研究角膜伤口愈合的上皮擦伤模型

Summary

这里，描述了使用环锯和钝高尔夫球杆螺杆在小鼠中形成中央角膜上皮擦伤伤口的方案。这种角膜伤口愈合模型具有高度可重复性，现在正用于评估疾病背景下受损的角膜伤口愈合。

Abstract

角膜对视力至关重要，约占眼睛屈光力的三分之二。角膜在视觉中的作用至关重要的是其透明度。然而，由于其外部位置，角膜极易受到各种损伤的影响，这些损伤可能导致角膜透明度丧失并最终失明。针对这些损伤，有效的角膜伤口愈合对于维持角膜稳态和保持角膜透明度和屈光能力至关重要。在角膜伤口愈合受损的情况下，角膜变得容易受到感染，溃疡和瘢痕形成。鉴于角膜伤口愈合对保持角膜透明度和视力的根本重要性，更好地了解正常的角膜伤口愈合过程是了解与感染和疾病相关的角膜伤口愈合受损的先决条件。为了实现这一目标，角膜损伤的小鼠模型已被证明有助于进一步了解在正常生理条件下运作的角膜伤口愈合机制。这里，描述了使用环锯和钝高尔夫球杆螺杆在小鼠中产生中央角膜上皮磨损的方案。在该模型中，一个直径为2毫米的圆形环锯，以角膜为中心，用于划定伤口区域。高尔夫球杆螺杆经过精心使用，以清创上皮并形成圆形伤口，而不会损坏角膜上皮基底膜。由此产生的炎症反应作为表征良好的细胞和分子事件的级联进行，这些事件对于有效的伤口愈合至关重要。这种简单的角膜伤口愈合模型具有高度可重复性和良好的出版性，现在正用于评估疾病背景下受损的角膜伤口愈合。

Introduction

角膜是眼睛前三分之一的透明角膜。角膜具有多种功能，包括保护眼睛的内部结构和形成保护眼睛免受感染的结构屏障¹。更重要的是，角膜对视力至关重要，提供约三分之二的眼睛屈光力^2，3。角膜在视觉中的作用至关重要的是其透明度。然而，由于其向外的位置，角膜每天都会暴露在各种各样的损伤中，这可能导致其屏障功能的破坏，透明度的丧失以及最终的失明。角膜透明度丧失是全球视力障碍的主要原因^4，5.角膜擦伤是急诊室（ER）就诊的常见原因，占ER⁶上眼部相关病例的一半。据估计，美国每年有超过100万人遭受眼部相关伤害⁷.针对这些损伤，有效的角膜伤口愈合对于维持角膜稳态和保持其透明度和屈光能力至关重要。在角膜伤口愈合受损的情况下，角膜变得容易受到感染，溃疡和瘢痕形成^8，9。此外，屈光手术的日益普及给角膜¹⁰带来了独特的创伤性挑战。鉴于角膜伤口愈合对保持角膜透明度和视力的根本重要性，更好地了解正常的角膜伤口愈合过程是了解与感染和疾病相关的角膜伤口愈合受损的先决条件。

为此，已经开发了几种角膜伤口愈合的动物模型^{11，12，13，14，15}。角膜伤口愈合的小鼠模型已被证明有助于进一步了解在正常生理条件下起作用的角膜伤口愈合机制。不同类型的角膜伤口已被用于研究角膜伤口愈合，每种伤口都适用于研究伤口愈合过程的不同方面。角膜伤口愈合研究中使用的最常见类型的伤口模型是机械和化学伤口模型。化学角膜伤口，主要涉及角膜上碱性烧伤的产生，可用于研究角膜溃疡，混浊和新生血管形成¹³。机械性角膜伤口涉及清创（擦伤）伤口和角膜切除术伤口^14，15，16。完整或破裂的角膜上皮基底膜分别定义了清创术和角膜切除术伤口。在清创伤口中，上皮基底膜保持完整，而在角膜切除术伤口中，基底膜被破坏，主要渗透到前基质中。清创伤口对于研究角膜损伤后的再上皮化、上皮细胞增殖、免疫反应和神经再生最有用。另一方面，角膜切除术伤口对于研究角膜瘢痕形成最有用^14，15。

这里，描述了使用环锯和钝高尔夫球杆螺杆在小鼠中形成中央角膜上皮擦伤伤口的方案。这种简单的角膜伤口愈合模型具有高度可重复性和良好的出版性，现在正用于评估疾病¹⁷背景下受损的角膜伤口愈合。

Protocol

所有动物协议均由休斯顿大学和贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会批准。在处理和使用小鼠时，遵循了视觉和眼科研究协会（ARVO）关于在视觉和眼科研究中使用动物的声明中概述的指南。

1. 准备工作

1. 荧光素溶液的制备
   1. 通过将10mg荧光素钠盐溶解在1mL无菌盐水或无菌1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中来制备1%荧光素溶液。
      注意：在使用当天或前一天准备荧光素钠溶液，以避免微生物污染。当在使用前一天制备时，将荧光素溶液储存在4°C远离光线的地方。用铝箔包裹管，以防止光漂白。
   2. 将溶液分成适合在单个实验中使用的等分试样。每个时间点每只小鼠使用1-1.5μL荧光素溶液。使用以下公式计算适合单个实验的等分试样体积：
      
      注意：例如，如果在单个实验中研究六只小鼠，并在五个时间点监测伤口大小，则适合该单个实验的等分试样体积为：
      
2. 制备氯胺酮/赛拉嗪鸡尾酒用于麻醉小鼠。
   1. 要制备10毫升鸡尾酒，将2.0毫升氯胺酮（100毫克/毫升）与1.0毫升赛拉嗪（20毫克/毫升）混合，加入7.0毫升无菌PBS。在手术前一天或手术当天准备氯胺酮/甲苯噻嗪鸡尾酒。
      注意：除非另有说明，否则所有溶液都应在室温下使用。

2. 麻醉

1. 称量小鼠（8-12周龄C57BL / 6野生型小鼠）以确定适量的麻醉剂给药。使用双手小鼠约束技术来抑制和处理用于注射麻醉剂的小鼠¹⁸。腹膜内给予氯胺酮/赛拉嗪鸡尾酒（ip），终浓度为80mg / kg氯胺酮和8mg / kg甲苯噻嗪。
2. 等到达到完全麻醉后再对小鼠进行角膜损伤。通过评估脚趾捏合后的踏板反射来评估麻醉深度。当达到足够的麻醉时，鼠标不应该在脚趾捏时移动。
   注意：由于小鼠在麻醉期间会迅速失去体温，因此为小鼠提供保暖源以防止体温过低非常重要。在麻醉和恢复阶段将小鼠放在热源（加热垫）上。

3. 角膜伤口的形成

1. 仅损伤右眼或左眼。与从鼠标移动到鼠标时受伤的眼睛（即左或右）保持一致。
   注意：由于擦伤会损害角膜神经并降低视力，因此双眼受伤会引起严重的不适和损害。由于镇痛药具有抑制炎症反应的潜力，因此在某些旨在了解角膜炎症的实验中，它们的使用可能是一个混杂因素。在角膜伤口实验中避免使用镇痛药已获得我们的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
2. 形成上皮角膜伤口
   1. 在解剖显微镜下，使用直径为2mm的环锯（见 图1）来标定角膜的中心，用拇指和食指保持眼睛睁开以握住眼睑。轻轻旋转环锯，在角膜上皮上留下印记。
      注意：使用环锯时必须注意不要施加过大的压力，因为这可能导致角膜穿孔。此外，必须注意将环锯定位在中央。瞳孔可以用作定位角膜中心的地标。
   2. 在解剖显微镜下，将钝的高尔夫球杆螺杆（见 图1）保持在距角膜表面约45°的位置，在用环锯划定的区域内。小心而连续地用蜘蛛刮擦划定上皮区域内的上皮，以清创上皮。
      注意：不要在清创术中施加过大的力，因为这也会导致角膜穿孔。在受伤过程中，小鼠的眼睛会干涸，使清创变得困难。在这种情况下，将无菌PBS涂抹在眼表面以保持最佳水合作用。

图 1：2 毫米环锯和钝高尔夫球杆。 环锯用于在角膜中心划定圆形区域，高尔夫球杆螺杆用于去除划定区域内的上皮。 请点击此处查看此图的大图。

4. 监测伤口闭合和再上皮化

1. 将1-1.5μL1%荧光素溶液移液到受伤的表面上，并使用带有蓝色光源的数字显微镜对角膜进行成像。
2. 在荧光素溶液添加的第一分钟内获取图像，以避免扩散到周围的上皮，导致伤口尺寸的高估。在受伤后的特定时间（即 0 小时、12 小时、18 小时、24 小时和 30 小时）对受伤的角膜进行成像。
   注意：在所有时间点，成像都是在麻醉下进行的;在伤口时使用氯胺酮/甲苯噻嗪，而在随后的时间点使用异氟醚。在伤口闭合监测期间，将小鼠单独饲养在单独的笼子中。当被饲养在一起时，小鼠倾向于舔猫的眼睛，这种行为已被证明会影响不同组织中的伤口愈合^19，20。
3. 分析捕获的图像，使用图像分析软件追踪伤口区域。每个时间点的伤口面积表示为0小时时原始伤口面积的百分比。

5. 免疫荧光成像和分析

1. 在受伤后，通过IACUC批准的方法（在这种情况下，二氧化碳过量，然后是宫颈脱位）对小鼠实施安乐死。
2. 通过轻轻按压外侧疙疽来收获眼球，使用虹膜弯曲剪刀移位眼球。引导眼球后面的剪刀牢牢抓住视神经，然后切开神经，这样就可以取出眼球。
3. 在室温下将每个眼球固定在1 mL含有2%多聚甲醛的1x PBS中1小时，然后在1mL 1x PBS中洗涤三次，每次5分钟。
4. 在解剖显微镜下，使用手术刀片在巩膜上切开一个切口，距离边缘远端约500μm，然后切开球体。使用镊子，轻轻地从角膜上取出虹膜物质，然后小心地修剪掉巩膜组织，确保保持边缘完整。
5. 做四个部分径向切口，每个切口的长度约为1毫米，从周围角膜延伸并停止在中心附近，以使角膜变平。
6. 在1mL的2%牛血清白蛋白（BSA）和0.01%TritonX -100中透化并阻断角膜，在1x PBS中透化并阻断角膜15分钟，然后在室温下在1x PBS中阻断2%BSA，再阻断45分钟。
7. 将角膜在4°C下孵育在含有2%BSA的1x PBS中制备的直接标记的独特荧光染料偶联抗体的混合物中过夜。
   注意：抗体靶向标记感兴趣的特定细胞和组织。例如，内皮细胞、嗜中性粒细胞和血小板分别标记有抗 CD31^21，22、抗 Ly-6G^23，24 和抗 CD41^25，26 抗体。将4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI）添加到抗体混合物中以可视化细胞核。
8. 孵育后，在1x PBS中洗涤角膜三次，每次15分钟。
9. 将角膜安装在显微镜载玻片上，滴入一滴防褪色荧光安装介质中，用盖玻片覆盖，并使用荧光显微镜以所需的放大倍率（4x至100x物镜）成像。拍摄不同区域角膜的全厚度图像，如图 2A所示。
   注意： 图2A 所示的显微分析模式用于分析炎症和细胞分裂的特定区域变化。DAPI和Ly-6G染色都用于识别血管外嗜中性粒细胞。通过DAPI染色，球形嗜中性粒细胞具有明显的马蹄形或甜甜圈形细胞核（图2B）。

图2：角膜成像策略和中心擦伤后的中性粒细胞浸润。 （A）角膜整个支架的示意图，显示了角膜直径上的九个微观场。灰色区域表示原始伤口区域。每个区域的宽度为500μm.（B）注意DAPI染色的嗜中性粒细胞核的独特马蹄形或甜甜圈形状。 请点击此处查看此图的大图。

Representative Results

图3 显示了用钝性高尔夫球杆孢子形成的角膜伤口的透射电子显微镜照片，表明上皮基底膜在损伤后确实完好无损。

图3：角膜擦伤后上皮基底膜保持完整。 用钝性高尔夫球杆刺形成的角膜伤口的透射电子显微照片。箭头指向伤口周围剩余上皮下方的基底膜，而箭头指向剥脱区域的基底膜。这显示了基底膜从未磨损的角膜到磨损部分的连续性，表明基底膜在清创后保持完整。 请点击此处查看此图的大图。

该角膜伤口方案已被广泛用于表征2mm上皮擦伤伤口27，28，^{29，30，31，32，33}的伤口愈合^动力学。监测体内伤口闭合和上皮再皮化速率的能力是该模型的核心部分。如图4A所示，使用荧光素溶液和带有蓝色光源的数字显微镜可以使伤口大小的可视化。在该模型中，在受伤时（0小时），12小时，18小时，24小时和30小时进行伤口闭合监测。图4B显示了30小时内伤口闭合的动力学。在8-12周龄的C57BL / 6野生型小鼠中，伤口闭合和再上皮化通常在伤口后24小时完成，如图4B所示，调节良好的炎症反应是有效伤口愈合的基础^34，35，36。

图4：使用荧光素染色评估上皮伤口闭合。 （A）角膜伤口在0小时，12小时，18小时，24小时和30小时时荧光素染色的代表性图像。在该模型中，伤口闭合通常在受伤后24小时完成。注意24小时和30小时中央角膜缺乏绿色染色（B）伤口闭合动力学表明伤口在受伤后24小时完全闭合。每个时间点的值表示为原始伤口面积的百分比（即，0小时时的伤口面积）（n ≥6）。以平均±标准差表示的数据。 请点击此处查看此图的大图。

该模型中对伤口的炎症反应具有良好的特征。上皮擦伤伤口在角膜边缘脉管系统中引起快速炎症反应，其主要特征是血管舒张，血小板外渗局限于边缘^37，38，39和中性粒细胞外渗向角膜^中心40。 图5 显示了具有血管外嗜中性粒细胞的未卷曲角膜的边缘脉管系统（图5A）和具有血管外血小板和中性粒细胞的损伤角膜（图5B）。

图5：边缘的炎症细胞成像。 角膜边缘的显微照片显示边缘血管有抗 CD31 抗体染色（红色显示）、嗜中性粒细胞有抗 Ly-6G 抗体染色（绿色显示）和血小板有抗 CD41 抗体染色（蓝色显示）。（A）无磨损和（B）磨损后30小时。 请点击此处查看此图的大图。

在该模型中，中性粒细胞浸润到角膜中评估了五个不同的区域，如图 2A所示。为了确定这些不同的区域，捕获整个角膜的图像，通过抗CD31染色可视化边缘脉管系统。每个花瓣上边缘区域的最内侧边缘使用边缘脉管系统作为指导进行标记。测量边缘区域最内边缘在水平（x）或垂直（y）方向上从一个花瓣到另一个花瓣的距离。对于8-12周龄的C57BL / 6野生型小鼠，该距离约为3.7毫米。此距离覆盖外围区域之间的外围区域。然后将整个角膜的中心计算为对应于整个支架水平或垂直直径的一半的点。准中心区域距离计算中心为500μm的左，右，上或下。其他字段距离前一个字段均为 500 μm。DAPI和Ly-6G染色都用于识别血管外嗜中性粒细胞。从四个象限开始，每个角膜区域的中性粒细胞计数被平均并表示为每田的嗜中性粒细胞。

该模型中的血小板评估仅在边缘进行;在角膜伤口愈合期间，血小板外渗并定位到边缘^27，37。计数边缘的血小板总数，计数表示为边缘区域的血小板/ mm² 。四片花瓣的计数可以合计或平均。

Discussion

该方法论文的目的是描述一种方案，用于使用环锯和钝高尔夫球杆在小鼠中形成中央角膜上皮擦伤伤口。该小鼠模型已被用于研究角膜炎症及其对伤口愈合的贡献。这种类型的模型可用于研究正常生理条件下角膜伤口愈合机制和病理学^17，28，^29，41，42。该模型已被用于研究病理条件下的角膜伤口愈合，正如在饮食诱导的肥胖小鼠模型中对角膜伤口愈合受损的研究所证明的那样¹⁷。该模型的一个明显优点是，它可以创建精确（2 mm）可重复的上皮伤口尺寸，具有精确的中心位置，而不会破坏基底膜。这种角膜损伤模型简单明了，执行起来很快。除了钝的高尔夫球杆桩^{29，39，43，44，45}，旋转毛刺（Algerbrush）^38，46，47和金刚石刀片^{32，37，40，48，49，50，51} 两者都可用于在此模型中产生磨损伤口。在有经验的用户手中，任何一种工具产生的磨损伤口都没有实质性的差异。出于训练目的，在新手的手中，与旋转的毛刺和金刚石刀片相比，钝的高尔夫球杆螺杆通常更容易获得可重复的结果。旋转毛刺（Algerbrush）需要精细的触摸，否则旋转毛刺会损坏上皮基底膜。其他调查人员也报告了这一情况^，52，53。另一方面，钝化的高尔夫球杆螺杆始终使上皮基底膜完好无损。

为了成功复制这种角膜伤口方案并观察随后的再上皮化和炎症动力学，必须使用相同的菌株和年龄范围的小鼠，并且必须如上所述创建伤口的大小和深度。该协议中描述的角膜伤口愈合动力学和时间表适用于C57BL / 6小鼠菌株，如果使用不同的小鼠菌株，则可能不会共享。Pal-Ghosh等人⁵⁴ 报告了C57BL / 6和BALB / c愈合角膜上皮清创伤口的能力的变化。对于相同的角膜伤口大小，BALB / c小鼠的角膜伤口闭合和再上皮化较慢。完成伤口闭合的时间线和此处描述的特征性炎症反应适用于直径为2 mm的圆形伤口。对于直径大于2 mm的伤口，预计伤口闭合完成时间会更长，而对于伤口直径小于2 mm，预计伤口闭合时间会更短。此外，较大的角膜伤口，特别是那些靠近边缘的伤口，预计将引起更夸张的炎症反应，因为更多的白细胞被招募到角膜¹⁶中。更重要的是，伤口应局限于角膜上皮。突破上皮基底膜或穿透角膜基质的伤口需要更长的时间才能愈合。这些伤口还与炎症反应改变、新生血管形成、肌成纤维细胞形成和瘢痕形成^55，56 有关。

在每一步都必须小心，以防止磨损角膜的微生物感染。微生物感染改变炎症反应并可导致溃疡，瘢痕形成和视力丧失⁵⁷。为了防止伤口的微生物感染，应始终使用无菌工具和解决方案。如果多只小鼠一次受伤，则应为每只小鼠使用无菌环锯。在小鼠之间，高尔夫球杆螺杆应用无菌PBS洗涤，然后在70%乙醇中消毒，然后在无菌PBS中再次洗涤。如果在多天内对其他小鼠进行伤口，则应在一天中的同一时间进行。这是为了控制昼夜节律对伤口愈合和炎症的影响。在C57BL / 6小鼠中，伤口形成的时间会影响角膜伤口愈合的速度和质量。与下午或晚上受伤相比，当小鼠在早上受伤时，观察到更快的伤口闭合和更大的细胞分裂⁴²。昼夜节律对伤口愈合的影响在其他组织中已有报道，包括皮肤^58，59。在这个模型中，伤口总是在早上进行。

在该模型中，由此产生的对伤口的炎症反应作为细胞和分子事件的表征良好的级联反应进行，这些事件对于有效的伤口愈合至关重要。在该模型中，磨损诱导的炎症中最具特征的细胞参与者是嗜中性粒细胞和血小板。中性粒细胞是角膜擦伤部位的第一反应者;在受伤后6小时内在角膜基质中检测到显着水平的嗜中性粒细胞。中性粒细胞负责清除细胞碎片，这是炎症和伤口修复⁶⁰固有的过程。除了它们的吞噬活性外，嗜中性粒细胞还含有生长因子，例如血管内皮生长因子（VEGF）⁶¹。VEGF是^62，63 受伤后角膜神经再生的关键神经再生因子，并且对于角膜上皮细胞分裂^45，63也很重要。边缘的中性粒细胞浸润发生在两波中，第一个峰值在18小时，第二个峰值在受伤^{40小时后30}小时。使用中性粒细胞减少小鼠^37，40，中性粒细胞外渗和随后向角膜中心的迁移已被证明对角膜伤口愈合至关重要。虽然传统上已知在维持止血和凝血方面起着关键作用，但血小板在角膜伤口愈合中也具有公认的关键作用³⁷。血小板含有许多有助于炎症和组织消退的介质^64，65。在患有血小板减少症的小鼠中，该模型已被用于表明血小板对于有效的角膜伤口愈合很重要³⁷。

尽管中性粒细胞和血小板是该模型中表征最好的细胞，但使用该模型^27，48也显示免疫细胞（例如γδ T细胞，自然杀伤细胞和树突状细胞）参与对伤害的免疫反应。已经报道了基质^28，29 中的自然杀伤细胞外渗以及γδT细胞向愈合上皮²⁷ 的迁移。该模型还被用于鉴定角膜伤口愈合过程中免疫细胞外渗的关键粘附分子。淋巴细胞功能抗原-1 （LFA-1）³²、^{CD18 51} 和细胞间粘附分子-1 （ICAM-1）^47，49 均已被证明对于中性粒细胞外渗和有效的角膜伤口愈合至关重要。使用有丝分裂图评估伤口闭合后上皮细胞分裂，这对于伤口闭合后的上皮重新分层至关重要。在细胞分裂的不同阶段，染色体的凝聚使细胞核具有特征性的外观，称为有丝分裂图。细胞核的DAPI染色可以可视化这些有丝分裂图。

小鼠角膜磨损伤口模型已被证明具有显着的可重复性，并且为有助于有效伤口愈合的细胞和分子机制提供了相当的见解。然而，值得注意的是，该模型在临床适用性方面存在局限性。该模型及其结果仅适用于简单的，非穿透性的上皮擦伤。如前所述，由物理或化学损伤引起的穿透性伤口引起的角膜损伤将引起不同的伤口愈合动力学和结果，特别是如果伤口感染，如在人类角膜损伤的情况下经常发生的那样。话虽如此，小鼠角膜磨损伤口模型确实为研究调节角膜伤口愈合的炎症基本原理提供了极好的基础。

这里描述的角膜伤口方案是直接的，易于复制。它提供了一个有用的工具来研究有关角膜伤口愈合过程及其相关炎症反应的基本问题。它有助于理解与伤口愈合并发症相关的角膜病变的潜力仅仅是个开始。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-CD31 antibody	BD Bioscience, Pharmingen	550274
Anti-CD41 antibody	BD Bioscience, Pharmingen	553847
Anti-Ly6G antibody	BD Bioscience, Pharmingen	551459
Bovine serum albumin (BSA)	ThermoFisher scientific	B14
C57BL/6 mice	Jackson Laboratories	664
DAPI	Sigma Aldrich	D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope	GE Life Sciences
Dissecting microscope	Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale)	Fisher Scientific
Ethanol	ThermoFisher scientific	T038181000CS
Golf-club spud	Stephens instruments	S2-1135
Iris curve scissors	Fisher Scientific	31212
Isoflurane	Patterson veterinary	07-893-1389
Ketamine	Patterson veterinary	07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS)	ThermoFisher scientific	AM9624
Sodium fluorescein salt	Sigma Aldrich	46970
Surgical blade (scapel blade)	Fine Science tools	10022-00
Trephine	Integra Miltex	33-31
TritonX -100	Fisher Scientific	50-295-34
Forcep	Fine Science tools	11923-13
Xylazine	Patterson veterinary	07-808-1947