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Mesure de la photophysiologie du stade attaché de Colacium sp. par un fluoromètre à taux de répétition rapide de type cuvette

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Le fluoromètre à taux de répétition rapide (FRRf) est une méthode bénéfique pour mesurer la photophysiologie du photosystème II et la productivité primaire. Nous décrivons ici un protocole pour mesurer la photophysiologie PSII de l’algue épizoïque, Colacium sp. sur substrat zooplancton en utilisant FRRf de type cuvette.

Abstract

Le fluoromètre à taux de répétition rapide (FRRf) est une méthode bénéfique pour mesurer la photophysiologie du photosystème II (PSII) et la productivité primaire. Bien que frRf puisse mesurer la section transversale d’absorption psiI (σ PSII), l’efficacité photochimique maximale (Fv / Fm), l’efficacité photochimique efficace (Fq ′ / Fm ′ ) et la trempe non photochimique (NPQNSV) pour diverses algues eucaryotes et cyanobactéries, presque toutes les études FRRf à ce jour se sont concentrées sur le phytoplancton. Ici, le protocole décrit comment mesurer la photophysiologie PSII d’une algue épizoïque Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), dans son stade attaché (attaché au zooplancton), en utilisant frRf de type cuvette. Tout d’abord, nous avons estimé les effets du zooplancton substrat (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) sur la fluorescence de base et σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′ et NPQNSV de Colacium sp planctonique. Pour valider cette méthodologie, nous avons enregistré des mesures photophysiologiques de Colacium sp. attaché sur S. mucronata et comparé ces résultats avec son stade planctonique. Des résultats représentatifs ont montré comment le protocole pouvait déterminer les effets du calcium (Ca) et du manganèse (Mn) sur la photophysiologie de Colacium sp. et identifier les divers effets de l’enrichissement en Mn entre les stades attaché et planctonique. Enfin, nous discutons de l’adaptabilité de ce protocole à d’autres algues périphytes.

Introduction

La fluorescence variable de la chlorophylle est un outil utile pour mesurer la photophysiologie du photosystème algal II (PSII). Les algues réagissent à divers stress environnementaux, tels que l’excès de lumière et la carence en nutriments, en modifiant leur photophysiologie PSII. Le fluoromètre à taux de répétition rapide (FRRf) est une méthode courante pour mesurer la photophysiologie PSII1,2 et estimer la productivité primaire1,3,4, ce qui permet de surveiller la photophysiologie PSII du phytoplancton, ainsi que la productivité primaire sur de larges échelles spatiales et temporelles5,6,7. FRRf peut mesurer simultanément la section transversale d’absorption PSII (σ PSII), la concentration du centre de réaction ([RCII]), l’efficacité photochimique maximale (Fv/Fm), l’efficacité photochimique efficace (Fq′/Fm′) et la trempe non photochimique (NPQNSV) (tableau 1). En général, Fv/Fm et Fq′/Fm′ sont définis comme une activité PSII8, tandis que NPQNSV est défini comme une énergie relative dissipée par la chaleur9.

Il est important de noter que les flashs de FRRf à renouvellement unique (ST) réduisent complètement l’accepteur d’électrons de quinone primaire, QA, mais pas le pool de plastoquinone. Inversement, les flashs à rotation multiple (MT) d’un fluoromètre à modulation d’amplitude d’impulsion (PAM) peuvent réduire les deux. La méthode ST présente un net avantage par rapport à la méthode MT lors de l’identification des origines possibles du NPQNSV en mesurant simultanément la cinétique de récupération de Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV et σ PSII10. À ce jour, plusieurs types d’instruments FRRf, tels que le type submersible, le type cuvette et le type flow-through, sont disponibles dans le commerce. Le FRRf de type submersible permet des mesures in situ dans les océans et les lacs, tandis que le FRRf de type cuvette convient à la mesure de petits volumes d’échantillons. Le type d’écoulement est couramment utilisé pour mesurer en continu la photophysiologie du phytoplancton dans les eaux de surface.

Compte tenu du développement des fluoromètres PAM, y compris le type cuvette, pour un large éventail de sujets11, les fluoromètres PAM sont encore plus courants que les FRRfs dans la recherche en photophysiologie des algues12. Par exemple, bien que la structure de la chambre d’échantillonnage et la capacité de la cuvette entre ces outils ne diffèrent que légèrement, le PAM de type cuvette a été appliqué aux phytoplanctones13,14,15, aux microalgues benthiques16,17,18, aux algues de glace19 et aux algues épizoïques20, tandis que le FRRf de type cuvette a été appliqué principalement aux phytoplanctonons21,22,23 et un nombre limité de communautés d’algues de glace24,25. Compte tenu de son efficacité, le FRRf de type cuvette est également applicable aux algues benthiques et épizoïques. Par conséquent, l’élargissement de son application fournira des informations considérables sur la photophysiologie PSII, en particulier pour la photophysiologie des algues épizoïques moins connue.

Les algues épizoïques ont reçu peu d’attention, avec peu d’études examinant leur photophysiologie PSII20,26, probablement en raison de leur rôle mineur dans les réseaux trophiques aquatiques27,28. Cependant, les épibiotes, y compris les algues épizoïques, peuvent influencer positivement la dynamique des communautés de zooplancton, comme l’augmentation des taux de reproduction et de survie29,30, ainsi que les processus d’impact négatif, tels que l’augmentation du taux de naufrage29,31 et la vulnérabilité aux prédateurs visuels32,33,34,35,36 . Par conséquent, il est crucial d’explorer les facteurs environnementaux et biologiques contrôlant la dynamique des épibiotes dans les communautés de zooplancton.

Parmi les algues épizoïques, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) est un groupe algal commun d’eau douce32,37,38,39 avec différents stades de vie, y compris attaché (Figure 1A-D), planctonique non mobile (Figure 1E,F) et planctonique mobile40,41 . Au cours de la phase planctonique non mobile, les cellules vivent sous forme de planctons unicellulaires, de colonies agrégées ou de colonies de feuilles à une couche, recouvertes de mucilage42. Au stade attaché, Colacium sp. utilise le mucilage excrété de l’extrémité antérieure de la cellule37,39,41 pour se fixer aux organismes du substrat (basibiontes), en particulier les microcrustacés41,43. Leur cycle de vie implique également de se détacher de l’exosquelette en mue ou du basibiont mort et de nager avec leurs flagelles pour trouver un autre organisme substrat39. Les stades planctoniques et attachés peuvent augmenter la taille de leur population par mitose40. Bien que leur stade attaché soit supposé être un trait évolutif pour la collecte de ressources, telles que la lumière44 et les oligo-éléments41,45,46, ou comme une stratégie de dispersion27, peu de preuves expérimentales sont disponibles sur ces aspects37,41,44 et les principaux mécanismes d’attachement sont largement inconnus. Par exemple, Rosowski et Kugrens s’attendaient à ce que Colacium obtienne du manganèse (Mn) à partir de copépodes de substrat41, concentrés dans l’exosquelette47.

Ici, nous décrivons comment mesurer la photophysiologie PSII des algues planctoniques et la méthode d’application connexe pour cibler les algues attachées (se fixant au zooplancton) avec des cellules Colacium sp. en utilisant le FRRf de type cuvette. Nous utilisons le système Act2 équipé de trois diodes électroluminescentes (LED) qui fournissent une énergie d’excitation flash centrée à 444 nm, 512 nm et 633 nm48. Ici, 444 nm (bleu) correspond au pic d’absorption de la chrophylle a (Chl-a), tandis que 512 nm (vert) et 633 nm (orange) correspondent aux pics d’absorption de la phycoérythrine et de la phycocyanine, respectivement. Le pic de détection du signal fluorescent est de 682 nm avec une demi-bande passante de 30 nm. Comme il est difficile de trouver le stade planctonique de Colacium sp. dans les environnements naturels, leur stade attaché a été collecté pour les expériences. Parmi les nombreux organismes substrats, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figure 1A, B, G) est l’un des plus simples à manipuler en raison de sa vitesse de nage lente, de sa grande taille corporelle (400-650 μm) et de son comportement unique (suspendu à l’envers à la surface de l’eau). Par conséquent, ce protocole utilise Colacium sp. attaché sur S. mucronata comme étude de cas du système Colacium-basibiont. Pour éviter la fluorescence dérivée du contenu intestinal, S. mucronata était affamé. Comme une étude précédente a rapporté que le signal de fluorescence du contenu intestinal (algues ingérées) affiche une diminution de cinq fois après 40 min49, nous nous attendions à ce que 90 min de famine soient suffisants pour minimiser la possibilité que la fluorescence du contenu intestinal affecte la mesure FRRf avec un minimum d’effets de stress expérimental sur Colacium sp., tels qu’une carence en nutriments. En outre, ce protocole a été appliqué pour clarifier le mécanisme de fixation de Colacium sp. et déterminer comment deux métaux, le calcium (Ca) et le manganèse (Mn) affectent la photophysiologie des stades planctonique et attaché. Le calcium joue un rôle clé dans les voies photosynthétiques50 de multiples façons, et les deux métaux sont nécessaires pour construire les complexes évolutifs en oxygène du PSII51. Comme le calcium et le manganèse sont très concentrés dans la carapace du zooplancton des crustacés47, nous émettons l’hypothèse que la photophysiologie de Colacium sp. pourrait répondre plus en évidence à l’enrichissement en Ca et Mn au cours de la phase planctonique si cette étape de la vie obtient ces éléments de S. mucronata pendant la phase attachée.

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Protocol

1. Échantillonnage

  1. Recueillez l’eau du lac à la surface par un seau. Pour cibler Colacium sp. attaché à S. mucronata (Figure 1A-C), filtrez 0,5 à 10 L d’eau du lac à l’aide d’un filet en maille de nylon de 100 μm52.
    REMARQUE: S. mucronata s’agrège souvent densément dans les eaux peu profondes, eutrophes et boueuses, comme parmi les zones de roseaux (phragmites).
  2. Conservez les échantillons concentrés dans des bouteilles en plastique de 500 mL avec 350 mL d’eau de lac. Conserver dans l’obscurité.
  3. En laboratoire, versez l’eau de l’échantillon dans un bécher de 500 ml et laissez-le reposer pendant quelques minutes.
  4. Filtrer l’eau du lac à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,2 μm.
  5. Ramasser S. les individus mucronata utilisant une pipette sous un microscope optique à un grossissement de 100x. Effectuer l’identification des espèces selon Błędzki et Rybak53.
  6. Transférez-les dans une goutte d’eau de lac filtrée (FLW) de 0,2 μm placée sur une lame de verre.
    REMARQUE : S. mucronata peut nager à la surface ou s’attacher à la paroi du bécher.
  7. Cochez S. mucronata en microscopie optique.
  8. Laver S. les personnes mucronata utilisant le FLW (3 gouttes ou plus) pour prévenir la contamination par d’autres organismes (figure 2).
  9. Gardez S. mucronata à une température in situ dans une chambre de croissance inférieure à 40 μmol photon·m−2·s−1.

2. Effets de S . mucronata sur fluorescence de base

  1. S. culture de mucronata
    1. Ramasser les individus de S. mucronata à l’aide d’une pipette sous un microscope optique à un grossissement de 100x et laver à l’aide de FLW, comme à l’étape 1.8.
    2. Aérer l’eau du robinet à l’aide d’une pompe à air électrique via une pierre à air pendant au moins 1 semaine. Versez 300 mL d’eau du robinet aérée dans un bocal en verre de 350 mL.
    3. Nourrir la Chlorella (1 mg C·L−1) et maintenir à 20 °C sous 40 μmol photon·m−2·s−1 dans une chambre de croissance.
    4. Après environ 14 jours, ramassez 5 à 30 personnes à l’aide d’une pipette sous un microscope optique à un grossissement de 100x et inoculez-les dans 300 mL d’eau du robinet propre et aérée pour garder le milieu frais.
  2. Configuration de FRRf
    1. Lancez le logiciel Act2Run.
    2. Cliquez sur l’onglet Options et sélectionnez Act2 FLC (LED blanches) en mode de fonctionnement pour définir la couleur des LED actiniques.
    3. Cliquez sur la valeur Sombre à l’étape 1 des paramètres de la courbe de lumière fluorescente dans la fenêtre principale, puis tapez 30 pour définir la durée de la période d’obscurité (Figure 3A).
    4. Cliquez sur la combinaison de LED B, C et D pour éteindre les LED vertes et oranges (Figure 3C).
    5. Cliquez sur la valeur Fets et Pitch sous Sat, et tapez 100 et 2, respectivement, pour définir le nombre et le pas de flashlet dans la phase de saturation (Figure 3D).
    6. Cliquez sur la valeur fets et pitch sous Rel, et tapez respectivement 40 et 60 pour définir le nombre et le pas de l’éclair dans la phase de relaxation (Figure 3E).
    7. Activez la pompe à enveloppe d’eau en cliquant sur Pendant le FLC (Figure 3F) pour contrôler la température de l’échantillon pendant la mesure.
    8. Activez en cliquant sur Auto-LED et Auto-PMT (Figure 3F).
    9. Cliquez sur Synchroniser pour connecter FRRf-Act2.
  3. Mesures FRRf
    1. Pour examiner les effets des individus zooplanctoniques sur la fluorescence initiale, préparez S adulte. mucronata (taille corporelle 400-650 μm) de la culture aux étapes 2.1.1-2.1.4 sans aucun organisme attaché.
    2. Pour éviter la fluorescence du contenu intestinal, affamer les individus en FLW à 20 ° C pendant au moins 90 minutes.
    3. Verser 1,5 mL de FLW dans une cuvette. Détectez 0, 1, 5 et 10 personnes S. mucronata à l’aide d’une pipette sous un microscope optique à un grossissement de 100x.
    4. Transfert S. mucronata dans la cuvette et ajouter FLW pour porter l’échantillon à 2 mL.
    5. S’acclimater en basse lumière (photon de 1-10 μmol·m−2·s−1) à 20 °C pendant 15 min avant la mesure FRRf.
    6. Cliquez sur Act2 Run pour lancer la mesure. Répétez les mesures >3 fois par échantillon.
    7. Lisez la valeur Fo du graphique des résultats (Figure 4).

3. Effets de l’organisme du substrat sur la fluorescence Chl- a

  1. Culture de Colacium sp.
    1. Préparer le milieu FLW et AF-654 pour la culture (tableau 2).
    2. Recueillir Colacium sp. attaché à S. mucronata comme aux étapes 1.1 et 1.2 et maintenir à température in situ dans une chambre de croissance.
    3. Ramasser Colacium sp. avec une carapace fondue (Figure 1D) à l’aide d’une pipette sous un microscope optique à un grossissement de 100x. Lavez-les avec FLW, comme à l’étape 1.8.
    4. Inoculer de manière aseptique Colacium sp. et AF-6 dans un tube de verre de 10 mL sur un banc propre.
    5. Maintenir la culture à une température in situ inférieure à 200 μmol photon·m−2·s−1 dans une chambre de croissance. Secouez doucement le tube de verre à la main au moins une fois par jour pour éviter le tassement cellulaire.
      REMARQUE: Pour maintenir l’effet d’atténuation des colonies agrégées aussi bas que possible, vérifiez les colonies au microscope avant la mesure FRRf. L’agrégation cellulaire peut provoquer des colonies denses et affecter la photophysiologie des algues55.
  2. Mesures FRRf
    1. Pour examiner les effets des individus zooplanctoniques sur la fluorescence Chl-a de Colacium sp., préparez S adulte. mucronata (taille corporelle 400-650 μm) sans aucun organisme attaché.
    2. Pour éviter la fluorescence du contenu intestinal, affamer les individus en FLW pendant au moins 90 minutes.
    3. Installez un fluoromètre à taux de répétition rapide (FRRf) de type cuvette.
    4. Verser un sous-échantillon de 1,5 mL de Colacium sp. préculé dans une cuvette. Transfert 0, 5, 10 et 15 S. Les individus mucronata dans ces cuvettes et ajoutent 2 μm de milieu filtré pour porter l’échantillon à 2 mL.
    5. Acclimater sous faible luminosité (photon·m−2·s−1) de 1-10 μmol à 20 °C pendant 15 min avant de prendre la mesure FRRf.
      REMARQUE: Maintenir les échantillons à la température d’incubation pendant les mesures
    6. Cliquez sur Act2 Run pour lancer la mesure. Répétez les mesures >3 fois par échantillon.
    7. Lisez les valeurs FO et Fm du graphique des résultats (Figure 4).
      REMARQUE: Vérifiez la valeur RσPSII (Tableau 1), qui indique si la puissance du VOYANT est dans la plage optimale pour estimer correctement les paramètres PSII. Lorsque l’Auto-LED est activé, le système Act2run contrôle la puissance de la LED pour atteindre une plage RσPSII optimale (0,042-0,064). La valeur seuil expérimentale de RσPSII a été définie à 0,03 et 0,08 dans une étude précédente48.
    8. Pour corriger la fluorescence de base22, filtrez le milieu de culture à l’aide d’un filtre de la taille d’un pore de 0,2 μm et mesurez la fluorescence. Soustrayez FO de l’échantillon de base de FO et Fm de Colacium sp., ou modifiez la valeur de correction Blank dans les Paramètres de l’onglet Options.

4. Photophysiologie de Colacium sp. (étage attaché)

  1. Isoler les individus de S. mucronata avec Colacium sp. à l’aide d’une pipette au microscope optique.
  2. Laver S. mucronata utilisant FLW, comme à l’étape 1.8.
  3. Transfert S. mucronata dans un 100 mL de FLW. Pour la famine, conserver dans des conditions sombres à température in situ pendant 90 min.
  4. Verser 1,5 mL de FLW dans une cuvette.
  5. Transfert ~10 S. mucronata individus avec Colacium sp. dans une cuvette. Pour les mesures, plus de 100 cellules Colacium par 2 mL sont nécessaires. Ajouter FLW pour porter l’échantillon à 2 mL.
  6. Acclimater sous basse lumière (photon de 1-10 μmol·m−2·s−1) à température in situ pendant 15 min. Mesurer la fluorescence Chl-a comme aux étapes 3.2.6-3.2.8.
  7. Pour dénombrer le nombre de cellules attachées, fixez l’échantillon avec du glutaraldéhyde (2% du volume final) après avoir pris la mesure FRRf. Prenez des photos à plusieurs profondeurs focales et positions de S. mucronata sous un microscope optique.

5. Photophysiologie de Colacium sp. (stade planctonique)

  1. Cultiver Colacium sp. échantillonné dans un milieu AF-6 à température in situ comme aux étapes 3.1.1-3.1.5.
  2. Pour la phase stationnaire, prendre 2 mL de Colacium sp. cultivé et verser dans une cuvette.
  3. Acclimater sous basse lumière (photon de 1-10 μmol·m−2·s−1) à température in situ pendant 15 min. Mesurer la fluorescence Chl-a comme aux étapes 3.2.6-3.2.8.

6. Effets de l’addition de Ca et de Mn sur la photophysiologie de Colacium sp.

  1. Effets sur la scène attachée
    1. Isoler les individus de S. mucronata avec Colacium sp. à l’aide d’une pipette au microscope optique. Laver à l’aide de FLW, comme à l’étape 1.8.
    2. Transférer six individus chacun dans 12 béchers en verre avec 30 mL de FLW. Assurez-vous que chaque bécher contient >100 cellules Colacium sp.
    3. Ajouter 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (traitement au Ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (traitement Mn), ou eau ultrapure (contrôle) à chaque bécher. Incuber les échantillons sous 200 μmol photon·m−2 ·s−1 à température in situ dans une chambre de croissance.
    4. À 3 h et 21 h, transférer tous les individus et les peaux muées dans une cuvette avec 2 mL du milieu.
    5. Pour examiner la réponse rapide à l’augmentation de la lumière, cliquez sur Haut des périodes de 8 pas de lumière actinique et tapez 20 (Figure 3A) pour définir la durée de chaque étape en 20 s. Pour définir la lumière actinique par étapes sur 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 et 200 μmol photon·m−2·s−1, cliquez sur High E et Step Up et modifiez les valeurs à 200 et 34, respectivement (Figure 3B).
    6. Après 15 min d’acclimatation à l’obscurité, mesurez la fluorescence Chl-a de chaque échantillon de manière similaire aux étapes 3.2.6-3.2.8.
      REMARQUE : Vérifiez que les valeurs RσPSII et RσPSII se situent dans la plage optimale (0,03-0,08)48.
  2. Effets sur le stade planctonique
    1. Cultiver Colacium sp. échantillonné dans un milieu AF-6 à température in situ comme aux étapes 3.1.1-3.1.5.
    2. Transférer le Colacium sp. cultivé dans flW et s’acclimater à une température in situ inférieure à 200 μmol photon·m−2·s−1 pendant 3 jours.
    3. Transférer 1 mL des échantillons acclimatés dans trois flacons en verre contenant 10 mL de FLW.
    4. Ajouter 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (traitement au Ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (traitement Mn), ou eau ultrapure (contrôle) aux flacons. Incuber les échantillons sous 200 μmol photon·m−2·s−1 à température in situ dans une chambre de croissance.
    5. À 3 h et 21 h, mesurer la fluorescence Chl-a de chaque échantillon comme aux étapes 3.2.6-3.2.8.

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Representative Results

Il n’y avait pas d’effet significatif de la fluorescence initiale (Figure 5) ou de la fluorescence Chl-a (Figure 6) par S. mucronata jusqu’à 5 individus (inds.) mL−1. Cependant, Fv/Fm et NPQNSV ont été significativement affectés lorsque S. mucronata était de 7,5 inds·mL−1. Par conséquent, pour mesurer la photophysiologie de Colacium sp. au cours de la phase attachée, nous avons choisi S. mucronata avec la charge plus élevée de Colacium sp. afin d’atteindre une abondance suffisante de Colacium sp. (>50 cellules·mL−1) et un faible nombre de S. mucronata (≤5 inds·mL−1) dans la cuvette.

Le tableau 3 montre la variation saisonnière de la photophysiologie de Colacium sp. au cours de la phase attachée. Bien que la température d’échantillonnage ait varié, leur photophysiologie est restée relativement constante. σ PSII variait de 3,42 nm2 à 3,76 nm2 (moyenne de 3,60 nm2), Fv/Fm variait de 0,52 à 0,60 (moyenne de 0,55) et NPQNSV variait de 0,66 à 0,85 (moyenne de 0,82). Pour valider ces résultats, nous avons étudié plus en détail les variations de la photophysiologie de Colacium sp. au cours de la phase planctonique pour la phase stationnaire dans le milieu AF-6 (tableau 4). Les moyennes Fv/Fm et NPQNSV pour l’étage attaché étaient similaires à celles de l’étage planctonique lorsqu’elles étaient incubées dans un milieu AF-6.

Pour déterminer l’effet du Ca et du Mn sur la photophysiologie de Colacium sp. aux stades attaché et planctonique, nous avons effectué des expériences d’enrichissement en Ca et Mn. Des échantillons ont été prélevés dans la zone de roseaux du lac Biwa le 7 mai 2021. Pour le stade attaché de Colacium sp. dans des conditions sombres, il n’y avait pas de différence significative dans les paramètres photophysiologiques entre les traitements, à l’exception du NPQNSV entre les traitements Mn et Ca à 3 h, où Ca < Mn (Figure 7A, C, E). De plus, σ réponses DEPSII′, Fq′/Fm′ et NPQNSV à l’augmentation de la lumière au cours de la phase attachée n’ont montré aucune différence claire entre les traitements (Figure 8A,C,E et Figure 9A,C,E). Cependant, le NPQNSV avait tendance à être plus faible dans le traitement Ca que dans le témoin à faible intensité lumineuse à 21 h (photon de 11 et 25 μmol·m−2·s−1, figure 9E). Pour le stade planctonique, σ PSII était significativement plus faible dans le traitement mn que ca à 3 h (figure 7B). Fq′/Fm′ était significativement plus élevé, mais le NPQNSV était plus faible dans le traitement Mn que dans le contrôle à 21 h (Figure 7D,F). Sous une lumière croissante, mn avait tendance à diminuer σ PSII et à augmenter Fq′/Fm′ au cours de la phase planctonique, par rapport au témoin à 3 h (figure 8D). De même, mn a significativement réduit le NPQNSV au cours de la phase planctonique par rapport au témoin à 21 h (figure 9F). Semblable à l’étage attaché, le calcium a légèrement amélioré le NPQNSV pour l’étage planctonique sous une lumière croissante (Figure 9F). Cependant, le Ca a diminué Fq′/Fm′ et augmenté le NPQNSV pour le stade planctonique par rapport au traitement Mn sous photon·m−2·s−1 de 44-200 μmol à 3 h (Figure 8D,F).

Figure 1
Figure 1 : Colacium sp. et organisme-substance Scapholeberis mucronata. (A) S. mucronata infecté. B) S. mucronata infecté fixé avec du glutaraldéhyde. (C) Cellules de Colacium attachées sur S. mucronata vivant. (D) Cellules de colacium attachées sur la carapace fondue. (E, F) Colacium sp. de stade planctonique (palmella). G) S. mucronata non infecté. Les flèches indiquent les cellules de Colacium. Barres d’échelle : 200 μm (A, B et G), 10 μm (C, E et F) et 100 μm (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Lavage du zooplancton par pipetage sous l’eau filtrée du lac (FLW). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Interface utilisateur du logiciel Act2Run. (A) Temps d’exposition à chaque pas de lumière actinique ; (B) Nombre d’étapes et flux de photons de la lumière actinique; C) Combinaison de la longueur d’onde d’excitation; D) Séquence d’éclats de saturation et de relaxation; E) Fréquences et intensités de la gaine d’eau et des pompes de mélange d’échantillons; (F) Flux de photons du flash d’excitation à 444 (noté 450 ici), 512 (530) et 633 nm (624), tension du tube photomultiplicateur (PMT), et répliques et intervalle de séquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Lecture par fluorescence de l’échantillon d’algues sur le logiciel Act2Run. Les lignes rouge et bleue indiquent le signal de fluorescence brut par une séquence d’ajustement de plaquettes et de courbes dans les phases de saturation et de relaxation, respectivement. Voir Kolber et al.2 pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Effet de la densité de S. mucronata sur la fluorescence de base. Les petits points représentent des répliques (n = 3). Les résultats du test ANOVA sont également présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Les effets des densités de S. mucronata sur (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm et (D) NPQNSV pour Colacium sp. au cours de la phase planctonique. Les petits points représentent des répliques (n = 3). Colacium sp. a été cultivé en milieu AF-6. Les résultats des tests post-hoc ANOVA et Tukey sont également présentés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Réponses de la section transversale d’absorption (A,B), de la photochimie PSII (C,D) et de la trempe non photochimique (E,F) de l’étage attaché (A,C,E) et de l’étape planctonique (B,D,F) de Colacium sp. à 3 h et 21 h après addition de Ca et Mn. Les petits points représentent les répliques (n = 4). Les résultats des tests post-hoc ANOVA et Tukey sont également présentés. * p < 0,05. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Réponses lumineuses rapides de la section transversale d’absorption (A, B), de la photochimie PSII (C, D) et de la trempe non photochimique (E, F) de Colacium sp. dans les stades attachés et planctoniques au protocole de lumière par étapes à 3 h après l’addition de Ca et Mn. C, contrôle; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Différences significatives entre (a) C et Ca, (b) C et Mn, et (c) Ca et Mn à chaque flux PAR, avec un niveau de signification de p < 0,05 indiqué dans chaque panneau. Barre d’erreur, Moyenne SD (n = 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Réponses rapides à la lumière de la section transversale d’absorption (A,B), de la photochimie PSII (C,D) et de la trempe non photochimique (E,F) de Colacium sp. dans les stades attachés et planctoniques au protocole de lumière par étapes à 21 h après l’addition de Ca et Mn. C, contrôle; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Différences significatives entre (a) C et Ca, (b) C et Mn, et (c) Ca et Mn à chaque flux PAR, avec un niveau de signification de p < 0,05 indiqué dans chaque panneau. Barre d’erreur, Moyenne SD (n = 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Terme Définition Unités
Fluorescence de base Valeur Fo sans fluorescence Chl-a
F' Fluorescence à zéro flashlet d’une seule mesure de rotation lorsque C>0
Fo (ʹ) Rendement minimum de fluorescence PSII (sous lumière de fond) à zéro flashlet
Fv (ʹ) Fm(ʹ) − Fo(ʹ)
Fm (ʹ) Rendement maximal en fluorescence PSII (sous lumière de fond)
Fv/Fm Efficacité photochimique PSII maximale dans l’obscurité
Fqʹ/Fmʹ Efficacité photochimique PSII maximale sous lumière de fond, (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV Trempe Stern-Volmer normalisée, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] Concentration du centre de réaction
RσPSII (ʹ) Probabilité qu’un RCII soit fermé lors de la première éclair d’une seule phase de saturation de rotation (sous lumière de fond)
σ PSII (ʹ) Section transversale d’absorption fonctionnelle du PSII pour les plaquettes d’excitation (sous lumière de fond) nm2

Tableau 1 : Termes utilisés dans le présent protocole.

Composant Quantité
NaNO3 140 mg· L−1
NH4NO3 22 mg· L−1
MgSO4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 10 mg· L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 10 mg· L−1
F-citrate* 2 mg· L−1
Acide citrique* 2 mg· L−1
Biotine 0,002 mg· L−1
Vit.B 1 0,01 mg· L−1
Vit.B 6 0,001 mg· L−1
Vit.B 12 0,001 mg· L−1
Métaux traces 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0,002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·mL−1)

Tableau 2 : Recette du support AF-6. Ajuster le pH à 6,6. Dissoudre séparément le citrate de fe et l’acide citrique dans du H2O chaud et ajouter le HCl (1 mL·L−1) après avoir mélangé les deux réactifs. Le contenu des métaux traces est indiqué entre parenthèses.

Date d’échantillonnage N° d’échantillon Température de l’eau.
(°C) 		Densité de S. mucronata
(inds.· mL−1)		 Colacium sp. densité cellulaire
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
27 avril 2020 N° 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
21 mai 2020 N° 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
N°3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
N°4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
18 juin 2020 N°5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
N°6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
N°7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
20 juillet 2020 N° 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Méchant 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tableau 3 : Photophysiologie de Colacium sp. attaché sur S. mucronata.

Date d’échantillonnage N° d’échantillon Douleur moyenne Température de croissance (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
21 mai 2020 N° 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
18 juin 2020 N° 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
20 juillet 2020 N°3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Méchant 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tableau 4 : Photophysiologie du stade planctonique de Colacium sp. Chaque échantillon a été mesuré pendant la phase stationnaire.

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Discussion

Ce protocole a démontré pour la première fois que la photophysiologie de Colacium sp. pendant la phase attachée dans un environnement naturel est comparable à son stade planctonique en milieu AF-6. De plus, le contenu intestinal de S. mucronata affamé n’a pas affecté la fluorescence initiale et Chl-a lorsque la densité était de ≤5 inds·mL−1 (Figure 5 et Figure 6). Ces résultats suggèrent que ce protocole peut mesurer la photophysiologie de Colacium sp. pendant la phase attachée sans correction sous une faible abondance d’organismes du substrat. Cependant, les résultats des étapes 3.2.1 à 3.2.8 ont montré que l’abondance la plus élevée de S. mucronata affectait Fv/Fm et NPQNSV de manière significative, mais pas FO et σ PSII (Figure 4). Ici, il est possible qu’une densité d’organisme plus élevée ait exacerbé le stress physique sur les individus de Colacium sp. et ait ensuite diminué l’activité photosynthétique. Pour les mesures sous une abondance élevée d’organismes de substrat ou d’autres espèces, les effets de la densité de l’organisme du substrat sur la ligne de base et la fluorescence Chl-a nécessitent une attention plus approfondie.

Les FRRfs ont été utilisés pour examiner l’impact de la manipulation des nutriments sur le flux linéaire d’électrons et la trempe non photochimique du phytoplancton22,56,57. Les premiers résultats montrent que l’enrichissement en Ca et en Mn différait significativement entre les stades de vie de Colacium sp. (Figure 7, Figure 8 et Figure 9). Plus précisément, le manganèse a clairement amélioré le rendement photochimique (maximal) du PSII (Fv/Fm et Fq′/Fm′) et diminué la dissipation thermique (NPQNSV)50 des étages planctoniques dans des conditions sombres (Figure 7D,F) et lumineuses (Figure 8D,F et Figure 9D,F). Ces résultats peuvent provenir de la réduction de la taille de l’antenne sur PSII, σ PSII et σ PSII′ (Figure 7B et Figure 8B), ce qui réduit l’absorption excessive de lumière58,59. La mesure de la taille de l’antenne en plus du flux d’énergie entre les complexes PSII permettrait des mesures plus précises de la réponse algale10. Ce protocole permet également l’examen des limitations de la photosynthèse par d’autres ressources. Par exemple, les limitations d’azote et de phosphore ont été examinées dans diverses communautés de phytoplancton, mais pas chez les algues épizoïques, malgré les effets prévus sur Colacium41 et les diatomées épizoïques marines60,61. En plus des nutriments, l’environnement lumineux peut influencer davantage la distribution des algues épizoïques44.

Comme le montrent la figure 7, la figure 8 et la figure 9, le FRRf de type cuvette nous permet d’examiner simultanément les effets des nutriments et de la lumière sans longs temps d’incubation ni effort de mesure. Ce protocole de lumière par étapes (étape 6.1.5) peut également dessiner des courbes de lumière rapide des taux de transport relatifs d’électrons (rETR = Fq′/Fm′× lumière) par rapport à la lumière en tant qu’analogue pour la production par rapport aux courbes de lumière62. Cependant, bien que le flux linéaire d’électrons dans le PSII puisse être estimé à partir de paramètres photophysiologiques par le FRRf, il n’est pas nécessairement analogue au taux de fixation du carbone63,64. Pour estimer la production primaire à base de carbone, les besoins en électrons par fixation du CO2 (Фe, C), qui peuvent varier dans le temps et dans l’espace5,48, devraient être examinés lors de l’évaluation des communautés de sujets.

Si le filet planctonique est obstrué par des débris, préfiltrez par un maillage plus grand, tel qu’un filet maillé de 5 mm, ou préposez les zooplanctons directement dans l’eau du lac à l’aide d’une pipette sans filtration. Il convient de noter que certains dommages peuvent survenir aux algues attachées même lorsque la filtration est menée doucement à l’aide d’un maillage relativement grand (200 μm). Bien que les résultats montrent que l’écart-type des paramètres PSII était faible (tableau 3) et que les valeurs moyennes des paramètres étaient très similaires à celles du stade planctonique cultivé (tableau 4), l’échantillonnage sans filtration pourrait être idéal.

Une autre limite de cette étude était la dérivation σ PSII. La lumière actinique et l’atténuation de fluorescence Chl-a peuvent exercer une influence/distorsion majeure sur les FRRfs, qui reposent sur des échantillons optiquement minces pour la détermination précise de σ PSII65. Bien que nous ayons montré que S. mucronata n’affectait pas la σ PSII des cellules planctoniques de Colacium, cela devrait être examiné en relation avec la σ PSII des cellules de Colacium attachées. En outre, un facteur de correction spectrale (SCF) serait nécessaire pour l’estimation in situ σ PSII66 car la longueur d’onde d’excitation du système ACT2 (444 nm) diffère de la distribution spectrale de l’environnement lumineux in situ. En général, la technique du tampon filtrant est utilisée pour mesurer le spectre d’absorption spécifique de Chl-a afin de calculer le SCF. Cette procédure est nécessaire pour estimer la productivité primaire des algues par les FRRfs. Comme nous n’avons pas pu récolter suffisamment de cellules Colacium attachées au cours de la période d’étude, le spectre d’absorption spécifique de Chl-a devrait être examiné dans de futures études.

La mise en œuvre de FRRf de type cuvette devrait dépendre de la taille du substrat, car les algues périphytes nécessitent une fixation du substrat. Par exemple, les études d’algues sur des substances indestructibles, telles que des roches67, des organismes plus gros26,68 ou des algues symbiotiques, y compris Symbiodinium associée à des coraux durs10,69,70, pourraient nécessiter le FRRf69 de type submersible. Inversement, si le basibiont est assez petit pour se suspendre dans une cuvette, un FRRf de type cuvette pourrait suffire en plus d’un PAM de type cuvette, comme les algues benthiques16,17,18. En effet, des études récentes ont exploré un FRRf de type cuvette pour mesurer la photophysiologie des algues de glace24,25. De plus, l’activation du flash d’excitation à 512 et 633 nm permet l’application aux cyanobactéries avec différents pigments d’antenne PSII, phycoérythrines et phycocyanines, et donc différents pics d’absorption avec Chl-a71. Étant donné que les modèles FRRf actuels incorporant des longueurs d’onde multi-excitation sont des outils utiles pour examiner la photophysiologie et la productivité des cyanobactéries7,66,72, ces méthodes devraient être utiles pour évaluer les cyanobactéries benthiques, si les effets de l’épaisseur de l’échantillon sur les paramètres photophysiologiques étaient améliorés65 . Dans les études futures, les FRRfs devraient viser un plus large éventail d’organismes sujets afin de mieux comprendre les mécanismes complexes de la photophysiologie des algues dans divers habitats.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucune divulgation à déclarer.

Acknowledgments

Le travail a été soutenu par le Fonds de recherche collaborative de la préfecture de Shiga intitulé « Étude sur la qualité de l’eau et l’environnement de fond de lac pour la protection de la solidité de l’environnement aquatique » dans le cadre de la subvention japonaise pour la revitalisation régionale et du Fonds de recherche et de développement technologique pour l’environnement (n° 5-1607) du Ministère de l’environnement du Japon. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Les auteurs tiennent à remercier Enago (www.enago.jp) pour la revue en langue anglaise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie numéro 177 FRRf de paillasse Colacium sp. épibiote algues épizoïques lac Biwa photophysiologie
Mesure de la photophysiologie du stade attaché de <em>Colacium</em> sp. par un fluoromètre à taux de répétition rapide de type cuvette
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

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