Isolering af epitelceller fra human tandsække
Summary
Tandsækken indeholder en epitelpopulation og mesenkymale celler. Epitelpopulationen blev udvalgt blandt den heterogene dentalsækkecellepopulation ved at give et særskilt kulturmedium. Epitelceller overlevede og dannede kolonier i et serumfrit medium.
Abstract
Tandsækken (DF) blev høstet under fjernelsen af en påvirket tredje molar af en oral maxillofacial kirurg. Epitelcelleisolation blev udført på dagen for DF-høsten. DF blev vasket tre gange med DPBS og derefter dissekeret med vævssaks, indtil vævet havde en pulpy eller squishy konsistens. Encellede populationer blev pelleted af centrifugering og vasket med keratinocyt serum-fri medium. Heterogene cellepopulationer blev fordelt i en kulturret. Keratinocyte serum-fri medium blev brugt til at vælge epitelceller. Kulturmediet blev ændret dagligt, indtil der ikke blev observeret flydende snavs eller døde celler. Epitelceller dukkede op inden for 7-10 dage efter cellepopulationsfordelingen. Epitelceller overlevede i serumfrit medium, mens α-modifikation minimal vigtigt medium suppleret med 10% fosterkvæg serum tilladt spredning af mesenchymale-type celler. DF er en vævskilde til isolering af dental epitelceller.
Formålet med denne undersøgelse var at etablere en metode til isolering af epitelceller fra human DF. Paradent ledbånd (PDL) blev brugt til isolering af menneskelige dental epitelceller. Fremskaffelse af epitelceller fra menneskelige PDL er ikke altid vellykket på grund af det lille vævsvolumen, hvilket fører til et lavt antal epitelceller. DF har en større diskenhed end PDL og indeholder flere celler. DF kan være en vævskilde til den primære kultur af menneskelige dental epitelceller. Denne protokol er nemmere og mere effektiv end isolationsmetoden ved hjælp af PDL. Fremskaffelse af humane dental epitelceller kan lette yderligere undersøgelser af dental epitel-mesenchymale interaktioner.
Introduction
Tanddannelse begynder med invagination af det orale epitel1. Ifølge tandudviklingsstadiet har det orale epitel forskellige navne, herunder indre og ydre emalje epitel, cervikal sløjfe og Hertwigs epitelrods kappe (HERS). Epitelrummene kommunikerer med de omgivende mesenkymale celler. Epitel-mesenchymale interaktioner regulerer tanddannelse og vævsregenerering. Fremskaffelse af dental epitelceller, såsom orale keratinocytter og Hertwigs epitelrodsdedelceller (HERSC’er), er afgørende for studiet af dental epitel-mesenchymale interaktioner2.
Gnaver-afledte dental epitelceller er isoleret fra epitelstrukturen, såsom HERS. Li og kolleger isolerede og udødeliggjorde rotte molar-afledte HERSC’er efter høst af den apikale del af de udviklende tandkim fra 8-dages gamle rotter3. HERS blev adskilt fra apikvæv under forstørrelse. I betragtning af tandudviklingsstadiet og alderen er høst af BESÆTNING FRA mennesker næsten umuligt på grund af etiske problemer: En udviklende tandkim skal fjernes fra et lille barn for at høste den menneskelige HERS. Umodne tand bakterier er sjældent ekstraheret. Humane dental epitelceller kan isoleres fra gingiva og paradentose ledbånd (PDL). Epitelstruktur-afledte celler deltager i tanddannelse sammen med mesenkymale komponenter og kan være mere egnet til undersøgelse af dental epitel-mesenchymale interaktioner end orale keratinocytter. Epitelcellestøtter af Malassez (ERM) er HERS-afledte epitelrester og bor i små tal i PDL4. Undersøgelser rapporterer isolering af menneskelige HERSCs fra PDL5. Men høst af menneskelige HERSCs fra PDL væv er ikke altid en succes på grund af knapheden på epitelpopulationen på dette sted5,6.
Selv om gnaver-afledte HERSCs opretholdes i serum-holdige medier3,7, menneskelige DF-afledte epitelceller er kultiveret med serum-fri medier svarende til andre menneskelige epitelceller, såsom normale menneskelige epidermal keratinocytter og normale menneskelige orale keratinocytter8,9. Dette indebærer fysiologiske eller funktionelle forskelle mellem gnaver dental epitelceller og menneskelige dental epitelceller. Forståelse af mekanismen vedrørende dental epitel-mesenchymale interaktioner kan bidrage til udviklingen af kliniske anvendelser, herunder paradentose genindsættelse under genplantning, paradentose regenerering i paradentose, pulp-dentin kompleks regenerering, og bio-tand generation. I betragtning af de karakteristiske træk ved translationel forskning, human dental epitelceller kan være mere hensigtsmæssigt end gnaver dental epitelceller til undersøgelse af epitel-mesenchymale interaktioner.
Den menneskelige DF er en løs bindevæv og ofte bor i en påvirket tand. DF indeholder mesenchymale prækursorer10. Men så vidt vi ved, har ingen undersøgelse rapporteret isolering af epitelceller fra tandsække før 2021. Åh, og Yi rapporterede isolering af epitelceller fra menneskelige DF i 20218. Epitelfænotypen blev bekræftet af vestlig blotting og morfologisk analyse. Analyse af oprindelsen af DF-afledte epitelceller viste lignende resultater med andre undersøgelser. DF-afledte epitelceller var hverken endotel- eller hæmatopoietiske5,11, og Oh og Yi foreslog at navngive disse celler som DF-HERSC’er. DF har en større volumen end PDL, og flere epitelceller kan isoleres fra DF. Dette øger fremkomsten af epitelkolonier og resulterer i en høj succesrate ved høst af epitelceller fra DF. Denne undersøgelse tyder på at bruge DF som en vævskilde til isolering af dental epitelceller.
I denne undersøgelse blev enkelte celler isoleret fra DF ifølge tidligere beskrevne procedurer10,12. DF indeholder heterogene cellepopulationer, og flere celletyper kan være til stede på det tidlige stadium af proceduren. Morsczek og kolleger isolerede DF-afledte mesenkymale stamceller10. Vi har antaget, at DF indeholder epitelceller, og at kun epitelceller kan overleve under serumfrie forhold. Denne undersøgelse adskiller sig fra Morsczek et al. med hensyn til udvælgelsen af epitelpopulationen og hæmningen af mesenkymale celler. Udvælgelsen blev udført ved hjælp af keratinocyte serum-fri medier (SFM), som tillader epitelcellespredning og hæmmer mesenkymal cellespredning. Denne undersøgelse stammer fra en rapport fra Oh og Yi8. Formålet med denne undersøgelse var at beskrive detaljer om den metode, der anvendes i denne rapport til isolering af epitelceller fra human DF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol indeholder vigtige trin. Høst af encellede populationer er afgørende for en vellykket isolering af epitelceller fra DF. Vi forsøgte at isolere epitelceller fra DF ud fra vores hypotese om, at der er flere epitelceller i DF. Hakkeproceduren forbedrer løsrivelse og frigivelse af celler fra DF. Hakkeproceduren blev forbedret, og hakken gentog sig, indtil DF syntes pulpy for at lette frigivelsen af enkelte celler. Opnåelse af det maksimale antal enkeltceller øger sandsynligheden for fremkomsten af epitel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af den koreanske regering (NRF-2017R1C1B2008406 og NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae sørgede venligt for DF for primær kultur.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
References
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Developmental Biology. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
