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Biology

Messung der Photophysiologie des angeschlossenen Stadiums von Colacium sp. mit einem Küvetten-Fluorometer mit schneller Wiederholungsrate

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Das Fast Repetition Rate Fluorometer (FRRf) ist eine nützliche Methode zur Messung der Photophysiologie des Photosystems II und der Primärproduktivität. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der PSII-Photophysiologie der Epizoenalge Colacium sp. auf Substratzooplankton mit Küvettentyp FRRf.

Abstract

Das Fast Repetition Rate Fluorometer (FRRf) ist eine nützliche Methode zur Messung der Photophysiologie und Primärproduktivität des Photosystems II (PSII). Obwohl FRRf den PSII-Absorptionsquerschnitt (σ PSII), die maximale photochemische Effizienz (Fv/Fm), die effektive photochemische Effizienz (Fq′/Fm′) und die nicht-photochemische Abschreckung (NPQNSV) für verschiedene eukaryotische Algen und Cyanobakterien messen kann, haben sich fast alle FRRf-Studien bisher auf Phytoplankton konzentriert. Hier beschreibt das Protokoll, wie die PSII-Photophysiologie einer Epizoenalge Colacium sp gemessen werden kann. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), in seinem angehängten Stadium (an Zooplankton befestigt), unter Verwendung von FRRf vom Küvettentyp. Zunächst schätzten wir die Auswirkungen von Substrat-Zooplankton (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) auf die Baseline-Fluoreszenz und σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′ und NPQNSV von planktonischer Colacium sp. Um diese Methodik zu validieren, haben wir photophysiologische Messungen von angehängtem Colacium sp. an S. mucronata aufgezeichnet und diese Ergebnisse mit seinem planktonischen Stadium verglichen. Repräsentative Ergebnisse zeigten, wie das Protokoll die Auswirkungen von Calcium (Ca) und Mangan (Mn) auf die Photophysiologie von Colacium sp. bestimmen und die verschiedenen Auswirkungen der Mn-Anreicherung zwischen angeschlossenen und planktonischen Stadien identifizieren konnte. Schließlich diskutieren wir die Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls an andere periphytische Algen.

Introduction

Die variable Fluoreszenz des Chlorophylls ist ein nützliches Werkzeug zur Messung der Photophysiologie des Algenphotosystems II (PSII). Algen reagieren auf verschiedene Umweltbelastungen wie überschüssiges Licht und Nährstoffmangel, indem sie ihre PSII-Photophysiologie verändern. Das Fast Repetition Rate Fluorometer (FRRf) ist eine gängige Methode zur Messung der PSII-Photophysiologie1,2 und zur Schätzung der Primärproduktivität1,3,4, die die Überwachung der Phytoplankton-PSII-Photophysiologie sowie der Primärproduktivität über weite räumliche und zeitliche Skalen ermöglicht5,6,7. FRRf kann gleichzeitig den PSII (σ PSII)-Absorptionsquerschnitt, die Reaktionszentrumskonzentration ([RCII]), die maximale photochemische Effizienz (Fv/Fm), die effektive photochemische Effizienz (Fq′/Fm′) und die nicht-photochemische Abschreckung (NPQNSV) messen (Tabelle 1). Im Allgemeinen werden Fv/Fm und Fq′/Fm′ als PSII-Aktivität8 definiert, während NPQNSV als relative wärmeabgeführte Energie definiert ist9.

Wichtig ist, dass Einzelumsatzblitze (ST) von FRRf den primären Chinonelektronenakzeptor, QA, vollständig reduzieren, aber nicht den Plastochinonpool. Umgekehrt können Mehrfachumsatzblitze (MT) von einem PAM-Fluorometer (Pulse Amplitude Modulation) beide reduzieren. Die ST-Methode hat einen klaren Vorteil gegenüber der MT-Methode bei der Identifizierung der möglichen Ursprünge von NPQNSV durch gleichzeitige Messung der Rückgewinnungskinetik von Fv/Fm, Fq′/Fm′, NPQNSV und σ PSII10. Bis heute sind verschiedene Arten von FRRf-Instrumenten, wie z. B. Tauch-, Küvetten- und Durchfluss-Typ, im Handel erhältlich. Der Tauchtyp FRRf ermöglicht In-situ-Messungen in Ozeanen und Seen, während der Küvettentyp FRRf für die Messung kleiner Probenvolumina geeignet ist. Der Durchflusstyp wird häufig verwendet, um die Photophysiologie von Phytoplankton in Oberflächengewässern kontinuierlich zu messen.

Angesichts der Entwicklung von PAM-Fluorometern, einschließlich des Küvettentyps, für ein breites Spektrum von Probanden11, sind PAM-Fluorometer in der algenphotophysiologischen Forschung immer noch häufiger als FRRfs12. Obwohl sich beispielsweise die Probenkammerstruktur und die Küvettenkapazität zwischen diesen Werkzeugen nur geringfügig unterscheiden, wurde das PAM vom Küvettentyp auf Phytoplankton13,14,15, benthische Mikroalgen16,17,18, Eisalgen19 und epizoische Algen20 angewendet, während die FRRf vom Küvettentyp hauptsächlich auf Phytoplankton21,22,23 angewendet wurde. und eine begrenzte Anzahl von Eisalgengemeinschaften24,25. Aufgrund seiner Wirksamkeit ist der Küvettentyp FRRf gleichermaßen auf benthische und epizoische Algen anwendbar. Daher wird die Erweiterung seiner Anwendung erhebliche Einblicke in die PSII-Photophysiologie geben, insbesondere für die weniger bekannte Epizoikaalgen-Photophysiologie.

Epizoische Algen haben wenig Aufmerksamkeit erhalten, wobei nur wenige Studien ihre PSII-Photophysiologie untersuchten20,26, höchstwahrscheinlich aufgrund ihrer geringen Rolle in aquatischen Nahrungsnetzen27,28. Epibionten, einschließlich epizoischer Algen, können jedoch die Dynamik der Zooplanktongemeinschaft, wie z. B. die Erhöhung der Fortpflanzungs- und Überlebensraten29,30, positiv beeinflussen und Prozesse wie die Erhöhung der Absinkrate29,31 und die Anfälligkeit für visuelle Raubtiere negativ beeinflussen32,33,34,35,36 . Daher ist die Erforschung der Umwelt- und biologischen Faktoren, die die Epibiontendynamik in Zooplanktongemeinschaften steuern, von entscheidender Bedeutung.

Unter den epizoischen Algen ist Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) eine häufige Süßwasser-Algengruppe32,37,38,39 mit verschiedenen Lebensstadien, einschließlich angehängter (Abbildung 1A-D), nicht beweglicher planktonischer (Abbildung 1E,F) und beweglicher planktonischer Stadien40,41 . Während des nicht-beweglichen Planktonstadiums leben Zellen als einzellige Plankton, aggregierte Kolonien oder einschichtige Blattkolonien, die von Schleim bedeckt sind42. Im angehängten Stadium verwendet Colacium sp. Schleim, der vom vorderen Ende der Zelle ausgeschieden wird37,39,41, um sich an Substratorganismen (Basibionts), insbesondere Mikrokrebse41,43, zu binden. Ihr Lebenszyklus besteht auch darin, sich vom gehäuteten Exoskelett oder toten Basibiont zu lösen und mit ihren Flagellen zu schwimmen, um einen anderen Substratorganismus zu finden39. Sowohl planktonische als auch angehängte Stadien können ihre Populationsgröße um Mitose erhöhen40. Obwohl angenommen wird, dass ihr angehängtes Stadium ein evolutionäres Merkmal für die Sammlung von Ressourcen wie Licht44 und Spurenelementen41,45,46 oder als Ausbreitungsstrategie27 ist, gibt es nur wenige experimentelle Beweise für diese Aspekte37,41,44 und die wichtigsten Bindungsmechanismen sind weitgehend unbekannt. Zum Beispiel erwarteten Rosowski und Kugrens, dass Colacium Mangan (Mn) aus Substrat-Copepoden41 gewinnt, die im Exoskelett konzentriert sind47.

Hier beschreiben wir, wie die PSII-Photophysiologie von Planktonalgen gemessen werden kann und die damit verbundene Applikationsmethode für das Targeting von angehängten Algen (an Zooplankton bindend) mit Colacium sp.-Zellen unter Verwendung des Küvettentyps FRRf. Wir verwenden das Act2-System, das mit drei Leuchtdioden (LEDs) ausgestattet ist, die eine Blitzanregungsenergie mit einer Mitte von 444 nm, 512 nm und 633 nm48 liefern. Dabei entspricht 444 nm (blau) dem Absorptionspeak von Chrophyll a (Chl-a), während 512 nm (grün) und 633 nm (orange) den Absorptionspeaks von Phycoerythrin bzw. Phycocyanin entsprechen. Der Fluoreszenzsignal-Detektionspeak beträgt 682 nm bei 30 nm halber Bandbreite. Da es schwierig ist, das planktonische Stadium von Colacium sp. in natürlichen Umgebungen zu finden, wurde ihre angeschlossene Stufe für die Experimente gesammelt. Unter den zahlreichen Substratorganismen ist Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Abbildung 1A, B, G) ist aufgrund ihrer langsamen Schwimmgeschwindigkeit, ihrer großen Körpergröße (400-650 μm) und ihres einzigartigen Verhaltens (kopfüber auf der Wasseroberfläche hängend) eine der einfachsten zu handhaben. Daher verwendet dieses Protokoll Colacium sp., das an S. mucronata angebracht ist, als Fallstudie des Colacium-Basibont-Systems. Um Fluoreszenz aus dem Darminhalt zu vermeiden, wurde S. mucronata ausgehungert. Da eine frühere Studie berichtete, dass das Fluoreszenzsignal von Darminhalten (aufgenommene Algen) nach 40 min49 eine fünffache Abnahme aufweist, erwarteten wir, dass 90 Minuten Hunger ausreichen würden, um die Möglichkeit einer Darminhaltfluoreszenz, die die FRRf-Messung beeinflusst, mit minimalen Auswirkungen von experimentellem Stress auf Colacium sp., wie Nährstoffmangel, zu minimieren. Darüber hinaus wurde dieses Protokoll angewendet, um den Bindungsmechanismus von Colacium sp. zu klären und zu bestimmen, wie zwei Metalle, Calcium (Ca) und Mangan (Mn), die Photophysiologie sowohl planktonischer als auch angeschlossener Stadien beeinflussen. Kalzium spielt auf vielfältige Weise eine Schlüsselrolle in den Photosynthesewegen50, und beide Metalle werden benötigt, um die sauerstoffentwickelnden Komplexe des PSII51 zu konstruieren. Da Calcium und Mangan im Panzer des Krebstier-Zooplanktons47 hoch konzentriert sind, vermuten wir, dass die Photophysiologie von Colacium sp. während des planktonischen Stadiums stärker auf die Anreicherung von Ca und Mn reagieren könnte, wenn dieses Lebensstadium diese Elemente während des angehängten Stadiums aus S. mucronata erhält.

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Protocol

1. Probenahme

  1. Sammeln Sie Seewasser von der Oberfläche mit einem Eimer. Um Colacium sp. an S. mucronata (Abbildung 1A-C) zu richten, filtern Sie 0,5-10 l Seewasser mit einem 100 μm Nylonnetz net52.
    HINWEIS: S. mucronata aggregiert oft dicht in flachem, eutrophem, schlammigem Wasser, wie z.B. in Schilfgebieten (Phragmiten).
  2. Lagern Sie die konzentrierten Proben in 500 mL Plastikflaschen mit 350 mL Seewasser. Bei Dunkelheit aufbewahren.
  3. Gießen Sie im Labor das Probenwasser in ein 500-ml-Becherglas und lassen Sie es einige Minuten absetzen.
  4. Filtern Sie das Seewasser durch einen 0,2 μm porengroßen Filter.
  5. S. abholen Mucronata-Personen, die eine Pipette unter einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung verwenden. Führen Sie die Artbestimmung nach Błędzki und Rybak53 durch.
  6. Übertragen Sie sie in einen Tropfen von 0,2 μm gefiltertem Seewasser (FLW), das auf einem Glasobjektträger platziert wird.
    HINWEIS: S. Mucronata kann an die Oberfläche schwimmen oder sich an der Becherwand befestigen.
  7. Prüfen Sie S. mucronata unter Lichtmikroskopie.
  8. Waschen S. Mucronata-Personen, die FLW (3 Tropfen oder mehr) verwenden, um eine Kontamination durch andere Organismen zu verhindern (Abbildung 2).
  9. S. behalten Mucronata bei einer in situ Temperatur in einer Wachstumskammer unter 40 μmol Photon·m−2·s−1.

2. Wirkungen von S . Mucronata auf Baseline-Fluoreszenz

  1. S. Mucronata-Anbau
    1. Nehmen Sie S. mucronata-Personen mit einer Pipette unter einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung auf und waschen Sie sie mit FLW, wie in Schritt 1.8.
    2. Belüften Sie Leitungswasser mit einer elektrischen Luftpumpe über einen Luftstein für mindestens 1 Woche. Gießen Sie 300 ml belüftetes Leitungswasser in ein 350 ml Glasgefäß.
    3. Füttern Sie Chlorella (1 mg C·L−1) und halten Sie bei 20 °C unter 40 μmol Photon·m−2·s−1 in einer Wachstumskammer.
    4. Nach etwa 14 Tagen nehmen Sie 5-30 Personen mit einer Pipette unter einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung auf und impfen Sie sie in 300 ml sauberes, belüftetes Leitungswasser, um das Medium frisch zu halten.
  2. FRRf einrichten
    1. Starten Sie die Act2Run-Software.
    2. Klicken Sie auf die Registerkarte Optionen und wählen Sie Act2 FLC (weiße LEDs) im Betriebsmodus , um die aktinische LED-Farbe einzustellen.
    3. Klicken Sie in Schritt 1 der Einstellungen der Fluoreszenz-Licht-Kurve im Hauptfenster auf den Wert von Dark und geben Sie 30 ein, um die Dauer der Dunkelperiode einzustellen (Abbildung 3A).
    4. Klicken Sie auf die LED-Kombination B, C und D , um die grünen und orangefarbenen LEDs auszuschalten (Abbildung 3C).
    5. Klicken Sie auf den Wert von Fets und Pitch unter Sat und geben Sie 100 bzw. 2 ein, um die Anzahl und Tonhöhe der Flashlet in der Sättigungsphase einzustellen (Abbildung 3D).
    6. Klicken Sie unter Rel auf den Wert von Fets und Pitch und geben Sie 40 bzw. 60 ein, um die Anzahl und Tonhöhe der Flashlet in der Entspannungsphase festzulegen (Abbildung 3E).
    7. Aktivieren Sie die Wassermantelpumpe, indem Sie auf Während der FLC (Abbildung 3F) klicken, um die Probentemperatur während der Messung zu steuern.
    8. Aktivieren Sie die Aktivierung, indem Sie auf Auto-LED und Auto-PMT klicken (Abbildung 3F).
    9. Klicken Sie auf Synchronisieren, um FRRf-Act2 zu verbinden.
  3. FRRf-Messungen
    1. Um die Auswirkungen von Zooplankton-Individuen auf die Fluoreszenz zu untersuchen, bereiten Sie erwachsene S vor. Mucronata (Körpergröße 400-650 μm) aus der Kultur in den Schritten 2.1.1-2.1.4 ohne angehängte Organismen.
    2. Um Fluoreszenz aus dem Darminhalt zu vermeiden, verhungern Sie die Personen in FLW bei 20 ° C für mindestens 90 Minuten.
    3. Gießen Sie 1,5 ml FLW in eine Küvette. Nehmen Sie 0, 1, 5 und 10 S. mucronata-Personen mit einer Pipette unter einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung auf.
    4. Übertragung S. Mucronata-Individuen in die Küvette und fügen Sie FLW hinzu, um die Probe auf bis zu 2 ml zu bringen.
    5. Akklimatisieren Sie sich bei schwachem Licht (1-10 μmol Photon·m−2·s−1) bei 20 °C für 15 min vor der FRRf-Messung.
    6. Klicken Sie auf Act2 Run , um die Messung zu starten. Wiederholen Sie die Messungen >3 Mal pro Probe.
    7. Lesen Sie den Fo-Wert aus dem Ergebnisdiagramm (Abbildung 4).

3. Auswirkungen des Substratorganismus auf die Chl- eine Fluoreszenz

  1. Colacium sp. Anbau
    1. Bereiten Sie die FLW und AF-6 medium54 für den Anbau vor (Tabelle 2).
    2. Colacium sp. wird wie in den Schritten 1.1 und 1.2 an S. mucronata gebunden gesammelt und in einer Wachstumskammer bei In-situ-Temperatur gehalten.
    3. Nehmen Sie Colacium sp. mit einem gehäuteten Panzer (Abbildung 1D) mit einer Pipette unter einem optischen Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung auf. Waschen Sie sie mit FLW, wie in Schritt 1.8.
    4. Aseptisch impfen Colacium sp. und AF-6 medium in einem 10 ml Glasröhrchen auf einer sauberen Bank.
    5. Halten Sie die Kultur bei einer In-situ-Temperatur unter 200 μmol Photon·m−2·s−1 in einer Wachstumskammer. Schütteln Sie das Glasröhrchen mindestens einmal täglich vorsichtig von Hand, um eine Zellablagerung zu verhindern.
      HINWEIS: Um den Dämpfungseffekt von aggregierten Kolonien so gering wie möglich zu halten, überprüfen Sie die Kolonien vor der FRRf-Messung unter einem Mikroskop. Die Zellaggregation kann dichte Kolonien verursachen und die Photophysiologie der Algen beeinflussen55.
  2. FRRf-Messungen
    1. Um die Auswirkungen von Zooplankton-Individuen auf die Chl-a-Fluoreszenz von Colacium sp. zu untersuchen, bereiten Sie erwachsene S vor. Mucronata (Körpergröße 400-650 μm) ohne angehängte Organismen.
    2. Um Fluoreszenz aus dem Darminhalt zu vermeiden, verhungern Sie die Personen in FLW für mindestens 90 min.
    3. Richten Sie ein Küvetten-Fluorometer mit schneller Wiederholungsrate (FRRf) ein.
    4. Gießen Sie eine 1,5-ml-Teilprobe von vorkultiviertem Colacium sp. in eine Küvette. Transfer 0, 5, 10 und 15 S. Mucronata-Individuen in diese Küvetten und fügen Sie 2 μm gefiltertes Medium hinzu, um die Probe auf 2 ml zu bringen.
    5. Akklimatisieren Sie sich bei schwachem Licht (1-10 μmol Photon·m−2·s−1) bei 20 °C für 15 Minuten vor der FRRf-Messung.
      HINWEIS: Halten Sie die Proben während der Messungen auf Inkubationstemperatur
    6. Klicken Sie auf Act2 Run , um die Messung zu starten. Wiederholen Sie die Messungen >3 Mal pro Probe.
    7. Lesen Sie die FO- und Fm-Werte aus dem Ergebnisdiagramm (Abbildung 4).
      HINWEIS: Überprüfen Sie den RσPSII-Wert (Tabelle 1), der zeigt, ob die LED-Leistung im optimalen Bereich liegt, um die PSII-Parameter richtig zu schätzen. Wenn die Auto-LED aktiviert ist, steuert das Act2run-System die LED-Leistung, um einen optimalen RσPSII-Bereich (0,042-0,064) zu erreichen. Der experimentelle RσPSII-Grenzwert wurde in einer früheren Studie48 bei 0,03 und 0,08 definiert.
    8. Um die Baseline-Fluoreszenz22 zu korrigieren, filtern Sie das Kulturmedium mit einem 0,2-μm-Porengrößenfilter und messen Sie die Fluoreszenz. Subtrahieren Sie FO der Basisprobe von FO und Fm von Colacium sp., oder ändern Sie den Korrekturwert für Leerzeichen in den Einstellungen auf der Registerkarte Optionen.

4. Photophysiologie von Colacium sp. (beigefügtes Stadium)

  1. Isolieren Sie S. mucronata-Individuen mit Colacium sp. unter einer Pipette unter einem optischen Mikroskop.
  2. Waschen S. mucronata mit FLW, wie in Schritt 1.8.
  3. Übertragung S. mucronata in eine 100 ml FLW. Bei Hunger 90 min unter dunklen Bedingungen bei In-situ-Temperatur aufbewahren.
  4. Gießen Sie 1,5 ml FLW in eine Küvette.
  5. Transfer ~10 S. mucronata Individuen mit Colacium sp. in eine Küvette. Für Messungen werden mehr als 100 Colacium-Zellen pro 2 ml benötigt. Fügen Sie FLW hinzu, um die Probe auf bis zu 2 ml zu bringen.
  6. Akklimatisieren Sie sich bei schwachem Licht (1-10 μmol Photon·m−2·s−1) bei In-situ-Temperatur für 15 min. Chl-a-Fluoreszenz wie in den Schritten 3.2.6-3.2.8 messen.
  7. Um die Anzahl der angeschlossenen Zellen aufzuzählen, fixieren Sie die Probe mit Glutaraldehyd (2% Endvolumen) nach der FRRf-Messung. Machen Sie Fotos in mehreren Fokustiefen und Positionen von S. mucronata unter einem Lichtmikroskop.

5. Photophysiologie von Colacium sp. (Planktonstadium)

  1. Beprobtes Colacium sp. kultiviert in AF-6-Medium bei In-situ-Temperatur wie in den Schritten 3.1.1-3.1.5.
  2. Für die stationäre Phase nehmen Sie 2 ml kultiviertes Colacium sp. und gießen Sie es in eine Küvette.
  3. Akklimatisieren Sie sich bei schwachem Licht (1-10 μmol Photon·m−2·s−1) bei In-situ-Temperatur für 15 min. Chl-a-Fluoreszenz wie in den Schritten 3.2.6-3.2.8 messen.

6. Auswirkungen der Ca- und Mn-Addition auf die Photophysiologie von Colacium sp.

  1. Auswirkungen auf die angehängte Bühne
    1. Isolieren Sie S. mucronata-Individuen mit Colacium sp. unter einer Pipette unter einem optischen Mikroskop. Waschen mit FLW, wie in Schritt 1.8.
    2. Übertragen Sie jeweils sechs Personen in 12 Glasbecher mit 30 ml FLW. Stellen Sie sicher, dass jedes Becherglas >100 Colacium sp.-Zellen enthält.
    3. 200 μmol· hinzufügen L−1 CaCl2· H2O (Ca-Behandlung), 40 μmol· L−1 MnCl4 (Mn-Behandlung) oder Reinstwasser (Kontrolle) zu jedem Becherglas. Inkubieren Sie die Proben unter 200 μmol Photon·m−2 ·s−1 bei in situ Temperatur in einer Wachstumskammer.
    4. Bei 3 h und 21 h alle Individuen und Häutungshäute in eine Küvette mit 2 ml Medium überführen.
    5. Um die schnelle Reaktion auf zunehmendes Licht zu untersuchen, klicken Sie auf Nach oben der Perioden von 8 aktinischen Lichtschritten und geben Sie 20 ein (Abbildung 3A), um die Dauer jedes Schritts in 20 s einzustellen. Um das schrittweise aktinische Licht als 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 und 200 μmol Photon·m−2·s−1 einzustellen, klicken Sie auf High E und Step Up und ändern Sie die Werte auf 200 bzw. 34 (Abbildung 3B).
    6. Nach 15 Minuten dunkler Akklimatisierung ist die Chl-a-Fluoreszenz jeder Probe ähnlich den Schritten 3.2.6-3.2.8 zu messen.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die RσPSII- und RσPSII-Werte im optimalen Bereich (0,03-0,08)48 liegen.
  2. Auswirkungen auf die planktonische Stufe
    1. Beprobtes Colacium sp. kultiviert in AF-6-Medium bei In-situ-Temperatur wie in den Schritten 3.1.1-3.1.5.
    2. Überführen Sie das kultivierte Colacium sp. in FLW und akklimatisieren Sie sich bei einer In-situ-Temperatur von weniger als 200 μmol Photon·m−2·s−1 für 3 Tage.
    3. Übertragen Sie 1 ml der akklimatisierten Proben in drei Glasfläschchen mit 10 ml FLW.
    4. 200 μmol· hinzufügen L−1 CaCl2· H2O (Ca-Behandlung), 40 μmol· L−1 MnCl3 (Mn-Behandlung) oder Reinstwasser (Kontrolle) für Fläschchen. Inkubieren Sie die Proben unter 200 μmol Photon·m−2·s−1 bei in situ Temperatur in einer Wachstumskammer.
    5. Bei 3 h und 21 h wird die Chl-a-Fluoreszenz jeder Probe wie in den Schritten 3.2.6-3.2.8 gemessen.

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Representative Results

Es gab keinen signifikanten Effekt der Baseline-Fluoreszenz (Abbildung 5) oder der Chl-a-Fluoreszenz (Abbildung 6) durch S. mucronata bis zu 5 Individuen (inds.) mL−1. Fv/Fm und NPQNSV waren jedoch signifikant betroffen, wenn S. mucronata 7,5 inds·mL−1 betrug. Daher wählten wir zur Messung der Photophysiologie von Colacium sp. während des angeschlossenen Stadiums S. mucronata mit der höheren Belastung von Colacium sp., um eine ausreichende Colacium sp.-Häufigkeit (>50 Zellen·mL −1) und eine geringe Anzahl von S. mucronata (≤5 inds·mL−1) in der Küvette zu erreichen.

Tabelle 3 zeigt saisonale Schwankungen in der Photophysiologie von Colacium sp. während der angehängten Phase. Obwohl die Probenahmetemperatur variierte, blieb ihre Photophysiologie relativ konstant. σ PSII schwankte zwischen 3,42 nm2 und 3,76 nm2 (Mittelwert 3,60 nm2), Fv/Fm schwankte zwischen 0,52 und 0,60 (Mittelwert 0,55) und NPQNSV schwankte zwischen 0,66 und 0,85 (Mittelwert 0,82). Um diese Ergebnisse zu validieren, untersuchten wir weitere Variationen in der Photophysiologie von Colacium sp. während des planktonischen Stadiums für die stationäre Phase im AF-6-Medium (Tabelle 4). Mean Fv/Fm und NPQNSV für die angeschlossene Stufe ähnelten denen der planktonischen Stufe, wenn sie in AF-6-Medium inkubiert wurden.

Um die Wirkung von Ca und Mn auf die Photophysiologie von Colacium sp. sowohl im angeschlossenen als auch im planktonischen Stadium zu bestimmen, führten wir Ca- und Mn-Anreicherungsexperimente durch. Am 7. Mai 2021 wurden Proben aus dem Schilfgebiet des Biwa-Sees entnommen. Für das angehängte Stadium von Colacium sp. unter dunklen Bedingungen gab es keinen signifikanten Unterschied in den photophysiologischen Parametern zwischen den Behandlungen, mit Ausnahme von NPQNSV zwischen Mn- und Ca-Behandlungen bei 3 h, wo Ca < Mn (Abbildung 7A, C, E). Darüber hinaus zeigten σ PSII′-, Fq′/Fm′- und NPQNSV-Reaktionen auf zunehmendes Licht während der angeschlossenen Phase keine deutlichen Unterschiede zwischen den Behandlungen (Abbildung 8A, C, E und Abbildung 9A, C, E). Allerdings war NPQNSV bei einer geringen Lichtintensität bei 21 h tendenziell niedriger als die Kontrolle (11 und 25 μmol Photon·m−2·s−1, Abbildung 9E). Für das planktonische Stadium war σ PSII in der Mn-Behandlung bei 3 h signifikant niedriger als Ca (Abbildung 7B). Fq′/Fm′ war signifikant höher, aber NPQNSV war in der Mn-Behandlung niedriger als die Kontrolle bei 21 h (Abbildung 7D,F). Bei zunehmendem Licht tendierte Mn dazu, während der planktonischen Stufe den σ PSII zu verringern und Fq′/Fm′ zu erhöhen, verglichen mit der Kontrolle bei 3 h (Abbildung 8D). In ähnlicher Weise reduzierte Mn den NPQNSV während der planktonischen Phase im Vergleich zur Kontrolle bei 21 h signifikant (Abbildung 9F). Ähnlich wie bei der angeschlossenen Stufe verbesserte Calcium den NPQNSV für die Planktonstufe bei zunehmendem Licht leicht (Abbildung 9F). Ca verringerte jedoch Fq′/Fm′ und erhöhte NPQNSV für das planktonische Stadium im Vergleich zur Mn-Behandlung unter 44-200 μmol Photon·m−2·s−1 bei 3 h (Abbildung 8D,F).

Figure 1
Abbildung 1: Colacium sp. und Substanzorganismus Scapholeberis mucronata. a) infizierte S. mucronata. b) mit Glutaraldehyd fixierte S. mucronata. (C) Angehängte Kolaziumzellen an lebenden S. mucronata. (D) Angehängte Kolaziumzellen auf dem gehäuteten Panzer. (E, F) Colacium sp. des planktonischen (palmella) Stadiums. (G) Nicht infizierte S. mucronata. Pfeile zeigen Colacium-Zellen an. Maßstabsstäbe: 200 μm (A, B und G), 10 μm (C, E und F) und 100 μm (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Waschen von Zooplankton durch Pipettieren unter gefiltertem Seewasser (FLW). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Benutzeroberfläche der Act2Run-Software. (A) Belichtungszeit für jeden aktinischen Lichtschritt; (B) Anzahl der Schritte und Photonenfluss des aktinischen Lichts; (C) Kombination der Anregungswellenlänge; D) Sättigungs- und Entspannungs-Flashlet-Sequenz; E) Frequenzen und Intensitäten des Wassermantels und der Probenmischpumpen; (F) Photonenfluss der Anregung blitzt bei 444 (hier als 450 bezeichnet), 512 (530) und 633 nm (624), Photomultiplier Tube (PMT) Spannung und Replikate und Intervall der Sequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Fluoreszenzmessung der Algenprobe auf der Act2Run-Software. Die roten und blauen Linien zeigen das rohe Fluoreszenzsignal durch eine Abfolge von Flashlet und Kurve an, die sowohl in der Sättigungs- als auch in der Relaxationsphase passen. Siehe Kolber et al.2 für weitere Details. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Der Einfluss der S. mucronata-Dichte auf die Baseline-Fluoreszenz. Die kleinen Punkte stellen Replikate dar (n = 3). Die Ergebnisse des ANOVA-Tests werden ebenfalls angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 6
Abbildung 6: Die Auswirkungen der S. mucronata-Dichten auf (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm und (D) NPQNSV für Colacium sp. während der planktonischen Stufe. Die kleinen Punkte stellen Replikate dar (n = 3). Colacium sp. wurde in AF-6 medium kultiviert. Die Ergebnisse des Post-hoc-Tests von ANOVA und Tukey werden ebenfalls vorgestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 7
Abbildung 7: Reaktionen des (A,B)-Absorptionsquerschnitts, (C,D) PSII-Photochemie und (E,F) nicht-photochemischer Abschreckung der (A,C,E) angebrachten Stufe und (B,D,F) Planktonstufe von Colacium sp. bei 3 h und 21 h nach Ca- und Mn-Addition. Die kleinen Punkte stellen Replikate dar (n = 4). Die Ergebnisse des Post-hoc-Tests von ANOVA und Tukey werden ebenfalls vorgestellt. * p < 0,05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 8
Abbildung 8: Schnelllichtreaktionen von (A, B) Absorptionsquerschnitt, (C,D) PSII-Photochemie und (E,F) nicht-photochemischer Abschreckung von Colacium sp. in angehängten und planktonischen Stufen auf das schrittweise Lichtprotokoll bei 3 h nach Ca- und Mn-Addition. C, Kontrolle; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Signifikante Unterschiede zwischen (a) C und Ca, (b) C und Mn und (c) Ca und Mn bei jedem PAR-Fluss, mit einem Signifikanzniveau von p < 0,05 in jedem Panel. Fehlerindikator, Mittlerer SD (n = 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 9
Abbildung 9: Schnelllichtreaktionen des (A,B)-Absorptionsquerschnitts, (C,D) PSII-Photochemie und (E,F) nicht-photochemisches Abschrecken von Colacium sp. in angeschlossenen und planktonischen Stufen auf das schrittweise Lichtprotokoll bei 21 h nach Ca- und Mn-Addition. C, Kontrolle; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. Signifikante Unterschiede zwischen (a) C und Ca, (b) C und Mn und (c) Ca und Mn bei jedem PAR-Fluss, mit einem Signifikanzniveau von p < 0,05 in jedem Panel. Fehlerindikator, Mittlerer SD (n = 4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ausdruck Definition Einheiten
Baseline-Fluoreszenz Wert ohne Chl-a-Fluoreszenz
F' Fluoreszenz bei Nullstel-Flashlet einer Einzelumsatzmessung bei C>0
Für (ʹ) Minimale PSII-Fluoreszenzausbeute (unter Hintergrundlicht) bei Nullt-Flashlet
Fv (ʹ) fm(ʹ) − fo(ʹ)
Fm (ʹ) Maximale PSII-Fluoreszenzausbeute (unter Hintergrundlicht)
Fv/FM Maximale photochemische Effizienz von PSII bei Dunkelheit
Fqʹ/Fmʹ Maximale photochemische Effizienz von PSII unter Hintergrundlicht (Fmʹ− F)/(Fmʹ)
NPQNSV Normalisierte Stern-Volmer-Abschreckung, FOʹ/(Fmʹ − FOʹ)
[RCII] Konzentration des Reaktionszentrums
RσPSII (ʹ) Wahrscheinlichkeit, dass ein RCII während der ersten Flashlet-Phase einer einzelnen Umsatzsättigungsphase (unter Hintergrundlicht) geschlossen wird
σ PSII (ʹ) Funktioneller Absorptionsquerschnitt von PSII für Anregungsblitze (unter Hintergrundlicht) nm2

Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Begriffe

Bestandteil Menge
NaNO3 140 mg L−1
NH4NO3 22 mg· L−1
MgSO4·7H2O 30 mg L−1
KH2PO4 10 mg· L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 10 mg· L−1
Fe-Citrat* 2 mg· L−1
Zitronensäure* 2 mg· L−1
Biotin 0,002 mg· L−1
Vit.B 1 0,01 mg· L−1
Vit.B 6 0,001 mg· L−1
Vit.B 12 0,001 mg· L−1
Spurenmetalle 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0,002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·mL−1)

Tabelle 2: Rezept für AF-6 medium. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,6 ein. Fecitrat und Zitronensäure getrennt in warmem H2O auflösen und HCl (1 ml·L−1) nach dem Mischen beider Reagenzien hinzufügen. Die Gehalte an Spurenmetallen sind in Klammern angegeben.

Stichtag der Probenahme Beispiel-Nr. Wassertemperatur
(°C) 		S. mucronata Dichte
(inds.· ml−1)		 Colacium sp. Zelldichte
(inds.· ml−1)		 σ PSII (nm2) Fv/FM NPQNSV
27. April 2020 Nr. 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
21. Mai 2020 Nr. 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
Nr.3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
Nr.4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Juni 18/2020 Nr.5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
Nr.6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
Nr.7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
Juli 20/2020 Nr. 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Bedeuten 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tabelle 3: Photophysiologie von Colacium sp. an S. mucronata.

Stichtag der Probenahme Beispiel-Nr. Mittel Wachstumstemperatur (°C) σ PSII (nm2) Fv/FM NPQNSV
21. Mai 2020 Nr. 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
Juni 18/2020 Nr. 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
Juli 20/2020 Nr.3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Bedeuten 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tabelle 4: Photophysiologie des Planktonstadiums von Colacium sp. Jede Probe wurde während der stationären Phase gemessen.

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Discussion

Dieses Protokoll zeigte zum ersten Mal, dass die Photophysiologie von Colacium sp. während des angeschlossenen Stadiums in einer natürlichen Umgebung mit seinem planktonischen Stadium in AF-6-Medium vergleichbar ist. Darüber hinaus hatten die Darmgehalte von ausgehungertem S. mucronata keinen Einfluss auf die Ausgangs- und Chl-a-Fluoreszenz, wenn die Dichte ≤5 inds·mL−1 betrug (Abbildung 5 und Abbildung 6). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll die Photophysiologie von Colacium sp. während des angeschlossenen Stadiums ohne Korrektur unter geringer Substratorganismushäufigkeit messen kann. Die Ergebnisse der Schritte 3.2.1-3.2.8 zeigten jedoch, dass die höchste S. mucronata-Häufigkeit Fv/Fm und NPQNSV signifikant beeinflusste, nicht jedoch FO und σ PSII (Abbildung 4). Hier ist es möglich, dass eine höhere Organismusdichte den physischen Stress auf Colacium sp.-Individuen verschärft und anschließend die photosynthetische Aktivität verringert hat. Für Messungen unter einer hohen Häufigkeit von Substratorganismen oder anderen Spezies erfordern die Auswirkungen der Substratorganismusdichte auf die Baseline und der Chl-a-Fluoreszenz weitere Aufmerksamkeit.

FRRfs wurden verwendet, um den Einfluss der Nährstoffmanipulation auf den linearen Elektronenfluss und die nicht-photochemische Abschreckung von Phytoplankton22,56,57 zu untersuchen. Die primären Ergebnisse zeigen, dass sich die Ca- und Mn-Anreicherung zwischen den Lebensstadien von Colacium sp. signifikant unterschied (Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9). Insbesondere verbesserte Mangan deutlich die (maximale) photochemische Ausbeute von PSII (Fv/Fm und Fq′/Fm′) und verringerte die Wärmeableitung (NPQNSV)50 von planktonischen Stufen bei Dunkelheit (Abbildung 7D,F) und Lichtverhältnissen (Abbildung 8D,F und Abbildung 9D,F). Diese Ergebnisse können auf eine reduzierte Antennengröße bei PSII, σ PSII und σ PSII′ zurückzuführen sein (Abbildung 7B und Abbildung 8B), wodurch die überschüssige Lichtabsorption reduziert wird58,59. Die Messung der Antennengröße zusätzlich zum Energiefluss zwischen PSII-Komplexen würde genauere Messungen der Algenantwort ermöglichen10. Dieses Protokoll ermöglicht auch die Untersuchung von Photosynthese-Einschränkungen durch andere Ressourcen. Zum Beispiel wurden Stickstoff- und Phosphorgrenzen in verschiedenen Phytoplanktongemeinschaften untersucht, aber nicht in Epizoenalgen, trotz vorhergesagter Auswirkungen auf Colacium41 und marine epizoische Kieselalgen60,61. Neben Nährstoffen kann die Lichtumgebung die Verteilung der epizoischen Algen weiter beeinflussen44.

Wie in Abbildung 7, Abbildung 8 und Abbildung 9 gezeigt, ermöglicht uns der Küvettentyp FRRf, Nährstoff- und Lichteffekte ohne lange Inkubationszeiten und Messaufwand gleichzeitig zu untersuchen. Dieses schrittweise Lichtprotokoll (Schritt 6.1.5) kann auch Schnelllichtkurven der relativen Elektronentransportraten (rETR = Fq′/Fm′× Licht) vs. Licht als Analogon für Produktions- vs. Lichtkurven62 zeichnen. Obwohl der lineare Elektronenfluss in PSII aus photophysiologischen Parametern durch den FRRf geschätzt werden kann, ist er nicht unbedingt analog zur Kohlenstofffixierungsrate63,64. Für die Abschätzung der kohlenstoffbasierten Primärproduktion sollte der Elektronenbedarf pro CO2-Fixierung (Фe, C), der zeitlich und räumlich variieren kann5,48, bei der Beurteilung von Probandengemeinschaften untersucht werden.

Wenn das Planktonnetz durch Ablagerungen verstopft ist, sollten Sie ein größeres Netz, z. B. ein 5-mm-Netz, vorprüfen oder Zooplanktons direkt aus dem Seewasser mit einer Pipette ohne Filtration pflücken. Es sollte beachtet werden, dass einige Schäden an den angeschlossenen Algen auftreten können, selbst wenn die Filtration sanft mit einer relativ großen (200 μm) Maschenweite durchgeführt wird. Obwohl die Ergebnisse zeigen, dass die Standardabweichung der PSII-Parameter gering war (Tabelle 3) und die Mittelwerte der Parameter denen der kultivierten planktonischen Stufe sehr ähnlich waren (Tabelle 4), könnte eine Probenahme ohne Filtration ideal sein.

Eine weitere Einschränkung dieser Studie war die Ableitung von σ PSII. Aktinisches Licht und Chl-a-Fluoreszenzdämpfung können einen großen Einfluss/Verzerrung auf das FRRfs ausüben, das für die genaue σ PSII-Bestimmung auf optisch dünne Proben angewiesen ist65. Obwohl wir gezeigt haben, dass S. mucronata das σ PSII von planktonischen Colacium-Zellen nicht beeinflusst, sollte dies in Bezug auf das σ PSII der angeschlossenen Colacium-Zellen untersucht werden. Darüber hinaus wäre ein spektraler Korrekturfaktor (SCF) für die σ PSII in situ66-Schätzung erforderlich, da sich die Anregungswellenlänge des ACT2-Systems (444 nm) von der spektralen Verteilung der In-situ-Lichtumgebung unterscheidet. Im Allgemeinen wird die Filterpad-Technik verwendet, um das Chl-a-spezifische Absorptionsspektrum zu messen, um den SCF zu berechnen. Dieses Verfahren ist notwendig, um die Primärproduktivität der Algen anhand des FRRfs zu schätzen. Da wir während des Untersuchungszeitraums nicht genügend angehängte Colacium-Zellen entnehmen konnten, sollte das Chl-a-spezifische Absorptionsspektrum in zukünftigen Studien untersucht werden.

Die Implementierung von FRRf vom Typ Küvette sollte von der Substratgröße abhängen, da periphytische Algen eine Substratbefestigung erfordern. Zum Beispiel könnten Studien von Algen an unzerstörbaren Substanzen wie Steinen67, größeren Organismen26,68 oder symbiotischen Algen, einschließlich Symbiodinium, das mit Hartkorallen assoziiert ist10,69,70, den Tauchtyp FRRf69 erfordern. Umgekehrt, wenn das Basibiont klein genug ist, um sich in einer Küvette zu suspendieren, könnte ein FRRf vom Küvettentyp zusätzlich zu einem PAM vom Küvettentyp, wie z. B. benthischen Algen16,17,18, ausreichen. In der Tat haben neuere Studien einen Küvettentyp FRRf zur Messung der Photophysiologie von Eisalgen untersucht24,25. Darüber hinaus ermöglicht das Einschalten des Anregungsblitzes bei 512 und 633 nm die Applikation auf Cyanobakterien mit unterschiedlichen PSII-Antennenpigmenten, Phycoerythrinen und Phycocyaninen und damit unterschiedlichen Absorptionsspitzen mit Chl-a71. Da aktuelle FRRf-Modelle, die Multi-Anregungswellenlängen enthalten, nützliche Werkzeuge zur Untersuchung der Photophysiologie und Produktivität von Cyanobakterien sind7,66,72, sollten dies nützliche Methoden zur Beurteilung benthischer Cyanobakterien sein, wenn die Auswirkungen der Probendicke auf photophysiologische Parameter verbessert würden65 . In zukünftigen Studien sollten FRRfs auf ein breiteres Spektrum von Probandenorganismen ausgerichtet sein, um weitere Einblicke in die komplexen Mechanismen der Algenphotophysiologie in verschiedenen Lebensräumen zu erhalten.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Offenlegungen zu erklären.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde vom Collaborative Research Fund der Präfektur Shiga mit dem Titel "Study on water quality and lake-bottom environment for the protection of the solidness of water environment" im Rahmen des Japanese Grant for Regional Revitalization and the Environment Research and Technology Development Fund (No. 5-1607) des japanischen Umweltministeriums unterstützt. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Die Autoren danken Enago (www.enago.jp) für die englischsprachige Rezension.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie Ausgabe 177 Tischplatte FRRf Colacium sp. Epibiont Epizoenalgen Lake Biwa Photophysiologie
Messung der Photophysiologie des angeschlossenen <em>Stadiums von Colacium</em> sp. mit einem Küvetten-Fluorometer mit schneller Wiederholungsrate
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

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