Summary
Rask repetisjonshastighet fluorometer (FRRf) er en gunstig metode for måling av fotosystem II fotofysiologi og primær produktivitet. Her beskriver vi en protokoll for å måle PSII fotofysiologi av epizoisk alge, Colacium sp. på substrat dyreplankton ved hjelp av cuvette-type FRRf.
Abstract
Rask repetisjonshastighet fluorometer (FRRf) er en gunstig metode for måling av fotosystem II (PSII) fotofysiologi og primær produktivitet. Selv om FRRf kan måle PSII absorpsjon tverrsnitt (σ PSII), maksimal fotokjemisk effektivitet (Fv / Fm), effektiv fotokjemisk effektivitet (Fq′/Fm′), og ikke-fotokjemisk slukking (NPQNSV) for ulike eukaryote alger og cyanobakterier, har nesten alle FRRf-studier til dags dato fokusert på planteplankton. Her beskriver protokollen hvordan man måler PSII-fotofysiologi av en epizoisk alge Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), i sitt vedlagte stadium (festet til dyreplankton), ved hjelp av cuvette-type FRRf. Først estimerte vi effekten av substrat zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) på baseline fluorescens og σ PSII, Fv/ Fm, Fq′/Fm′, og NPQNSV av planktonisk Colacium sp. For å validere denne metodikken registrerte vi fotofysiologimålinger av vedlagte Colacium sp. på S. mucronata og sammenlignet disse resultatene med dets planktoniske stadium. Representative resultater viste hvordan protokollen kunne bestemme effekten av kalsium (Ca) og mangan (Mn) på Colacium sp. fotofysiologi og identifisere de ulike effektene av Mn-berikelse mellom vedlagte og planktoniske stadier. Til slutt diskuterer vi tilpasningsevnen til denne protokollen til andre perifytiske alger.
Introduction
Klorofyll variabel fluorescens er et nyttig verktøy for måling av alge fotosystem II (PSII) fotofysiologi. Alger reagerer på ulike miljøspenninger, for eksempel overflødig lys og næringsmangel, ved å endre PSII-fotofysiologien. Rask repetisjonshastighet fluorometer (FRRf) er en vanlig metode for å måle PSII fotofysiologi1,2 og estimere primær produktivitet1,3,4, som muliggjør overvåking av planteplankton PSII fotofysiologi, samt primær produktivitet på tvers av brede romlige og tidsskalaer5,6,7. FRRf kan samtidig måle PSII (σ PSII) absorpsjon tverrsnitt, reaksjonssenter ([RCII]) konsentrasjon, maksimal fotokjemisk effektivitet (Fv/Fm), effektiv fotokjemisk effektivitet (Fq′/Fm′) og ikke-fotokjemisk slukking (NPQNSV) (tabell 1). Generelt er Fv/Fm og Fq′/Fm′ definert som PSII-aktivitet8, mens NPQNSV er definert som relativ varmeavledende energi9.
Viktigst, enkeltomsetning (ST) blinker av FRRf reduserer den primære quinone elektron akseptor, QA, men ikke plastokinon bassenget. På den annen side blinker multippel omsetning (MT) fra et pulsamplitudemodulerings-fluorometer (PAM) som kan redusere begge deler. ST-metoden har en klar fordel i forhold til MT-metoden når du identifiserer den mulige opprinnelsen til NPQNSV ved samtidig måling av utvinning kinetikk av Fv / Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV, og σ PSII10. Til dags dato er flere typer FRRf-instrumenter, for eksempel nedsenkbar type, cuvette-type og flow-through-type, kommersielt tilgjengelige. Frrf av nedsenkbar type muliggjør in situ-målinger i hav og innsjøer, mens cuvette-typen FRRf er egnet for måling av små prøvevolumer. Gjennomstrømningstypen brukes vanligvis til kontinuerlig å måle fotofysiologien til planteplankton i overflatevann.
Gitt utviklingen av PAM fluorometre, inkludert cuvette-typen, for et bredt spekter av fag11, er PAM fluorometre fortsatt mer vanlige enn FRRfs i alge fotofysiologisk forskning12. For eksempel kan Selv om prøvekammerstrukturen og cuvettekapasiteten mellom disse verktøyene bare varierer noe, har cuvette-typen PAM blitt brukt på planteplankton13,14,15, bunnmikroalger16,17,18, isalger19 og epizoiske alger20, mens den cuvette-typen FRRf har blitt brukt primært på planteplankton21,22,2 og et begrenset antall isalgesamfunn24,25. Gitt effektiviteten, er cuvette-type FRRf like aktuelt for bunn- og epizoiske alger. Derfor vil utvidelse av søknaden gi betydelig innsikt i PSII fotofysiologi, spesielt for mindre kjent epizoisk alge fotofysiologi.
Epizoiske alger har fått liten oppmerksomhet, med få studier som undersøker deres PSII-fotofysiologi20,26, mest sannsynlig på grunn av deres mindre roller i akvatiske matbaner27,28. Epibionter, inkludert epizoiske alger, kan imidlertid positivt påvirke dyreplanktonsamfunnsdynamikken, for eksempel økende reproduksjons- og overlevelsesrater29,30, samt negativ innvirkningsprosesser, for eksempel økende synkehastighet29,31 og sårbarhet for visuelle rovdyr32,33,34,35,36 . Derfor er det avgjørende å utforske de miljømessige og biologiske faktorene som kontrollerer epibiontdynamikk i dyreplanktonsamfunn.
Blant epizoiske alger er Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) en vanlig, ferskvanns-, algegruppe32,37,38,39 med ulike livsstadier, inkludert vedlagt (Figur 1A-D), ikke-motil planktonisk (figur 1E,F) og motile planktoniske stadier40,41 . I løpet av det ikke-motile planktoniske stadiet lever celler som encellede planktoner, aggregerte kolonier eller ettlags arkkolonier, dekket av mucilage42. I det vedlagte stadiet bruker Colacium sp. mucilage utskilt fra den fremre enden av cellen37,39,41 for å feste til substratorganismer (basibionts), spesielt mikrocrustaceans41,43. Deres livssyklus innebærer også å løsne fra smeltet eksoskjelett eller død basibiont og svømme med flagellaen for å finne en annen substratorganisme39. Både planktoniske og vedlagte stadier kan øke bestandsstørrelsen ved mitose40. Selv om deres vedlagte stadium er hypoteset om å være et evolusjonært trekk for å samle ressurser, for eksempel light44 og sporstoffer41,45,46, eller som en dispersjonsstrategi27, er det lite eksperimentelt bevis tilgjengelig om disse aspektene37,41,44 og de viktigste vedleggsmekanismene er i stor grad ukjente. For eksempel forventet Rosowski og Kugrens at Colacium får mangan (Mn) fra substrat copepods41, konsentrert i eksoskjelettet47.
Her beskriver vi hvordan du måler PSII fotofysiologi av planktoniske alger og den relaterte søknadsmetoden for målretting av vedlagte alger (feste til dyreplankton) med Colacium sp. celler ved hjelp av cuvette-type FRRf. Vi bruker Act2-systemet utstyrt med tre lysdioder (lysdioder) som gir flash eksitasjonsenergi sentrert ved 444 nm, 512 nm og 633 nm48. Her tilsvarer 444 nm (blå) absorpsjonstoppen av chrophyll a (Chl-a), mens 512 nm (grønn) og 633 nm (oransje) tilsvarer absorpsjonstoppene til henholdsvis fycoerythrin og phycocyanin. Den fluorescerende signaldeteksjonstoppen er 682 nm med 30 nm halv båndbredde. Siden det er vanskelig å finne det planktoniske stadiet av Colacium sp. i naturlige miljøer, ble deres vedlagte stadium samlet inn for forsøkene. Blant de mange substratorganismer, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figur 1A, B, G) er en av de enkleste å håndtere på grunn av deres langsomme svømmehastighet, stor kroppsstørrelse (400-650 μm) og unik oppførsel (hengende opp ned på vannoverflaten). Derfor bruker denne protokollen Colacium sp. festet på S. mucronata som en casestudie av Colacium-basibiont-systemet. For å unngå fluorescens avledet fra tarminnholdet, ble S. mucronata sultet. Som en tidligere studie rapporterte at fluorescenssignalet fra tarminnhold (inntatt alger) viser en fem ganger reduksjon etter 40 min49, forventet vi at 90 min sult ville være nok til å minimere muligheten for tarminnhold fluorescens som påvirker FRRf-målingen med minimale effekter av eksperimentell stress til Colacium sp., for eksempel næringsmangel. Videre ble denne protokollen brukt for å avklare festemekanismen til Colacium sp. og bestemme hvordan to metaller, kalsium (Ca) og mangan (Mn) påvirker fotofysiologien til både planktoniske og vedlagte stadier. Kalsium spiller nøkkelroller i fotosyntetiske veier50 på flere måter, og begge metallene er pålagt å konstruere de oksygen-utviklende kompleksene til PSII51. Ettersom kalsium og mangan er svært konsentrert i karapace av krepsdyr zooplankton47, vi hypoteser at Colacium sp. fotofysiologi kan reagere mer fremtredende på Ca og Mn berikelse i løpet av planktonisk stadium hvis dette livsstadiet får disse elementene fra S. mucronata i det vedlagte stadiet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Prøvetaking
- Samle innsjøvann fra overflaten med en bøtte. For å målrette Colacium sp. festet til S. mucronata (Figur 1A-C) filter 0,5-10 L innsjøvann ved hjelp av en 100 μm nylon mesh net52.
MERK: S. mucronata samles ofte tett i grunne, eutrofiske, gjørmete vann, for eksempel blant reed (phragmites) områder. - Oppbevar de konsentrerte prøvene i 500 ml plastflasker med 350 ml innsjøvann. Hold deg i mørke forhold.
- I laboratoriet, hell prøvevannet i et 500 ml beger og la det bosette seg i noen minutter.
- Filtrer innsjøvannet gjennom et filter på 0,2 μm porestørrelse.
- Plukk opp S. mucronata individer som bruker en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse. Utfør artsidentifikasjon i henhold til Błędzki og Rybak53.
- Overfør dem til en dråpe på 0,2-μm filtrert innsjøvann (FLW) plassert på en glasssklie.
MERK: S. mucronata kan svømme til overflaten eller festes til begerveggen. - Sjekk S. mucronata under lysmikroskopi.
- Vask S. mucronata-personer som bruker FLW (3 dråper eller mer) for å forhindre forurensning fra andre organismer (figur 2).
- Behold S. mucronata ved en in situ temperatur i et vekstkammer under 40 μmol foton·m−2·s−1.
2. Effekter av S . mucronata på baseline fluorescens
-
S. mucronata dyrking
- Plukk opp S. mucronata individer ved hjelp av en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse og vask ved hjelp av FLW, som i trinn 1.8.
- Lufte vann fra springen ved hjelp av en elektrisk luftpumpe via en luftstein i minst 1 uke. Hell 300 ml vann fra ølvann i en 350 ml glassburk.
- Fôr Chlorella (1 mg C·L−1) og vedlikehold ved 20 °C under 40 μmol foton·m−2·s−1 i et vekstkammer.
- Etter ca. 14 dager, plukk opp 5-30 personer ved hjelp av en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse og inokuler dem i 300 ml rent, luftet vann fra springen for å holde mediet friskt.
- Definere FRRf
- Start Act2Run-programvaren.
- Klikk på Alternativer-fanen og velg Act2 FLC (hvite lysdioder) i driftsmodus for å angi aktiniske lysdioder farge.
- Klikk på verdien av Mørk i trinn 1 av innstillingene for fluorescerende lyskurve i hovedvinduet, og skriv inn 30 for å angi varigheten av den mørke perioden (figur 3A).
- Klikk på LED-kombinasjonen B, C og D for å slå av de grønne og oransje lysdiodene (figur 3C).
- Klikk på verdien av Fets og Pitch under Lør, og skriv inn henholdsvis 100 og 2 for å angi antall og tonehøyde for flashlet i metningsfasen (figur 3D).
- Klikk på verdien av Fets og Pitch under Rel, og skriv inn henholdsvis 40 og 60 for å angi antall og tonehøyde for flashlet i avslapningsfasen (figur 3E).
- Aktiver vannjakkepumpen ved å klikke på Under FLC (figur 3F) for å kontrollere prøvetemperaturen under målingen.
- Aktiver ved å klikke på Automatisk LED og Automatisk AVDRAG (figur 3F).
- Klikk Synkroniser for å koble til FRRf-Act2.
- FRRf-målinger
- For å undersøke effekten av zooplankton individer på baseline fluorescens, forberede voksen S. mucronata (kroppsstørrelse 400-650 μm) fra kulturen i trinn 2.1.1-2.1.4 uten vedlagte organismer.
- For å unngå fluorescens fra tarminnholdet, sulte individene i FLW ved 20 °C i minst 90 minutter.
- Hell 1,5 ml FLW i en cuvette. Plukk opp 0, 1, 5 og 10 S. mucronata individer ved hjelp av en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse.
- Overføring S. mucronata individer inn i cuvette og legge FLW for å bringe prøven opp til 2 ml.
- Akklimatisere under svakt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved 20 °C i 15 minutter før FRRf-måling.
- Klikk på Act2 Run for å starte målingen. Gjenta målingene >3 ganger per prøve.
- Les Fo-verdien fra resultatplottet (figur 4).
3. Effekter av substratorganisme på Chl- en fluorescens
-
Colacium sp. dyrking
- Klargjør FLW og AF-6 medium54 for dyrking (tabell 2).
- Samle Colacium sp. festet til S. mucronata som i trinn 1.1 og 1.2 og, hold ved in situ temperatur i et vekstkammer.
- Plukk opp Colacium sp. med en smeltet karapace (figur 1D) ved hjelp av en pipette under et optisk mikroskop ved 100x forstørrelse. Vask dem med FLW, som i trinn 1.8.
- Aseptisk inokulere Colacium sp. og AF-6 medium i et 10 ml glassrør på en ren benk.
- Opprettholde kulturen ved in situ temperatur under 200 μmol photon·m−2·s−1 i et vekstkammer. Rist glassrøret forsiktig for hånd minst en gang per dag for å forhindre celleoppgjør.
MERK: For å holde dempingseffekten av aggregerte kolonier så lav som mulig, kontroller koloniene under et mikroskop før FRRf-måling. Celleaggregering kan forårsake tette kolonier og påvirke alge fotofysiologi55.
- FRRf-målinger
- For å undersøke effekten av zooplankton individer på Chl-a fluorescens fra Colacium sp., forberede voksen S. mucronata (kroppsstørrelse 400-650 μm) uten tilknyttede organismer.
- For å unngå fluorescens fra tarminnholdet, sulte individene i FLW i minst 90 min.
- Sett opp et hurtigrepetisjonshastighetsfluoriometer av cuvette-typen (FRRf).
- Hell en 1,5 ml subsample av precultured Colacium sp. i en cuvette. Overføring 0, 5, 10 og 15 S. mucronata individer i disse cuvettes og tilsett 2 μm filtrert medium for å bringe prøven opp til 2 ml.
- Akklimatiseres under svakt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved 20 °C i 15 minutter før FRRf-målingen foretas.
MERK: Vedlikehold prøvene ved inkubasjonstemperatur under målinger - Klikk på Act2 Run for å starte målingen. Gjenta målingene >3 ganger per prøve.
- Les FO- og FM-verdiene fra resultatplottet (figur 4).
MERK: Kontroller RσPSII-verdien (tabell 1), som viser om LED-effekten er innenfor det optimale området for å estimere PSII-parametrene riktig. Når auto-LED-lampen er aktivert, styrer Act2run-systemet LED-strømmen for å oppnå et optimalt RσPSII-område (0,042-0,064). Den eksperimentelle RσPSII-cut-off-verdien ble definert til 0,03 og 0,08 i en tidligere studie48. - For å korrigere baseline fluorescens22, filtrer kulturmediet ved hjelp av et 0,2-μm porestørrelsesfilter og mål fluorescensen. Trekk FO fra grunnlinjeutvalget fra FO og Fm for Colacium sp., eller endre verdien for Tom rettelse i kategorien Innstillinger i kategorien Alternativer.
4. Fotofysiologi av Colacium sp. (vedlagt stadium)
- Isoler S. mucronata individer med Colacium sp. ved hjelp av en pipette under et optisk mikroskop.
- Vask S. mucronata ved hjelp av FLW, som i trinn 1.8.
- Overføring S. mucronata inn i en 100 ml FLW. For sult, hold under mørke forhold ved in situ temperatur i 90 min.
- Hell 1,5 ml FLW i en cuvette.
- Overføring ~ 10 S. mucronata individer med Colacium sp. inn i en cuvette. For målinger er det nødvendig med mer enn 100 Colacium-celler per 2 ml. Tilsett FLW for å ta med prøven opp til 2 ml.
- Akklimatisere under svakt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved in situ temperatur i 15 min. Mål Chl-a fluorescens som i trinn 3.2.6-3.2.8.
- For å liste opp antall vedlagte celler, fest prøven med glutaraldehyd (2% endelig volum) etter å ha tatt FRRf-målingen. Ta bilder på flere brennvidder og posisjoner av S. mucronata under et lett mikroskop.
5. Fotofysiologi av Colacium sp. (planktonisk stadium)
- Dyrk colacium sp. i AF-6 medium ved in situ temperatur som i trinn 3.1.1-3.1.5.
- For den stasjonære fasen, ta 2 ml dyrket Colacium sp. og hell i en cuvette.
- Akklimatisere under svakt lys (1-10 μmol foton·m−2·s−1) ved in situ temperatur i 15 min. Mål Chl-a fluorescens som i trinn 3.2.6-3.2.8.
6. Effekter av Ca og Mn addisjon på fotofysiologi av Colacium sp.
- Effekter på vedlagt stadium
- Isoler S. mucronata individer med Colacium sp. ved hjelp av en pipette under et optisk mikroskop. Vask med FLW, som i trinn 1.8.
- Overfør seks personer hver til 12 glassbeger med 30 ml FLW. Forsikre deg om at hvert beger inneholder > 100 Colacium sp. celler.
- Tilsett 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca behandling), 40 μmol· L−1 MnCl4 (Mn-behandling) eller ultrarent vann (kontroll) til hvert beger. Inkuber prøvene under 200 μmol foton·m−2 ·s−1 ved in situ temperatur i et vekstkammer.
- Ved 3 timer og 21 timer, overfør alle individer og smeltet skinn til en cuvette med 2 ml av mediet.
- For å undersøke den raske responsen på økende lys, klikk på Opp av periodene med 8 aktiniske lystrinn og skriv inn 20 (figur 3A) for å angi varigheten for hvert trinn i 20 s. Hvis du vil angi det trinnvise aktiniske lyset som 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 og 200 μmol photon·m−2·s−1, klikker du på Høy E og Trinn opp og endrer verdiene til henholdsvis 200 og 34 (figur 3B).
- Etter 15 min mørk akklimatisering måler du Chl-a fluorescens av hver prøve som ligner på trinn 3.2.6-3.2.8.
MERK: Kontroller at verdiene for RσPSII og RσPSII er innenfor det optimale området (0,03-0,08)48.
- Effekter på planktonisk stadium
- Dyrk colacium sp. i AF-6 medium ved in situ temperatur som i trinn 3.1.1-3.1.5.
- Overfør den kultiverte Colacium sp. til FLW og akklima ved in situ temperatur mindre enn 200 μmol photon·m−2·s−1 i 3 dager.
- Overfør 1 ml av de akklimatiserte prøvene til tre hetteglass med 10 ml FLW.
- Tilsett 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (Ca behandling), 40 μmol· L−1 MnCl3 (Mn-behandling) eller ultrarent vann (kontroll) til hetteglass. Inkuber prøvene under 200 μmol foton·m−2·s−1 ved in situ temperatur i et vekstkammer.
- Ved 3 timer og 21 timer måler du Chl-a fluorescens for hver prøve som i trinn 3.2.6-3.2.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var ingen signifikant effekt av baseline fluorescens (figur 5) eller Chl-a fluorescens (figur 6) av S. mucronata opptil 5 personer (inds.) ml−1. Fv/Fm og NPQNSV ble imidlertid betydelig påvirket da S. mucronata var 7,5 inds·mL−1. Derfor, for å måle fotofysiologien til Colacium sp. i det vedlagte stadiet, valgte vi S. mucronata med den høyere byrden av Colacium sp. for å nå tilstrekkelig Colacium sp. overflod (>50 celler·mL−1) og et lavt antall S. mucronata (≤5 inds·mL−1) i cuvette.
Tabell 3 viser sesongvariasjon i fotofysiologien til Colacium sp. i vedlagte fase. Selv om prøvetakingstemperaturen varierte, forble fotofysiologien deres relativt konstant. σ PSII varierte fra 3,42 nm2 til 3,76 nm2 (gjennomsnitt 3,60 nm2), Fv/Fm varierte fra 0,52 til 0,60 (gjennomsnitt 0,55), og NPQNSV varierte fra 0,66 til 0,85 (gjennomsnitt 0,82). For å validere disse resultatene undersøkte vi videre variasjoner i Colacium sp. fotofysiologi under planktonisk stadium for den stasjonære fasen i AF-6-mediet (tabell 4). Gjennomsnittlig Fv/Fm og NPQNSV for vedlagte stadium var lik de i planktonfasen når de inkuberes i AF-6 medium.
For å bestemme effekten av Ca og Mn på Colacium sp. fotofysiologi i både vedlagte og planktoniske stadier, utførte vi Ca og Mn berikelseseksperimenter. Prøver ble tatt fra sivområdet i Biwasjøen 7. For det vedlagte stadiet av Colacium sp. under mørke forhold var det ingen signifikant forskjell i fotofysiologiske parametere blant behandlinger, bortsett fra NPQNSV mellom Mn- og Ca-behandlinger ved 3 timer, hvor Ca < Mn (figur 7A, C, E). Videre viste σ PSII′, Fq′/Fm′, og NPQNSV svar på økende lys i det vedlagte stadiet ingen klare forskjeller mellom behandlinger (figur 8A, C, E og figur 9A, C, E). NPQNSV hadde imidlertid en tendens til å være lavere i Ca-behandlingen enn kontrollen ved lav lysintensitet ved 21 timer (11 og 25 μmol foton·m−2·s−1, figur 9E). For det planktoniske stadiet var σ PSII signifikant lavere i Mn enn Ca-behandlingen ved 3 timer (figur 7B). Fq′/Fm′ var betydelig høyere, men NPQNSV var lavere i Mn-behandlingen enn kontroll ved 21 timer (figur 7D,F). Under økende lys hadde Mn en tendens til å redusere σ PSII og øke Fq′/Fm′ i løpet av planktonisk stadium, sammenlignet med kontrollen ved 3 t (figur 8D). Tilsvarende reduserte Mn NPQNSV betydelig i planktonfasen sammenlignet med kontrollen ved 21 timer (figur 9F). I likhet med vedlagte stadium forbedret kalsium NPQNSV noe for det planktoniske stadiet under økende lys (figur 9F). Ca reduserte imidlertid Fq′/Fm′ og økte NPQNSV for planktonisk stadium sammenlignet med Mn-behandling under 44-200 μmol foton·m−2·s−1 ved 3 t (figur 8D,F).
Figur 1: Colacium sp. og substansorganismen Scapholeberis mucronata. (A) Infisert S. mucronata. (B) Infisert S. mucronata festet med glutaraldehyd. (C) Festet Colacium celler på levende S. mucronata. (D) Festet Colacium celler på smeltet karapace. (E, F) Colacium sp. av planktonisk (palmella) stadium. (G) Ikke-infisert S. mucronata. Piler angir Colacium-celler. Skalastenger: 200 μm (A, B og G), 10 μm (C, E og F) og 100 μm (D). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Vaske dyreplankton ved å pipettere under filtrert innsjøvann (FLW). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Act2Run-programvarens brukergrensesnitt. (A) Eksponeringstid for hvert aktinisk lystrinn; (B) Antall trinn og fotonfluks av aktinisk lys; (C) Kombinasjon av eksitasjonsbølgelengde; (D) Metning og avslapning flashlet sekvens; (E) Frekvenser og intensiteter av vannjakken og prøveblandingspumper; (F) Fotonfluks av eksitasjonsblits ved 444 (betegnet som 450 her), 512 (530) og 633 nm (624), fotomultiplierrør (PMT) spenning, og replikerer og intervall av sekvens. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fluorescensavlesning av algeprøven på Act2Run-programvare. De røde og blå linjene indikerer rå fluorescenssignal ved en sekvens av flashlet og kurvetilpasning i henholdsvis metnings- og avslapningsfaser. Se Kolber et al.2 for mer informasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Effekten av S. mucronata tetthet på baseline fluorescens. De små prikkene representerer replikeringer (n = 3). Resultatene av ANOVA-testen vises også. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Effektene av S. mucronata tettheter på (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm og (D) NPQNSV for Colacium sp. i løpet av planktonfasen. De små prikkene representerer replikeringer (n = 3). Colacium sp. ble dyrket i AF-6 medium. Resultatene av ANOVA og Tukey post-hoc test presenteres også. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Responser av (A,B) absorpsjon tverrsnitt, (C, D) PSII fotokjemi, og (E,F) ikke-fotokjemisk slukking av (A, C, E) festet scenen og (B, D, F) planktonisk stadium av Colacium sp. på 3 h og 21 h etter Ca og Mn tillegg. De små prikkene representerer replikeringer (n = 4). Resultatene av ANOVA og Tukey post-hoc test presenteres også. * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Hurtiglysresponser av (A, B) absorpsjonstrsnitt, (C,D) PSII-fotokjemi og (E,F) ikke-fotokjemisk slukking av Colacium sp. i vedlagte og planktoniske stadier til trinnvis lysprotokoll ved 3 timer etter Ca og Mn tillegg. C, kontroll; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Signifikante forskjeller mellom (a) C og Ca, (b) C og Mn, og (c) Ca og Mn ved hver PAR-flux, med et signifikansnivå på p < 0,05 vist i hvert panel. Feilfelt, gjennomsnittlig SD (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Hurtiglysresponser av (A,B) absorpsjons tverrsnitt, (C,D) PSII-fotokjemi og (E,F) ikke-fotokjemisk slukking av Colacium sp. i vedlagte og planktoniske stadier for å trinnvis lysprotokoll ved 21 timer etter Ca og Mn tillegg. C, kontroll; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Signifikante forskjeller mellom (a) C og Ca, (b) C og Mn, og (c) Ca og Mn ved hver PAR-flux, med et signifikansnivå på p < 0,05 vist i hvert panel. Feilfelt, gjennomsnittlig SD (n = 4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Vilkår | Definisjon | Enheter | |
| Fluorescens ved baseline | Fo-verdi uten Chl-a fluorescens | ||
| F' | Fluorescens ved nullende blits av en enkelt omsetningsmåling når C>0 | ||
| Fo (ʹ) | Minimum PSII fluorescensutbytte (under bakgrunnslys) ved nullende blits | ||
| Sluttverdi (ʹ) | Fm(ʹ) − Fo(ʹ) | ||
| Fm (ʹ) | Maksimal PSII fluorescensutbytte (under bakgrunnslys) | ||
| Sluttverdi/sluttverdi | Maksimal PSII fotokjemisk effektivitet under mørkets frembrudd | ||
| Fq ʹ/Fm ʹ | Maksimal PSII fotokjemisk effektivitet under bakgrunnslys, (Fm ʹ− F)/(Fm ʹ) | ||
| NPQNSV | Normalisert Stern-Volmer-slukking, FO ʹ/(Fm ʹ − FO ʹ) | ||
| [RCII] | Konsentrasjon av reaksjonssenter | ||
| RσPSII (ʹ) | Sannsynligheten for at en RCII lukkes under den første flashleten i en enkelt omsetningsmetningsfase (under bakgrunnslys) | ||
| σ PSII (ʹ) | Funksjonell absorpsjon tverrsnitt av PSII for eksitasjon flashlets (under bakgrunnslys) | nm2 | |
Tabell 1: Termer som brukes i denne protokollen.
| Komponent | Kvantitet |
| NaNO3 | 140 mg· L−1 |
| NH4NO3 | 22 mg· L−1 |
| MgSO4·7H2O | 30 mg· L−1 |
| KH2PO4 | 10 mg· L−1 |
| K2HPO4 | 5 mg· L−1 |
| CaCl2·2H2O | 10 mg· L−1 |
| CaCO3 | 10 mg· L−1 |
| Fe-citrate* | 2 mg· L−1 |
| Sitronsyre* | 2 mg· L−1 |
| Biotin | 0,002 mg· L−1 |
| Vit.B 1 | 0,01 mg· L−1 |
| Vit.B 6 | 0,001 mg· L−1 |
| Vit.B 12 | 0,001 mg· L−1 |
| Spor metaller | 1 ml·L−1 |
| (FeCl3·6H2O) | (1,0 mg·ml−1) |
| (MnCl3·4H2O) | (0,4 mg·ml−1) |
| (ZnSO4·7H2O) | (0,005 mg·ml−1) |
| (CoCl2·6H2O) | (0,002 mg·ml−1) |
| (Na2Moo4) | (0,004 mg·ml−1) |
| (Na2-EDTA) | (7,5 mg·ml−1) |
Tabell 2: Oppskrift på AF-6 medium. Juster pH til 6,6. Løs opp Fe-citrat og sitronsyre i varm H2O separat og tilsett HCl (1 ml·l−1) etter blanding av begge reagensene. Innhold av spormetaller er vist i parentes.
| Dato for prøvetaking | Eksempelnr. |
Vann temp. (°C) |
S. mucronata tetthet (inds.· ml−1) |
Colacium sp. celle tetthet (inds.· ml−1) |
σ PSII (nm2) | Sluttverdi/sluttverdi | NPQNSV |
| april 2020 kl. | Nr. 1 | 14.2 | 4.5 | 77 | 3.42 | 0.60 | 0.66 |
| SE | 0.22 | 0.01 | 0.04 | ||||
| mai 2020 kl. | Nr. 2 | 19.4 | 2 | 282.5 | 3.62 | 0.54 | 0.85 |
| SE | 0.16 | 0.02 | 0.06 | ||||
| Nr.3 | 19.4 | 2 | 250.5 | 3.55 | 0.56 | 0.77 | |
| SE | 0.09 | 0.01 | 0.02 | ||||
| Nr.4 | 19.4 | 5 | 204.5 | 3.76 | 0.52 | 0.94 | |
| SE | 0.12 | 0.00 | 0.02 | ||||
| juni 2020 kl. | Nr.5 | 22.4 | 2.5 | 474 | 3.62 | 0.54 | 0.85 |
| SE | 0.16 | 0.02 | 0.06 | ||||
| Nr.6 | 22.4 | 2 | 410 | 3.55 | 0.56 | 0.77 | |
| SE | 0.09 | 0.01 | 0.02 | ||||
| Nr.7 | 22.4 | 2.5 | 441 | 3.76 | 0.52 | 0.94 | |
| SE | 0.12 | 0.00 | 0.02 | ||||
| Juli 20/2020 | Nr. 8 | 27.5 | 5 | 109 | 3.49 | 0.58 | 0.74 |
| SE | 0.10 | 0.00 | 0.00 | ||||
| Bety | 3.60 | 0.55 | 0.82 | ||||
| S.D. | 0.120349 | 0.03 | 0.10 |
Tabell 3: Fotofysiologi av Colacium sp. festet på S. mucronata.
| Dato for prøvetaking | Eksempelnr. | Middels | Veksttemperatur (°C) | σ PSII (nm2) | Sluttverdi/sluttverdi | NPQNSV |
| mai 2020 kl. | Nr. 1 | AF-6 | 19.4 | 2.72 | 0.65 | 0.53 |
| SE | 0.03 | 0.00 | 0.01 | |||
| juni 2020 kl. | Nr. 2 | AF-6 | 22.4 | 3.07 | 0.55 | 0.84 |
| SE | 0.08 | 0.02 | 0.07 | |||
| Juli 20/2020 | Nr.3 | AF-6 | 27.5 | 2.90 | 0.58 | 0.73 |
| SE | 0.06 | 0.01 | 0.02 | |||
| Bety | 2.90 | 0.59 | 0.70 | |||
| S.D. | 0.18 | 0.05 | 0.16 |
Tabell 4: Fotofysiologi av Colacium sp. planktonic stadium. Hver prøve ble målt i den stasjonære fasen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen demonstrerte for første gang at fotofysiologien til Colacium sp. i løpet av det vedlagte stadiet i et naturlig miljø er sammenlignbar med dets planktoniske stadium i AF-6 medium. I tillegg påvirket ikke tarminnholdet i sultet S. mucronata baseline og Chl-a fluorescens når tettheten ble ≤5 inds·mL−1 (figur 5 og figur 6). Disse resultatene antyder at denne protokollen kan måle fotofysiologi av Colacium sp. i det vedlagte stadiet uten korreksjon under lav substratorganisme overflod. Resultatene fra trinn 3.2.1-3.2.8 viste imidlertid at den høyeste S. mucronata-overfloden påvirket Fv/Fm og NPQNSV betydelig, men ikke FO og σ PSII (figur 4). Her er det mulig høyere organismetetthet forverret fysisk stress på Colacium sp. individer og deretter redusert fotosyntetisk aktivitet. For målinger under en høy overflod av substratorganismer eller andre arter krever effekten av substratorganismetetthet på grunnlinjen og Chl-a fluorescens ytterligere oppmerksomhet.
FRRfs har blitt brukt til å undersøke virkningen av næringsmanipulasjon på den lineære elektronstrømmen og ikke-fotokjemisk slukking av planteplankton22,56,57. De primære resultatene viser at Ca og Mn berikelse var signifikant forskjellig mellom Colacium sp. livsstadier (figur 7, figur 8 og figur 9). Spesielt forbedret mangan klart det (maksimale) fotokjemiske utbyttet til PSII (Fv/Fm og Fq′/Fm′) og reduserte varmespredningen (NPQNSV)50 av planktoniske stadier under mørke (figur 7D,F) og lysforhold (figur 8D,F og figur 9D,F). Disse resultatene kan stamme fra redusert antennestørrelse på PSII, σ PSII og σ PSII′ (figur 7B og figur 8B), noe som reduserer overflødig lysabsorpsjon58,59. Måling av antennestørrelse i tillegg til energiflyt mellom PSII-komplekser vil tillate mer presise målinger av algeresponsen10. Denne protokollen tillater også undersøkelse av fotosyntesebegrensninger av andre ressurser. For eksempel har nitrogen- og fosforbegrensninger blitt undersøkt i ulike planteplanktonsamfunn, men ikke i epizoiske alger, til tross for predikerte effekter på Colacium41 og marine epizoiske diatomer60,61. I tillegg til næringsstoffer kan lysmiljøet ytterligere påvirke epizoiske algerfordeling44.
Som vist i figur 7, figur 8 og figur 9, gjør cuvette-type FRRf oss i stand til samtidig å undersøke nærings- og lyseffekter uten lange inkubasjonstider og måleinnsats. Denne trinnvise lysprotokollen (trinn 6.1.5) kan også trekke hurtiglyskurver av relative elektrontransporthastigheter (rETR = Fq′/Fm′× lys) vs. lys som en analog for produksjon vs. lyskurver62. Men selv om lineær elektronstrøm i PSII kan estimeres fra fotofysiologiske parametere av FRRf, er det ikke nødvendigvis analogt med karbonfikseringsraten63,64. For estimering av karbonbasert primærproduksjon bør elektronbehov per CO2-fiksering (Ф e, C), som kan variere timelig og romlig5,48, undersøkes ved vurdering av fagmiljøer.
Hvis planktonnettet er tilstoppet av rusk, kan du forhåndsscreene med et større nett, for eksempel et 5 mm nettingnett, eller plukke dyreplankton direkte fra innsjøvannet ved hjelp av en pipette uten filtrering. Det skal bemerkes at det kan oppstå noen skader på de vedlagte alger selv når filtreringen utføres forsiktig ved hjelp av en relativt stor (200 μm) maskestørrelse. Selv om resultatene viser at standardavviket for PSII-parametrene var lite (tabell 3), og gjennomsnittsverdiene til parametrene var svært lik de i det dyrkede planktoniske stadiet (tabell 4), kan prøvetaking uten filtrering være ideelle.
En annen begrensning i denne studien var å utlede σ PSII. Aktinisk lys og Chl-a fluorescensdemping kan utøve stor påvirkning/forvrengning på FRRFene, som er avhengig av optisk tynne prøver for nøyaktig σ PSII-bestemmelse65. Selv om vi viste at S. mucronata ikke påvirket σ PSII av planktoniske Colacium-celler, bør det undersøkes relatert til σ PSII av de vedlagte Colacium-cellene. Videre vil det være behov for en spektral korreksjonsfaktor (SCF) for σ PSII in situ66-estimering ettersom eksitasjonsbølgelengden til ACT2-systemet (444 nm) er forskjellig fra spektralfordelingen av in situ-lysmiljøet. Generelt brukes filterputeteknikken til å måle Chl-et spesifikt absorpsjonsspekter for å beregne SCF. Denne prosedyren er nødvendig for å estimere alge primærproduktivitet av FRRfs. Siden vi ikke kunne høste nok vedlagte Colacium-celler gjennom studieperioden, bør Chl-et spesifikt absorpsjonsspekter undersøkes i fremtidige studier.
Implementering av cuvette-type FRRf bør avhenge av substratstørrelse, da perifytiske alger krever et substratfeste. For eksempel kan studier av alger på uforgjengelige stoffer, som bergarter67, større organismer26,68 eller symbiotiske alger, inkludert Symbiodinium forbundet med harde koraller10,69,70, kreve den nedsenkbare typen FRRf69. Motsatt, hvis basibiont er liten nok til å suspendere seg selv i en cuvette, kan en cuvette-type FRRf være tilstrekkelig i tillegg til en cuvette-type PAM, for eksempel bunnalger16,17,18. Faktisk har nyere studier utforsket en cuvette-type FRRf for å måle fotofysiologien til isalger24,25. Ved å slå på eksitasjonsblitsen ved 512 og 633 nm kan applikasjonen også brukes til cyanobakterier med forskjellige PSII-antennepigmenter, fykoerythriner og fykocyaniner, og dermed forskjellige absorpsjonstopper med Chl-a71. Ettersom nåværende FRRf-modeller som inkorporerer bølgelengder med flere eksitasjoner er nyttige verktøy for å undersøke cyanobakterier fotofysiologi og produktivitet7,66,72, bør disse være nyttige metoder for å vurdere bunncyobakterier, hvis effekten av prøvetykkelse på fotofysiologiske parametere ville bli forbedret65 . I fremtidige studier bør FRRfs være rettet mot et bredere spekter av fagorganismer for å kaste ytterligere innsikt i de komplekse mekanismene for alge fotofysiologi på tvers av ulike habitater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å erklære.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av Collaborative Research Fund fra Shiga Prefecture med tittelen "Study on water quality and lake-bottom environment for the protection of the soundness of water environment" under det japanske bevilgningen til regional revitalisering og Miljøforsknings- og teknologiutviklingsfondet (nr. 5-1607) fra Miljøverndepartementet, Japan. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Forfatterne vil takke Enago (www.enago.jp) for den engelske språkanmeldelsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrodisc syringe filter | Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA | 0.2 μm pore size | |
| Act2Run | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
| Biotin | Wako | 023-08711 | AF-6 medium |
| CaCl2·2H2O | Wako | 031-25031 | AF-6 medium |
| CaCO3 | Wako | 036-00382 | AF-6 medium |
| Citric acid | Wako | 036-05522 | AF-6 medium |
| CoCl2·6H2O | Wako | 036-03682 | AF-6 medium |
| Concentrated Chlorella | Recenttec, Tokyo, Japan | 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C | |
| FastOcean Act2 | CTG Ltd., West Molesey, UK | ||
| Fe-citrate | Wako | 093-00952 | AF-6 medium |
| FeCl3·6H2O | Wako | 091-00872 | AF-6 medium |
| HCLP-880PF | Nippon Medical and Chemical Instruments Co., Ltd., Osaka, Japan |
With LED light bulbs | |
| K2HPO4 | Wako | 160-04292 | AF-6 medium |
| KH2PO4 | Wako | 167-04241 | AF-6 medium |
| MgSO4·7H2O | Wako | 137-00402 | AF-6 medium |
| MnCl3·4H2O | Wako | 139-00722 | AF-6 medium |
| Na2EDTA | Wako | 343-01861 | AF-6 medium |
| Na2MoO4 | Wako | 196-02472 | AF-6 medium |
| NaNO3 | Wako | 191-02542 | AF-6 medium |
| NH4NO3 | Wako | 015-03231 | AF-6 medium |
| Plankton Counter | Matsunami Glass, Osaka, Japan | S6300 | |
| Pylex test tube | CTG Ltd., West Molesey, UK | With rim, 16 x 100 mm | |
| Vit. B1 | Wako | 203-00851 | AF-6 medium |
| Vit. B12 | Wako | 226-00343 | AF-6 medium |
| Vit. B6 | Wako | 165-05401 | AF-6 medium |
| ZnSO4·7H2O | Wako | 264-00402 | AF-6 medium |
References
- Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
- Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
- Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
- Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
- Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
- Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
- Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
- Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
- McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
- Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
- Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
- Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
- Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
- Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
- Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
- Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
- McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
- Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
- McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
- Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
- Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
- Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
- Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
- Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
- Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
- Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
- Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
- Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
- Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
- Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
- Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
- Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
- Green, J.
- Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
- Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
- Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
- Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
- Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
- Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
- Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
- Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
- Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
- Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
- Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
- Pringsheim, E. G.
- Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
- Martin, J. H., Knauer, G. A.
- Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
- Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
- Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X.
- Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
- Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
- Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
- Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
- Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
- Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
- Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
- Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
- Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
- Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
- Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
- Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
- Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
- Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
- Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
- Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
- Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
- Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
- Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
- Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
- Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
- Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).
