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Biology

एक Cuvette-प्रकार तेजी से पुनरावृत्ति दर फ्लोरोमीटर द्वारा कोलाशियम एसपी के संलग्न चरण के फोटोफिजियोलॉजी को मापने

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

फास्ट पुनरावृत्ति दर फ्लोरोमीटर (FRRf) फोटोसिस्टम II फोटोफिजियोलॉजी और प्राथमिक उत्पादकता को मापने के लिए एक लाभकारी विधि है। यहां हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए epizoic alga के PSII photophysiology को मापने के लिए, Colacium sp. सब्सट्रेट zooplankton पर cuvette-प्रकार FRRf का उपयोग कर.

Abstract

फास्ट पुनरावृत्ति दर फ्लोरोमीटर (एफआरआरएफ) फोटोसिस्टम II (PSII) फोटोफिजियोलॉजी और प्राथमिक उत्पादकता को मापने के लिए एक लाभकारी विधि है। यद्यपि FRRf PSII अवशोषण क्रॉस-सेक्शन (σ PSII), अधिकतम फोटोकैमिकल दक्षता (Fv / Fm), प्रभावी फोटोकैमिकल दक्षता (Fq′/Fm′), और विभिन्न यूकेरियोटिक शैवाल और साइनोबैक्टीरिया के लिए गैर-फोटोकैमिकल शमन (NPQNSV) को माप सकता है, आज तक लगभग सभी FRRf अध्ययनों ने फाइटोप्लांकटन पर ध्यान केंद्रित किया है। यहां, प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि एक एपिज़ोइक एल्गा कोलाशियम एसपी के पीएसआईआई फोटोफिजियोलॉजी को कैसे मापा जाए। Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), अपने संलग्न चरण में (zooplankton से जुड़ा हुआ), cuvette-प्रकार FRRf का उपयोग कर। सबसे पहले, हमने बेसलाइन प्रतिदीप्ति पर सब्सट्रेट ज़ोप्लांकटन (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) के प्रभावों का अनुमान लगाया और σ PSII, Fv / Fm, Fq′/Fm′, और प्लवक कोलाशियम एसपी के NPQNSV। इस पद्धति को मान्य करने के लिए, हमने एस म्यूक्रोनाटा पर संलग्न कोलाशियम एसपी के फोटोफिजियोलॉजी माप दर्ज किए और इन परिणामों की तुलना इसके प्लवक चरण के साथ की। प्रतिनिधि परिणामों से पता चला है कि कैसे प्रोटोकॉल कोलासियम एसपी फोटोफिजियोलॉजी पर कैल्शियम (सीए) और मैंगनीज (एमएन) के प्रभावों को निर्धारित कर सकता है और संलग्न और प्लवक चरणों के बीच एमएन संवर्धन के विभिन्न प्रभावों की पहचान कर सकता है। अंत में, हम अन्य पेरिफाइटिक शैवाल के लिए इस प्रोटोकॉल की अनुकूलन क्षमता पर चर्चा करते हैं।

Introduction

क्लोरोफिल चर प्रतिदीप्ति अल्गल फोटोसिस्टम II (PSII) फोटोफिजियोलॉजी को मापने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। शैवाल विभिन्न पर्यावरणीय तनावों का जवाब देते हैं, जैसे कि अतिरिक्त प्रकाश और पोषक तत्वों की कमी, उनके पीएसआईआई फोटोफिजियोलॉजी को बदलकर। फास्ट पुनरावृत्ति दर फ्लोरोमीटर (FRRf) PSII फोटोफिजियोलॉजी 1,2 को मापने और प्राथमिक उत्पादकता 1,3,4 का अनुमान लगाने के लिए एक सामान्य विधि है, जो फाइटोप्लांकटन PSII फोटोफिजियोलॉजी की निगरानी करने में सक्षम बनाता है, साथ ही साथ व्यापक स्थानिक और अस्थायी तराजू में प्राथमिक उत्पादकता 5,6,7। FRRf एक साथ PSII (σ PSII) अवशोषण क्रॉस सेक्शन, प्रतिक्रिया केंद्र ([RCII]) एकाग्रता, अधिकतम फोटोकैमिकल दक्षता (Fv / Fm), प्रभावी फोटोकैमिकल दक्षता (Fq′/Fm′), और गैर-फोटोकैमिकल शमन (NPQNSV) (तालिका 1) को माप सकता है। सामान्य तौर पर, Fv / Fm और Fq′/Fm' को PSII activity8 के रूप में परिभाषित किया जाता है, जबकि NPQNSV को सापेक्ष गर्मी-विलुप्त ऊर्जा 9 के रूप में परिभाषित किया गया है।

महत्वपूर्ण रूप से, FRRf के एकल टर्नओवर (एसटी) चमक पूरी तरह से प्राथमिक क्विनोन इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता, क्यूए को कम करते हैं, लेकिन प्लास्टोक्विनोन पूल नहीं। इसके विपरीत, पल्स आयाम मॉडुलन (पीएएम) फ्लोरोमीटर से कई टर्नओवर (एमटी) चमक दोनों को कम कर सकते हैं। एसटी विधि एमटी विधि पर एक स्पष्ट लाभ है जब एक साथ Fv / Fm, Fq'/ Fm', NPQNSV, और σ PSII10 की वसूली कैनेटीक्स को मापने के द्वारा NPQNSV के संभावित मूल की पहचान। आज तक, कई प्रकार के FRRf उपकरण, जैसे पनडुब्बी-प्रकार, क्यूवेट-प्रकार, और प्रवाह-थ्रू-प्रकार, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। पनडुब्बी-प्रकार FRRf महासागरों और झीलों में सीटू माप में सक्षम बनाता है, जबकि cuvette-प्रकार FRRf छोटे नमूना मात्रा को मापने के लिए उपयुक्त है। प्रवाह के माध्यम से प्रकार का उपयोग आमतौर पर सतह के पानी में फाइटोप्लांकटन के फोटोफिजियोलॉजी को लगातार मापने के लिए किया जाता है।

पीएएम फ्लोरोमीटर के विकास को देखते हुए, जिसमें क्यूवेट-प्रकार भी शामिल है, विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए 11, पीएएम फ्लोरोमीटर अभी भी अल्गल फोटोफिजियोलॉजी रिसर्च 12 में एफआरआरएफ की तुलना में अधिक आम हैं। उदाहरण के लिए, हालांकि इन उपकरणों के बीच नमूना कक्ष संरचना और क्यूवेट क्षमता केवल थोड़ी भिन्न होती है, लेकिन क्यूवेट-प्रकार पीएएम को फाइटोप्लांकटन 13,14,15, बेंथिक माइक्रोएल्गे 16,17,18, बर्फ शैवाल 19, और एपिज़ोइक शैवाल 20 पर लागू किया गया है, जबकि क्यूवेट-प्रकार के एफआरआरएफ को मुख्य रूप से फाइटोप्लांकटन 21,22,23 पर लागू किया गया है। और बर्फ algal समुदायों की एक सीमित संख्या24,25. इसकी प्रभावशीलता को देखते हुए, क्यूवेट-प्रकार के एफआरआरएफ बेंथिक और एपिज़ोइक शैवाल पर समान रूप से लागू होते हैं। इसलिए, इसके आवेदन का विस्तार PSII फोटोफिजियोलॉजी में काफी अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा, विशेष रूप से कम ज्ञात एपिज़ोइक अल्गल फोटोफिजियोलॉजी के लिए।

एपिज़ोइक शैवाल को बहुत कम ध्यान दिया गया है, कुछ अध्ययनों ने अपने पीएसआईआई फोटोफिजियोलॉजी 20,26 की जांच की है, सबसे अधिक संभावना है कि जलीय खाद्य जाल 27,28 में उनकी मामूली भूमिकाओं के कारण। हालांकि, एपिजोइक शैवाल सहित एपिबियोंट, सकारात्मक रूप से ज़ोप्लांकटन सामुदायिक गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि प्रजनन और उत्तरजीविता दर 29,30 में वृद्धि, साथ ही नकारात्मक रूप से प्रभाव प्रक्रियाएं, जैसे कि डूबने की दर 29,31 और दृश्य शिकारियों के लिए भेद्यता 32,33,34,35,36 . इसलिए, ज़ोप्लांकटन समुदायों में एपिबायोंट गतिशीलता को नियंत्रित करने वाले पर्यावरणीय और जैविक कारकों की खोज करना महत्वपूर्ण है।

एपिज़ोइक शैवाल के बीच, कोलेसियम एहरेनबर्ग 1834 (यूग्लेनोफाइटा) एक आम, मीठे पानी, अल्गल समूह 32,37,38,39 है, जिसमें संलग्न (चित्रा 1 ए-डी), गैर-गतिशील प्लवक (चित्रा 1ई, एफ), और गतिशील प्लवक चरण40,41 सहित विभिन्न जीवन चरणों के साथ शामिल हैं। . गैर-गतिशील प्लवक चरण के दौरान, कोशिकाएं एकल-सेल प्लवक, एकत्रित कॉलोनियों, या एक-परत शीट कॉलोनियों के रूप में रहती हैं, जो म्यूसिलेज 42 द्वारा कवर की जाती हैं। संलग्न चरण में, कोलासियम एसपी सब्सट्रेट जीवों (basibionts), विशेष रूप से microcrustaceans41,43 से जुड़ने के लिए सेल 37,39,41 के पूर्वकाल के अंत से उत्सर्जित म्यूसिलेज का उपयोग करता है। उनके जीवन चक्र में पिघले हुए एक्सोस्केलेटन या मृत बेसिबियोंट से अलग होना और एक और सब्सट्रेट जीव 39 खोजने के लिए अपने फ्लैगेला के साथ तैरना भी शामिल है। प्लवक और संलग्न दोनों चरण माइटोसिस 40 द्वारा अपनी आबादी के आकार को बढ़ा सकते हैं। यद्यपि उनके संलग्न चरण को संसाधनों को इकट्ठा करने के लिए एक विकासवादी विशेषता होने की परिकल्पना की गई है, जैसे कि light44 और ट्रेस तत्व41,45,46, या एक फैलाव रणनीति 27 के रूप में, इन पहलुओं के बारे में बहुत कम प्रयोगात्मक सबूत उपलब्ध हैं37,41,44 और प्रमुख अनुलग्नक तंत्र काफी हद तक अज्ञात हैं। उदाहरण के लिए, रोसोव्स्की और कुग्रेन्स को उम्मीद थी कि कोलाशियम सब्सट्रेट कोपपोड्स 41 से मैंगनीज (एमएन) प्राप्त करता है, जो एक्सोस्केलेटन 47 में केंद्रित है।

यहां, हम वर्णन करते हैं कि प्लवक शैवाल के पीएसआईआई फोटोफिजियोलॉजी को कैसे मापा जाए और कोलेट-प्रकार के एफआरआरएफ का उपयोग करके कोलेसियम एसपी कोशिकाओं के साथ संलग्न शैवाल (ज़ोप्लांकटन से संलग्न) को लक्षित करने के लिए संबंधित आवेदन विधि। हम तीन प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) से लैस एक्ट 2 सिस्टम का उपयोग करते हैं जो 444 एनएम, 512 एनएम और 633 एनएम 48 पर केंद्रित फ्लैश उत्तेजना ऊर्जा प्रदान करते हैं। यहां, 444 एनएम (नीला) क्रोफिल ए (सीएचएल-ए) के अवशोषण शिखर से मेल खाती है, जबकि 512 एनएम (हरा) और 633 एनएम (नारंगी) क्रमशः फाइकोएरिथ्रिन और फाइकोसायनिन के अवशोषण चोटियों के अनुरूप है। फ्लोरोसेंट सिग्नल डिटेक्शन पीक 30 एनएम आधा बैंडविड्थ के साथ 682 एनएम है। चूंकि प्राकृतिक वातावरण में कोलाशियम एसपी के प्लवक चरण को ढूंढना मुश्किल है, इसलिए प्रयोगों के लिए उनके संलग्न चरण को एकत्र किया गया था। कई सब्सट्रेट जीवों में, स्कैफोलेबेरिस म्यूक्रोनाटा ओ.एफ. मुलर 1776 (ब्रांचिओपोडा, डैफनिइडे; चित्रा 1A, B, G) उनकी धीमी तैराकी की गति, बड़े शरीर के आकार (400-650 μm), और अद्वितीय व्यवहार (पानी की सतह पर उल्टा लटका) के कारण संभालने के लिए सबसे सरल में से एक है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल कोलाशियम-बेसिबियोंट सिस्टम के मामले के अध्ययन के रूप में एस म्यूक्रोनाटा पर संलग्न कोलासियम एसपी का उपयोग करता है। आंत की सामग्री से प्राप्त प्रतिदीप्ति से बचने के लिए, एस म्यूक्रोनेटा को भूखा रखा गया था। जैसा कि पिछले अध्ययन ने बताया कि आंत सामग्री (निगला शैवाल) से प्रतिदीप्ति संकेत 40 मिनट 49 के बाद पांच गुना कमी प्रदर्शित करता है, हमें उम्मीद थी कि 90 मिनट भुखमरी आंत सामग्री प्रतिदीप्ति की संभावना को कम करने के लिए पर्याप्त होगी जो एफआरआरएफ माप को प्रभावित करती है, जैसे कि कोलेसियम एसपी के लिए प्रयोगात्मक तनाव के न्यूनतम प्रभावों के साथ, जैसे पोषक तत्वों की कमी। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को कोलासियम एसपी के संलग्न तंत्र को स्पष्ट करने और यह निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था कि दो धातुओं, कैल्शियम (सीए) और मैंगनीज (एमएन) प्लवक और संलग्न दोनों चरणों के फोटोफिजियोलॉजी को कैसे प्रभावित करते हैं। कैल्शियम प्रकाश संश्लेषक pathways50 में कई तरीकों से महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और दोनों धातुओं को PSII51 के ऑक्सीजन-विकसित परिसरों का निर्माण करने की आवश्यकता होती है। जैसा कि कैल्शियम और मैंगनीज क्रस्टेशियन ज़ोप्लांकटन 47 के कैरापेस में अत्यधिक केंद्रित हैं, हम परिकल्पना करते हैं कि कोलासियम एसपी फोटोफिजियोलॉजी प्लवक चरण के दौरान सीए और एमएन संवर्धन के लिए अधिक प्रमुखता से प्रतिक्रिया दे सकता है यदि यह जीवन चरण संलग्न चरण के दौरान एस म्यूक्रोनेटा से इन तत्वों को प्राप्त करता है।

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Protocol

1. नमूना

  1. एक बाल्टी द्वारा सतह से झील के पानी को इकट्ठा करें। कोलाशियम को लक्षित करने के लिए एस mucronata (चित्रा 1A-C) फ़िल्टर 0.5-10 एल झील के पानी के एक 100 μm नायलॉन जाल net52 का उपयोग कर.
    नोट: एस mucronata अक्सर उथले, यूट्रोफिक, मैला पानी में घनी समुच्चय, जैसे कि रीड (phragmites) क्षेत्रों के बीच।
  2. झील के पानी के 350 मिलीलीटर के साथ 500 मिलीलीटर प्लास्टिक की बोतलों में केंद्रित नमूनों को स्टोर करें। अंधेरे परिस्थितियों में रहो।
  3. प्रयोगशाला में, नमूना पानी को 500 एमएल बीकर में डालें और इसे कुछ मिनटों के लिए बसने की अनुमति दें।
  4. एक 0.2 μm ताकना आकार फिल्टर के माध्यम से झील के पानी को फ़िल्टर करें।
  5. उठाओ एस। 100x आवर्धन पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करने वाले म्यूक्रोनाटा व्यक्ति। Bódzki और Rybak53 के अनुसार प्रजातियों की पहचान करें।
  6. उन्हें एक ग्लास स्लाइड पर रखे गए 0.2-μm फ़िल्टर्ड लेक वॉटर (FLW) की एक बूंद में स्थानांतरित करें।
    नोट: एस। म्यूक्रोनेटा सतह पर तैर सकता है या बीकर की दीवार से जुड़ सकता है।
  7. S की जाँच करें. प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत म्यूक्रोनेटा।
  8. धोएं एस। अन्य जीवों से संदूषण को रोकने के लिए FLW (3 बूँदें या अधिक) का उपयोग करने वाले म्यूक्रोनेटा व्यक्ति (चित्रा 2)।
  9. एस रखें। 40 μmol फोटॉन·m−2·s−1 के तहत एक विकास कक्ष में एक इन सीटू तापमान पर म्यूक्रोनेटा।

2. एस के प्रभाव | आधारभूत प्रतिदीप्ति पर म्यूक्रोनेटा

  1. एस। म्यूक्रोनेटा खेती
    1. 100x आवर्धन पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करके एस म्यूक्रोनाटा व्यक्तियों को उठाएं और चरण 1.8 के रूप में FLW का उपयोग करके धोएं।
    2. कम से कम 1 सप्ताह के लिए एक हवा के पत्थर के माध्यम से एक इलेक्ट्रिक एयर पंप का उपयोग करके एरेट नल का पानी। एक 350 मिलीलीटर ग्लास जार में 300 मिलीलीटर वातित नल का पानी डालें।
    3. क्लोरेला (1 mg C·L−1) फ़ीड करें और एक विकास कक्ष में 40 μmol photon·m−2·s−1 के तहत 20 °C पर बनाए रखें।
    4. लगभग 14 दिनों के बाद, 100x आवर्धन पर ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करके 5-30 व्यक्तियों को उठाएं और माध्यम को ताजा रखने के लिए उन्हें 300 मिलीलीटर साफ, वातित नल के पानी में टीका लगाएं।
  2. FRRf की स्थापना
    1. Act2Run सॉफ़्टवेयर लॉन्च करें।
    2. विकल्प टैब पर क्लिक करें और Actinic LEDs रंग सेट करने के लिए ऑपरेशन के मोड में Act2 FLC (सफेद LEDs) का चयन करें।
    3. मुख्य विंडो में फ्लोरोसेंट-लाइट वक्र की सेटिंग्स के चरण 1 पर डार्क के मूल्य पर क्लिक करें, और डार्क अवधि (चित्रा 3 ए) की अवधि निर्धारित करने के लिए 30 टाइप करें।
    4. हरे और नारंगी एलईडी (चित्रा 3 सी) को बंद करने के लिए एलईडी संयोजन बी, सी और डी पर क्लिक करें।
    5. शनि के तहत Fets और पिच के मूल्य पर क्लिक करें, और संतृप्ति चरण (चित्रा 3 डी) में flashlet की संख्या और पिच सेट करने के लिए क्रमशः 100 और 2 टाइप करें।
    6. Rel के तहत Fets और पिच के मूल्य पर क्लिक करें, और क्रमशः 40 और 60 टाइप करें, विश्राम चरण (चित्रा 3E) में flashlet की संख्या और पिच सेट करने के लिए।
    7. माप के दौरान नमूना तापमान को नियंत्रित करने के लिए FLC (चित्रा 3F) के दौरान क्लिक करके पानी की जैकेट पंप को सक्रिय करें।
    8. ऑटो-एलईडी और ऑटो-पीएमटी (चित्रा 3F) पर क्लिक करके सक्रिय करें.
    9. FRRf-Act2 को कनेक्ट करने के लिए सिंक्रनाइज़ पर क्लिक करें।
  3. FRRf मापन
    1. बेसलाइन प्रतिदीप्ति पर ज़ोप्लांकटन व्यक्तियों के प्रभावों की जांच करने के लिए, वयस्क एस तैयार करें। mucronata (शरीर का आकार 400-650 μm) किसी भी संलग्न जीवों के बिना चरण 2.1.1-2.1.4 में संस्कृति से।
    2. आंत की सामग्री से प्रतिदीप्ति से बचने के लिए, FLW में व्यक्तियों को कम से कम 90 मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर भूखा रखें।
    3. एक cuvette में FLW के 1.5 mL डालो. 100x आवर्धन पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करके 0, 1, 5, और 10 एस म्यूक्रोनेटा व्यक्तियों को उठाएं।
    4. स्थानांतरण एस। mucronata व्यक्तियों को क्यूवेट में और FLW जोड़ने के लिए नमूना 2 mL तक लाने के लिए.
    5. FRRf माप से पहले 15 मिनट के लिए 20 °C पर कम प्रकाश (1-10 μmol photon·m−2·s−1) के तहत acclimate।
    6. माप शुरू करने के लिए Act2 Run पर क्लिक करें। प्रति नमूना >3 बार माप को दोहराएं।
    7. परिणाम प्लॉट (चित्रा 4) से Fo मान पढ़ें।

3. Chl पर सब्सट्रेट जीव के प्रभाव- एक प्रतिदीप्ति

  1. कोलेसियम एसपी खेती
    1. खेती के लिए FLW और AF-6 medium54 तैयार करें (तालिका 2)।
    2. चरण 1.1 और 1.2 के रूप में एस mucronata करने के लिए संलग्न Colacium sp. ले लीजिए और, एक विकास कक्ष में सीटू तापमान में रखें।
    3. 100x आवर्धन पर एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करके एक पिघला हुआ कैरापेस (चित्रा 1 डी) के साथ कोलेसियम एसपी उठाओ। उन्हें FLW के साथ धोएं, जैसा कि चरण 1.8 में है।
    4. एक साफ बेंच पर एक 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में कोलेसियम एसपी और एएफ -6 माध्यम को एसेप्टिक रूप से संक्रमित करें।
    5. एक विकास कक्ष में 200 μmol फोटॉन ·m−2·s−1 के तहत सीटू तापमान पर संस्कृति को बनाए रखें। सेल निपटान को रोकने के लिए प्रति दिन कम से कम एक बार कांच की ट्यूब को धीरे-धीरे हाथ से हिलाएं।
      नोट: एकत्रित कालोनियों के क्षीणन प्रभाव को यथासंभव कम रखने के लिए, FRRf माप से पहले माइक्रोस्कोप के तहत कॉलोनियों की जांच करें। सेल एकत्रीकरण घने उपनिवेशों का कारण बन सकता है और अल्गल फोटोफिजियोलॉजी 55 को प्रभावित कर सकता है।
  2. FRRf मापन
    1. Chl पर zooplankton व्यक्तियों के प्रभावों की जांच करने के लिए-Colacium sp. से एक प्रतिदीप्ति, वयस्क एस तैयार करें। म्यूक्रोनेटा (शरीर का आकार 400-650 μm) किसी भी संलग्न जीव के बिना।
    2. आंत की सामग्री से प्रतिदीप्ति से बचने के लिए, कम से कम 90 मिनट के लिए FLW में व्यक्तियों को भूखा रखें।
    3. एक क्यूवेट-प्रकार तेजी से पुनरावृत्ति दर फ्लोरोमीटर (FRRf) सेट करें।
    4. एक cuvette में precultured Colacium sp. के एक 1.5 mL subsample डालो. स्थानांतरण 0, 5, 10, और 15 एस। इन cuvettes में mucronata व्यक्तियों और 2 mL करने के लिए नमूना लाने के लिए फ़िल्टर माध्यम के 2 μm जोड़ें।
    5. FRRf माप लेने से पहले 15 मिनट के लिए 20 °C पर कम प्रकाश (1-10 μmol photon·m−2·s−1) के तहत acclimate।
      नोट: माप के दौरान इनक्यूबेशन तापमान पर नमूनों को बनाए रखें
    6. माप शुरू करने के लिए Act2 Run पर क्लिक करें। प्रति नमूना >3 बार माप को दोहराएं।
    7. परिणाम प्लॉट (चित्रा 4) से FO और Fm मान पढ़ें।
      नोट:: RπPSII मान (तालिका 1) की जाँच करें, जो दिखाता है कि क्या एलईडी पावर PSII पैरामीटर ्स का सही अनुमान लगाने के लिए इष्टतम श्रेणी के भीतर है। जब ऑटो-एलईडी सक्रिय है, तो Act2run सिस्टम एक इष्टतम RπPSII रेंज (0.042-0.064) को प्राप्त करने के लिए एलईडी पावर को नियंत्रित करता है। प्रयोगात्मक RπPSII कट-ऑफ मान को पिछले अध्ययन 48 में 0.03 और 0.08 पर परिभाषित किया गया था।
    8. बेसलाइन प्रतिदीप्ति 22 को सही करने के लिए, 0.2-μm रंध्र-आकार फ़िल्टर का उपयोग करके संस्कृति माध्यम को फ़िल्टर करें और प्रतिदीप्ति को मापें। कोलाशियम sp., के FO और Fm से आधार रेखा नमूने का FO घटाएँ, या विकल्प टैब में सेटिंग्स में रिक्त सुधार मान को संशोधित करें।

4. कोलाशियम एसपी के फोटोफिजियोलॉजी (संलग्न चरण)

  1. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करके कोलासियम एसपी के साथ एस म्यूक्रोनेटा व्यक्तियों को अलग करें।
  2. धोएं एस। FLW का उपयोग कर mucronata, चरण 1.8 के रूप में।
  3. स्थानांतरण एस। FLW के एक 100 mL में mucronata . भुखमरी के लिए, 90 मिनट के लिए सीटू तापमान पर अंधेरे परिस्थितियों में रखें।
  4. एक cuvette में FLW के 1.5 mL डालो.
  5. स्थानांतरण ~ 10 एस. कोलेसियम एसपी के साथ mucronata व्यक्तियों एक cuvette में. माप के लिए, प्रति 2 मिलीलीटर 100 से अधिक कोलेसियम कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। 2 mL तक नमूना लाने के लिए FLW जोड़ें।
  6. 15 मिनट के लिए सीटू तापमान पर कम प्रकाश (1-10 μmol फोटॉन·m−2·s−1) के तहत acclimate. चरण 3.2.6-3.2.8 के रूप में Chl-a प्रतिदीप्ति को मापें।
  7. संलग्न कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए, FRRf माप लेने के बाद ग्लूटाराल्डिहाइड (2% अंतिम मात्रा) के साथ नमूने को ठीक करें। एस की कई फोकल गहराई और पदों पर तस्वीरें लें। एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत म्यूक्रोनेटा ।

5. कोलेसियम एसपी के फोटोफिजियोलॉजी (प्लवक चरण)

  1. चरण 3.1.1-3.1.5 के रूप में सीटू तापमान में AF-6 माध्यम में नमूना कोलासियम एसपी की खेती करें।
  2. स्थिर चरण के लिए, सुसंस्कृत कोलासियम एसपी के 2 एमएल लें और एक क्यूवेट में डालें।
  3. 15 मिनट के लिए सीटू तापमान पर कम प्रकाश (1-10 μmol फोटॉन·m−2·s−1) के तहत acclimate. चरण 3.2.6-3.2.8 के रूप में Chl-a प्रतिदीप्ति को मापें।

6. Colacium एसपी के photophysiology पर Ca और Mn इसके अलावा के प्रभाव.

  1. संलग्न चरण पर प्रभाव
    1. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत एक पिपेट का उपयोग करके कोलासियम एसपी के साथ एस म्यूक्रोनेटा व्यक्तियों को अलग करें। चरण 1.8 के रूप में, FLW का उपयोग करके धोएं।
    2. FLW के 30 mL के साथ 12 ग्लास बीकर में प्रत्येक छह व्यक्तियों को स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि प्रत्येक बीकर में >100 कोलेसियम एसपी कोशिकाएं हैं।
    3. 200 μmol जोड़ें · L−1 CaCl2· H2O (Ca उपचार), 40 μmol · L−1 MnCl4 (Mn उपचार), या प्रत्येक बीकर के लिए अल्ट्राप्योर पानी (नियंत्रण)। एक विकास कक्ष में सीटू तापमान पर 200 μmol फोटॉन ·m−2 ·s−1 के तहत नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    4. 3 घंटे और 21 घंटे में, सभी व्यक्तियों और मोल्ड खाल को माध्यम के 2 एमएल के साथ एक क्यूवेट में स्थानांतरित करें।
    5. बढ़ती रोशनी के लिए तेजी से प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए, 20 सेकंड में प्रत्येक चरण की अवधि निर्धारित करने के लिए 8 एक्टिनिक प्रकाश चरणों और टाइप 20 (चित्रा 3 ए) की अवधि के ऊपर क्लिक करें। चरणवार एक्टिनिक प्रकाश को 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144, और 200 μmol फोटॉन ·m−2·s−1 के रूप में सेट करने के लिए, उच्च E और Step Up पर क्लिक करें और मानों को क्रमशः 200 और 34 में परिवर्तित करें (चित्र3B)।
    6. अंधेरे acclimation के 15 मिनट के बाद, चरण 3.2.6-3.2.8 के समान प्रत्येक नमूने के Chl-एक प्रतिदीप्ति उपाय।
      नोट:: सत्यापित करें कि RπPSII और RπPSII'मान इष्टतम श्रेणी (0.03-0.08)48 के भीतर हैं।
  2. प्लवक अवस्था पर प्रभाव
    1. चरण 3.1.1-3.1.5 के रूप में सीटू तापमान में AF-6 माध्यम में नमूना कोलासियम एसपी की खेती करें।
    2. सुसंस्कृत कोलासियम एसपी को FLW में स्थानांतरित करें और 3 दिनों के लिए 200 μmol photon·m−2·s−1 से कम सीटू तापमान पर acclimate।
    3. FLW के 10 mL के साथ तीन कांच की शीशियों में acclimated नमूनों के 1 mL स्थानांतरण.
    4. 200 μmol जोड़ें · L−1 CaCl2· H2O (Ca उपचार), 40 μmol · L−1 MnCl3 (Mn उपचार), या शीशियों के लिए ultrapure पानी (नियंत्रण)। एक विकास कक्ष में सीटू तापमान पर 200 μmol फोटॉन ·m−2·s−1 के तहत नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    5. 3 h और 21 h पर, चरण 3.2.6-3.2.8 के रूप में प्रत्येक नमूने के Chl-a प्रतिदीप्ति को मापें।

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Representative Results

बेसलाइन प्रतिदीप्ति (चित्रा 5) या Chl-a प्रतिदीप्ति (चित्रा 6) का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था S. mucronata द्वारा 5 व्यक्तियों (inds.) mL−1 तक। हालांकि, Fv/Fm और NPQNSV काफी प्रभावित हुए थे जब S. mucronata 7.5 inds·mL−1 था। इसलिए, संलग्न चरण के दौरान कोलासियम एसपी के फोटोफिजियोलॉजी को मापने के लिए, हमने पर्याप्त कोलाशियम एसपी के उच्च बोझ के साथ एस म्यूक्रोनाटा को चुना है, ताकि पर्याप्त कोलाशियम एसपी बहुतायत (>50 कोशिकाएं · एमएल -1) और क्यूवेट में एस म्यूक्रोनेटा (≤5 इंड्स · एमएल -1) की कम संख्या तक पहुंच सके।

तालिका 3 संलग्न चरण के दौरान कोलासियम एसपी के फोटोफिजियोलॉजी में मौसमी भिन्नता दिखाती है। हालांकि नमूना तापमान भिन्न था, उनके फोटोफिजियोलॉजी अपेक्षाकृत स्थिर रहे। σ PSII 3.42 nm2 से 3.76 nm2 (मतलब 3.60 nm2) तक भिन्न होता है, Fv/ Fm 0.52 से 0.60 (मतलब 0.55) तक भिन्न होता है, और NPQNSV 0.66 से 0.85 (मतलब 0.82) तक भिन्न होता है। इन परिणामों को मान्य करने के लिए, हमने एएफ -6 माध्यम (तालिका 4) में स्थिर चरण के लिए प्लवक चरण के दौरान कोलासियम एसपी फोटोफिजियोलॉजी में भिन्नताओं की जांच की। संलग्न चरण के लिए माध्य Fv / FM और NPQNSV प्लवक चरण के समान थे जब AF-6 माध्यम में इनक्यूबेट किया गया था।

दोनों संलग्न और प्लवक चरणों में Colacium sp. photophysiology पर Ca और Mn के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, हमने Ca और Mn संवर्धन प्रयोगों का प्रदर्शन किया। 7 मई, 2021 को बिवा झील के रीड क्षेत्र से नमूने लिए गए थे। अंधेरे परिस्थितियों में कोलासियम एसपी के संलग्न चरण के लिए, उपचार के बीच फोटोफिजियोलॉजिकल मापदंडों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, सिवाय एमएन और सीए उपचार के बीच एनपीक्यूएनएसवी के 3 घंटे में, जहां सीए < एमएन (चित्रा 7 ए, सी, ई)। इसके अलावा, σ PSII', Fq′/Fm′, और संलग्न चरण के दौरान प्रकाश बढ़ाने के लिए NPQNSV प्रतिक्रियाओं ने उपचारों के बीच कोई स्पष्ट अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 8A, C, E और चित्रा 9A, C, E)। हालांकि, NPQNSV 21 h (11 और 25 μmol photon·m−2·s−1, चित्रा 9E) पर कम प्रकाश तीव्रता पर नियंत्रण की तुलना में Ca उपचार में कम होता है। प्लवक चरण के लिए, σ PSII 3 h (चित्रा 7B) पर Ca उपचार की तुलना में Mn में काफी कम था। Fq′/Fm' काफी अधिक था, लेकिन NPQNSV 21 h (चित्रा 7D, F) पर नियंत्रण की तुलना में Mn उपचार में कम था। बढ़ती रोशनी के तहत, Mn ने σ PSII को कम करने और प्लवक चरण के दौरान Fq'/ Fm' को बढ़ाने की प्रवृत्ति की, 3 h (चित्रा 8D) पर नियंत्रण की तुलना में। इसी तरह, Mn ने 21 h (चित्रा 9F) पर नियंत्रण की तुलना में प्लवक चरण के दौरान NPQNSV को काफी कम कर दिया। संलग्न चरण के समान, कैल्शियम ने बढ़ते प्रकाश (चित्रा 9 एफ) के तहत प्लवक चरण के लिए एनपीक्यूएनएसवी में थोड़ा सुधार किया। हालांकि, Ca ने Fq′/Fm' को कम कर दिया और 44-200 μmol photon·m−2·s−1 के तहत Mn उपचार की तुलना में प्लवक चरण के लिए NPQNSV में वृद्धि की।

Figure 1
चित्रा 1: कोलेसियम एसपी और पदार्थ जीव स्कैफोलेबेरिस म्यूक्रोनेटा। (ए) संक्रमित एस म्यूक्रोनाटा। (बी) संक्रमित एस म्यूक्रोनाटा ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ तय किया गया। (C) जीवित एस म्यूक्रोनेटा पर संलग्न कोलेसियम कोशिकाएं। (d) पिघले हुए कैरापेस पर संलग्न कोलेसियम कोशिकाएं। (ई, एफ) प्लवक (पाल्मेला) चरण के कोलेसियम एसपी। (जी) गैर-संक्रमित एस म्यूक्रोनाटा। तीर कोलेसियम कोशिकाओं को इंगित करते हैं। स्केल बार: 200 μm (A, B, और G), 10 μm (C, E, और F), और 100 μm (D)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: फ़िल्टर्ड झील के पानी (FLW) के नीचे पिपेटिंग द्वारा ज़ोप्लांकटन को धोना। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: Act2Run सॉफ़्टवेयर उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस. (A) प्रत्येक actinic प्रकाश चरण के लिए एक्सपोज़र समय; (बी) एक्टिनिक प्रकाश के चरणों और फोटॉन फ्लक्स की संख्या; (c) उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का संयोजन; (डी) संतृप्ति और विश्राम flashlet अनुक्रम; (ई) पानी की जैकेट और नमूना मिश्रण पंपों की आवृत्तियों और तीव्रता; (एफ) 444 (यहां 450 के रूप में दर्शाया गया है), 512 (530), और 633 एनएम (624), फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज पर उत्तेजना फ्लैश का फोटॉन फ्लक्स, और अनुक्रम की प्रतिकृति और अंतराल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: Act2Run सॉफ्टवेयर पर अल्गल नमूने के प्रतिदीप्ति पढ़ने. लाल और नीली रेखाएं क्रमशः संतृप्ति और विश्राम चरणों दोनों में फ्लैशलेट और वक्र फिटिंग के अनुक्रम द्वारा कच्चे प्रतिदीप्ति संकेत को इंगित करती हैं। अधिक जानकारी के लिए Kolber et al.2 देखें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: बेसलाइन प्रतिदीप्ति पर एस म्यूक्रोनेटा घनत्व का प्रभाव। छोटे डॉट्स प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 3)। एनोवा परीक्षण के परिणाम भी दिखाए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: प्लवक चरण के दौरान (ए) एफओ (बी) σ पीएसआईआई, (सी) एफवी / एफएम, और (डी) कोलाशियम एसपी के लिए एनपीक्यूएनएसवी पर एस म्यूक्रोनाटा घनत्व के प्रभाव। छोटे डॉट्स प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 3)। कोलेसियम एसपी को एएफ -6 माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था। एनोवा और टुकी पोस्ट-हॉक परीक्षण के परिणाम भी प्रस्तुत किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: (ए, बी) अवशोषण क्रॉस-सेक्शन, (सी, डी) पीएसआईआई फोटोकेमिस्ट्री, और (ई, एफ) (ए, सी, ई) संलग्न चरण और (बी, डी, एफ) के गैर-फोटोकैमिकल शमन की प्रतिक्रियाएं कोलासियम एसपी के प्लवक चरण में सीए और एमएन के अलावा 3 एच और 21 एच पर। छोटे डॉट्स प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 4)। एनोवा और टुकी पोस्ट-हॉक परीक्षण के परिणाम भी प्रस्तुत किए जाते हैं। * पी < 0.05. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्रा 8: (ए, बी) अवशोषण क्रॉस-सेक्शन, (सी, डी) पीएसआईआई फोटोकेमिस्ट्री, और (ई, एफ) कोलासियम एसपी के गैर-फोटोकैमिकल शमन की तीव्र-प्रकाश प्रतिक्रियाएं संलग्न और प्लवक चरणों में सीए और एमएन के अलावा के बाद 3 घंटे में स्टेपवाइज लाइट प्रोटोकॉल के लिए। सी, नियंत्रण; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. (a) C और Ca, (b) C और Mn, और (c) Ca और Mn के बीच महत्वपूर्ण अंतर प्रत्येक PAR फ्लक्स पर, p < 0.05 के महत्व स्तर के साथ प्रत्येक पैनल में दिखाया गया है। त्रुटि पट्टी, माध्य एसडी (n = 4). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्रा 9: (ए, बी) अवशोषण क्रॉस-सेक्शन, (सी, डी) पीएसआईआई फोटोकेमिस्ट्री, और (ई, एफ) कोलासियम एसपी के गैर-फोटोकैमिकल शमन की तीव्र-प्रकाश प्रतिक्रियाएं संलग्न और प्लवक चरणों में सीए और एमएन के अलावा के बाद 21 घंटे में स्टेपवाइज लाइट प्रोटोकॉल के लिए। सी, नियंत्रण; Ca, 200 μM Ca; Mn, 40 μM Mn. (a) C और Ca, (b) C और Mn, और (c) Ca और Mn के बीच महत्वपूर्ण अंतर प्रत्येक PAR फ्लक्स पर, p < 0.05 के महत्व स्तर के साथ प्रत्येक पैनल में दिखाया गया है। त्रुटि पट्टी, माध्य एसडी (n = 4). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अवधि परिभाषा इकाइयों
आधारभूत प्रतिदीप्ति Chl-a प्रतिदीप्ति के बिना Fo मान
F' एक एकल टर्नओवर माप के zeroth flashlet पर प्रतिदीप्ति जब C>0
फो (π) शून्य फ़्लैशलेट पर न्यूनतम PSII प्रतिदीप्ति उपज (पृष्ठभूमि प्रकाश के तहत)
Fv (π) Fm(å) − Fo(â)
Fm (π) अधिकतम PSII प्रतिदीप्ति उपज (पृष्ठभूमि प्रकाश के तहत)
Fv/Fm अंधेरे के तहत अधिकतम PSII फोटोकैमिकल दक्षता
Fq/FM पृष्ठभूमि प्रकाश के तहत अधिकतम PSII फोटोकैमिकल दक्षता, (Fm− F)/(Fmå)
NPQNSV सामान्यीकृत स्टर्न-वोल्मर शमन, FO/(Fmå − FO)
[RCII] अभिक्रिया केंद्र की सांद्रता
RπPSII (π) एक एकल टर्नओवर संतृप्ति चरण के पहले फ्लैशलेट के दौरान एक RCII के बंद होने की संभावना (पृष्ठभूमि प्रकाश के तहत)
σ PSII (π) उत्तेजना flashlets के लिए PSII के कार्यात्मक अवशोषण क्रॉस सेक्शन (पृष्ठभूमि प्रकाश के तहत) nm2

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले शब्द।

घटक परिमाण
NaNO3 140 मिलीग्राम · L−1
NH4NO3 22 mg· L−1
MgSO4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 10 मिलीग्राम · L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 मिलीग्राम · L−1
CaCO3 10 मिलीग्राम · L−1
Fe-साइट्रेट* 2 mg· L−1
साइट्रिक एसिड * 2 mg· L−1
बायोटिन 0.002 मिलीग्राम · L−1
Vit.B 1 0.01 मिलीग्राम · L−1
Vit.B 6 0.001 मिलीग्राम · L−1
Vit.B 12 0.001 मिलीग्राम · L−1
ट्रेस धातुओं 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1.0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0.4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0.005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0.002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0.004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7.5 mg·mL−1)

तालिका 2: AF-6 माध्यम के लिए नुस्खा. पीएच को 6.6 पर समायोजित करें। गर्म H2O में Fe-साइट्रेट और साइट्रिक एसिड को अलग-अलग भंग करें और दोनों अभिकर्मकों को मिलाने के बाद HCl (1 mL·L−1) जोड़ें। ट्रेस धातुओं की सामग्री कोष्ठक में दिखाया गया है।

नमूनाकरण दिनांक नमूना सं. पानी का तापमान।
(°C) 		S. mucronata घनत्व
(inds.· mL−1)		 कोलेसियम एसपी सेल घनत्व
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
27 अप्रैल/2020 नंबर 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
एसई 0.22 0.01 0.04
मई 21/2020 नंबर 2 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
एसई 0.16 0.02 0.06
नंबर 3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
एसई 0.09 0.01 0.02
नंबर 4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
एसई 0.12 0.00 0.02
18 जून/2020 No.5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
एसई 0.16 0.02 0.06
नंबर 6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
एसई 0.09 0.01 0.02
No.7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
एसई 0.12 0.00 0.02
20 जुलाई/2020 नंबर 8 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
एसई 0.10 0.00 0.00
औसत 3.60 0.55 0.82
एस.डी. 0.120349 0.03 0.10

तालिका 3: एस म्यूक्रोनेटा पर संलग्न कोलासियम एसपी की फोटोफिजियोलॉजी।

नमूनाकरण दिनांक नमूना सं. मध्यम वृद्धि तापमान (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
मई 21/2020 नंबर 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
एसई 0.03 0.00 0.01
18 जून/2020 नंबर 2 AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
एसई 0.08 0.02 0.07
20 जुलाई/2020 नंबर 3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
एसई 0.06 0.01 0.02
औसत 2.90 0.59 0.70
एस.डी. 0.18 0.05 0.16

तालिका 4: कोलेसियम एसपी प्लवक चरण के फोटोफिजियोलॉजी। प्रत्येक नमूने को स्थिर चरण के दौरान मापा गया था।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल ने पहली बार प्रदर्शित किया कि प्राकृतिक वातावरण में संलग्न चरण के दौरान कोलासियम एसपी की फोटोफिजियोलॉजी एएफ -6 माध्यम में इसके प्लवक चरण के बराबर है। इसके अतिरिक्त, भूखे एस म्यूक्रोनाटा की आंत सामग्री ने बेसलाइन और Chl-a प्रतिदीप्ति को प्रभावित नहीं किया जब घनत्व ≤5 inds·mL−1 (चित्रा 5 और चित्रा 6) ≤ था। इन परिणामों से पता चलता है कि यह प्रोटोकॉल कम सब्सट्रेट जीव बहुतायत के तहत सुधार के बिना संलग्न चरण के दौरान कोलासियम एसपी के फोटोफिजियोलॉजी को माप सकता है। हालांकि, चरण 3.2.1-3.2.8 के परिणामों से पता चला है कि उच्चतम एस म्यूक्रोनेटा बहुतायत ने Fv / Fm और NPQNSV को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित किया, लेकिन FO और σ PSII (चित्रा 4) नहीं। यहां, यह संभव है कि उच्च जीव घनत्व ने कोलेसियम एसपी व्यक्तियों पर शारीरिक तनाव को बढ़ा दिया और बाद में प्रकाश संश्लेषक गतिविधि में कमी आई। सब्सट्रेट जीवों या अन्य प्रजातियों की एक उच्च बहुतायत के तहत माप के लिए, बेसलाइन और Chl-a प्रतिदीप्ति पर सब्सट्रेट जीव घनत्व के प्रभावों को और अधिक ध्यान देने की आवश्यकता होती है।

FRRfs रैखिक इलेक्ट्रॉन प्रवाह और फाइटोप्लांकटन 22,56,57 के गैर-फोटोकैमिकल शमन पर पोषक तत्वों के हेरफेर के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। प्राथमिक परिणामों से पता चलता है कि Ca और Mn संवर्धन Colacium sp. जीवन चरणों (चित्रा 7, चित्रा 8, और चित्रा 9) के बीच काफी भिन्न थे। विशेष रूप से, मैंगनीज ने स्पष्ट रूप से PSII (Fv / Fm और Fq′/ Fm′) की (अधिकतम) फोटोकैमिकल उपज में सुधार किया और अंधेरे (चित्रा 7 D, F) और प्रकाश की स्थिति (चित्रा 8D, F और चित्रा 9D, F) के तहत प्लवक चरणों के गर्मी अपव्यय (NPQNSV) 50 को कम कर दिया। ये परिणाम PSII, σ PSII, और σ PSII' (चित्रा 7B और चित्रा 8B) पर कम एंटीना आकार से स्टेम कर सकते हैं, जो अतिरिक्त प्रकाश अवशोषण 58,59 को कम करता है। PSII परिसरों के बीच ऊर्जा प्रवाह के अलावा एंटीना आकार को मापने से अल्गल प्रतिक्रिया 10 के अधिक सटीक माप की अनुमति मिलेगी। यह प्रोटोकॉल अन्य संसाधनों द्वारा प्रकाश संश्लेषण सीमाओं की परीक्षा की भी अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, नाइट्रोजन और फास्फोरस सीमाओं की जांच विभिन्न फाइटोप्लांकटन समुदायों में की गई है, लेकिन एपिज़ोइक शैवाल में नहीं, कोलाशियम 41 और समुद्री एपिज़ोइक डायटम60,61 पर अनुमानित प्रभावों के बावजूद। पोषक तत्वों के अलावा, प्रकाश वातावरण आगे epizoic शैवाल वितरण 44 को प्रभावित कर सकते हैं।

जैसा कि चित्रा 7, चित्रा 8, और चित्रा 9 में दिखाया गया है, क्यूवेट-प्रकार FRRf हमें लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय और माप प्रयास के बिना पोषक तत्वों और प्रकाश प्रभावों की एक साथ जांच करने में सक्षम बनाता है। यह stepwise प्रकाश प्रोटोकॉल (चरण 6.1.5) भी सापेक्ष इलेक्ट्रॉन परिवहन दरों (rETR = Fq′/Fm′× प्रकाश) बनाम प्रकाश के लिए एक एनालॉग के रूप में प्रकाश बनाम प्रकाश के तेजी से प्रकाश घटता आकर्षित कर सकते हैं62. हालांकि, हालांकि PSII में रैखिक इलेक्ट्रॉन प्रवाह का अनुमान FRRf द्वारा फोटोफिजियोलॉजिकल मापदंडों से लगाया जा सकता है, यह जरूरी नहीं कि कार्बन निर्धारण दर 63,64 के अनुरूप हो। कार्बन-आधारित प्राथमिक उत्पादन का अनुमान लगाने के लिए, प्रति सीओ 2 निर्धारण (Πe, C) इलेक्ट्रॉन की आवश्यकता, जो अस्थायी और स्थानिक रूप से भिन्न हो सकती है5,48, विषय समुदायों का आकलन करते समय जांच की जानी चाहिए।

यदि प्लवक नेट मलबे से भरा हुआ है, तो एक बड़े जाल द्वारा प्रीस्क्रीन, जैसे कि 5-मिमी जाल जाल, या निस्पंदन के बिना एक पिपेट का उपयोग करके झील के पानी से सीधे ज़ोप्लांकटन चुनें। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संलग्न शैवाल को कुछ नुकसान हो सकता है, भले ही निस्पंदन अपेक्षाकृत बड़े (200 μm) जाल आकार का उपयोग करके धीरे से आयोजित किया जाता है। यद्यपि परिणामों से पता चलता है कि PSII पैरामीटर का मानक विचलन छोटा था (तालिका 3), और मापदंडों के औसत मान सुसंस्कृत प्लवक चरण (तालिका 4) के समान थे, निस्पंदन के बिना नमूनाकरण आदर्श हो सकता है।

इस अध्ययन की एक और सीमा σ पीएसआईआई प्राप्त करना था। Actinic प्रकाश और Chl-एक प्रतिदीप्ति क्षीणन FRRfs, जो सटीक σ PSII निर्धारण 65 के लिए ऑप्टिकल रूप से पतले नमूनों पर निर्भर करता है पर एक प्रमुख प्रभाव / विरूपण डाल सकते हैं। यद्यपि हमने दिखाया कि एस म्यूक्रोनाटा ने प्लवक कोलेसियम कोशिकाओं के σ पीएसआईआई को प्रभावित नहीं किया, लेकिन संलग्न कोलासियम कोशिकाओं के σ पीएसआईआई से संबंधित जांच की जानी चाहिए। इसके अलावा, एक वर्णक्रमीय सुधार कारक (एससीएफ) σ पीएसआईआई इन सीटू 66 अनुमान के लिए आवश्यक होगा क्योंकि ACT2 सिस्टम (444 एनएम) की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य इन सीटू प्रकाश वातावरण के वर्णक्रमीय वितरण से अलग है। सामान्य तौर पर, फ़िल्टर पैड तकनीक का उपयोग एससीएफ की गणना करने के लिए Chl-एक विशिष्ट अवशोषण स्पेक्ट्रम को मापने के लिए किया जाता है। यह प्रक्रिया FRRfs द्वारा अल्गल प्राथमिक उत्पादकता का अनुमान लगाने के लिए आवश्यक है। चूंकि हम अध्ययन अवधि के माध्यम से पर्याप्त संलग्न कोलेसियम कोशिकाओं की कटाई नहीं कर सकते थे, इसलिए भविष्य के अध्ययनों में सीएचएल-एक विशिष्ट अवशोषण स्पेक्ट्रम की जांच की जानी चाहिए।

क्यूवेट-प्रकार के FRRf को लागू करना सब्सट्रेट आकार पर निर्भर होना चाहिए क्योंकि पेरिफाइटिक शैवाल को सब्सट्रेट अनुलग्नक की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, अविनाशी पदार्थों पर शैवाल के अध्ययन, जैसे कि चट्टान67, बड़े जीव26,68, या सहजीवी शैवाल, जिसमें कठोर कोरल 10,69,70 से जुड़े सिम्बियोडिनियम शामिल हैं, को पनडुब्बी-प्रकार FRRf69 की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, यदि बेसिबियंट एक क्यूवेट में खुद को निलंबित करने के लिए पर्याप्त छोटा है, तो एक क्यूवेट-प्रकार एफआरआरएफ एक क्यूवेट-प्रकार के पीएएम के अलावा पर्याप्त हो सकता है, जैसे कि बेंथिक शैवाल 16,17,18। दरअसल, हाल के अध्ययनों ने बर्फ शैवाल 24,25 के फोटोफिजियोलॉजी को मापने के लिए एक क्यूवेट-प्रकार के एफआरआरएफ का पता लगाया है। इसके अलावा, 512 और 633 एनएम पर उत्तेजना फ्लैश को चालू करने से विभिन्न पीएसआईआई एंटीना पिगमेंट, फाइकोएरिथ्रिन और फाइकोसायनिन के साथ साइनोबैक्टीरिया के लिए आवेदन को सक्षम बनाता है, और इस प्रकार Chl-a71 के साथ अलग-अलग अवशोषण चोटियां। जैसा कि बहु-उत्तेजना तरंग दैर्ध्य को शामिल करने वाले वर्तमान FRRf मॉडल साइनोबैक्टीरिया फोटोफिजियोलॉजी और उत्पादकता 7,66,72 की जांच के लिए उपयोगी उपकरण हैं, ये बेंथिक साइनोबैक्टीरिया का आकलन करने के लिए उपयोगी तरीके होने चाहिए, अगर फोटोफिजियोलॉजिकल मापदंडों पर नमूना मोटाई के प्रभावों में सुधार किया जाएगा65 . भविष्य के अध्ययनों में, FRRfs को विषय जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला के उद्देश्य से विभिन्न आवासों में अल्गल फोटोफिजियोलॉजी के जटिल तंत्र पर आगे की अंतर्दृष्टि डालने के लिए किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कोई प्रकटीकरण नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को शिगा प्रीफेक्चर से सहयोगात्मक अनुसंधान कोष द्वारा समर्थित किया गया था जिसका शीर्षक था "जल पर्यावरण की सुदृढ़ता की सुरक्षा के लिए पानी की गुणवत्ता और झील के नीचे के वातावरण पर अध्ययन" क्षेत्रीय पुनरुद्धार के लिए जापानी अनुदान और पर्यावरण अनुसंधान और प्रौद्योगिकी विकास निधि (संख्या 5-1607) पर्यावरण मंत्रालय, जापान के तहत। https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html। लेखक अंग्रेजी भाषा की समीक्षा के लिए एनागो (www.enago.jp) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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एक Cuvette-प्रकार तेजी से पुनरावृत्ति दर फ्लोरोमीटर द्वारा <em>कोलाशियम</em> एसपी के संलग्न चरण के फोटोफिजियोलॉजी को मापने
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

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