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Biology

Medindo fotofisiologia do estágio anexado de Colacium sp. por um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette

Published: November 12, 2021 doi: 10.3791/63108
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2, 1
1Lake Biwa Branch Office, National Institute for Environmental Studies, 2Center for Regional Environmental Research, National Institute for Environmental Studies, 3Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 4Lake Biwa Environmental Research Institute

Summary

Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método benéfico para medir fotofilosiologia fotossiológica II e produtividade primária. Aqui descrevemos um protocolo para medir a fotofisiologia PSII de algas epizoicas, Colacium sp. em zooplâncton substrato usando FRRf tipo cuvette.

Abstract

Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método benéfico para medir fotosiologia II (PSII) e produtividade primária. Embora a FRRf possa medir a seção transversal de absorção do PSII (σ PSII), eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm), eficiência fotoquímica eficaz (Fq′/Fm′) e saciamento não fotoquímico (NPQNSV) para várias algas eucarióticas e cianobactérias, quase todos os estudos frrf até o momento se concentraram em fitoplâncton. Aqui, o protocolo descreve como medir a fotofisiologia psii de uma alga epizoica Colacium sp. Ehrenberg 1834 (Euglenophyta), em seu estágio anexo (ligado ao zooplâncton), usando FRRf tipo cuvette. Primeiro, estimamos os efeitos do zooplâncton substrato (Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776, Cladocera, Daphniidae) na fluorescência da linha de base e σ PSII, Fv/Fm, Fq′/Fm′, e NPQNSV de Colacium planctônico sp. Para validar essa metodologia, foram registradas medições fotofisiologia do Colacium sp. anexado em S. mucronata e comparamos esses resultados com sua fase planctônica. Resultados representativos mostraram como o protocolo poderia determinar os efeitos do cálcio (Ca) e manganês (Mn) na fotofisiologia de Colacium sp. e identificar os diversos efeitos do enriquecimento de Mn entre estágios ligados e plantônicos. Finalmente, discutimos a adaptabilidade deste protocolo a outras algas perifitárias.

Introduction

A fluorescência variável de clorofila é uma ferramenta útil para medir a fotofilosiologia alcanela II (PSII). As algas respondem a diversos estresses ambientais, como excesso de luz e deficiência de nutrientes, alterando sua fotofisiologia PSII. Fluorometer de taxa de repetição rápida (FRRf) é um método comum para medir a fotofisiologia PSII1,2 e estimar a produtividade primária1,3,4, o que permite monitorar a fotofisiologia fitoplâncton PSII, bem como a produtividade primária em larga escala espacial e temporal5,6,7. A FRRf pode medir simultaneamente a seção transversal de absorção do PSII (σ PSII), concentração do centro de reação ([RCII]), eficiência fotoquímica máxima (Fv/Fm), eficiência fotoquímica eficaz (Fq'/Fm′) e saciamento não fotoquímico (NPQNSV) (Tabela 1). Em geral, Fv/Fm e Fq'/Fm′ são definidos como atividade PSII8, enquanto NPQNSV é definido como energia relativa dissipada pelo calor9.

É importante ressaltar que os flashes de rotatividade única (ST) de FRRf reduzem totalmente o principal aceitador de elétrons de quinone, QA, mas não a piscina de plastoquinona. Por outro lado, vários flashes de rotatividade (MT) a partir de um fluorômetro de modulação de amplitude de pulso (PAM) podem reduzir ambos. O método ST tem uma clara vantagem sobre o método MT ao identificar as possíveis origens do NPQNSV, medindo simultaneamente cinéticas de recuperação de Fv/Fm, Fq'/Fm′, NPQNSV e σ PSII10. Até o momento, vários tipos de instrumentos FRRf, como tipo submersível, tipo cuvette e fluxo através do tipo, estão disponíveis comercialmente. O FRRf do tipo submersível permite medições in situ em oceanos e lagos, enquanto o FRRf do tipo cuvette é adequado para medir pequenos volumes de amostra. O tipo de fluxo é comumente usado para medir continuamente a fotofisiologia do fitoplâncton em águas superficiais.

Dado o desenvolvimento de fluorômetros PAM, incluindo o tipo cuvette, para uma ampla gama de indivíduos11, fluorômetros PAM ainda são mais comuns do que FRRfs em pesquisa de fotofisiologia alga ágala12. Por exemplo, embora a estrutura da câmara de amostra e a capacidade de cuvette entre essas ferramentas só diferem ligeiramente, o PAM tipo cuvette foi aplicado aos fitoplânctons13,14,15, microalgas benthic16,17,18, algas de gelo19 e algas epizoicas20, enquanto a FRRf tipo cuvette foi aplicada principalmente aos fitoplânctons21,22,23 e um número limitado de comunidades algas de gelo24,25. Dada a sua eficácia, a FRRf do tipo cuvette é igualmente aplicável às algas benthic e epizoicas. Portanto, a expansão de sua aplicação fornecerá uma visão considerável da fotofisiologia psii, particularmente para fotofisiologia de algas epizoicas menos conhecidas.

As algas epizoicas têm recebido pouca atenção, com poucos estudos examinando sua fotofisiologia PSII20,26, provavelmente devido a seus papéis menores em teias de alimentos aquáticos27,28. No entanto, epibiontes, incluindo algas epizoicas, podem influenciar positivamente a dinâmica da comunidade zooplâncton, como o aumento das taxas de reprodução e sobrevivência29,30, bem como processos de impacto negativo, como o aumento da taxa de afundamento29,31 e a vulnerabilidade aos predadores visuais32,33,34,35,36 . Por isso, é fundamental explorar os fatores ambientais e biológicos que controlam a dinâmica dos epibiontes nas comunidades zooplânctons.

Entre as algas epizoicas, Colacium Ehrenberg 1834 (Euglenophyta) é um grupo comum, de água doce, alga32,37,38,39 com várias fases de vida, incluindo anexado (Figura 1A-D), planktônico não motile (Figura 1E,F) e estágios plantônicos motile40,41 . Durante o estágio plantônico não motil, as células vivem como plânctons unicelulares, colônias agregadas, ou colônias de folhas de uma camada, cobertas por mucilage42. No estágio anexo, Colacium sp. utiliza mucilagem excretada da extremidade anterior da célula37,39,41 para anexar a organismos substratos (basibionts), particularmente microcrustaceanos41,43. Seu ciclo de vida também envolve se separar do exoesqueleto derretido ou basibiont morto e nadar com sua flagela para encontrar outro organismo substrato39. Ambos os estágios planctônicos e anexados podem aumentar seu tamanho populacional por mitose40. Embora seu estágio anexado seja considerado um traço evolutivo para a coleta de recursos, como a luz44 e os elementos de rastreamento41,45,46, ou como estratégia de dispersão27, poucas evidências experimentais estão disponíveis sobre esses aspectos37,41,44 e os mecanismos-chave de apego são amplamente desconhecidos. Por exemplo, Rosowski e Kugrens esperavam que Colacium obtenha manganês (Mn) de copepods substratos41, concentrados no exoesqueleto47.

Aqui, descrevemos como medir a fotofisiologia PSII das algas planctônicas e o método de aplicação relacionado para segmentação de algas anexadas (anexando ao zooplâncton) com células colacium sp. usando a FRRf tipo cuvette. Utilizamos o sistema Act2 equipado com três diodos emissores de luz (LEDs) que fornecem energia de excitação flash centrada em 444 nm, 512 nm e 633 nm48. Aqui, 444 nm (azul) corresponde ao pico de absorção de cromofila a (Chl-a), enquanto 512 nm (verde) e 633 nm (laranja) correspondem aos picos de absorção de ficoerthrina e ficocyanina, respectivamente. O pico de detecção de sinal fluorescente é de 682 nm com largura de banda de 30 nm. Como é difícil encontrar a etapa planctônica do Colacium sp. em ambientes naturais, seu estágio anexo foi coletado para os experimentos. Entre os numerosos organismos substratos, Scapholeberis mucronata O.F. Müller 1776 (Branchiopoda, Daphniidae; Figura 1A,B,G) é uma das mais simples de manusear devido à sua velocidade de natação lenta, grande tamanho do corpo (400-650 μm) e comportamento único (pendurado de cabeça para baixo na superfície da água). Portanto, este protocolo utiliza o Colacium sp. anexado em S. mucronata como um estudo de caso do sistema Colacium-basibiont. Para evitar fluorescência derivada do conteúdo intestinal, S. mucronata estava faminta. Como um estudo anterior relatou que o sinal de fluorescência do conteúdo intestinal (algas ingeridas) apresenta uma redução de cinco vezes após 40 min49, esperávamos que 90 min de fome fossem suficientes para minimizar a possibilidade de fluorescência do conteúdo intestinal afetando a medição da FRRf com efeitos mínimos de estresse experimental para Colacium sp., como deficiência de nutrientes. Além disso, este protocolo foi aplicado para esclarecer o mecanismo de anexação do Colacium sp. e determinar como dois metais, cálcio (Ca) e manganês (Mn) afetam a fotofisiologia tanto de estágios planctônicos quanto anexados. O cálcio desempenha papéis-chave nas vias fotossintéticas50 de várias maneiras, e ambos os metais são necessários para construir os complexos em evolução de oxigênio do PSII51. Como o cálcio e o manganês são altamente concentrados na carapaça do zooplâncton 47, temos a hipótese de que a fotofisiologia de Colacium sp. pode responder com mais destaque ao enriquecimento de Ca e Mn durante a fase planctônica se esta fase de vida obter esses elementos de S. mucronata durante a fase anexada.

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Protocol

1. Amostragem

  1. Recolher água do lago da superfície por um balde. Para atingir Colacium sp. anexado ao filtro S. mucronata (Figura 1A-C) 0,5-10 L de água do lago usando uma rede de malha de nylon de 100 μm52.
    NOTA: S. mucronata muitas vezes agregado densamente em águas rasas, eutróficas, lamacentas, como entre as áreas de reed (phragmites).
  2. Armazene as amostras concentradas em garrafas plásticas de 500 mL com 350 mL de água do lago. Mantenha-se em condições escuras.
  3. No laboratório, despeje a água da amostra em um béquer de 500 mL e deixe que ela se acomode por alguns minutos.
  4. Filtre a água do lago através de um filtro de tamanho de poros de 0,2 μm.
  5. Pegue S. indivíduos de mucronata usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação. Realizar a identificação das espécies de acordo com Błędzki e Rybak53.
  6. Transfira-os para uma gota de 0,2-μm de água filtrada do lago (FLW) colocada em um escorregador de vidro.
    NOTA: S. mucronata pode nadar até a superfície ou se prender à parede do béquer.
  7. Verifique s. mucronata sob microscopia leve.
  8. Lave S. indivíduos de mucronata usando FLW (3 gotas ou mais) para evitar contaminação de outros organismos (Figura 2).
  9. Mantenha S. mucronata a uma temperatura in situ em uma câmara de crescimento sob 40 μmol fóton·m−2·s−1.

2. Efeitos de S . mucronata na fluorescência da linha de base

  1. S. cultivo de mucronata
    1. Pegue indivíduos de S. mucronata usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação e lave usando FLW, como na etapa 1.8.
    2. Aerate água da torneira usando uma bomba de ar elétrica através de uma pedra de ar por pelo menos 1 semana. Despeje 300 mL de água aerada da torneira em um frasco de vidro de 350 mL.
    3. Alimente chlorella (1 mg C·L−1) e mantenha a 20 °C sob 40 μmol fóton·m−2·s−1 em uma câmara de crescimento.
    4. Após aproximadamente 14 dias, pegue 5-30 indivíduos usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação e inocula-os em 300 mL de água limpa e arejada da torneira para manter o meio fresco.
  2. Configuração de FRRf
    1. Inicie o software Act2Run.
    2. Clique na guia Opções e selecione Act2 FLC (LEDs brancos) em Modo de Operação para definir a cor de LEDs actínicos.
    3. Clique no valor de Escuro na etapa 1 das configurações da curva de luz fluorescente na janela principal e digite 30 para definir a duração do período escuro (Figura 3A).
    4. Clique na combinação LED B, C e D para desligar os LEDs verde e laranja (Figura 3C).
    5. Clique no valor de Fets e Pitch sob sat, e tipo 100 e 2, respectivamente, para definir o número e o tom de flashlet na fase de saturação (Figura 3D).
    6. Clique no valor de Fets e Pitch sob Rel, e tipo 40 e 60, respectivamente, para definir o número e o tom de flashlet na fase de relaxamento (Figura 3E).
    7. Ative a bomba da capa de água clicando em Durante FLC (Figura 3F) para controlar a temperatura da amostra durante a medição.
    8. Ative clicando em Auto-LED e Auto-PMT (Figura 3F).
    9. Clique em Sincronizar para conectar FRRf-Act2.
  3. Medições frrf
    1. Para examinar os efeitos dos indivíduos zooplânctons na fluorescência da linha de base, prepare o S adulto. mucronata (tamanho corporal 400-650 μm) da cultura nas etapas 2.1.1-2.1.4 sem organismos ligados.
    2. Para evitar fluorescência do conteúdo intestinal, esflaçam os indivíduos em FLW a 20°C por pelo menos 90 minutos.
    3. Despeje 1,5 mL de FLW em uma cuvette. Pegue 0, 1, 5 e 10 indivíduos de mucronata s. usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação.
    4. Transferência S. mucronata indivíduos no cuvette e adicionar FLW para trazer a amostra até 2 mL.
    5. Aclimato sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) a 20 °C por 15 min antes da medição da FRRf.
    6. Clique no Act2 Run para iniciar a medição. Repita as medidas >3 vezes por amostra.
    7. Leia o valor fo da parcela de resultado (Figura 4).

3. Efeitos do organismo substrato em Chl- uma fluorescência

  1. Cultivo de Colacium sp.
    1. Prepare o FLW e o MÉDIO AF-654 para cultivo (Tabela 2).
    2. Recolher Colacium sp. anexado a S. mucronata como nas etapas 1.1 e 1.2 e, manter em temperatura in situ em uma câmara de crescimento.
    3. Pegue Colacium sp. com uma carapaça derretida (Figura 1D) usando uma pipeta sob um microscópio óptico a 100x de ampliação. Lave-os com FLW, como na etapa 1.8.
    4. Asepticamente inoculado Colacium sp. e meio AF-6 em um tubo de vidro de 10 mL em um banco limpo.
    5. Mantenha a cultura em temperatura in situ abaixo de 200 μmol fóton·m−2·s−1 em uma câmara de crescimento. Agite o tubo de vidro suavemente à mão pelo menos uma vez por dia para evitar a liquidação celular.
      NOTA: Para manter o efeito de atenuação das colônias agregadas o mais baixo possível, verifique as colônias sob um microscópio antes da medição da FRRf. A agregação celular pode causar colônias densas e afetar a fotofisiologia alga55.
  2. Medições frrf
    1. Para examinar os efeitos dos indivíduos zooplânctons em Chl-a fluorescência de Colacium sp., preparem s adultos. mucronata (tamanho corporal 400-650 μm) sem qualquer organismo ligado.
    2. Para evitar fluorescência do conteúdo intestinal, esfurre os indivíduos na FLW por pelo menos 90 minutos.
    3. Configure um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette (FRRf).
    4. Despeje um subsample de 1,5 mL de Colacium sp. pré-esculpido em uma cuvette. Transferência 0, 5, 10 e 15 S. mucronata indivíduos nestas cuvetas e adicionar 2 μm de meio filtrado para trazer a amostra até 2 mL.
    5. Aclimatar sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) a 20 °C por 15 minutos antes de tomar a medição frf.
      NOTA: Mantenha as amostras em temperatura de incubação durante as medições
    6. Clique no Act2 Run para iniciar a medição. Repita as medidas >3 vezes por amostra.
    7. Leia os valores de FO e Fm do gráfico de resultados (Figura 4).
      NOTA: Verifique o valor de RσPSII (Tabela 1), que mostra se a potência LED está dentro do intervalo ideal para estimar corretamente os parâmetros psii. Quando o Auto-LED é ativado, o sistema Act2run controla a potência LED para alcançar uma faixa RσPSII ótima (0.042-0.064). O valor de corte experimental de RσPSII foi definido em 0,03 e 0,08 em estudo anterior48.
    8. Para corrigir a fluorescência da linha de base22, filtrar o meio de cultura usando um filtro de tamanho de poros de 0,2 μm e medir a fluorescência. Subtrair FO da amostra de linha de base de FO e Fm de Colacium sp., ou modificar o valor de correção em branco nas configurações da guia Opções.

4. Fotofisiologia de Colacium sp. (estágio anexo)

  1. Isole indivíduos de S. mucronata com Colacium sp. usando uma pipeta sob um microscópio óptico.
  2. Lave S. mucronata usando FLW, como na etapa 1.8.
  3. Transferência S. mucronata em um 100 mL de FLW. Para a fome, mantenha-se sob condições escuras em temperatura in situ por 90 minutos.
  4. Despeje 1,5 mL de FLW em uma cuvette.
  5. Transferência ~10 S. mucronata indivíduos com Colacium sp. em uma cuvette. Para as medições, são necessárias mais de 100 células de Colacium por 2 mL. Adicione FLW para levar a amostra até 2 mL.
  6. Aclimatar sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) em temperatura in situ por 15 min. Medida Chl-a fluorescência como nas etapas 3.2.6-3.2.8.
  7. Para enumerar o número de células anexadas, fixar a amostra com glutaraldeído (volume final de 2%) após a medição da FRRf. Tire fotos em várias profundidades focais e posições de S. mucronata sob um microscópio leve.

5. Fotofisiologia de Colacium sp. (estágio planctônico)

  1. Cultivar colacium amostrado sp. em média AF-6 em temperatura in situ como nas etapas 3.1.1-3.1.5.
  2. Para a fase estacionária, pegue 2 mL de Colacium sp. cultivado e despeje em uma cuvette.
  3. Aclimatar sob pouca luz (1-10 μmol fóton·m−2·s−1) em temperatura in situ por 15 min. Medida Chl-a fluorescência como nas etapas 3.2.6-3.2.8.

6. Efeitos da adição de Ca e Mn na fotofisiologia de Colacium sp.

  1. Efeitos no estágio anexado
    1. Isole indivíduos de S. mucronata com Colacium sp. usando uma pipeta sob um microscópio óptico. Lave usando FLW, como na etapa 1.8.
    2. Transfira seis indivíduos cada um em 12 copos de vidro com 30 mL de FLW. Certifique-se de que cada béquer contém células de >100 Colacium sp.
    3. Adicionar 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamento ca), 40 μmol· L−1 MnCl4 (tratamento Mn), ou água ultrauso (controle) para cada béquer. Incubar as amostras sob 200 μmol fóton·m−2 ·s−1 em temperatura in situ em uma câmara de crescimento.
    4. Às 3h e 21h, transfira todos os indivíduos e peles fundidas em uma cuvette com 2 mL do meio.
    5. Para examinar a resposta rápida ao aumento da luz, clique em Up dos períodos de 8 passos de luz actínica e tipo 20 (Figura 3A) para definir a duração de cada etapa em 20 s. Para definir a luz actínica stepwise como 0, 11, 25, 44, 68, 101, 144 e 200 μmol fóton·m−2·s−1, clique em High E e Step Up e altere os valores para 200 e 34, respectivamente (Figura 3B).
    6. Após 15 minutos de aclimatação escura, meça a fluorescência chl-a de cada amostra semelhante aos passos 3.2.6-3.2.8.
      NOTA: Verifique se os valores RσPSII e RσPSII estão dentro da faixa ideal (0,03-0,08)48.
  2. Efeitos no estágio planctônico
    1. Cultivar colacium amostrado sp. em média AF-6 em temperatura in situ como nas etapas 3.1.1-3.1.5.
    2. Transfira o cultura colacium sp. para FLW e aclimatar a temperatura in situ inferior a 200 μmol fóton·m−2·s−1 por 3 dias.
    3. Transfira 1 mL das amostras aclimatadas em três frascos de vidro com 10 mL de FLW.
    4. Adicionar 200 μmol· L−1 CaCl2· H2O (tratamento ca), 40 μmol· L−1 MnCl3 (tratamento Mn), ou água ultrauso (controle) para frascos. Incubar as amostras sob 200 μmol fóton·m−2·s−1 em temperatura in situ em uma câmara de crescimento.
    5. Às 3h e 21h, meça a fluorescência chl-a de cada amostra como nas etapas 3.2.6-3.2.8.

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Representative Results

Não houve efeito significativo da fluorescência da linha de base (Figura 5) ou flauscência chl-a (Figura 6) por S. mucronata até 5 indivíduos (inds.) mL−1. No entanto, Fv/Fm e NPQNSV foram significativamente afetados quando a mucronata de S. foi de 7,5 inds·mL−1. Portanto, para medir a fotofisiologia de Colacium sp. durante a fase anexada, escolhemos S. mucronata com a maior carga de Colacium sp. a fim de alcançar abundância suficiente de Colacium sp. (>50 células·mL−1) e um baixo número de S. mucronata (≤5 inds·mL−1) no cuvette.

A Tabela 3 apresenta variação sazonal na fotofisiologia de Colacium sp. durante a fase anexada. Embora a temperatura amostral variasse, sua fotofisiologia permaneceu relativamente constante. σ PSII variou de 3,42 nm2 a 3,76 nm2 (média de 3,60 nm2), Fv/Fm variou de 0,52 a 0,60 (média 0,55) e NPQNSV variou de 0,66 a 0,85 (média de 0,82). Para validar esses resultados, investigamos ainda variações na fotofisiologia de Colacium sp. durante a fase planctônica para a fase estacionária no meio AF-6 (Tabela 4). O Fv/Fm médio e npqnsv para o estágio anexo foram semelhantes aos da etapa planctônica quando incubados no meio AF-6.

Para determinar o efeito de Ca e Mn em Colacium sp. fotofisiologia nas etapas anexadas e planctônicas, realizamos experimentos de enriquecimento de Ca e Mn. Amostras foram colhidas na área de cana do Lago Biwa em 7 de maio de 2021. Para o estágio anexado do Colacium sp. em condições escuras, não houve diferença significativa nos parâmetros fotofisiológicos entre os tratamentos, exceto para NPQNSV entre tratamentos Mn e Ca às 3h, onde Ca < Mn (Figura 7A,C,E). Além disso, as respostas σ PSII′, Fq'/Fm′, e NPQNSV ao aumento da luz durante a fase anexa não mostraram diferenças claras entre os tratamentos (Figura 8A,C,E e Figura 9A,C,E). No entanto, npqnsv tende a ser menor no tratamento ca do que o controle em baixa intensidade de luz a 21 h (11 e 25 μmol fóton·m−2·s−1, Figura 9E). Para a etapa planctônica, σ PSII foi significativamente menor no tratamento Mn do que ca em 3 h (Figura 7B). Fq'/Fm′ foi significativamente maior, mas o NPQNSV foi menor no tratamento Mn do que o controle em 21 h (Figura 7D,F). Sob luz crescente, Mn tendia a diminuir σ PSII e aumentar Fq'/Fm′ durante a fase planctônica, em comparação com o controle em 3 h (Figura 8D). Da mesma forma, mn reduziu significativamente NPQNSV durante a fase planktônica em comparação com o controle em 21 h (Figura 9F). Semelhante ao estágio anexado, o cálcio melhorou ligeiramente o NPQNSV para o estágio plantônico sob luz crescente (Figura 9F). No entanto, Ca diminuiu Fq'/Fm′ e aumentou o NPQNSV para o estágio plantônico em comparação com o tratamento Mn sob 44-200 μmol fóton·m−2·s−1 a 3 h (Figura 8D,F).

Figure 1
Figura 1: Colacium sp. e organismo de substâncias Scapholeberis mucronata. (A) S. mucronata infectada. (B) S. mucronata infectada fixada com glutaraldeído. (C) Células colacium anexadas em S. mucronata viva. (D) Células colacium anexadas na carapaça derretida. (E, F) Colacium sp. de estágio plantônico (palmella). (G) S. mucronata não infectada. Setas indicam células de Colacium. Barras de escala: 200 μm (A, B e G), 10 μm (C, E e F) e 100 μm (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Lavar zooplâncton por tubulação sob água filtrada do lago (FLW). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Interface do usuário de software Act2Run. (A) Tempo de exposição a cada passo de luz actínico; (B) Número de passos e fluxo de fótons de luz actínica; (C) Combinação de comprimento de onda de excitação; (D) Sequência de flashlet de saturação e relaxamento; (E) Frequências e intensidades das bombas de mistura de cana-d'água e amostra; (F) Fluxo de fóton de flash de excitação em 444 (denotado como 450 aqui), 512 (530) e 633 nm (624), tubo fotomultiplier (PMT) tensão, e réplicas e intervalo de sequência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Leitura de fluorescência da amostra de algas no software Act2Run. As linhas vermelha e azul indicam sinal de fluorescência crua por uma sequência de flashlet e encaixe de curva em fases de saturação e relaxamento, respectivamente. Consulte Kolber et al.2 para obter mais detalhes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: O efeito da densidade de S. mucronata na fluorescência da linha de base. Os pequenos pontos representam réplicas (n = 3). Os resultados do teste ANOVA também são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Os efeitos das densidades de S. mucronata em (A) FO (B) σ PSII, (C) Fv/Fm e (D) NPQNSV para Colacium sp. durante a fase planctônica. Os pequenos pontos representam réplicas (n = 3). Colacium sp. foi cultivado em meio AF-6. Os resultados do teste pós-hoc ANOVA e Tukey também são apresentados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Respostas da (A,B) seção transversal de absorção, (C,D) fotoquímica PSII, e (E,F) sacieciação não fotoquímica do estágio (A,C,E) e (B,D,F) estágio plantônico de Colacium sp. às 3h e 21 h após adição de Ca e Mn. Os pequenos pontos representam réplicas (n = 4). Os resultados do teste pós-hoc ANOVA e Tukey também são apresentados. * p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Respostas de luz rápida de (A, B) seção transversal de absorção, (C,D) fotoquímica PSII e (E,F) saciamento não fotoquímico de Colacium sp. em estágios anexados e planctônicos ao protocolo de luz stepwise às 3h após a adição de Ca e Mn. C, controle; Ca, 200 µM Ca; Mn, 40 μM Mn. Diferenças significativas entre (a) C e Ca, (b) C e Mn, e (c) Ca e Mn em cada fluxo PAR, com um nível de significância de p < 0,05 mostrado em cada painel. Barra de erro, SD Médio (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Respostas de luz rápida de (A,B) seção transversal de absorção, (C,D) fotoquímica PSII e (E,F) saciamento não fotoquímico de Colacium sp. em estágios anexados e plantônicos ao protocolo de luz stepwise às 21 h após a adição de Ca e Mn. C, controle; Ca, 200 µM Ca; Mn, 40 μM Mn. Diferenças significativas entre (a) C e Ca, (b) C e Mn, e (c) Ca e Mn em cada fluxo PAR, com um nível de significância de p < 0,05 mostrado em cada painel. Barra de erro, SD Médio (n = 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Prazo Definição Unidades
Fluorescência da linha de base Valor fo sem Chl-a fluorescence
F' Fluorescência em flashlet zeroth de uma única medição de volume de negócios quando C>0
Fo (20) Rendimento mínimo de fluorescência PSII (sob luz de fundo) em flashlet zeroth
Fv (20) Fm(0) − Fo(0)
Fm (20) Rendimento máximo de fluorescência PSII (sob luz de fundo)
Fv/Fm Máxima eficiência fotoquímica psii sob escuro
Fq/Fm² Máxima eficiência fotoquímica PSII sob luz de fundo,(Fm0− F)/(Fm)
NPQNSV Saciado normalizado stern-volmer, FO0/(Fm0 − FO0)
[RCII] Concentração de centro de reação
RσPSII (0) Probabilidade de um RCII ser fechado durante o primeiro flashlet de uma única fase de saturação de turnover (sob luz de fundo)
σ PSII (0) Seção transversal de absorção funcional do PSII para flashlets de excitação (sob luz de fundo) nm2

Tabela 1: Termos utilizados neste protocolo.

Componente Quantidade
NaNO3 140 mg· L−1
NH4NO3 22 mg· L−1
Mgso4·7H2O 30 mg· L−1
KH2PO4 10 mg· L−1
K2HPO4 5 mg· L−1
CaCl2·2H2O 10 mg· L−1
CaCO3 10 mg· L−1
Fe-citrato* 2 mg· L−1
Ácido cítrico* 2 mg· L−1
Biotina 0,002 mg· L−1
Vit.B 1 0,01 mg· L−1
Vit.B 6 0,001 mg· L−1
Vit.B 12 0,001 mg· L−1
Metais de rastreamento 1 mL·L−1
(FeCl3·6H2O) (1,0 mg·mL−1)
(MnCl3·4H2O) (0,4 mg·mL−1)
(ZnSO4·7H2O) (0,005 mg·mL−1)
(CoCl2·6H2O) (0,002 mg·mL−1)
(Na2MoO4) (0,004 mg·mL−1)
(Na2-EDTA) (7,5 mg·mL−1)

Tabela 2: Receita para o meio AF-6. Ajuste o pH para 6,6. Dissolver fe-citrato e ácido cítrico em H2O quente separadamente e adicionar HCl (1 mL·L−1) depois de misturar ambos os reagentes. O conteúdo dos metais de rastreamento são mostrados entre parênteses.

Data de amostragem Amostra Nº. Temperatura da água.
(°C) 		Densidade de s. mucronata
(inds.· mL−1)		 Colacium sp. densidade celular
(inds.· mL−1)		 σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
27 de abril/2020 Nº 1 14.2 4.5 77 3.42 0.60 0.66
SE 0.22 0.01 0.04
21/07/2020 Nº 2. 19.4 2 282.5 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
No.3 19.4 2 250.5 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
No.4 19.4 5 204.5 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
18 de junho de 2020 No.5 22.4 2.5 474 3.62 0.54 0.85
SE 0.16 0.02 0.06
No.6 22.4 2 410 3.55 0.56 0.77
SE 0.09 0.01 0.02
No.7 22.4 2.5 441 3.76 0.52 0.94
SE 0.12 0.00 0.02
20 de julho de 2020 Nº 8. 27.5 5 109 3.49 0.58 0.74
SE 0.10 0.00 0.00
Significar 3.60 0.55 0.82
S.D. 0.120349 0.03 0.10

Tabela 3: Fotofisiologia de Colacium sp. anexada em S. mucronata.

Data de amostragem Amostra Nº. Média Temperatura de crescimento (°C) σ PSII (nm2) Fv/Fm NPQNSV
21/07/2020 Nº 1 AF-6 19.4 2.72 0.65 0.53
SE 0.03 0.00 0.01
18 de junho de 2020 Nº 2. AF-6 22.4 3.07 0.55 0.84
SE 0.08 0.02 0.07
20 de julho de 2020 No.3 AF-6 27.5 2.90 0.58 0.73
SE 0.06 0.01 0.02
Significar 2.90 0.59 0.70
S.D. 0.18 0.05 0.16

Tabela 4: Fotofisiologia de Colacium sp. planktonic stage. Cada amostra foi medida durante a fase estacionária.

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Discussion

Este protocolo demonstrou pela primeira vez que a fotofisiologia de Colacium sp. durante a fase anexa em um ambiente natural é comparável à sua etapa planctônica no meio AF-6. Além disso, o conteúdo intestinal da esfomeada S. mucronata não afetou a linha de base e a fluorescência chl-a quando a densidade foi ≤5 inds·mL−1 (Figura 5 e Figura 6). Esses resultados sugerem que este protocolo pode medir a fotofisiologia de Colacium sp. durante o estágio anexado sem correção sob baixa abundância de organismos substratos. No entanto, os resultados das etapas 3.2.1-3.2.8 mostraram que a maior abundância de mucronata s. afetou Fv/Fm e NPQNSV significativamente, mas não FO e σ PSII (Figura 4). Aqui, é possível que a maior densidade do organismo exacerbou o estresse físico em indivíduos de Colacium sp. e, posteriormente, diminuiu a atividade fotossintética. Para medições sob uma alta abundância de organismos substratos ou outras espécies, os efeitos da densidade do organismo substrato na linha de base e da fluorescência chl-a requer mais atenção.

As FRRfs têm sido usadas para examinar o impacto da manipulação de nutrientes no fluxo linear de elétrons e a extinção não fotoquímica do fitoplâncton22,56,57. Os resultados primários mostram que o enriquecimento de Ca e Mn difere significativamente entre as etapas de vida de Colacium sp. (Figura 7, Figura 8 e Figura 9). Especificamente, o manganês melhorou claramente o (máximo) rendimento fotoquímico do PSII (Fv/Fm e Fq′/Fm′) e diminuiu a dissipação de calor (NPQNSV)50 de estágios plantônicos em condições escuras (Figura 7D,F) e condições de luz (Figura 8D,F e Figura 9D,F). Esses resultados podem decorrer da redução do tamanho da antena no PSII, σ PSII e σ PSII′ (Figura 7B e Figura 8B), o que reduz o excesso de absorção de luz58,59. Medir o tamanho da antena, além do fluxo de energia entre os complexos psii, permitiria medições mais precisas da resposta alga10. Este protocolo também permite o exame das limitações da fotossíntese por outros recursos. Por exemplo, limitações de nitrogênio e fósforo foram examinadas em várias comunidades fitoplâncton, mas não em algas epizoicas, apesar dos efeitos previstos sobre Colacium41 e diatomas epizoicos marinhos60,61. Além dos nutrientes, o ambiente leve pode influenciar ainda mais a distribuição de algas epizoicas44.

Como mostrado na Figura 7, Figura 8 e Figura 9, a FRRf do tipo cuvette nos permite examinar simultaneamente efeitos de nutrientes e leves sem longos tempos de incubação e esforço de medição. Este protocolo de luz stepwise (passo 6.1.5) também pode desenhar curvas de luz rápida de taxas relativas de transporte de elétrons (rETR = Fq'/Fm'× luz) versus luz como um analógico para a produção vs. curvas de luz62. No entanto, embora o fluxo de elétrons lineares no PSII possa ser estimado a partir de parâmetros fotofisiológicos pela FRRf, não é necessariamente análogo à taxa de fixação de carbono63,64. Para estimar a produção primária baseada em carbono, deve-se examinar a exigência de elétrons por fixação de CO2 (Пe, C), que pode variar temporal e espacialmente5,48, ao avaliar as comunidades sujeitas.

Se a rede de plâncton estiver entupida por detritos, pré-tela por uma malha maior, como uma rede de malha de 5 mm, ou colher zooplânctons diretamente da água do lago usando uma pipeta sem filtragem. Deve-se notar que algum dano pode ocorrer às algas anexadas mesmo quando a filtragem é conduzida suavemente usando um tamanho de malha relativamente grande (200 μm). Embora os resultados mostrem que o desvio padrão dos parâmetros do PSII foi pequeno (Tabela 3), e os valores médios dos parâmetros foram muito semelhantes aos do estágio plantônico culto (Tabela 4), a amostragem sem filtragem pode ser ideal.

Outra limitação deste estudo foi o σ PSII. A luz actínica e a atenuação da fluorescência chl-a podem exercer uma grande influência/distorção sobre as FRRfs, que se baseia em amostras opticamente finas para a determinação precisa σ PSII65. Embora tenhamos mostrado que a S. mucronata não afetou o σ PSII das células de Colacium planctônico, que devem ser examinadas relacionadas à σ PSII das células colacium anexadas. Além disso, seria necessário um fator de correção espectral (SCF) para o σ PSII na estimativa situ66, pois o comprimento de onda de excitação do sistema ACT2 (444 nm) difere da distribuição espectral do ambiente de luz in situ. Em geral, a técnica do bloco de filtro é usada para medir o espectro de absorção específico chl-a para calcular o SCF. Este procedimento é necessário para estimar a produtividade primária de algas pelas FRRfs. Como não pudemos colher células colacium suficientes anexadas durante o período de estudo, o espectro de absorção específico chl-a deve ser examinado em estudos futuros.

A implementação do FRRf tipo cuvette deve depender do tamanho do substrato, pois as algas perifísticas requerem um acessório de substrato. Por exemplo, estudos de algas em substâncias indestrutíveis, como rochas67, organismos maiores26,68, ou algas simbióticas, incluindo o simbiodinium associado a corais duros10,69,70, podem exigir o tipo submersível FRRf69. Por outro lado, se o basibionto for pequeno o suficiente para se suspender em uma cuvette, uma FRRf tipo cuvette pode ser suficiente, além de um PAM tipo cuvette, como algas benthic16,17,18. De fato, estudos recentes têm explorado uma FRRf do tipo cuvette para medir a fotofisiologia das algas de gelo24,25. Além disso, ligar o flash de excitação em 512 e 633 nm permite que a aplicação cianobactérias com diferentes pigmentos de antena PSII, ficoerythrins e ficocyanins, e, portanto, diferentes picos de absorção com Chl-a71. Como os modelos atuais de FRRf que incorporam comprimentos de onda multi-excitação são ferramentas úteis para examinar a fotofisiologia e produtividade da cianobactéria cianobactéria7,66,72, estes devem ser métodos úteis para avaliar cianobactérias bentíficas, se os efeitos da espessura da amostra nos parâmetros fotofísicos fossem melhorados65 . Em estudos futuros, as FRFs devem ser destinadas a uma gama mais ampla de organismos sujeitos para desa uma visão mais aprofundada sobre os mecanismos complexos da fotofisiologia alga em vários habitats.

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Disclosures

Os autores não têm revelações para declarar.

Acknowledgments

O trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa Colaborativa da Prefeitura de Shiga intitulado "Estudo sobre a qualidade da água e meio ambiente no fundo do lago para a proteção da solidez do ambiente hídrico" sob a Concessão Japonesa de Revitalização Regional e o Fundo de Pesquisa e Desenvolvimento De Tecnologia ambiental (nº 5-1607) do Ministério do Meio Ambiente, Japão. https://www.kantei.go.jp/jp/singi/tiiki/tiikisaisei/souseikoufukin.html. Os autores gostariam de agradecer a Enago (www.enago.jp) pela revisão da língua inglesa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acrodisc syringe filter Pall Corporation, Ann Arbor, MI, USA 0.2 μm pore size
Act2Run CTG Ltd., West Molesey, UK
Biotin Wako 023-08711 AF-6 medium
CaCl2·2H2O Wako 031-25031 AF-6 medium
CaCO3 Wako 036-00382 AF-6 medium
Citric acid Wako 036-05522 AF-6 medium
CoCl2·6H2O Wako 036-03682 AF-6 medium
Concentrated Chlorella Recenttec, Tokyo, Japan 20 mg C·mL−1 ; store at 4 °C
FastOcean Act2 CTG Ltd., West Molesey, UK
Fe-citrate Wako 093-00952 AF-6 medium
FeCl3·6H2O Wako 091-00872 AF-6 medium
HCLP-880PF Nippon Medical and Chemical Instruments
 Co., Ltd., Osaka, Japan		 With LED light bulbs
K2HPO4 Wako 160-04292 AF-6 medium
KH2PO4 Wako 167-04241 AF-6 medium
MgSO4·7H2O Wako 137-00402 AF-6 medium
MnCl3·4H2O Wako 139-00722 AF-6 medium
Na2EDTA Wako 343-01861 AF-6 medium
Na2MoO4 Wako 196-02472 AF-6 medium
NaNO3 Wako 191-02542 AF-6 medium
NH4NO3 Wako 015-03231 AF-6 medium
Plankton Counter Matsunami Glass, Osaka, Japan S6300
Pylex test tube CTG Ltd., West Molesey, UK With rim, 16 x 100 mm
Vit. B1 Wako 203-00851 AF-6 medium
Vit. B12 Wako 226-00343 AF-6 medium
Vit. B6 Wako 165-05401 AF-6 medium
ZnSO4·7H2O Wako 264-00402 AF-6 medium

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References

  1. Kolber, Z., Falkowski, P. G. Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1646-1665 (1993).
  2. Kolber, Z. S., Prášil, O., Falkowski, P. G. Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1367 (1), 88-106 (1998).
  3. Oxborough, K., Moore, C. M., Suggett, D. J., Lawson, T., Chan, H. G., Geider, R. J. Direct estimation of functional PSII reaction center concentration and PSII electron flux on a volume basis: a new approach to the analysis of Fast Repetition Rate fluorometry (FRRf) data. Limnology and Oceanography: Methods. 10 (3), 142-154 (2012).
  4. Smyth, T. J., Pemberton, K. L., Aiken, J., Geider, R. J. A methodology to determine primary production and phytoplankton photosynthetic parameters from fast repetition rate fluorometry. Journal of Plankton Research. 26 (11), 1337-1350 (2004).
  5. Lawrenz, E., et al. Predicting the electron requirement for carbon fixation in seas and oceans. PLoS ONE. 8 (3), 58137 (2013).
  6. Zhu, Y., et al. Relationship between light, community composition and the electron requirement for carbon fixation in natural phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 580, 83-100 (2017).
  7. Schuback, N., Tortell, P. D. Diurnal regulation of photosynthetic light absorption, electron transport and carbon fixation in two contrasting oceanic environments. Biogeosciences. 16 (7), 1381-1399 (2019).
  8. Cosgrove, J., Borowitzka, M. A. Chlorophyll fluorescence terminology: an introduction. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 1-17 (2010).
  9. McKew, B. A., et al. The trade-off between the light-harvesting and photoprotective functions of fucoxanthin-chlorophyll proteins dominates light acclimation in Emiliania huxleyi (clone CCMP 1516). New Phytologist. 200 (1), 74-85 (2013).
  10. Warner, M. E., Lesser, M. P., Ralph, P. J. Chlorophyll fluorescence in reef building corals. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. , Springer. Dordrecht. 209-222 (2010).
  11. Bhagooli, R., et al. Chlorophyll fluorescence - A tool to assess photosynthetic performance and stress photophysiology in symbiotic marine invertebrates and seaplants. Marine Pollution Bulletin. 165, 112059 (2021).
  12. Zavafer, A., Labeeuw, L., Mancilla, C. Global trends of usage of chlorophyll fluorescence and projections for the next decade. Plant Phenomics. 2020, 6293145 (2020).
  13. Goto, N., Tanaka, Y., Mitamura, O. Relationships between carbon flow through freshwater phytoplankton and environmental factors in Lake Biwa, Japan. Fundamental and Applied Limnology/Archiv für Hydrobiologie. 184 (4), 261-275 (2014).
  14. Napoléon, C., Raimbault, V., Claquin, P. Influence of nutrient stress on the relationships between PAM measurements and carbon incorporation in four phytoplankton species. PLOS ONE. 8 (6), 66423 (2013).
  15. Morris, E. P., Kromkamp, J. C. Influence of temperature on the relationship between oxygen- and fluorescence-based estimates of photosynthetic parameters in a marine benthic diatom (Cylindrotheca closterium). European Journal of Phycology. 38 (2), 133-142 (2003).
  16. Fraga, S., Rodríguez, F., Bravo, I., Zapata, M., Marañón, E. Review of the main ecological features affecting benthic dinoflagellate blooms. Cryptogamie, Algologie. 33 (2), 171-179 (2012).
  17. McMinn, A., et al. Quantum yield of the marine benthic microflora of near-shore coastal Penang, Malaysia. Marine and Freshwater Research. 56 (7), 1047-1053 (2005).
  18. Salleh, S., McMinn, A. The effects of temperature on the photosynthetic parameters and recovery of two temperate benthic microalgae, Amphora cf. coffeaeformis and Cocconeis cf. sublittoralis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology. 47 (6), 1413-1424 (2011).
  19. McMinn, A., Pankowskii, A., Ashworth, C., Bhagooli, R., Ralph, P., Ryan, K. In situ net primary productivity and photosynthesis of Antarctic sea ice algal, phytoplankton and benthic algal communities. Marine Biology. 157 (6), 1345-1356 (2010).
  20. Garbary, D. J., Bird, C. J., Kim, K. Y. Sporocladopsis jackii, sp. nov. (Chroolepidaceae, chlorophyta): a new species from eastern Canada and Maine symbiotic with the mud snail, Ilyanassa obsoleta (Gastropoda). Rhodora. 107 (929), 52-68 (2005).
  21. Suggett, D. J., Oxborough, K., Baker, N. R., MacIntyre, H. L., Kana, T. M., Geider, R. J. Fast repetition rate and pulse amplitude modulation chlorophyll a fluorescence measurements for assessment of photosynthetic electron transport in marine phytoplankton. European Journal of Phycology. 38 (4), 371-384 (2003).
  22. Hughes, D. J., et al. Impact of nitrogen availability upon the electron requirement for carbon fixation in Australian coastal phytoplankton communities. Limnology and Oceanography. 63 (5), 1891-1910 (2018).
  23. Melrose, D. C., Oviatt, C. A., O'Reilly, J. E., Berman, M. S. Comparisons of fast repetition rate fluorescence estimated primary production and 14C uptake by phytoplankton. Marine Ecology Progress Series. 311, 37-46 (2006).
  24. Yoshida, K., Seger, A., Kennedy, F., McMinn, A., Suzuki, K. Freezing, melting, and light stress on the photophysiology of ice algae: ex situ incubation of the ice algal diatom Fragilariopsis cylindrus (Bacillariophyceae) using an ice tank. Journal of Phycology. 56 (5), 1323-1338 (2020).
  25. Selz, V., et al. Ice algal communities in the Chukchi and Beaufort Seas in spring and early summer: composition, distribution, and coupling with phytoplankton assemblages. Limnology and Oceanography. 63 (3), 1109-1133 (2018).
  26. Falasco, E., Bo, T., Ghia, D., Gruppuso, L., Bona, F., Fenoglio, S. Diatoms prefer strangers: non-indigenous crayfish host completely different epizoic algal diatom communities from sympatric native species. Biological Invasions. 20 (10), 2767-2776 (2018).
  27. Møhlenberg, F., Kaas, H. Colacium vesiculosum Ehrenberg (Euglenophyceae), infestation of planktonic copepods in the Western Baltic. Ophelia. 31 (2), 125-132 (1990).
  28. Zalocar, Y., Frutos, S. M., Casco, S. L., Forastier, M. E., Vallejos, S. V. Prevalence of Colacium vesiculosum (Colaciales: Euglenophyceae) on planktonic crustaceans in a subtropical shallow lake of Argentina. Revista De Biologia Tropical. 59 (3), 1295-1306 (2011).
  29. Barea-Arco, J., Pérez-Martínez, C., Morales-Baquero, R. Evidence of a mutualistic relationship between an algal epibiont and its host, Daphnia pulicaria. Limnology and Oceanography. 46 (4), 871-881 (2001).
  30. Decaestecker, E., Declerck, S., De Meester, L., Ebert, D. Ecological implications of parasites in natural Daphnia populations. Oecologia. 144 (3), 382-390 (2005).
  31. Allen, Y. C., Stasio, B. T. D., Ramcharan, C. W. Individual and population level consequences of an algal epibiont on Daphnia. Limnology and Oceanography. 38 (3), 592-601 (1993).
  32. Willey, R. L., Cantrell, P. A., Threlkeld, S. T. Epibiotic euglenoid flagellates increase the susceptibility of some zooplankton to fish predation. Limnology and Oceanography. 35 (4), 952-959 (1990).
  33. Green, J. Parasites and epibionts of Cladocera. The Transactions of the Zoological Society of London. 32 (6), 417-515 (1974).
  34. Evans, M. S., Sicko-Goad, L. M., Omair, M. Seasonal occurrence of Tokophrya quadripartita (Suctoria) as epibionts on adult Limnocalanus macrurus (Copepoda: Calanoida) in southeastern Lake Michigan. Transactions of the American Microscopical Society. 98 (1), 102-109 (1979).
  35. Chiavelli, D. A., Mills, E. L., Threlkeld, S. T. Host preference, seasonality, and community interactions of zooplankton epibionts. Limnology and Oceanography. 38 (3), 574-583 (1993).
  36. Willey, R. L., Willey, R. B., Threlkeld, S. T. Planktivore effects on zooplankton epibiont communities: epibiont pigmentation effects. Limnology and Oceanography. 38 (8), 1818-1822 (1993).
  37. Rosowski, J. R., Willey, R. L. Colacium libellae sp. nov. (euglenophyceae), a photosynthetic inhabitant of the larval damselfly rectum. Journal of Phycology. 11 (3), 310-315 (1975).
  38. Willey, R. L., Threlkeld, S. T. Organization of crustacean epizoan communities in a chain of subalpine ponds. Limnology and Oceanography. 38 (3), 623-627 (1993).
  39. Al-Dhaheri, R. S., Willey, R. L. Colonization and reproduction of the epibiotic flagellate Colacium vesiculosum (euglenophyceae) on Daphnia pulex. Journal of Phycology. 32 (5), 770-774 (1996).
  40. Rosowski, J. R. Photosynthetic euglenoids. Freshwater Algae of North America. , Elsevier Science. USA. 383-422 (2003).
  41. Rosowski, J. R., Kugrens, P. Observations on the euglenoid Colacium with special reference to the formation and morphology of attachment material. Journal of Phycology. 9 (4), 370-383 (1973).
  42. Salmaso, N., Tolotti, M. Other phytoflagellates and groups of lesser importance. Encyclopedia of Inland Waters. , Academic Press. 174-183 (2009).
  43. Threlkeld, S. T., Chiavelli, D. A., Willey, R. L. The organization of zooplankton epibiont communities. Trends in Ecology & Evolution. 8 (9), 317-321 (1993).
  44. Bertolo, A., Rodríguez, M. A., Lacroix, G. Control mechanisms of photosynthetic epibionts on zooplankton: an experimental approach. Ecosphere. 6 (11), (2015).
  45. Pringsheim, E. G. Notiz über Colacium (Euglenaceae). Österreichische Botanische Zeitschrift. 100 (3), 270-275 (1953).
  46. Wołowski, K., Duangjan, K., Peerapornpisal, Y. Colacium minimum (Euglenophyta), a new epiphytic species for Asia. Polish Botanical Journal. 60 (2), 179-185 (2015).
  47. Martin, J. H., Knauer, G. A. The elemental composition of plankton. Geochimica et Cosmochimica Acta. 37 (7), 1639-1653 (1973).
  48. Kazama, T., Hayakawa, K., Kuwahara, V. S., Shimotori, K., Imai, A., Komatsu, K. Development of photosynthetic carbon fixation model using multi-excitation wavelength fast repetition rate fluorometry in Lake Biwa. PLOS ONE. 16 (2), 0238013 (2021).
  49. Chesney, T., Sastri, A. R., Beisner, B. E., Nandini, S., Sarma, S. S. S., Juneau, P. Application of fluorometry (Phyto-PAM) for assessing food selection by cladocerans. Hydrobiologia. 829 (1), 133-142 (2019).
  50. Wang, Q., Yang, S., Wan, S., Li, X. The significance of calcium in photosynthesis. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1353 (2019).
  51. Dau, H., Haumann, M. Eight steps preceding O-O bond formation in oxygenic photosynthesis-A basic reaction cycle of the photosystem II manganese complex. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1767 (6), 472-483 (2007).
  52. Suthers, I., Bowling, L., Kobayashi, T., Rissik, D. Sampling methods for plankton. Plankton: A guide to their ecology and monitoring for water quality. , CSIRO Publishing. Melbourne. 63-90 (2019).
  53. Błędzki, L. A., Rybak, J. I. Freshwater Crustacean Zooplankton of Europe: Cladocera & Copepoda (Calanoida, Cyclopoida) Key to species identification, with notes on ecology, distribution, methods and introduction to data analysis. , Springer. Switzerland. (2016).
  54. Kato, S. Laboratory culture and morphology of Colacium vesiculosum Ehrb. (Euglenophyceae). Japanese Journal of Phycology (Sorui). 30, 63-67 (1982).
  55. Serôdio, J., Campbell, D. A. Photoinhibition in optically thick samples: Effects of light attenuation on chlorophyll fluorescence-based parameters. Journal of Theoretical Biology. 513, 110580 (2021).
  56. Sylvan, J. B., Quigg, A., Tozzi, S., Ammerman, J. W. Eutrophication-induced phosphorus limitation in the Mississippi River plume: evidence from fast repetition rate fluorometry. Limnology and Oceanography. 52 (6), 2679-2685 (2007).
  57. Browning, T. J., et al. P. Nutrient regulation of late spring phytoplankton blooms in the midlatitude North Atlantic. Limnology and Oceanography. 65 (6), 1136-1148 (2020).
  58. Pausch, F., Bischof, K., Trimborn, S. Iron and manganese co-limit growth of the Southern Ocean diatom Chaetoceros debilis. PLOS ONE. 14 (9), 0221959 (2019).
  59. Ferroni, L., Baldisserotto, C., Fasulo, M. P., Pagnoni, A., Pancaldi, S. Adaptive modifications of the photosynthetic apparatus in Euglena gracilis Klebs exposed to manganese excess. Protoplasma. 224 (3), 167-177 (2004).
  60. Gaiser, E. E., Bachmann, R. W. Seasonality, substrate pereference and attachment sites of epizoic diatoms on cladoceran zooplankton. Journal of Plankton Research. 16 (1), 53-68 (1994).
  61. Totti, C., et al. The diversity of epizoic diatoms: relationships between diatoms and marine invertebrates. The Diversity of Epizoic Diatoms. 16, 323-343 (2011).
  62. Perkins, M., Effler, S. W., Strait, C. M. Phytoplankton absorption and the chlorophyll a-specific absorption coefficient in dynamic Onondaga Lake. Inland Waters. 4 (2), 133-146 (2014).
  63. Kromkamp, J., Capuzzo, E., Philippart, C. J. M. Measuring phytoplankton primary production: review of existing methodologies and suggestions for a common approach. EcApRHA Deliverable WP 3.2. 28, (2017).
  64. Hughes, D., et al. Roadmaps and detours: active chlorophyll-a assessments of primary productivity across marine and freshwater systems. Environmental Science & Technology. 52 (21), 12039-12054 (2018).
  65. Perkins, R. G., et al. The application of variable chlorophyll fluorescence to microphytobenthic biofilms. Chlorophyll a Fluorescence in Aquatic Sciences: Methods and Applications. 4, Springer. Dordrecht. 237-275 (2010).
  66. Schuback, N., Flecken, M., Maldonado, M. T., Tortell, P. D. Diurnal variation in the coupling of photosynthetic electron transport and carbon fixation in iron-limited phytoplankton in the NE subarctic Pacific. Biogeosciences. 13 (4), 1019-1035 (2016).
  67. Schreiber, U., Gademann, R., Ralph, P. J., Larkum, A. W. D. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements. Plant and Cell Physiology. 38 (8), 945-951 (1997).
  68. Garbary, D. J., Miller, A. G., Scrosati, R. A. Ascophyllum nodosum and its symbionts: XI. The epiphyte Vertebrata lanosa performs better photosynthetically when attached to Ascophyllum than when alone. Algae. 29 (4), 321-331 (2014).
  69. Gorbunov, M. Y., Kolber, Z. S., Lesser, M. P., Falkowski, P. G. Photosynthesis and photoprotection in symbiotic corals. Limnology and Oceanography. 46 (1), 75-85 (2001).
  70. Yellowlees, D., Warner, M. Photosynthesis in symbiotic algae. Photosynthesis in Algae. 14, Springer. Dordrecht. 437-455 (2003).
  71. Wojtasiewicz, B., Stoń-Egiert, J. Bio-optical characterization of selected cyanobacteria strains present in marine and freshwater ecosystems. Journal of Applied Phycology. 28 (4), 2299-2314 (2016).
  72. Aardema, H. M., Rijkeboer, M., Lefebvre, A., Veen, A., Kromkamp, J. C. High-resolution underway measurements of phytoplankton photosynthesis and abundance as an innovative addition to water quality monitoring programs. Ocean Science. 15 (5), 1267-1285 (2019).

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Biologia Edição 177 FRRf de bancada Colacium sp. epibionte algas epizoicas Lago Biwa fotofisiologia
Medindo fotofisiologia do estágio anexado de <em>Colacium</em> sp. por um fluorômetro de taxa de repetição rápida do tipo cuvette
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Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, … More

Kazama, T., Hayakawa, K., Shimotori, K., Imai, A. Measuring Photophysiology of Attached Stage of Colacium sp. by a Cuvette-Type Fast Repetition Rate Fluorometer. J. Vis. Exp. (177), e63108, doi:10.3791/63108 (2021).

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