauptmetriken für den erfolgreichen Abschluss einer TMA mit der Bandmethode. Die erste ist das Vorhandensein von Gewebekernpunkten an den erwarteten Positionen und Abständen voneinander entfernt, die durch visuelle Inspektion beurteilt werden. Abbildung 4A,B zeigt zwei erfolgreich vollständig mit Bandmethode TMAs und die entsprechenden H&E-Folien. Die visuelle Inspektion der TMA-Blöcke zeigt, dass die Kerne in jedem TMA vorhanden und regelmäßig verteilt sind. Zu den wichtigsten Konstruktionsproblemen, die während des Konstruktionsprozesses bei der Bandmethode auftreten können, gehört die Trennung von Block und Kassette aufgrund des vorzeitigen Entfernens der Metallbasis vor der Wachserstarrung (Abbildung 4C). Ein weiteres potenzielles Problem, das bei TMAs mit Bandmethode beobachtet wird, ist der Kernumsturz und / oder die Platzierungsdrift der eingebetteten Kerne (Abbildung 4D); ein Problem, das durch übermäßig turbulentes Gießen des geschmolzenen Paraffins entstehen kann, das durch schlecht haftendes DSST weiter verstärkt werden kann. Abbildung 5 zeigt die H&E-Bilder für die Kerne von TMA1. Alle bis auf einen Kern (Punkt 1) sind im H&E von TMA1 vorhanden. Abbildung 5 zeigt auch, dass einige Kerne als vollständige kreisförmige Gewebepunkte vorhanden sind (d. h. die Flecken 4, 6, 13, 17), während andere nicht vollständig vorhanden sind (d. h. die Flecken 3, 8, 9, 12). Der Gewebeverlust, der in diesen letzteren Fällen auftritt, ist nicht ungewöhnlich und kann auf unzureichende Schnitte zurückzuführen sein, die erforderlich sind, um alle Kerne vollständig zu enthüllen. Alternativ kann das Vorhandensein von unvollständigem oder das völlige Fehlen von Gewebe (dh Punkt 1) auf eine schlechte Gewebequalität dieses Kerns zurückzuführen sein, was zu einem Gewebeverlust während des Färbeprozesses führen kann.
Die zweite Erfolgsmetrik wird in Bezug darauf bewertet, ob die TMA-Kerne das interessierende Gewebe erfasst haben oder nicht. Dies wird durch pathologische Überprüfung und Validierung der einzelnen TMA H & E-Kerne (Abbildung 5) im Vergleich zu den vorgestanzten Spenderblock-H & Es (Abbildung 3) und gegebenenfalls durch andere zusätzliche immunhistochemische Färbungen erreicht. Abbildung 6 zeigt beispielhafte Flecken auf TMA1, einschließlich Vimentin, U6, EBER und CD20. Vimentin-positives Gewebe (braune Färbung) weisen darauf hin, dass alle Gewebe mesenchymalen Ursprungs sind und von guter Qualität sind, die gefärbt werden kann. U6-Positivität (dunkelviolette / blaue Färbung) zeigt an, dass die RNA-Qualität im Gewebe gut ist und ergänzt RNA-in-situ-Hybridisierungsflecken (ISH) wie EBER, die auf Gentranskripte abzielen. Die U6-Ergebnisse in Abbildung 5 zeigen, dass die RNA-Qualität im Lymphomgewebe (Punkt 9) und der normalen Orientierungskontrolle des Mandelgewebes (Punkt 22) hoch ist, nicht jedoch im normalen Gewebe an Punkt 19. Im Anschluss daran war die EBER-Färbung im normalen Gewebe negativ und die Orientierungskontrolle aber im Lymphomgewebe stark positiv (Punkt 9). Wie für Gewebe lymphatischen Ursprungs erwartet, färbten sich die beiden Flecken 9 und 22 positiv auf den B-Zellmarker CD20, aber Punkt 19, der aus normalem Rückenmarksgewebe stammt, nicht. Die Färbeergebnisse für alle TMA-Kerne sind in Tabelle 1 zusammengefasst und bestätigen die Gewebeannotation für diese TMA-Gewebekerne.
Abbildung 1: TMA-Karten. Sobald alle FFPE-Blöcke und Orientierungssteuerelemente ausgewählt wurden, wird eine detaillierte Karte, die als TMA-Karte (A) bezeichnet wird und beschreibt, wo sich jeder Spenderblockkern im fertigen Block befindet. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der Konstruktion einer TMA mit der Bandmethode die Konstruktionskarte (B) ein Spiegelbild der TMA-Karte ist, da diese Methode den Konstruktionsprozess umkehrt und geschmolzenes Paraffin um aufrechte Gewebekerne gießt, anstatt die Kerne in eine Fertigteilform einzuführen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Erstellen der TMA mit der Bandmethode. (A) Schicht 2 Stücke doppelseitiges Klebeband (DSST) und ein Papiergitter in der folgenden Reihenfolge auf der Unterseite der Metallgrundform; Legen Sie das erste Stück DSST (2A-Einsatz), gefolgt vom Einwegpapiergitter und dann das zweite Stück DSST an der Unterseite der Metallbasisform. (B) Für jeden Spenderblock wird ein frisches H & E generiert und von einem Pathologen überprüft, der das H & E markiert, um das Gewebe von Interesse zu bezeichnen, wo der Block gestanzt werden soll und wo gegebenenfalls das Stanzen vermieden werden sollte, um einen Gewebekern zu extrahieren. (C) Stanzen Sie den Spenderblock mit einem Entsorgungs- oder wiederverwendbaren tragbaren TMA-Stempel. (D) Mit einem Nadelpflücken wird jeder Kern aufrecht stehend platziert, der Tumor mit der Vorderseite nach unten auf dem DSST, der das Gitter bedeckt. (E) Legen Sie vorsichtig eine vorbeschriftete Kunststoffkassette auf die Metallschale, die die aufrechten Kerne enthält. (F) Geschmolzenes Paraffin wird vorsichtig durch das Kassettengitter in das Fach gegossen, um die aufrechten Kerne unter der Kassette zu umgeben und zu untertauchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: H&E-Fleck des Spenderblocks. H & E-gefärbte Abschnitte aus jedem Spenderblock werden einer QC-Überprüfung mit einem ausgebildeten Pathologen unterzogen, der den H & E-gefärbten Objektträger mit einem Marker annotiert, um die Bereiche / Gewebe von Interesse (dh lebensfähige Krebs- (CA) oder gutartige (BN) Gewebe) für die Kernentnahme anzuzeigen, sowie Bereiche, die vermieden werden sollten (dh B. nekrotische Gewebebereiche). Die entsprechenden Bereiche des Gewebeblocks, wie sie durch das annotierte H & E angezeigt werden, werden dann identifiziert, gestanzt und in das zu konstruierende TMA integriert. Der resultierende TMA-Kernstempel H & E kann dann auf den ungelochten Bereich des Spenderblocks H & E zurückreferenziert werden, um zu bestätigen, dass das interessierende Gewebe im Kernstempel erfasst wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse . (A,B) Erfolgreich abgeschlossene Bandmethoden-TMAs und ihre begleitenden H&Es zur pathologischen Überprüfung. (C) Trennung der Kunststoffkassette und des Paraffinblocks, wenn die Kassette vorzeitig aus der Metallgrundform entfernt wird. (D) Abgeschlossene Bandmethode TMA mit umgestürzten und migrierten Kernen, die aus dem turbulenten Gießen des geschmolzenen Paraffins resultieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: TMA-Kern H&Es. H & E-gefärbter Abschnitt für TMA1, der die einzelnen H & Es für jeden Gewebekern zeigt, der zum Aufbau der TMA verwendet wurde (Flecken 1-21) sowie die Orientierungskerne (Flecken 22 und 23). Die gezeigten Bilder wurden mit einem 4-fachen Objektiv aufgenommen, das mit einer Digitalkamera ausgestattet war, die mit der Bildgebungssoftware verbunden war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Beispielhafte immunhistochemische und RNA-ISH. Vollgesichtsschnitte aus TMA1 wurden von IHC auf Vimentin- und CD20-Expression und von RNA ISH auf RNA-ISH zur Beurteilung der RNA-Qualität (U6) und des EBV-Status mittels EBER ISH untersucht. Die Bilder zeigen exemplarische Bilder für drei Kerne, darunter ein Tumorgewebe (Punkt 9), ein normales Gewebe (Punkt 19) sowie eine der beiden Orientierungskontrollen (Punkt 22). Die Vimentin-Positivität wird durch braune Färbung, die U6-Positivität durch blau/violette Färbung, EBER durch blau/violette Färbung und CD20 durch braune Färbung bezeichnet. Die gezeigten Bilder wurden mit einem 4-fachen Objektiv aufgenommen, das mit einer Digitalkamera ausgestattet war, die mit der Bildgebungssoftware verbunden war. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Übersicht über die durchgeführten TMA-Gewebe und -Flecken: Die Tabelle zeigt, ob (a) Gewebe in jedem der repräsentativen TMA-Spots vorhanden ist (b) Tumor in jedem H & E-gefärbten Gewebefleck vorhanden ist und (c) die Ergebnisse zusätzlicher immunhistologischer Färbungen, die an benachbarten TMA-Abschnitten durchgeführt werden: "-" zeigt negativ an, n / d = nicht getan. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Eine der kritischsten Komponenten des TMA-Bauprozesses ist die pathologische Überprüfung von FFPE-Spenderblöcken, aus der die TMA-Kerne gewonnen werden4. Während der Überprüfung untersucht ein Board-zertifizierter Pathologe einen repräsentativen H & E-gefärbten Gewebeabschnitt aus jedem Spenderblock. Es ist unerlässlich, dass das H & E unter Verwendung eines frisch geschnittenen Gewebeabschnitts erzeugt wird, damit es die beste Darstellung des entsprechenden Spenderblocks ist. Die Verwendung älterer H & Es wird nicht empfohlen, da FFPE-Gewebe 3-dimensionale Strukturen sind, deren Gewebeprofil sich mit Blocktiefe und umfangreichem Schnitt signifikant verändern kann; Dies kann seit der Generierung des H & E aufgetreten sein, was möglicherweise seine Darstellung des FFPE-Blocks ungenau macht. Der Überprüfungsprozess ist für die Auswahl geeigneter Fälle und die Identifizierung von Gewebebereichen, aus denen Kerne gewonnen werden sollten, sowie für die Identifizierung von Bereichen, die bei der Entnahme von Kernen vermieden werden sollten, von wesentlicher Bedeutung. In Ermangelung einer pathologischen Überprüfung steigt die Wahrscheinlichkeit, ungeeignetes Gewebe einzubeziehen, signifikant an. Die Einbeziehung solcher Gewebe hat das Potenzial, das konstruierte TMA unwirksam und ungeeignet für den beabsichtigten Zweck zu machen. Wichtig ist, dass die unwissentliche Verwendung solcher ineffektiven TMAs ein enormes Potenzial hat, zu falschen und irreführenden Daten zu führen. Dies in Kombination mit dem Wissen, dass sich das Profil von FFPE-Geweben und damit ihrer abgeleiteten Kerne mit zunehmender Tiefe signifikant verändern kann, unterstreicht die Bedeutung einer kontinuierlichen pathologischen Überprüfung während der gesamten Lebensdauer eines konstruierten TMA-Blocks. Idealerweise sollten H&E mit jedem 15. oder 20. Abschnitt generiert werden, um sicherzustellen, dass Änderungen in den Gewebeprofilen der Kerne erfasst und aufgezeichnetwerden. Zumindest sollten H&E zu Beginn und am Ende eines Projekts generiert und überprüft werden, um diese potenziellen Änderungen zu überwachen. Angesichts dieser Punkte und der Bedeutung der TMA als Forschungsinstrument ist es unerlässlich, dass die pathologische Überprüfung fest in den TMA-Bauprozess und während der gesamten Lebensdauer des TMA-Blocks eingebettet ist.
FFPE-Blöcke werden während der routinemäßigen diagnostischen Verarbeitung oft umfangreich geschnitten, bevor sie für Forschungszwecke freigegeben werden. Infolgedessen sind die Donorblocktiefe und damit die Kernlängen des Donorblocks oft geringer als das Empfängerverfahren ideal von 4 mm. Hier haben wir gezeigt, wie TMAs mit dem Tape-Method-Konstruktionsprotokoll konstruiert werden können, dessen Hauptvorteil die Kompatibilität mit Kernen aus nicht idealen FFPE-Gewebeblöcken ist. Obwohl die Bandmethode von großem Forschungswert ist und eine kostengünstige, bequeme und zugängliche Methode zum Erstellen von TMA-Blöcken bietet, ist sie nicht ohne Herausforderungen und Einschränkungen. Im Vergleich zu automatisierten und manuellen Empfängermethoden, die 100-1.000 Kerne in einem einzigen TMA-Block aufnehmen können, werden maximal 40 Kerne für TMAs empfohlen, die mit der Bandmethode9 erstellt wurden. Eine weitere Einschränkung betrifft die einfache Konstruktion. Bei der Empfängermethode werden gestanzte Kerne lediglich in eine Fertigteilform eingesetzt, die für Kernstabilität sorgt, indem jeder Kern in ein eigenes Einzelloch eingeschlossen wird, wodurch eine Kernmigration verhindert und eine hochregelmäßige Kernplatzierung und -trennung gefördertwird 22. Darüber hinaus bietet die Empfängermethode den optionalen Komfort, vollständig manuell, halbmanuell und vollständig automatisiert zu sein. Im Gegensatz dazu erfordert die manuelle Klebebandmethode eine sorgfältige, schonende Platzierung jedes Kerns von Hand mit einem Nadelpickel. Obwohl das Fehlen einer Fertigteilform bei der Bandmethode die sehr regelmäßige Platzierung und Trennung bei der Empfängermethode ausschließt, wird dieser Mangel durch die Einbeziehung eines karierten Rasters behoben. Es ist wichtig, dass das karierte Gitter an der Mitte des Metallfachs befestigt wird, um eine Blockkantenplatzierung zu vermeiden, was das Risiko eines Kernverlusts erhöht, wenn der Kern nicht ausreichend Paraffin an Ort und Stelle hält. Es muss auch beachtet werden, dass die kleinen Kerntrennungen, die mit der Empfängermethode möglich sind, mit der Bandmethode aufgrund der manuellen Kernplatzierung und der Notwendigkeit, dass der Nadelpicker zwischen benachbarte Kerne passt, nicht erreicht werden können. Die Kerne werden freistehend aufrecht platziert, wobei die kleinste Oberfläche oder der kleinste Grundriss des Kerns das DSST-abgedeckte Raster berührt. Dieses Setup bietet eine deutlich geringere Kernstabilität als die Empfängermethode und birgt ein erhöhtes Risiko für Kernumsturz und/oder Migration beim Gießen des geschmolzenen Paraffins. Tatsächlich ist einer der kritischsten Schritte im Protokoll das Eingießen des geschmolzenen Paraffins. Es ist wichtig, dass dies beim Entfernen aus dem Ofen schnell geschieht, um sicherzustellen, dass das Paraffin vollständig flüssig ist und dass der Guss sanft und mit minimalen Turbulenzen durchgeführt wird. Interessanterweise entwickelten Chen et al. eine höchst neuartige Hilfsvorrichtung, ähnlich einer Schablone mit 7 x 11 gleichmäßig verteilten Löchern mit einem Durchmesser von 2 mm, die auf einen leeren Paraffinblock gelegt wird, um Nadeln beim Erstellen des Empfängerblocks und beim Einsetzen der Spenderblockkerne23 zu führen. Obwohl ein solches Gerät entwickelt wurde, um die Konstruktion von Empfängerblöcken zu unterstützen, könnte es leicht an die Bandmethode angepasst werden, um die Platzierung zu steuern, die Trennung zu regulieren und die Kernstabilität während des Bauprozesses zu erhöhen.
Einer der wichtigsten Effektoren der Kernstabilität ist die Anzahl der Kerne, die in einer Bandmethode TMA enthalten sind. Dies liegt daran, dass mit zunehmender Anzahl der Kerne der Durchmesser des Kerns verringert werden muss, um die zunehmende Anzahl von Kernen aufzunehmen, was wiederum den Kernfußabdruck reduziert, der sich an den DSST hält. Für die TMA-Konstruktion im Bandverfahren wird ein minimaler Kerndurchmesser von 1 mm empfohlen, da wir festgestellt haben, dass Kerne mit kleineren Durchmessern selbst bei sehr schonendem Paraffinguss besonders instabil und zum Umkippen neigen. Eine kürzlich durchgeführte Studie, die zwei verschiedene interne Methoden untersuchte, bei denen 16-G-Nadeln (Kerndurchmesser von 1,1 mm) und ein Stempel mit einem Durchmesser von 4 mm verwendet wurden, verzeichnete erhebliche Gewebeverluste mit den 1,1 mm (26,5%), aber nicht mit den 4-mm-Kernen24. Dies scheint darauf hinzudeuten, dass es problematisch sein kann, mit kleinen Kernen zu arbeiten, und nicht nur während des Baus. Darüber hinaus stellen kleinere Durchmesser möglicherweise nicht den ursprünglichen Spenderblock sowie größere Kerne dar, was die pathologische Interpretation erschwert und die Wahrscheinlichkeit einer ungenauen Darstellung des Spendergewebes erhöht.
Die Aufnahme und Platzierung von Orientierungsblöcken ist im TMA-Bau von großer Bedeutung. Dies ist jedoch von besonderer Bedeutung für Tape Method Constructed TMAs. Dies rührt daher, dass die Bandmethode den Bauprozess umkehrt und damit das Risiko einer räumlichen Desorientierung erhöht. Wir empfehlen, bis zu drei Orientierungskerne in jeden Block aufzunehmen und sie von den Probenkernen entfernt zu platzieren, um den Block optimal auszurichten. Orientierungskerne können Kerne aus Gewebeblöcken sein, die deutlich unterschiedliche Gewebe aus dem Thema der konstruierten TMA oder gewebefrei gefärbten Orientierungswerkzeuge21 enthalten, wobei letzteres besonders für Nicht-Pathologen hilfreich ist. In Kombination mit einer nicht regulären matrixgemusterten Kernplatzierung minimieren Orientierungskerne das Risiko einer Desorientierung.
Der ausgeprägte Unterschied in der Kernlänge zwischen TMAs, die mit der Band- und Empfängermethode konstruiert wurden, ergibt sich aus der Einbeziehung der Spenderblocktiefe in den Entscheidungsprozess bei der Auswahl der Konstruktionsmethode. Das hier beschriebene Protokoll verwendet einen Schwellenwert, bei dem TMAs mit der Band- und der Empfängermethode konstruiert werden, wenn die Spenderblöcke Tiefen von <4 mm bzw. 4 mm aufweisen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Einbeziehung der Spenderblocktiefe in die Wahl der Baumethode nicht universell ist. Obwohl es möglich ist, TMAs unabhängig von der Tiefe des Donorblocks mit beiden Methoden zu konstruieren, können höhere Kerne die Platzierung der Kunststoffkassette während der TMA-Konstruktion unter Verwendung der Bandmethode stören und/oder umkippen oder kippen. Die Entscheidung, Kriterien in den Entscheidungsprozess aufzunehmen oder wegzulassen, hängt von den Annehmlichkeiten ab, die dem Labor zur Verfügung stehen, den Kosten und dem gewünschten Endprodukt. Unter den Parametern dieses Protokolls ist die Anzahl der auf Objektträgern montierten TMA-Abschnitte, die aus einer Bandmethode erhalten werden können, die TMA konstruiert werden kann, signifikant geringer als die Anzahl der TMA-Empfängermethoden. Obwohl es möglich ist, FFPE-Gewebe erneut zu blockieren, um die Tiefe des Spenderblocks zu erhöhen und sie mit der Empfängermethode kompatibel zu machen, ist die Wahrscheinlichkeit, die gleiche Gewebeorientierung innerhalb des Re-Blocks zu erreichen, gering. Dies wiederum kann eine ausgedehnte Blockverkleidung erfordern, um einen Vollgesichtsabschnitt zu erhalten, der wahrscheinlich einen erheblichen Gewebeverlust beinhalten würde. Nach der Blockverkleidung ergibt ein TMA-Tape-Verfahren ungefähr 50 auf Schieber montierte TMA-Abschnitte mit allen vorhandenen Kernen. Die genaue Anzahl variiert jedoch von Block zu Block und hängt von der Länge der Kerne ab, die zum Aufbau des TMA verwendet werden, und von der Dicke der zu schneidenden Abschnitte (5 μm gegenüber 4 μm). Darüber hinaus muss auch beachtet werden, dass die Kerne aufgrund ihrer unterschiedlichen Kernlängen zu unterschiedlichen Zeiten erschöpft sind, wenn der TMA progressiv geschnitten wird; Ein Attribut, das die Notwendigkeit einer kontinuierlichen pathologischen Überprüfung erneut betont.
Obwohl die Empfängermethode erhebliche Vorteile und Vorteile gegenüber der Bandmethode bietet, einschließlich eines weniger mühsamen und schnelleren Konstruktionsprozesses, richtet sich die Bandmethode nicht an erfahrene Hochdurchsatzlabore. Es richtet sich an das durchschnittliche Labor, insbesondere an solche in ressourcenbegrenzten Umgebungen, mit Zugang zu Spenderblöcken mit variabler Tiefe, aber nicht zu TMA-Baudienstleistungen. Zukünftige Anwendungen könnten jedoch eine Automatisierung dieser Methode sehen, um den Pool der in Frage kommenden Proben in Hochdurchsatzlabors zu erweitern und die Notwendigkeit einer erneuten Blockierung von Spenderblöcken zu beseitigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das beschriebene TMA-Tape-Method-Konstruktionsprotokoll in nicht spezialisierten Labors leicht eingerichtet werden kann, ohne dass teure Geräte erforderlich sind. Es wird jedoch empfohlen, dass neue Benutzer FFPE-Gewebeblöcke ohne Wert, gewebefreie farbigeOrientierungswerkzeuge 21 oder sogar farbige Paraffinblöcke ohne Gewebe zunächst verwenden sollten, um sich mit der Bandmethodentechnik vertraut zu machen, bevor sie zur TMA-Konstruktion mit wertvollem Gewebe übergehen. Obwohl ihre Konstruktion nicht ohne potenzielle Fallstricke ist, die sowohl diejenigen, die TMA-Blöcke konstruieren als auch verwenden, beachten sollten, kann diese scheinbar unpolierte "hausgemachte" TMA-Bauweise qualitativ hochwertige, biologisch relevante TMAs für die Forschung liefern. Tatsächlich gehören TMA-Abschnitte, die aus der Tape-Methode hergestellten TMAs stammen, zu den am häufigsten nachgefragten Gewebeproben im ACSR-Biorepository.
Disclosures
Wir haben nichts offenzulegen.
Acknowledgments
Die Finanzierung für diese Arbeit wurde vom NIH finanzierten AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Biorepository (www.acsr1.com), UM1CA181255, bereitgestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| cellSens imaging software | Olympus | x | |
| Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
| Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
| DP72 camera | Olympus | DP72 | |
| Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
| Forceps | Various | x | |
| Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
| Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
| Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
| Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
| Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
| Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
| Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
| Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |
References
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