Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس الفيزيولوجيا الضوئية للمرحلة المرفقة من الكولاسيوم sp. بواسطة مقياس فلورومتر معدل التكرار السريع من نوع كوفيت

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

يعد مقياس الفلورومتر بمعدل التكرار السريع (FRRf) طريقة مفيدة لقياس الفيزيولوجيا الضوئية للنظام الضوئي II والإنتاجية الأولية. هنا نصف بروتوكولا لقياس الفسيولوجيا الضوئية PSII للطحالب الفوقية ، Colacium sp. على العوالق الحيوانية الركيزة باستخدام FRRf من نوع cuvette.

Abstract

يعد مقياس الفلورومتر بمعدل التكرار السريع (FRRf) طريقة مفيدة لقياس الفيزيولوجيا الضوئية للنظام الضوئي II (PSII) والإنتاجية الأولية. على الرغم من أن FRRf يمكنه قياس المقطع العرضي لامتصاص PSII (σ PSII) ، والحد الأقصى للكفاءة الكيميائية الضوئية (Fv / Fm) ، والكفاءة الكيميائية الضوئية الفعالة (Fq ′ / Fm′) ، والتبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQNSV) لمختلف الطحالب حقيقية النواة والبكتيريا الزرقاء ، فقد ركزت جميع دراسات FRRf تقريبا حتى الآن على العوالق النباتية. هنا ، يصف البروتوكول كيفية قياس الفسيولوجيا الضوئية PSII للطحالب الفوقية Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) ، في مرحلته المرفقة (المرفقة بالعوالق الحيوانية) ، باستخدام FRRf من نوع cuvette. أولا ، قمنا بتقدير آثار العوالق الحيوانية الركيزة (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 ، Cladocera ، Daphniidae) على التألق الأساسي و σ PSII و Fv / Fm و Fq ′ / Fm و NPQNSV من العوالق Colacium sp. للتحقق من صحة هذه المنهجية ، سجلنا قياسات الفيزيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. المرفق على S. mucronata وقارنا هذه النتائج مع مرحلة العوالق الخاصة به. أظهرت النتائج التمثيلية كيف يمكن للبروتوكول تحديد آثار الكالسيوم (Ca) والمنغنيز (Mn) على الكولاسيوم sp. الفيزيولوجيا الضوئية وتحديد الآثار المختلفة لتخصيب Mn بين المراحل المرفقة والعوالق . وأخيرا، نناقش قدرة هذا البروتوكول على التكيف مع الطحالب المحيطة الأخرى.

Introduction

يعد التألق المتغير الكلوروفيل أداة مفيدة لقياس الفيزيولوجيا الضوئية للنظام الضوئي للطحالب II (PSII). تستجيب الطحالب لمختلف الضغوط البيئية ، مثل الضوء الزائد ونقص المغذيات ، عن طريق تغيير الفيزيولوجيا الضوئية PSII. يعد مقياس فلورومتر معدل التكرار السريع (FRRf) طريقة شائعة لقياس الفيزيولوجيا الضوئية PSII 1,2 وتقدير الإنتاجية الأولية1,3,4 ، والتي تمكن من مراقبة الفيزيولوجيا الضوئية للعوالق النباتية PSII ، وكذلك الإنتاجية الأولية عبر المقاييس المكانية والزمانية الواسعة 5,6,7. يمكن ل FRRf قياس المقطع العرضي لامتصاص PSII (σ PSII) في وقت واحد ، وتركيز مركز التفاعل ([RCII]) ، والحد الأقصى للكفاءة الكيميائية الضوئية (Fv / Fm) ، والكفاءة الكيميائية الضوئية الفعالة (Fq ′ / Fm ′) ، والتبريد غير الكيميائي الضوئي (NPQNSV) (الجدول 1). بشكل عام، يتم تعريف Fv/Fm وFq′/Fm′ على أنهما نشاط PSII8، في حين يتم تعريف NPQNSV على أنه طاقة نسبية مبددة حراريا9.

الأهم من ذلك ، أن ومضات الدوران الفردي (ST) من FRRf تقلل تماما من مستقبل إلكترون الكينون الأساسي ، QA ، ولكن ليس تجمع البلاستوكينون. وعلى العكس من ذلك، فإن ومضات الدوران المتعدد (MT) من مقياس فلورومتر تعديل سعة النبض (PAM) يمكن أن تقلل من كليهما. تتمتع طريقة ST بميزة واضحة على طريقة MT عند تحديد الأصول المحتملة ل NPQNSV عن طريق قياس حركية الاسترداد في وقت واحد ل Fv / Fm و Fq ′ / Fm و NPQNSV و σ PSII10. وحتى الآن، هناك عدة أنواع من أدوات FRRf، مثل النوع الغاطس، ونوع الكوفيت، ونوع التدفق عبر الإنترنت، متاحة تجاريا. يتيح FRRf من النوع الغاطس قياسات في الموقع في المحيطات والبحيرات ، في حين أن FRRf من نوع cuvette مناسب لقياس أحجام العينات الصغيرة. يستخدم نوع التدفق بشكل شائع لقياس الفسيولوجيا الضوئية للعوالق النباتية في المياه السطحية باستمرار.

وبالنظر إلى تطور مقاييس الفلورومترات PAM، بما في ذلك نوع كوفيت، لمجموعة واسعة من الموضوعات11، لا تزال مقاييس الفلورومتر PAM أكثر شيوعا من FRRfs في أبحاث الفيزيولوجيا الضوئية للطحالب12. على سبيل المثال ، على الرغم من أن بنية غرفة العينة وسعة cuvette بين هذه الأدوات تختلف اختلافا طفيفا فقط ، فقد تم تطبيق PAM من نوع cuvette على العوالق النباتية13,14,15 ، والطحالب الدقيقة القاعية16,17,18 ، والطحالب الجليدية19 ، والطحالب epizoic 20 ، في حين تم تطبيق FRRf من نوع cuvette في المقام الأول على العوالق النباتية21,22,23 وعدد محدود من مجتمعات الطحالب الجليدية24,25. نظرا لفعاليته ، فإن FRRf من نوع cuvette ينطبق بنفس القدر على الطحالب القاعية و epizoic. لذلك ، فإن توسيع تطبيقه سيوفر نظرة ثاقبة كبيرة على الفيزيولوجيا الضوئية PSII ، خاصة بالنسبة للفسيولوجيا الضوئية للطحالب الفوقية الأقل شهرة.

لم تحظ الطحالب الإبيزوية باهتمام كبير ، مع القليل من الدراسات التي تدرس الفيزيولوجيا الضوئية PSII 20,26 ، على الأرجح بسبب أدوارها الثانوية في الشبكات الغذائية المائية27,28. ومع ذلك، يمكن أن تؤثر الإببيونتات، بما في ذلك الطحالب الفوقية، تأثيرا إيجابيا على ديناميكيات مجتمع العوالق الحيوانية، مثل زيادة معدلات التكاثر والبقاء على قيد الحياة29,30، فضلا عن التأثير سلبا على العمليات، مثل زيادة معدل الغرق29,31 والتعرض للحيوانات المفترسة البصرية32,33,34,35,36 . لذلك ، فإن استكشاف العوامل البيئية والبيولوجية التي تتحكم في ديناميكيات epibiont في مجتمعات العوالق الحيوانية أمر بالغ الأهمية.

من بين الطحالب الفوقية ، كولاسيوم إيرنبرغ 1834 (Euglenophyta) هي مجموعة طحالب شائعة في المياه العذبة32،37،38،39 مع مراحل حياة مختلفة ، بما في ذلك المرفقة (الشكل 1A-D) ، والعوالق غير المتحركة (الشكل 1E ، F) ، ومراحل العوالق المتحركة 40،41 . خلال مرحلة العوالق غير المتحركة ، تعيش الخلايا كعوالق أحادية الخلية ، أو مستعمرات مجمعة ، أو مستعمرات صفائح من طبقة واحدة ، مغطاة بالصمغ42. في المرحلة المرفقة ، يستخدم Colacium sp. الصمغ الذي يفرز من الطرف الأمامي للخلية37،39،41 للالتصاق بالكائنات الحية الركيزة (basibionts) ، وخاصة القشريات الدقيقة41،43. تتضمن دورة حياتها أيضا الانفصال عن الهيكل الخارجي المنصهر أو القاعدية الميتة والسباحة مع سوطاها للعثور على كائن حي آخر في الركيزة39. يمكن لكل من العوالق والمراحل المرفقة زيادة حجم سكانها عن طريق الانقسام الانقسامي40. على الرغم من افتراض أن المرحلة المرفقة بها هي سمة تطورية لجمع الموارد، مثل الضوء44 والعناصر النزرة41،45،46، أو كاستراتيجية تشتت27، إلا أنه لا يتوفر سوى القليل من الأدلة التجريبية حول هذه الجوانب37،41،44 وآليات التعلق الرئيسية غير معروفة إلى حد كبير. على سبيل المثال، توقع روسوسكي وكوغرينز أن يحصل الكولاسيوم على المنغنيز (Mn) من مجدافيات الأرجل الركيزة41، التي تتركز في الهيكل الخارجي47.

هنا ، نصف كيفية قياس الفسيولوجيا الضوئية PSII للطحالب العوالق وطريقة التطبيق ذات الصلة لاستهداف الطحالب المرفقة (المرتبطة بالعوالق الحيوانية) مع خلايا Colacium sp. باستخدام FRRf من نوع cuvette. نحن نستخدم نظام Act2 المجهز بثلاثة صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) توفر طاقة إثارة فلاش تتمحور حول 444 نانومتر و 512 نانومتر و 633 نانومتر 48. هنا ، يتوافق 444 نانومتر (أزرق) مع ذروة امتصاص chrophyll a (Chl-a ) ، في حين أن 512 نانومتر (أخضر) و 633 نانومتر (برتقالي) تتوافق مع قمم امتصاص phycoerythrin و phycocyanin ، على التوالي. تبلغ ذروة الكشف عن إشارة الفلورسنت 682 نانومتر مع عرض النطاق الترددي النصفي 30 نانومتر. نظرا لأنه من الصعب العثور على المرحلة العوالق من Colacium sp. في البيئات الطبيعية ، فقد تم جمع المرحلة المرفقة بها للتجارب. من بين العديد من الكائنات الحية الركيزة ، Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda ، Daphniidae; الشكل 1A ، B ، G) هو واحد من أبسط الأشكال للتعامل معها بسبب سرعة السباحة البطيئة ، وحجم الجسم الكبير (400-650 ميكرومتر) ، والسلوك الفريد (معلقة رأسا على عقب على سطح الماء). لذلك ، يستخدم هذا البروتوكول Colacium sp. المرفق على S. mucronata كدراسة حالة لنظام Colacium-basibiont. لتجنب التألق المشتق من محتويات الأمعاء ، تم تجويع S. mucronata. كما ذكرت دراسة سابقة أن إشارة التألق من محتويات الأمعاء (الطحالب المبتلعة) تظهر انخفاضا بمقدار خمسة أضعاف بعد 40 دقيقة 49 ، توقعنا أن تكون المجاعة لمدة 90 دقيقة كافية لتقليل إمكانية تألق محتوى الأمعاء الذي يؤثر على قياس FRRf مع الحد الأدنى من تأثيرات الإجهاد التجريبي على Colacium sp. ، مثل نقص المغذيات. علاوة على ذلك ، تم تطبيق هذا البروتوكول لتوضيح آلية ربط Colacium sp. وتحديد كيفية تأثير معدنين ، الكالسيوم (Ca) والمنغنيز (Mn) على الفسيولوجيا الضوئية لكل من العوالق والمراحل المرفقة. يلعب الكالسيوم أدوارا رئيسية في مسارات التمثيل الضوئي50 بطرق متعددة ، وكلا المعدنين مطلوبان لبناء المجمعات المتطورة للأكسجين في PSII51. نظرا لأن الكالسيوم والمنغنيز يتركزان بشكل كبير في قشرة العوالق الحيوانية القشريات47 ، فإننا نفترض أن الكولاسيوم sp. الفسيولوجيا الضوئية قد تستجيب بشكل أكثر بروزا لتخصيب Ca و Mn خلال مرحلة العوالق إذا حصلت مرحلة الحياة هذه على هذه العناصر من S. mucronata خلال المرحلة المرفقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. أخذ العينات

  1. جمع مياه البحيرة من السطح بواسطة دلو. لاستهداف Colacium sp. تعلق على S. mucronata (الشكل 1A-C) مرشح 0.5-10 لتر من مياه البحيرة باستخدام شبكة نايلون 100 ميكرومتر net52.
    ملاحظة: غالبا ما يتم تجميع S. mucronata بكثافة في المياه الضحلة والغنية بالمغذيات والموحلة ، مثل مناطق القصب (phragmites).
  2. تخزين العينات المركزة في زجاجات بلاستيكية 500 مل مع 350 مل من مياه البحيرة. يحفظ في ظروف مظلمة.
  3. في المختبر ، صب عينة الماء في كوب سعة 500 مل واتركه يستقر لبضع دقائق.
  4. قم بتصفية مياه البحيرة من خلال مرشح بحجم 0.2 ميكرومتر بحجم المسام.
  5. التقاط S. الأفراد mucronata باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي في تكبير 100x. إجراء تحديد الأنواع وفقا ل Błędzki و Rybak53.
  6. انقلها إلى قطرة من 0.2 ميكرومتر من مياه البحيرة المصفاة (FLW) الموضوعة على شريحة زجاجية.
    ملاحظة: س. قد يسبح mucronata إلى السطح أو يعلق على جدار الكعك.
  7. تحقق S. mucronata تحت المجهر الضوئي.
  8. غسل S. الأفراد mucronata باستخدام FLW (3 قطرات أو أكثر) لمنع التلوث من الكائنات الحية الأخرى (الشكل 2).
  9. حافظ على S. mucronata في درجة حرارة في الموقع في غرفة نمو أقل من 40 ميكرومول فوتون ·m−2·s−1.

2. آثار S . mucronata على التألق الأساسي

  1. س. زراعة mucronata
    1. التقط أفراد S. mucronata باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي عند تكبير 100x واغسلها باستخدام FLW ، كما هو الحال في الخطوة 1.8.
    2. تهوية مياه الصنبور باستخدام مضخة هواء كهربائية عبر حجر الهواء لمدة 1 أسبوع على الأقل. صب 300 مل من ماء الصنبور الخلوي في وعاء زجاجي سعة 350 مل.
    3. تغذية شلوريلا (1 ملغ C·L−1) والحفاظ على 20 درجة مئوية تحت 40 ميكرومول فوتون ·m−2·s−1 في غرفة النمو.
    4. بعد حوالي 14 يوما ، التقط 5-30 فردا باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي عند تكبير 100x وتلقيحهم في 300 مل من مياه الصنبور النظيفة والخلوية للحفاظ على الوسط طازجا.
  2. إعداد FRRf
    1. قم بتشغيل برنامج Act2Run.
    2. انقر فوق علامة التبويب خيارات وحدد Act2 FLC (مصابيح LED بيضاء) في وضع التشغيل لتعيين لون مصابيح LED الأكتينية.
    3. انقر على قيمة Dark في الخطوة 1 من إعدادات منحنى ضوء الفلورسنت في النافذة الرئيسية ، واكتب 30 لتعيين مدة الفترة المظلمة (الشكل 3A).
    4. انقر على مجموعة LED B و C و D لإيقاف تشغيل مصابيح LED الخضراء والبرتقالية (الشكل 3C).
    5. انقر على قيمة Fets و Pitch تحت السبت ، واكتب 100 و 2 ، على التوالي ، لتعيين عدد ودرجة الوميض في مرحلة التشبع (الشكل 3D).
    6. انقر على قيمة Fets و Pitch تحت Rel ، واكتب 40 و 60 ، على التوالي ، لتعيين عدد ودرجة الوميض في مرحلة الاسترخاء (الشكل 3E).
    7. قم بتنشيط مضخة سترة المياه بالنقر فوق أثناء FLC (الشكل 3F) للتحكم في درجة حرارة العينة أثناء القياس.
    8. قم بالتنشيط بالنقر فوق Auto-LED و PMT التلقائي (الشكل 3F).
    9. انقر فوق مزامنة لتوصيل FRRf-Act2.
  3. قياسات FRRf
    1. لدراسة آثار أفراد العوالق الحيوانية على التألق الأساسي ، قم بإعداد S للبالغين. mucronata (حجم الجسم 400-650 ميكرومتر) من الثقافة في الخطوات 2.1.1-2.1.4 دون أي كائنات حية مرفقة.
    2. لتجنب التألق من محتويات الأمعاء ، تجويع الأفراد في FLW عند 20 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة على الأقل.
    3. صب 1.5 مل من FLW في كوفيت. التقط 0 و 1 و 5 و 10 S. mucronata الأفراد باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي عند تكبير 100x.
    4. نقل S. الأفراد mucronata في cuvette وإضافة FLW لجلب عينة تصل إلى 2 مل.
    5. التأقلم تحت الإضاءة المنخفضة (1-10 ميكرومول فوتون·m−2·s−1) عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل قياس FRRf.
    6. انقر فوق Act2 Run لبدء القياس. كرر القياسات >3 مرات لكل عينة.
    7. اقرأ قيمة Fo من مخطط النتيجة (الشكل 4).

3. آثار الكائن الحي الركيزة على Chl- التألق

  1. زراعة الكولاسيوم sp.
    1. قم بإعداد FLW و AF-6 medium54 للزراعة (الجدول 2).
    2. جمع الكولاسيوم sp. تعلق على S. mucronata كما هو الحال في الخطوتين 1.1 و 1.2 ، والحفاظ عليها في درجة حرارة الموقع في غرفة النمو.
    3. التقط Colacium sp. باستخدام قفاز منصهر (الشكل 1D) باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي عند تكبير 100x. اغسلها باستخدام FLW ، كما هو الحال في الخطوة 1.8.
    4. قم بتلقيح Colacium sp. و AF-6 بشكل معقم في أنبوب زجاجي سعة 10 مل على مقعد نظيف.
    5. الحفاظ على الثقافة في درجة حرارة الموقع تحت 200 ميكرومول فوتون ·m−2·s−1 في غرفة النمو. رج الأنبوب الزجاجي بلطف باليد مرة واحدة على الأقل يوميا لمنع استقرار الخلايا.
      ملاحظة: للحفاظ على تأثير التوهين للمستعمرات المجمعة منخفضا قدر الإمكان ، تحقق من المستعمرات تحت المجهر قبل قياس FRRf. قد يسبب تراكم الخلايا مستعمرات كثيفة ويؤثر على الفيزيولوجيا الضوئية للطحالب55.
  2. قياسات FRRf
    1. لدراسة آثار أفراد العوالق الحيوانية على Chl-a fluorescence من Colacium sp. ، قم بإعداد S للبالغين. mucronata (حجم الجسم 400-650 ميكرومتر) دون أي كائنات حية مرفقة.
    2. لتجنب التألق من محتويات الأمعاء ، تجويع الأفراد في FLW لمدة 90 دقيقة على الأقل.
    3. قم بإعداد مقياس فلورومتر معدل التكرار السريع من نوع cuvette (FRRf).
    4. صب عينة فرعية 1.5 مل من كولاسيوم sp. قبل الزراعة في كوفيت. نقل 0 و 5 و 10 و 15 S. الأفراد mucronata في هذه cuvettes وإضافة 2 ميكرومتر من الوسط المصفى لجعل العينة تصل إلى 2 مل.
    5. التأقلم تحت الإضاءة المنخفضة (1-10 ميكرومول فوتون·m−2·s−1) عند 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل أخذ قياس FRRf.
      ملاحظة: الحفاظ على العينات في درجة حرارة الحضانة أثناء القياسات
    6. انقر فوق Act2 Run لبدء القياس. كرر القياسات >3 مرات لكل عينة.
    7. اقرأ قيم FO و Fm من مخطط النتائج (الشكل 4).
      ملاحظة: تحقق من قيمة RσPSII (الجدول 1)، والتي توضح ما إذا كانت طاقة LED ضمن النطاق الأمثل لتقدير معلمات PSII بشكل صحيح. عند تنشيط مؤشر LED التلقائي، يتحكم نظام Act2run في طاقة LED لتحقيق نطاق RσPSII الأمثل (0.042-0.064). تم تعريف قيمة القطع التجريبية RσPSII عند 0.03 و 0.08 في دراسة سابقة48.
    8. لتصحيح التألق الأساسي22، قم بتصفية وسط الاستزراع باستخدام مرشح بحجم 0.2 ميكرومتر بحجم المسام وقياس التألق. اطرح FO لنموذج الأساس من FO وFm من Colacium sp.، أو قم بتعديل قيمة التصحيح الفارغة في علامة التبويب الإعدادات في علامة التبويب خيارات.

4. الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. (المرحلة المرفقة)

  1. عزل الأفراد S. mucronata مع Colacium sp. باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي.
  2. غسل S. mucronata باستخدام FLW ، كما هو الحال في الخطوة 1.8.
  3. نقل S. mucronata في 100 مل من FLW. للمجاعة، احتفظ بها تحت ظروف مظلمة في درجة حرارة الموقع لمدة 90 دقيقة.
  4. صب 1.5 مل من FLW في كوفيت.
  5. نقل ~ 10 S. الأفراد mucronata مع Colacium sp. في cuvette. للقياسات ، هناك حاجة إلى أكثر من 100 خلية كولاسيوم لكل 2 مل. أضف FLW لجلب العينة إلى 2 مل.
  6. التأقلم تحت الإضاءة المنخفضة (1-10 ميكرومول فوتون·m−2·s−1) في درجة حرارة الموقع لمدة 15 دقيقة.
  7. لتعداد عدد الخلايا المرفقة ، قم بإصلاح العينة باستخدام glutaraldehyde (الحجم النهائي 2٪) بعد أخذ قياس FRRf. التقط صورا على عدة أعماق ومواضع بؤرية من S. mucronata تحت المجهر الضوئي.

5. الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. (مرحلة العوالق)

  1. قم بزراعة عينات من الكولاسيوم sp. في وسط AF-6 في درجة حرارة الموقع كما هو الحال في الخطوات 3.1.1-3.1.5.
  2. بالنسبة للمرحلة الثابتة ، خذ 2 مل من Colacium sp. المستزرع واسكبه في كوفيت.
  3. التأقلم تحت الإضاءة المنخفضة (1-10 ميكرومول فوتون·m−2·s−1) في درجة حرارة الموقع لمدة 15 دقيقة.

6. آثار إضافة Ca و Mn على الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp.

  1. التأثيرات على المرحلة المرفقة
    1. عزل الأفراد S. mucronata مع Colacium sp. باستخدام ماصة تحت المجهر الضوئي. اغسل باستخدام FLW ، كما هو الحال في الخطوة 1.8.
    2. نقل ستة أفراد إلى 12 كوب زجاجي مع 30 مل من FLW. تأكد من أن كل كوب يحتوي على >100 خلية كولاسيوم .
    3. أضف 200 ميكرومول· L−1 CaCl2· H2O (علاج Ca)، 40 ميكرومول· L−1 MnCl4 (معالجة Mn) ، أو مياه فائقة النقاء (التحكم) لكل دورق. احتضان العينات تحت 200 ميكرومول فوتون ·m−2 ·s−1 في درجة حرارة الموقع في غرفة النمو.
    4. في 3 ساعات و 21 ساعة ، انقل جميع الأفراد والجلود المنصهرة إلى كوفيت مع 2 مل من الوسط.
    5. لفحص الاستجابة السريعة للضوء المتزايد ، انقر فوق أعلى من فترات 8 خطوات ضوئية أكتينية واكتب 20 (الشكل 3A) لتعيين مدة كل خطوة في 20 ثانية. لضبط الضوء الأكتيني التدريجي على أنه 0 و 11 و 25 و 44 و 68 و 101 و 144 و 200 ميكرومول فوتون ·m−2·s−1 ، انقر فوق High E و Step Up وقم بتغيير القيم إلى 200 و 34 ، على التوالي (الشكل 3B).
    6. بعد 15 دقيقة من التأقلم المظلم ، قم بقياس تألق Chl-a لكل عينة على غرار الخطوات 3.2.6-3.2.8.
      ملاحظة: تحقق من أن قيم RσPSII و RσPSII ضمن النطاق الأمثل (0.03-0.08)48.
  2. التأثيرات على مرحلة العوالق
    1. قم بزراعة عينات من الكولاسيوم sp. في وسط AF-6 في درجة حرارة الموقع كما هو الحال في الخطوات 3.1.1-3.1.5.
    2. انقل الكولاسيوم المستزرع sp. إلى FLW وتأقلم في درجة حرارة الموقع أقل من 200 ميكرومول فوتون ·m−2·s−1 لمدة 3 أيام.
    3. نقل 1 مل من العينات المتأقلمة إلى ثلاث قوارير زجاجية مع 10 مل من FLW.
    4. أضف 200 ميكرومول· L−1 CaCl2· H2O (علاج Ca)، 40 ميكرومول· L−1 MnCl3 (معالجة Mn) ، أو مياه فائقة النقاء (التحكم) إلى القوارير. احتضان العينات تحت 200 ميكرومول فوتون·m−2·s−1 في درجة حرارة الموقع في غرفة النمو.
    5. عند 3 ساعات و 21 ساعة، قم بقياس تألق Chl-a لكل عينة كما في الخطوات 3.2.6-3.2.8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لم يكن هناك تأثير كبير للتألق الأساسي (الشكل 5) أو التألق Chl-a (الشكل 6) بواسطة S. mucronata حتى 5 أفراد (inds.) mL−1. ومع ذلك ، تأثرت Fv / Fm و NPQNSV بشكل كبير عندما كان S. mucronata 7.5 inds·mL−1. لذلك ، لقياس الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. خلال المرحلة المرفقة ، اخترنا S. mucronata مع العبء الأعلى من Colacium sp. من أجل الوصول إلى وفرة كافية من Colacium sp. (>50 خلية ·mL−1) وعدد منخفض من S. mucronata (≤5 inds·mL −1) في cuvette.

ويبين الجدول 3 التباين الموسمي في الفيزيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. خلال المرحلة المرفقة. على الرغم من اختلاف درجة حرارة أخذ العينات ، إلا أن الفيزيولوجيا الضوئية ظلت ثابتة نسبيا. σ تراوح PSII من 3.42 نانومتر2 إلى 3.76 نانومتر2 (متوسط 3.60 نانومتر2)، وتراوحت الترددات الدقيقة/الترددات المنخفضة من 0.52 إلى 0.60 (المتوسط 0.55)، وتراوحت النبضات النووية من 0.66 إلى 0.85 (المتوسط 0.82). للتحقق من صحة هذه النتائج ، قمنا بمزيد من التحقيق في الاختلافات في الكولاسيوم sp. الفسيولوجيا الضوئية خلال مرحلة العوالق للمرحلة الثابتة في وسط AF-6 (الجدول 4). كان متوسط Fv / Fm و NPQNSV للمرحلة المرفقة مشابها لتلك الموجودة في مرحلة العوالق عند احتضانها في وسط AF-6.

لتحديد تأثير Ca و Mn على الكولاسيوم sp. الفيزيولوجيا الضوئية في كل من المراحل المرفقة والعوالق ، أجرينا تجارب إثراء Ca و Mn. تم أخذ عينات من منطقة القصب في بحيرة بيوا في 7 مايو 2021. بالنسبة للمرحلة المرفقة من Colacium sp. في ظل الظروف المظلمة ، لم يكن هناك فرق كبير في المعلمات الفسيولوجية الضوئية بين العلاجات ، باستثناء NPQNSV بين Mn و Ca العلاجات في 3 ساعات ، حيث Ca < Mn (الشكل 7A ، C ، E). علاوة على ذلك ، لم تظهر استجابات σ PSII′ و Fq ′ / Fm و NPQNSV لزيادة الضوء خلال المرحلة المرفقة أي اختلافات واضحة بين العلاجات (الشكل 8A و C و E والشكل 9A و C و E). ومع ذلك ، يميل NPQNSV إلى أن يكون أقل في معالجة Ca من التحكم في شدة الضوء المنخفضة عند 21 ساعة (فوتون 11 و 25 ميكرومول ·m−2·s−1 ، الشكل 9E). بالنسبة لمرحلة العوالق ، كان σ PSII أقل بكثير في Mn من علاج Ca في 3 ساعات (الشكل 7B). كان Fq′/Fm′ أعلى بكثير، ولكن NPQNSV كان أقل في علاج Mn من التحكم عند 21 ساعة (الشكل 7D,F). في ظل زيادة الضوء ، يميل Mn إلى تقليل σ PSII وزيادة Fq′ / Fm ′ خلال مرحلة العوالق ، مقارنة بالتحكم عند 3 ساعات (الشكل 8D). وبالمثل ، خفضت Mn بشكل كبير NPQNSV خلال مرحلة العوالق مقارنة بالتحكم عند 21 ساعة (الشكل 9F). على غرار المرحلة المرفقة ، تحسن الكالسيوم قليلا NPQNSV لمرحلة العوالق تحت ضوء متزايد (الشكل 9F). ومع ذلك ، انخفض Ca Fq′ / Fm ′ وزاد NPQNSV لمرحلة العوالق مقارنة بمعالجة Mn تحت فوتون 44-200 ميكرومول ·m−2·s−1 عند 3 ساعات (الشكل 8D ، F).

Figure 1
الشكل 1: Colacium sp. وكائن المادة Scapholeberis mucronata. (أ) المصابة ببكتيريا S. mucronata. (ب) S. mucronata المصابة الثابتة مع glutaraldehyde. (ج) خلايا الكولاسيوم المرفقة على S. mucronata الحية. (د) خلايا الكولاسيوم المرفقة على الكارابيس المنصهر. (E, F) كولاسيوم sp. من العوالق (بالميلا) المرحلة. (ز) غير المصابة S. mucronata. تشير الأسهم إلى خلايا الكولاسيوم. أشرطة المقياس: 200 ميكرومتر (A و B و G) ، و 10 ميكرومتر (C و E و F) ، و 100 ميكرومتر (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: غسل العوالق الحيوانية عن طريق السحب تحت مياه البحيرة المصفاة (FLW). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: واجهة مستخدم برنامج Act2Run . (أ) وقت التعرض لكل خطوة من خطوات الضوء الأكتيني. (ب) عدد الخطوات وتدفق الفوتون للضوء الأكتيني؛ (ج) الجمع بين الطول الموجي للإثارة؛ (د) تسلسل الويشبع والاسترخاء؛ (ه) ترددات وشدة سترة المياه ومضخات خلط العينات؛ (F) تدفق الفوتون من وميض الإثارة عند 444 (يشار إليه باسم 450 هنا) ، 512 (530) ، و 633 نانومتر (624) ، أنبوب المضاعف الضوئي (PMT) الجهد ، ويكرر والفاصل الزمني للتسلسل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: قراءة التألق لعينة الطحالب على برنامج Act2Run. تشير الخطوط الحمراء والزرقاء إلى إشارة التألق الخام من خلال سلسلة من الوميض والمنحنى المناسب في كل من مرحلتي التشبع والاسترخاء ، على التوالي. انظر Kolber et al.2 لمزيد من التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تأثير كثافة S. mucronata على التألق الأساسي. تمثل النقاط الصغيرة النسخ المتماثلة (n = 3). تظهر أيضا نتائج اختبار ANOVA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: آثار كثافات S. mucronata على (A) FO (B) σ PSII، (C) Fv/Fm، و (D) NPQNSV للكولاسيوم sp. خلال مرحلة العوالق. تمثل النقاط الصغيرة النسخ المتماثلة (n = 3). تم استزراع Colacium sp. في وسط AF-6. كما يتم عرض نتائج اختبار ANOVA و Tukey بعد المخصصات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استجابات المقطع العرضي للامتصاص (A,B) والكيمياء الضوئية (C,D) PSII، و(E,F) التبريد غير الكيميائي الضوئي للمرحلة المرفقة (A,C,E) والمرحلة العوالق (B,D,F) من Colacium sp. عند 3 ساعات و21 ساعة بعد إضافة Ca و Mn. تمثل النقاط الصغيرة النسخ المتماثلة (n = 4). كما يتم عرض نتائج اختبار ANOVA و Tukey بعد المخصصات. * ص < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: استجابات الضوء السريع للمقطع العرضي للامتصاص (A ، B) ، (C ، D) PSII الكيمياء الضوئية ، و (E ، F) التبريد غير الكيميائي الضوئي للكولاسيوم sp. في المراحل المرفقة والعوالق إلى بروتوكول الضوء التدريجي عند 3 ساعات بعد إضافة Ca و Mn. ج ، السيطرة ؛ كاليفورنيا ، 200 ميكرومتر مكعب ؛ Mn, 40 μM Mn. فروق معنوية بين (أ) C و Ca، (b) C و Mn و (ج) Ca و Mn عند كل تدفق PAR، مع مستوى دلالة p < 0.05 موضح في كل لوحة. شريط الخطأ، متوسط SD (n = 4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: استجابات الضوء السريع للمقطع العرضي للامتصاص (A,B) ، (C,D) PSII الكيمياء الضوئية ، و (E ، F) التبريد غير الكيميائي الضوئي للكولاسيوم sp. في المراحل المرفقة والعوالق إلى بروتوكول الضوء التدريجي عند 21 ساعة بعد إضافة Ca و Mn. ج ، السيطرة ؛ كاليفورنيا ، 200 ميكرومتر مكعب ؛ Mn, 40 μM Mn. فروق معنوية بين (أ) C و Ca، (b) C و Mn و (ج) Ca و Mn عند كل تدفق PAR، مع مستوى دلالة p < 0.05 موضح في كل لوحة. شريط الخطأ، متوسط SD (n = 4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مصطلح تعريف الوحدات
التألق الأساسي قيمة Fo بدون Chl-a التألق
F' التألق عند الوميض الصفري لقياس دوران واحد عند C>0
فو (ʹ) الحد الأدنى من إنتاجية التألق PSII (تحت ضوء الخلفية) عند الفلاش الصفري
Fv (ʹ) FM (ʹ) - Fo (ʹ)
إف إم (ʹ) الحد الأقصى لإنتاجية التألق PSII (تحت ضوء الخلفية)
Fv / FM أقصى كفاءة كيميائية ضوئية PSII تحت الظلام
Fqʹ/Fmʹ أقصى كفاءة كيميائية ضوئية PSII تحت ضوء الخلفية، (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV تبريد ستيرن-فولمر العادي، FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] تركيز مركز التفاعل
RσPSII (ʹ) احتمال إغلاق RCII خلال الوميض الأول لمرحلة تشبع دوران واحدة (تحت ضوء الخلفية)
σ PSII (ʹ) المقطع العرضي للامتصاص الوظيفي ل PSII لفلاشات الإثارة (تحت ضوء الخلفية) نانومتر2

الجدول 1: المصطلحات المستخدمة في هذا البروتوكول.

مكون كم
نانو 3 140 ملغ· L−1
NH4NO3 22 ملغ · L−1
MgSO4·7H2O 30 ملغ · L−1
KH2PO4 10 ملغ · L−1
K2HPO4 5 ملغ · L−1
CaCl2·2H2O 10 ملغ · L−1
CaCO3 10 ملغ · L−1
فيترات الحديد* 2 ملغ · L−1
حمض الستريك* 2 ملغ · L−1
البيوتين 0.002 ملغ· L−1
فيتامين.B 1 0.01 ملغ · L−1
فيتامين.B 6 0.001 ملغ· L−1
فيتامين.B 12 0.001 ملغ· L−1
المعادن النزرة 1 مل· لتر−1
(FeCl3·6H2O) (1.0 ملغ·مل−1)
(MnCl3·4H2O) (0.4 ملغ·مل−1)
(ZnSO4·7H2O) (0.005 ملغ·مل−1)
(CoCl2·6H2O) (0.002 ملغ·مل−1)
(Na2MoO4) (0.004 ملغ·مل−1)
(Na2-EDTA) (7.5 ملغ·مل−1)

الجدول 2: وصفة لوسط AF-6. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.6. قم بإذابة سيترات Fe-citrate وحمض الستريك في H2O الدافئ بشكل منفصل وأضف HCl (1 mL·L−1) بعد خلط كلا الكواشف. وترد محتويات المعادن النزرة بين قوسين.

تاريخ أخذ العينات نموذج رقم درجة حرارة الماء.
(درجة مئوية) 		كثافة S. mucronata
(الهند.· مل−1)		 كولاسيوم sp. كثافة الخلايا
(الهند.· مل−1)		 σ PSII (nm2) Fv / FM NPQNSV
أبريل 27/2020 رقم 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
حد ذاته 0.22 0.01 0.04
مايو 21/2020 رقم 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
حد ذاته 0.16 0.02 0.06
رقم 3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
حد ذاته 0.09 0.01 0.02
رقم 4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
حد ذاته 0.12 0.00 0.02
يونيو 18/2020 رقم 5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
حد ذاته 0.16 0.02 0.06
رقم 6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
حد ذاته 0.09 0.01 0.02
رقم 7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
حد ذاته 0.12 0.00 0.02
يوليو 20/2020 رقم 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
حد ذاته 0.10 0.00 0.00
دني 3.60 0.55 0.82
س. د. 0.120349 0.03 0.10

الجدول 3: الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. المرفقة على S. mucronata.

تاريخ أخذ العينات نموذج رقم متوسط درجة حرارة النمو (°C) σ PSII (nm2) Fv / FM NPQNSV
مايو 21/2020 رقم 1 التركيز البؤري التلقائي-6 19.4 2.72 0.65 0.53
حد ذاته 0.03 0.00 0.01
يونيو 18/2020 رقم 2 التركيز البؤري التلقائي-6 22.4 3.07 0.55 0.84
حد ذاته 0.08 0.02 0.07
يوليو 20/2020 رقم 3 التركيز البؤري التلقائي-6 27.5 2.90 0.58 0.73
حد ذاته 0.06 0.01 0.02
دني 2.90 0.59 0.70
س. د. 0.18 0.05 0.16

الجدول 4: الفسيولوجيا الضوئية لمرحلة العوالق Colacium sp. تم قياس كل عينة خلال المرحلة الثابتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أظهر هذا البروتوكول لأول مرة أن الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. خلال المرحلة المرفقة في بيئة طبيعية قابلة للمقارنة مع مرحلة العوالق في وسط AF-6. بالإضافة إلى ذلك، لم تؤثر محتويات الأمعاء من S. mucronata الجائعة على خط الأساس وفلورة Chl-a عندما كانت الكثافة ≤5 inds·mL−1 (الشكل 5 والشكل 6). تشير هذه النتائج إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن يقيس الفسيولوجيا الضوئية للكولاسيوم sp. خلال المرحلة المرفقة دون تصحيح تحت وفرة الكائن الحي منخفض الركيزة. ومع ذلك، أظهرت النتائج المستخلصة من الخطوات 3-2-1-3-2-8 أن أعلى وفرة من S. mucronata أثرت على Fv/Fm وNPQNSV تأثيرا كبيرا، ولكن ليس FO و σ PSII (الشكل 4). هنا ، من الممكن أن تؤدي كثافة الكائنات الحية العالية إلى تفاقم الإجهاد البدني على أفراد Colacium sp. وبالتالي تقليل نشاط التمثيل الضوئي. بالنسبة للقياسات تحت وفرة عالية من الكائنات الحية الركيزة أو الأنواع الأخرى ، تتطلب آثار كثافة الكائنات الحية الركيزة على خط الأساس وتألق Chl-a مزيدا من الاهتمام.

تم استخدام FRRfs لدراسة تأثير التلاعب بالمغذيات على تدفق الإلكترون الخطي والتبريد غير الكيميائي الضوئي للعوالق النباتية22,56,57. تظهر النتائج الأولية أن إثراء Ca و Mn يختلف اختلافا كبيرا بين مراحل حياة Colacium sp. (الشكل 7 ، الشكل 8 ، والشكل 9). وعلى وجه التحديد، من الواضح أن المنغنيز قد حسن العائد الكيميائي الضوئي (الأقصى) ل PSII (Fv/Fm وFq′/Fm′) وقلل من تبديد الحرارة (NPQNSV)50 من مراحل العوالق تحت الظلام (الشكل 7D، F) وظروف الضوء (الشكل 8D، F والشكل 9D، F). يمكن أن تنبع هذه النتائج من انخفاض حجم الهوائي على PSII و σ PSII و σ PSII′ (الشكل 7B والشكل 8B) ، مما يقلل من امتصاص الضوء الزائد58,59. ومن شأن قياس حجم الهوائي بالإضافة إلى تدفق الطاقة بين مجمعات PSII أن يسمح بإجراء قياسات أكثر دقة لاستجابة الطحالب10. يسمح هذا البروتوكول أيضا بفحص قيود التمثيل الضوئي بواسطة موارد أخرى. على سبيل المثال، تم فحص قيود النيتروجين والفوسفور في مختلف مجتمعات العوالق النباتية، ولكن ليس في الطحالب الفوقية، على الرغم من الآثار المتوقعة على كولاسيوم 41 والدياتومات البحرية الإبيزويكية60,61. بالإضافة إلى العناصر الغذائية، يمكن للبيئة الخفيفة أن تؤثر بشكل أكبر على توزيع الطحالب الفوقية44.

كما هو موضح في الشكل 7 والشكل 8 والشكل 9 ، يمكننا FRRf من نوع cuvette من فحص التأثيرات الغذائية والضوئية في وقت واحد دون أوقات حضانة طويلة وجهد قياس. يمكن لبروتوكول الضوء التدريجي هذا (الخطوة 6.1.5) أيضا رسم منحنيات الضوء السريع لمعدلات نقل الإلكترون النسبية (rETR = Fq′/Fm′× الضوء) مقابل الضوء كتناظري للإنتاج مقابل منحنيات الضوء62. ومع ذلك ، على الرغم من أنه يمكن تقدير تدفق الإلكترون الخطي في PSII من المعلمات الفسيولوجية الضوئية بواسطة FRRf ، إلا أنه ليس بالضرورة مشابها لمعدل تثبيت الكربون63,64. لتقدير الإنتاج الأولي القائم على الكربون ، يجب فحص متطلبات الإلكترون لكل تثبيت CO2 (Фe ، C) ، والتي يمكن أن تختلف زمنيا ومكانيا 5,48 ، عند تقييم المجتمعات الموضوعية.

إذا كانت شبكة العوالق مسدودة بواسطة الحطام، فقم بالفحص المسبق بواسطة شبكة أكبر، مثل شبكة شبكية مقاس 5 مم، أو اختر العوالق الحيوانية مباشرة من مياه البحيرة باستخدام ماصة بدون ترشيح. تجدر الإشارة إلى أن بعض الأضرار قد تحدث للطحالب المرفقة حتى عندما يتم إجراء الترشيح بلطف باستخدام حجم شبكة كبير نسبيا (200 ميكرومتر). وعلى الرغم من أن النتائج تبين أن الانحراف المعياري لبارامترات PSII كان صغيرا (الجدول 3)، وأن القيم المتوسطة للبارامترات كانت مشابهة جدا لقيم مرحلة العوالق المستزرعة (الجدول 4)، فإن أخذ العينات بدون ترشيح قد يكون مثاليا.

كان هناك قيد آخر لهذه الدراسة يتمثل في اشتقاق σ PSII. يمكن أن يمارس الضوء الأكتيني وتوهين التألق Chl-a تأثيرا كبيرا / تشويها على FRRfs ، والذي يعتمد على عينات رقيقة بصريا لتحديد σ PSII الدقيق 65. على الرغم من أننا أظهرنا أن S. mucronata لم يؤثر على σ PSII لخلايا الكولاسيوم العوالق ، إلا أنه يجب فحصها فيما يتعلق σ PSII لخلايا الكولاسيوم المرفقة. وعلاوة على ذلك، ستكون هناك حاجة إلى عامل تصحيح طيفي (SCF) σ PSII في تقدير الموقع 66 لأن الطول الموجي للإثارة لنظام ACT2 (444 نانومتر) يختلف عن التوزيع الطيفي للبيئة الضوئية في الموقع. بشكل عام ، يتم استخدام تقنية لوحة المرشح لقياس طيف امتصاص Chl-a المحدد لحساب SCF. هذا الإجراء ضروري لتقدير الإنتاجية الأولية للطحالب بواسطة FRRfs. نظرا لأننا لم نتمكن من حصاد ما يكفي من خلايا الكولاسيوم المرفقة خلال فترة الدراسة ، يجب فحص طيف امتصاص Chl-a المحدد في الدراسات المستقبلية.

يجب أن يعتمد تنفيذ FRRf من نوع cuvette على حجم الركيزة لأن الطحالب المحيطة تتطلب مرفقا بالركيزة. على سبيل المثال، قد تتطلب دراسات الطحالب على مواد غير قابلة للتدمير، مثل الصخور67 أو الكائنات الحية الأكبر 26,68 أو الطحالب التكافلية، بما في ذلك Symbiodinium المرتبطة بالشعاب المرجانية الصلبة10,69,70، النوع الغاطس FRRf69. على العكس من ذلك ، إذا كان القاعدي صغيرا بما يكفي لتعليق نفسه في كوفيت ، فقد يكون FRRf من نوع كوفيت كافيا بالإضافة إلى PAM من نوع cuvette ، مثل الطحالب القاعية16،17،18. في الواقع ، استكشفت الدراسات الحديثة FRRf من نوع cuvette لقياس الفسيولوجيا الضوئية للطحالب الجليدية24,25. علاوة على ذلك ، فإن تشغيل وميض الإثارة عند 512 و 633 نانومتر يمكن من التطبيق على البكتيريا الزرقاء مع أصباغ هوائي PSII مختلفة ، و phycoerythrins و phycocyanins ، وبالتالي قمم امتصاص مختلفة مع Chl-a71. نظرا لأن نماذج FRRf الحالية التي تتضمن أطوال موجية متعددة الإثارة هي أدوات مفيدة لفحص الفيزيولوجيا الضوئية للبكتيريا الزرقاء والإنتاجية7,66,72 ، فيجب أن تكون هذه طرق مفيدة لتقييم البكتيريا الزرقاء القاعية ، إذا تم تحسين آثار سمك العينة على المعلمات الفسيولوجية الضوئية65 . في الدراسات المستقبلية ، يجب أن تستهدف FRRfs مجموعة أوسع من الكائنات الحية الخاضعة لإلقاء مزيد من الأفكار حول الآليات المعقدة للفسيولوجيا الضوئية للطحالب عبر الموائل المختلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ أي إفصاحات يعلنها.

Acknowledgments

وحظي هذا العمل بدعم من صندوق البحوث التعاونية من محافظة شيغا المعنون "دراسة عن نوعية المياه وبيئة قاع البحيرة لحماية سلامة البيئة المائية" في إطار المنحة اليابانية للتنشيط الإقليمي وصندوق بحوث البيئة وتطوير التكنولوجيا (رقم 5-1607) التابع لوزارة البيئة في اليابان. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. يود المؤلفون أن يشكروا Enago (www.enago.jp) على مراجعة اللغة الإنجليزية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

Tags

علم الأحياء ، العدد 177 ، FRRf على مقاعد البدلاء ، Colacium sp. ، epibiont ، الطحالب epizoic ، بحيرة Biwa ، الفسيولوجيا الضوئية
قياس الفيزيولوجيا الضوئية للمرحلة المرفقة من <em>الكولاسيوم</em> sp. بواسطة مقياس فلورومتر معدل التكرار السريع من نوع كوفيت
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter